Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh xoắn khuẩn Leptospira Interrogans

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của luận án

2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án

3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

4. Những đóng góp mới của luận án

5. Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án

6. Bố cục của luận án

1. CHƢƠNG 1: Đặc điểm xoắn khuẩn Leptospira và bệnh Leptospirosis

1.1. Đặc điểm sinh học của xoắn khuẩn Leptospira

1.1.1. Phân loại học

1.1.2. Cấu trúc hình thái

1.1.3. Đặc tính nuôi cấy xoắn khuẩn Leptospira

1.1.4. Sức đề kháng của mầm bệnh

1.1.5. Tính sinh miễn dịch

1.2. Đặc điểm dịch tễ học

1.2.1. Đường xâm nhập của mầm bệnh

1.2.2. Đặc tính gây bệnh của xoắn khuẩn Leptospira

1.3. Tình hình nghiên cứu bệnh Leptospirosis

1.3.1. Tình hình nghiên cứu bệnh Leptospirosis trên thế giới

1.3.2. Tình hình nghiên cứu bệnh Leptospirosis trên gia súc và người ở Việt Nam

1.4. Nghiên cứu hệ gen xoắn khuẩn Leptospira

1.4.1. Đặc điểm toàn bộ hệ gen xoắn khuẩn Leptospira

1.4.2. Đặc điểm hệ gen quyết định kháng nguyên của xoắn khuẩn Leptospira

1.4.3. Cơ chế tạo kháng thể trong cơ thể của xoắn khuẩn Leptospira

1.5. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis

1.5.1. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis trên thế giới

1.5.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis tại Việt Nam

2. CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

2.1.1. Trang thiết bị

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Tạo kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21 mang các epitope

2.2.2. Nuôi cấy, tăng sinh 5 chủng xoắn khuẩn Leptospira

2.2.3. Tách chiết DNA tổng số

2.2.4. Định lượng, kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA tổng số

2.2.5. Thiết kế cặp mồi của gen 16S rRNA và 6 gen quyết định kháng nguyên: OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, và LigB

2.2.6. Kỹ thuật PCR

2.2.7. Tinh sạch sản phẩm PCR

2.2.8. Giải trình tự gen bằng kỹ thuật Sanger

2.2.9. Xây dựng cây phát sinh chủng loại và định danh chính xác 5 chủng Leptospira về mặt phân tử

2.2.10. Xác định mức độ tương đồng về trình tự nucleotit và trình tự axit amin, các vùng giàu epitop trên các đoạn gen quyết định kháng nguyên

2.2.11. Phản ứng gắn đoạn gen đặc hiệu vào vector nhân dòng

2.2.12. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli bằng phương pháp sốc nhiệt

2.2.13. Tách chiết và định lượng DNA plasmid

2.2.14. Cắt vector nhân dòng mang đoạn gen đặc hiệu và vector biểu hiện bằng enzyme giới hạn

2.2.15. Tinh sạch sản phẩm cắt giới hạn

2.2.16. Gắn gen mã hóa protein LipL21 vào vector biểu hiện

2.2.17. Biểu hiện gen đích trong chủng E. Điện di DNA trên gel agarose

2.2.18. Điện di protein trên gel polyacrylamide có chất khử (SDS- PAGE)

2.2.19. Nuôi cấy tế bào vi khuẩn E. coli và thu protein tổng số trong phân đoạn dịch chiết và kết tủa tế bào

2.2.20. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký protein qua cột ái lực His-bind

2.2.21. Các kĩ thuật sử dụng gây miễn dịch cho thỏ tạo kháng thể đặc hiệu kháng protein tái tổ hợp rLipL21

2.2.22. Chuẩn bị dung dịch tiêm để gây miễn dịch

2.2.23. Gây miễn dịch tạo kháng thể kháng kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21

2.2.24. Kỹ thuật phản ứng ngưng kết kháng nguyên - kháng thể

2.2.25. Kỹ thuật phản ứng vi ngưng kết (Microscopic Agglutination Test: MAT)

2.2.26. Kĩ thuật Western Blot xác định kháng nguyên rLipL21

2.2.27. Kỹ thuật sản xuất vắc xin tái tổ hợp rLipL21

2.2.28. Kiểm tra tính sinh miễn dịch với hàm lượng protein tái tổ hợp rLipL21 khác nhau

2.2.29. Kỹ thuật tạo vắc xin tái tổ hợp rLipL21

2.2.30. Định liều tiêm vắc xin

2.2.31. Quy trình kiểm nghiệm vắc xin tái tổ hợp rLipL21

2.2.32. Đánh giá hiệu quả tạo miễn dịch

2.2.33. Chế tạo thử nghiệm 600 liều vacxin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis

2.2.34. Phân tích và xử lý kết quả trong nghiên cứu

2.2.35. Địa điểm tiến hành nghiên cứu

3. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nuôi cấy, định danh phân tử và xây dựng cây phát sinh chủng loại

3.1.1. Nuôi cấy, tăng sinh xoắn khuẩn

3.1.2. Tách chiết DNA tổng số

3.1.3. Nhân gen 16S rRNA với cặp mồi đặc hiệu

3.1.4. Tinh sạch sản phẩm PCR của gen 16S rRNA

3.1.5. Giải trình tự gen 5 chủng xoắn khuẩn

3.1.6. Xây dựng cây phát sinh chủng loại

3.2. Xác định các gen quyết định kháng nguyên trên 5 chủng và vùng giàu epitop của gen

3.2.1. Nhân gen với các cặp mồi của 6 gen quyết định kháng nguyên

3.2.2. Tinh sạch và giải trình tự đoạn gen quyết định kháng nguyên xuất hiện trên cả 5 chủng xoắn khuẩn

3.3. Xác định trình tự nucleotit, trình tự axit amin và vùng giàu epitop của các gen quyết định kháng nguyên LipL21

3.3.1. Trình tự nucleotit

3.3.2. So sánh trình tự axit amin

3.3.3. Xác định vùng giàu epitop

3.4. Nhân dòng gen quyết định kháng nguyên và biểu hiện protein LipL21

3.4.1. Nhân dòng đoạn gen quyết định kháng nguyên vào vector pJET1.2 trong hệ biểu hiện E

3.4.2. Chèn gen LipL21 vào vector biểu hiện pET32a

3.4.3. Biểu hiện và tối ưu các điều kiện biểu hiện protein tái tổ hợp LipL21

3.5. Kiểm tra tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp rLipL21

3.6. Qui trình chế tạo vắc xin tái tổ hợp rLipL21 phòng bệnh Leptospirosis

3.6.1. Xác định chất bổ trợ phối trộn đặc hiệu với kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21 để tạo vắc xin tái tổ hợp

3.6.2. Định liều tiêm vắc xin tái tổ hợp rLipL21 nhũ dầu cho động vật thí nghiệm

3.6.3. Kiểm nghiệm vắc xin tái tổ hợp rLipL21

3.6.4. Đánh giá chỉ tiêu vô trùng

3.6.5. Đánh giá chỉ tiêu an toàn

3.6.6. Đánh giá chỉ tiêu hiệu lực

3.6.7. Đánh giá hiệu quả tạo miễn dịch trên động vật thí nghiệm

3.7. Sản xuất vắc xin và các đánh giá khác với vắc xin tái tổ hợp rLipL21

3.7.1. Sản xuất 600 liều vắc xin

3.7.2. Kiểm tra các chỉ tiêu của vacxin theo tiêu chuẩn ngành

3.7.3. Kết quả kiểm tra tạp nhiễm các loại vi khuẩn và nấm mốc

3.7.4. Kết quả kiểm tra an toàn

3.7.5. Kết quả kiểm tra hiệu lực

4. CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kiến nghị

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

I. Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp

Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira interrogans là một bước đột phá trong lĩnh vực y học và công nghệ sinh học. Vắc xin tái tổ hợp được thiết kế dựa trên các gen quyết định kháng nguyên của Leptospira interrogans, giúp tạo ra miễn dịch đặc hiệu và hiệu quả cao. Quá trình nghiên cứu bao gồm việc nuôi cấy, định danh phân tử, và xây dựng cây phát sinh chủng loại của các chủng Leptospira. Các gen quyết định kháng nguyên như LipL21 được nhân dòng và biểu hiện trong hệ thống E. coli, tạo ra protein tái tổ hợp có khả năng kích thích miễn dịch.

1.1. Công nghệ tái tổ hợp trong chế tạo vắc xin

Công nghệ tái tổ hợp đóng vai trò quan trọng trong việc chế tạo vắc xin phòng bệnh. Các gen quyết định kháng nguyên của Leptospira interrogans được tách chiết, nhân dòng, và biểu hiện trong các hệ thống tế bào chủ như E. coli. Quá trình này giúp tạo ra các protein tái tổ hợp có tính kháng nguyên cao, đảm bảo an toàn và hiệu quả trong việc kích thích hệ miễn dịch. Các protein tái tổ hợp như rLipL21 được tinh sạch và sử dụng làm thành phần chính trong vắc xin phòng Leptospira.

1.2. Ứng dụng của vắc xin tái tổ hợp

Vắc xin tái tổ hợp không chỉ giúp phòng ngừa bệnh xoắn khuẩn mà còn có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong y học và thú y. Các nghiên cứu cho thấy vắc xin phòng Leptospira tái tổ hợp có khả năng tạo miễn dịch cao hơn so với các loại vắc xin truyền thống. Điều này mở ra cơ hội phát triển các loại vắc xin thế hệ mới với độ an toàn và hiệu quả vượt trội, đặc biệt trong bối cảnh dịch bệnh do Leptospira đang gia tăng trên toàn cầu.

II. Bệnh xoắn khuẩn Leptospirosis

Bệnh xoắn khuẩn Leptospirosis là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, gây ra bởi vi khuẩn Leptospira interrogans. Bệnh lây truyền qua tiếp xúc với nước hoặc đất bị ô nhiễm bởi nước tiểu của động vật nhiễm bệnh. Leptospirosis có thể gây ra các triệu chứng nghiêm trọng như sốt cao, vàng da, suy thận, và thậm chí tử vong nếu không được điều trị kịp thời. Việc phát triển vắc xin phòng bệnh là cần thiết để kiểm soát và ngăn ngừa sự lây lan của bệnh.

2.1. Đặc điểm dịch tễ học của Leptospirosis

Bệnh xoắn khuẩn có tỷ lệ lây nhiễm cao ở các khu vực có điều kiện vệ sinh kém và môi trường ẩm ướt. Leptospira interrogans có thể tồn tại lâu trong môi trường tự nhiên, làm tăng nguy cơ lây nhiễm. Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy sự đa dạng về serovar của Leptospira gây bệnh, đòi hỏi các giải pháp phòng ngừa hiệu quả như vắc xin tái tổ hợp.

2.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng Leptospirosis

Trên thế giới, các nghiên cứu về vắc xin phòng Leptospira đã tập trung vào việc tối ưu hóa công thức, chất bổ trợ, và liều lượng để đạt hiệu quả cao nhất. Tại Việt Nam, việc nghiên cứu và sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh xoắn khuẩn vẫn còn hạn chế, đòi hỏi sự đầu tư và phát triển mạnh mẽ hơn trong tương lai.

III. Kỹ thuật và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp sử dụng các kỹ thuật tái tổ hợp tiên tiến như PCR, nhân dòng gen, và biểu hiện protein. Các gen quyết định kháng nguyên của Leptospira interrogans được nhân dòng vào vector pJET1.2 và biểu hiện trong hệ thống E. coli. Quá trình tinh sạch protein tái tổ hợp được thực hiện bằng phương pháp sắc ký ái lực, đảm bảo tính kháng nguyên và hiệu quả miễn dịch.

3.1. Nhân dòng và biểu hiện gen

Các gen quyết định kháng nguyên như LipL21 được nhân dòng vào vector pJET1.2 và biểu hiện trong E. coli. Quá trình này bao gồm thiết kế mồi, phản ứng PCR, và tinh sạch sản phẩm. Protein tái tổ hợp rLipL21 được tối ưu hóa điều kiện biểu hiện để đạt hiệu suất cao nhất.

3.2. Tinh sạch và kiểm tra protein tái tổ hợp

Protein tái tổ hợp rLipL21 được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực và kiểm tra tính kháng nguyên thông qua các kỹ thuật như Western blot và phản ứng ngưng kết. Các kết quả cho thấy rLipL21 có khả năng kích thích miễn dịch mạnh, là ứng cử viên tiềm năng cho vắc xin phòng Leptospira.

Luận án tiến sĩ sinh học: Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira Interrogans