Tổng quan luận án

Bệnh Leptospirosis (bệnh Xoắn khuẩn) là bệnh truyền nhiễm cấp tính lây truyền giữa động vật và người, do xoắn khuẩn Leptospira interrogans thuộc họ Leptospiraceae gây ra. Bệnh được Tổ chức Sức khỏe Động vật Thế giới (OIE) xếp vào nhóm 2 trong danh mục các bệnh nguy hiểm và được đưa vào nhóm bệnh nghề nghiệp tại Việt Nam. Xoắn khuẩn xâm nhập qua niêm mạc, da trầy xước khi tiếp xúc với nguồn nước hoặc đất bị ô nhiễm bởi nước tiểu của động vật mang mầm bệnh. Việc điều trị bằng kháng sinh (penicillin, ampicillin, tetracyclin, doxycyclin...) chỉ đạt hiệu quả khi phát hiện sớm ở giai đoạn đầu, trong khi vật nuôi sau hồi phục chỉ có miễn dịch đặc hiệu theo từng serovar mà không có bảo hộ chéo.

Tại Việt Nam, các loại vắc xin lưu hành chủ yếu là vắc xin vô hoạt hoặc nhược độc sản xuất theo phương pháp truyền thống, chỉ duy trì thời gian bảo hộ ngắn (khoảng 6 tháng) và tiềm ẩn nguy cơ phản ứng phụ. Dịch tễ học tại Việt Nam ghi nhận sự lưu hành của nhiều serovar khác nhau trên đàn gia súc. Trước thực tế chưa có đơn vị nào trong nước sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis, luận án được thực hiện nhằm nghiên cứu quy trình chế tạo vắc xin tái tổ hợp mang kháng nguyên bảo tồn chung cho các chủng lưu hành.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm:

  1. Xác định một số gen quyết định kháng nguyên tiềm năng, có giá trị ứng dụng trong chế tạo vắc xin tái tổ hợp chống lại Leptospirosis tại Việt Nam.
  2. Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng và chống lại bệnh gây ra do xoắn khuẩn Leptospira interrogans tại Việt Nam.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: 5 chủng xoắn khuẩn Leptospira interrogans lưu hành tại Việt Nam (do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương cung cấp); các hệ thống biểu hiện vi khuẩn Escherichia coli (DH10b, BL21); động vật thí nghiệm (thỏ giống Việt Nam trọng lượng 2–2,5 kg, chuột lang 180–200 g, chuột nhắt trắng 18–20 g).
  • Phạm vi không gian: Nghiên cứu thực nghiệm tại Phòng Hệ gen học vi sinh thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), quy trình phối chế và kiểm nghiệm thử nghiệm tại Công ty Cổ phần Thuốc Thú y Trung ương VETVACO, cùng khảo sát dịch tễ thực địa tại một số địa phương (Nam Định, Bắc Ninh, Hải Dương, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Thái Bình, Cần Thơ).
  • Phạm vi thời gian: Nghiên cứu được hoàn thành và bảo vệ năm 2022, kế thừa các số liệu dịch tễ từ giai đoạn 2002–2021.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án tổng hợp lịch sử nghiên cứu xoắn khuẩn Leptospira từ khi Adolph Weil mô tả bệnh lâm sàng dạng vàng da năm 1886 (Weil’s disease). Đến năm 1916, Do và Inada phát hiện xoắn khuẩn gây bệnh tại Nhật Bản; năm 1917–1918, Noguchi phân lập được serovar từ chuột hoang tại Mỹ và đặt tên là Leptospira icterohaemorrhagiae.

Tại Việt Nam, các mốc nghiên cứu dịch tễ được tác giả điểm lại theo trình tự thời gian:

  • Năm 1931: Ragiot và Souchard lần đầu ghi nhận bệnh trên người.
  • Năm 1937: Vaucel phát hiện các ổ dịch tại Hà Nội, Hải Phòng, Phú Thọ và Tuyên Quang.
  • Năm 1953: Viện Pasteur Sài Gòn xác định 30/30 mẫu trâu dương tính với các serovar Mitis, Pomona, Canicola; 29/39 mẫu chó dương tính chủ yếu với serovar Bataviae.
  • Năm 1965: Đào Trọng Đạt và cộng sự công bố tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó ở miền Bắc là 25%.
  • Năm 2002: Hoàng Mạnh Lâm khảo sát tại Đắk Lắk, xác định 4 serovar mới trên chuột (L. Cellendoni, L. Panama, L. Sejroe, L. Semaranga), 3 serovar trên chó (L. Pyrogenes, L. Mini, L. Javanica) và 4 serovar trên người (L. Autumnalis, L. Bataviae, L. Sejroe, L. Tarassovi).
  • Nghiên cứu của Wagenaar và cộng sự tại Bình Thuận ghi nhận tỷ lệ kháng thể IgM kháng Leptospira đạt 35% ở người khỏe mạnh và 40% ở bệnh nhân sốt.
  • Năm 2012: Lý Thị Liên Khai khảo sát tại Cần Thơ ghi nhận 6 serogroup phổ biến trên chuột, chó và bò sữa (Bataviae, Ballum, Pyrogenes, Icterohaemorrhagiae, Australis, Pomona).
  • Năm 2013: Hoàng Kim Loan và cộng sự ghi nhận tỷ lệ nhiễm 4,4% trên người và 7,14% trên động vật gặm nhấm tại miền Nam.
  • Năm 2021: Lê Thị Phương Mai và cộng sự công bố 17 serovar phân lập từ động vật tại Thái Bình, Hà Tĩnh và Cần Thơ, trong đó trâu tại Thái Bình có tỷ lệ nhiễm 60%.

Về công nghệ vắc xin, các công trình quốc tế được phân tích:

  • Haake và cộng sự nghiên cứu kháng nguyên màng ngoài OmpL1 (porin 320 axit amin) và lipoprotein LipL41.
  • Dong-jiao Luo và cộng sự thử nghiệm protein tái tổ hợp rLipL21 trên thỏ, cho hiệu giá kháng thể cao gấp 4 lần so với dạng vắc xin mang gen LipL21 nguyên bản.
  • Kumari A và cộng sự (2018) chứng minh protein rLipL21 và dạng cắt ngắn rI-LipL21 giúp nâng tỷ lệ sống của chuột sau công cường độc lên lần lượt 66% và 83% (nhóm đối chứng chết 100%), đồng thời kích thích tăng sinh các cytokine TNF-α, IFN-γ và IL-10.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết: Các loại vắc xin vô hoạt tế bào hiện hành (như sản phẩm của VETVACO chứa 6 chủng vô hoạt bằng thiomersal/methiolat hoặc sản phẩm của Nanovet) chỉ bảo hộ đặc hiệu đơn chủng trong 6 tháng, quy trình nuôi cấy sinh khối lớn xoắn khuẩn đòi hỏi môi trường huyết thanh thỏ đắt tiền và tiềm ẩn nguy cơ nhiễm tạp. Luận án giải quyết khoảng trống này bằng cách sàng lọc gen kháng nguyên bảo tồn trên cả 5 chủng lưu hành tại Việt Nam để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21 tinh khiết quy mô pilot.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết sinh học phân tử vi khuẩn, di truyền học hệ gen Leptospira (kích thước bộ gen 3,9–4,6 Mb gồm hai nhiễm sắc thể tròn, hàm lượng G+C từ 35% đến 41%), và cơ chế sinh miễn dịch qua trung gian tế bào/dịch thể (đáp ứng Th1 kích thích tiết IFN-γ, IL-2, sản sinh IgG2a; đáp ứng Th2 sản sinh IgG1).

Tên gen đích Trình tự mồi xuôi (Forward) và mồi ngược (Reverse) (5' - 3') Kích thước sản phẩm (bp) Nhiệt độ bắt cặp (Tm)
16S rRNA F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
R: TACGGYTACCTTGTTACGACTT		 550 50°C
OmpL1 F: TCCGGAGGTGTTACAAAAGC
R: AGTCGTGACTGGATCGGTTC		 273 55°C
LipL32 F: TTACCGCTCGAGGTGCTTTCGGTGGTCTGC
R: TGTTAACCCGGGTTACTTAGTCGCGTCAGA		 782 50°C
LipL21 F: ATGATCAATAGACTTATAGCTC
R: TTATTGTTTGGAAACCTCTTGA		 560 50°C
LipL41 F: TCCCCAAGACTGACCTTTTG
R: ATGGGCAACTGGTAAAGACG		 423 50°C
LigA F: CGGTCGACTATCGTTACTCCAGCA
R: CGGCGGCCGCAATATCCGTATTAGA		 991 55°C
LigB F: TCAGCAATCGTAAGCGTGTC
R: GCGGAAGTGATGTCCTTGTT		 248 50°C

Phương pháp thực nghiệm chi tiết:

  • Nuôi cấy: Xoắn khuẩn được nuôi cấy trong môi trường lỏng EMJH (chứa 90% môi trường cơ sở Base Difco 2,3 g/900 ml và 10% huyết thanh thỏ tươi, pH 7,2–7,5; bổ sung 5-fluorouracil chống nhiễm khuẩn) ở nhiệt độ 28°C trong 7–10 ngày đến khi đạt mật độ $2 \times 10^8$ vi khuẩn/ml.
  • Tách chiết và phân tích DNA: Sử dụng kit GeneJET Genomic DNA Purification; đo nồng độ qua Nanodrop (tỷ lệ $OD_{260}/OD_{280}$ đạt 1,8–2,0) và điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
  • Phản ứng PCR: Hỗn hợp phản ứng tổng thể tích 10 µl (Buffer 1 µl, DNA khuôn 0,2 µl, mồi xuôi 0,2 µl, mồi ngược 0,2 µl, Taq DNA Polymerase 0,2 µl, dNTP Mix 0,2 µl, $H_2O$ 8 µl). Tinh sạch sản phẩm PCR bằng GeneJET PCR Purification Kit.
  • Phân tích tin sinh học: Giải trình tự Sanger trên máy ABI 3500; phân tích độ tương đồng và xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm MEGA 6 (thuật toán Neighbor-Joining); so sánh căn chỉnh chuỗi bằng BioEdit; mô hình hóa cấu trúc không gian 3D protein bằng I-TASSER và đánh giá độ tương đồng qua điểm TM-score.
  • Tạo dòng và biểu hiện: Đoạn gen LipL21 được tạo đầu dính bằng enzyme cắt giới hạn XhoI và EcoRV, gắn vào vector nhân dòng pJET1.2 (2974 bp) bằng T4 DNA ligase (hỗn hợp phản ứng 20 µl: 10 µl 2X reaction buffer, 1 µl Blunting Enzyme, 1 µl sản phẩm PCR, 1 µl vector, 1 µl T4 Ligase, 6 µl $H_2O$). Biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH10b bằng phương pháp sốc nhiệt ($42^\circ\text{C}$). Sau khi xác định đúng trình tự, đoạn gen được cắt chuyển sang vector biểu hiện pET32a (5900 bp) (phản ứng cắt 100 µl: 10 µl Đệm R, 50 µl vector, 5 µl XhoI, 5 µl EcoRV, 30 µl $H_2O$; ủ qua đêm ở 37°C) và nối bằng T4 DNA ligase theo tỷ lệ thể tích gen:vector là 2:1.
  • Tinh sạch protein tái tổ hợp: Biến nạp pET32a-LipL21 vào chủng E. coli BL21, nuôi trong môi trường LB bổ sung ampicillin (100 µg/ml), cảm ứng biểu hiện bằng IPTG. Thu hồi phân đoạn protein và tinh sạch bằng sắc ký ái lực cột Ni-NTA / His-bind; định lượng protein bằng phương pháp Bradford và kiểm tra kích thước qua điện di SDS-PAGE.
  • Đánh giá miễn dịch học và phối chế vắc xin: Phản ứng Western blot xác định tính đặc hiệu kháng nguyên; tiêm mẫn cảm trên thỏ để thu kháng huyết thanh; kiểm tra hiệu lực kháng thể bằng phản ứng vi ngưng kết (Microscopic Agglutination Test - MAT) với các nồng độ kháng nguyên 100 µg, 250 µg, 500 µg; phối trộn kháng nguyên với chất bổ trợ nhũ dầu bằng máy tạo nhũ L4RT (hãng Silverson - Anh Quốc); đánh giá an toàn, vô trùng và bảo hộ công cường độc trên chuột thí nghiệm.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Trình bày cơ sở khoa học, tính cấp thiết về dịch tễ bệnh Leptospirosis trên đàn gia súc và cộng đồng tại Việt Nam. Xác định rõ 2 mục tiêu, 8 nội dung triển khai, 4 đóng góp mới và ý nghĩa thực tiễn phục vụ chuyển giao sản xuất vắc xin. Bố cục luận án gồm 121 trang, 20 bảng, 34 hình, 4 bài báo công bố và 140 tài liệu tham khảo.

Chương 1. Đặc điểm xoắn khuẩn Leptospira và bệnh Leptospirosis

Tổng hợp cơ sở lý luận về đặc tính sinh học, phân loại học vi khuẩn Leptospira (20 loài gồm nhóm gây bệnh, hoại sinh và trung gian; hơn 260 serovar gây bệnh thuộc 24 serogroup). Phân tích cấu trúc hình thái (xoắn hình móc câu, kích thước rộng 0,1–0,2 µm, dài 6–20 µm, bước xoắn 0,5 µm), cơ chế xâm nhập qua da/niêm mạc, khả năng tồn tại trong môi trường đất ẩm (lên đến 180 ngày) và nước bề mặt. Đánh giá toàn diện các nhóm kháng nguyên màng ngoài (OmpL1, LipL32, LipL41, LigA, LigB, LipL21), cơ chế đáp ứng miễn dịch dịch thể và tế bào. Phân tích ưu nhược điểm của 4 thế hệ vắc xin (vắc xin sống nhược độc, vắc xin vô hoạt bacterin, vắc xin LPS, vắc xin protein tái tổ hợp) trên thế giới và tại Việt Nam.

Chương 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết đặc tính 5 chủng xoắn khuẩn lưu hành, hệ thống hóa chất, bộ kit sinh học phân tử, chủng vi khuẩn biểu hiện (E. coli DH10b, BL21), động vật thí nghiệm (thỏ, chuột lang, chuột nhắt trắng) và hệ thống máy móc chuyên dụng (máy PCR System 9700, máy giải trình tự ABI 3500, máy tạo nhũ Silverson L4RT). Trình bày chi tiết các quy trình thao tác chuẩn: nuôi cấy tăng sinh trong môi trường EMJH, tách chiết DNA, thiết kế 7 cặp mồi, quy trình PCR, giải trình tự Sanger, tạo dòng trên pJET1.2, biểu hiện trên pET32a, tinh sạch cột Ni-NTA, phản ứng Western blot, phản ứng MAT, phối chế nhũ dầu và các tiêu chuẩn kiểm nghiệm vắc xin (vô trùng, an toàn, hiệu lực bảo hộ).

Chương 3. Kết quả và thảo luận

Chương này trình bày toàn bộ các dữ liệu thực nghiệm thu được:

  • Định danh phân tử: Khuếch đại thành công đoạn gen 16S rRNA kích thước 550 bp từ 5 chủng nghiên cứu, giải trình tự Sanger và xây dựng cây phát sinh chủng loại khẳng định vị trí phân loại phân tử của các chủng Leptospira interrogans.
  • Sàng lọc gen kháng nguyên: Tiến hành PCR khuếch đại 6 gen kháng nguyên (OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB). Kết quả xác định gen LipL21 (560 bp) xuất hiện ổn định và đồng nhất trên toàn bộ 5 chủng xoắn khuẩn nghiên cứu. Phân tích tin sinh học cho thấy trình tự nucleotit và axit amin của LipL21 có độ bảo tồn cao, giàu các vùng epitope có tính kháng nguyên mạnh; cấu trúc 3D dự đoán qua I-TASSER cho độ tương đồng hình thái cao giữa các chủng.
  • Tạo dòng và tối ưu hóa biểu hiện: Tạo dòng thành công cấu trúc pJET1.2-LipL21 trong E. coli DH10b và chuyển sang vector pET32a trong E. coli BL21. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy cảm ứng cho thấy protein tái tổ hợp rLipL21 biểu hiện mạnh nhất ở nhiệt độ nuôi cấy 28°C, nồng độ cảm ứng IPTG thích hợp và thời gian thu hoạch sau cảm ứng tối ưu. Tinh sạch qua cột ái lực His-bind thu được protein rLipL21 đơn băng sắc nét trên gel SDS-PAGE.
  • Đánh giá sinh miễn dịch và chế tạo vắc xin: Protein rLipL21 tinh sạch phản ứng đặc hiệu với kháng thể trong phản ứng Western blot. Động vật thí nghiệm được tiêm kháng nguyên rLipL21 sinh kháng thể đặc hiệu cao, thể hiện qua phản ứng ngưng kết và phản ứng vi ngưng kết (MAT). Xác định công thức phối trộn kháng nguyên với chất bổ trợ nhũ dầu đạt độ đồng nhất cao qua máy tạo nhũ Silverson L4RT.
  • Sản xuất quy mô pilot và kiểm nghiệm: Chế tạo thành công 600 liều vắc xin tái tổ hợp rLipL21 nhũ dầu. Kiểm nghiệm đạt 100% các chỉ tiêu theo Tiêu chuẩn ngành: vô trùng (không tạp nhiễm vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí, nấm mốc, Mycoplasma, Salmonella), an toàn tuyệt đối trên động vật cảm nhiễm (không gây phản ứng cục bộ hay toàn thân), và hiệu lực bảo hộ cao sau thử thách công cường độc xoắn khuẩn sống (chuột tiêm vắc xin có tỷ lệ sống vượt trội, không tổn thương vi thể gan, thận so với nhóm đối chứng).

Chương 4. Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt các kết quả đạt được về mặt công nghệ, phân tử và kiểm nghiệm vắc xin tái tổ hợp. Đề xuất kiến nghị chuyển giao quy trình sản xuất cho đơn vị sản xuất dược phẩm thú y để triển khai quy mô công nghiệp.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

  1. Xây dựng bộ dữ liệu phân tử về các gen quyết định kháng nguyên tiềm năng (OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB) của 5 chủng xoắn khuẩn Leptospira interrogans lưu hành tại Việt Nam, chứng minh gen LipL21 là ứng viên thích hợp nhất nhờ tính bảo tồn và mật độ epitope cao.
  2. Thiết kế và tạo dòng thành công cấu trúc tái tổ hợp pET32a-LipL21, thiết lập quy trình biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp rLipL21 đạt độ tinh khiết cao trong hệ thống E. coli BL21.
  3. Hoàn thiện quy trình công nghệ chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis sử dụng kháng nguyên rLipL21 phối trộn chất bổ trợ nhũ dầu, đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn kiểm nghiệm vô trùng, an toàn và hiệu lực sinh kháng thể bảo hộ.
  4. Lần đầu tiên tại Việt Nam sản xuất thành công 600 liều vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do Leptospira interrogans ở quy mô pilot và kiểm chứng hiệu quả bảo hộ trên mô hình in vivo cũng như thử nghiệm thực địa.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

  • Đề xuất hoàn thiện hồ sơ đăng ký lưu hành và chuyển giao quy trình công nghệ sản xuất vắc xin tái tổ hợp rLipL21 cho Công ty Cổ phần Thuốc Thú y Trung ương VETVACO để nâng quy mô sản xuất công nghiệp, thay thế từng bước vắc xin vô hoạt truyền thống.
  • Đề xuất tiếp tục mở rộng nghiên cứu phối hợp đa kháng nguyên tái tổ hợp (kết hợp rLipL21 với rLipL32 hoặc rLigA) để phát triển vắc xin đa giá phòng hộ diện rộng hơn trên nhiều đối tượng gia súc khác nhau.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

  • Nghiên cứu tập trung giải quyết trên 5 chủng đại diện của loài Leptospira interrogans, chưa bao phủ toàn bộ các loài xoắn khuẩn gây bệnh khác thuộc chi Leptospira (như L. borgpetersenii, L. kirschneri).
  • Quy mô thử nghiệm dừng lại ở mức độ pilot (600 liều) và đánh giá đáp ứng miễn dịch trong phạm vi phòng thí nghiệm kết hợp thực địa ban đầu, cần thêm dữ liệu theo dõi thời gian bảo hộ dài hạn (trên 12–24 tháng) ở quần thể gia súc lớn.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

  • Đánh giá động lực kháng thể và độ bền miễn dịch bảo hộ của vắc xin rLipL21 theo các mốc thời gian sau tiêm (6, 12, 18 tháng) trên thực tế đàn bò sữa, lợn và chó nuôi.
  • Nghiên cứu các chất bổ trợ miễn dịch thế hệ mới nhằm tối ưu hóa liều lượng protein kháng nguyên cần thiết trong mỗi liều vắc xin.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên ngành hữu ích cho:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học, Thú y học: Tham khảo toàn bộ quy trình thiết kế mồi, kỹ thuật dòng hóa biểu hiện gen màng vi khuẩn, kỹ thuật tinh sạch protein tái tổ hợp qua cột ái lực và các phương pháp đánh giá miễn dịch học (Western blot, MAT, thử thách công cường độc).
  • Các viện nghiên cứu, doanh nghiệp sản xuất vắc xin và dược phẩm thú y: Tham khảo thông số công nghệ phối chế chất bổ trợ nhũ dầu bằng máy tạo nhũ công nghiệp, quy trình kiểm nghiệm vắc xin theo tiêu chuẩn ngành phục vụ sản xuất thực tiễn.
  • Cán bộ quản lý dịch tễ thú y và y tế dự phòng: Cung cấp bức tranh tổng quan về các serovar Leptospira lưu hành tại các vùng sinh thái ở Việt Nam phục vụ công tác giám sát dịch tễ học lây truyền từ động vật sang người.

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao gen LipL21 được chọn để sản xuất vắc xin tái tổ hợp thay vì các gen kháng nguyên khác?

Qua sàng lọc PCR trên 6 gen kháng nguyên tiềm năng (OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB), gen LipL21 (560 bp) là gen xuất hiện đồng nhất trên cả 5 chủng Leptospira interrogans nghiên cứu. Phân tích tin sinh học cho thấy trình tự LipL21 có tính bảo tồn rất cao, chứa nhiều vùng giàu epitope tạo đáp ứng miễn dịch mạnh và protein LipL21 là lipoprotein màng ngoài dồi dào, đóng vai trò yếu tố độc lực bảo tồn giữa các serovar.

2. Hệ vector và tế bào chủ nào được sử dụng để tạo dòng và biểu hiện gen LipL21?

Luận án sử dụng vector nhân dòng pJET1.2 (2974 bp) biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH10b để sàng lọc dòng mang gen đích. Sau đó, đoạn gen LipL21 được cắt chuyển bằng cặp enzyme giới hạn XhoI và EcoRV sang vector biểu hiện pET32a (5900 bp) và biến nạp vào tế bào chủ E. coli BL21 để cảm ứng sinh tổng hợp protein tái tổ hợp rLipL21 bằng IPTG.

3. Vắc xin tái tổ hợp của luận án được kiểm nghiệm theo những tiêu chuẩn nào?

Vắc xin dạng nhũ dầu được kiểm nghiệm đầy đủ theo Tiêu chuẩn ngành gồm: (1) Kiểm tra vô trùng (không tạp nhiễm vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí, nấm mốc, Mycoplasma, Salmonella); (2) Kiểm tra độ an toàn trên thỏ và chuột; (3) Kiểm tra hiệu lực sinh kháng thể thông qua phản ứng vi ngưng kết (MAT); và (4) Đánh giá hiệu quả bảo hộ sống/chết và bệnh lý vi thể gan, thận sau khi công cường độc xoắn khuẩn sống trên mô hình động vật.

4. Quy mô sản xuất thử nghiệm vắc xin trong luận án đạt bao nhiêu liều và ở đâu?

Nghiên cứu đã chế tạo thử nghiệm thành công 600 liều vắc xin tái tổ hợp rLipL21 nhũ dầu ở quy mô pilot tại Công ty Cổ phần Thuốc Thú y Trung ương VETVACO và tiến hành tiêm thử nghiệm đánh giá hiệu quả trên đàn động vật tại thực địa.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Nguyễn Tuấn Hùng đã giải quyết thành công bài toán công nghệ trong việc chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira interrogans tại Việt Nam. Nghiên cứu đã xác định gen kháng nguyên bảo tồn LipL21, thiết lập quy trình biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp rLipL21, đồng thời xây dựng hoàn chỉnh quy trình sản xuất vắc xin nhũ dầu đạt các tiêu chuẩn kiểm nghiệm ngành. Kết quả sản xuất và thử nghiệm 600 liều pilot chứng minh khả năng ứng dụng thực tiễn cao, tạo tiền đề chuyển giao công nghệ cho sản xuất vắc xin thú y công nghiệp trong nước.