phần Mở đầu 4 trang; Tổng quan tài liệu 23 trang; Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 27 trang; Kết quả và thảo luận 47 4 trang; Kết luận và kiến nghị 2 trang; Danh mục công trình của tác giả 1 trang; Tài liệu tham khảo 17 trang gồm 140 tài liệu; Trong luận án có 20 bảng, 34 hình và 4 bài báo trong phần Phụ lục. Đặc điểm xoắn khuẩn Leptospira và bệnh Leptospirosis 1. Đặc điểm vi sinh vật học của xoắn khuẩn Leptospira 1. Phân loại học Theo khóa phân loại khoa học Leptospira đƣợc xếp vào Giới: Bacteria Ngành: Spirochaetes Lớp: Spirochaetes Bộ: Spirochaetales Họ: Leptospiraceae Giống: Leptospira Dựa trên sự tƣơng đồng của bộ gen, các xoắn khuẩn thuộc giống Leptospira spp.
đã đƣợc chia thành 20 loài [1], bao gồm những loài gây bệnh và không gây bệnh (hoại sinh): Những loài xoắn khuẩn gây bệnh: L. Những loài hoại sinh (không gây bệnh): L. Trƣớc năm 1989, chi Leptospira đƣợc chia thành hai loài Leptospira interrogans bao gồm tất cả các chủng gây bệnh và Leptospira biflexa gồm các chủng hoại sinh (không gây bệnh). Sự phân chia này dựa trên các đặc tính kiểu hình và sự sinh trƣởng của chúng nhƣ các chủng hoại sinh có khả năng mọc đƣợc ở nhiệt độ 11-13oC và sinh trƣởng với sự có mặt của 8-azaguanine (225 μg/ml) [2].
Một số loài trung gian gây bệnh hoặc hoại sinh: L. Tuy nhiên, cũng có một số loài lại bao gồm cả các chủng xoắn khuẩn gây bệnh và không gây bệnh. Ngày nay hệ thống phân loại mới dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử và khác hẳn với hệ thống phân loại trƣớc đây dựa trên khảo sát huyết thanh học [5]. Các serovar Leptospira gây bệnh đƣợc xếp vào các nhóm khác nhau dựa vào mối quan hệ kháng nguyên, thông qua việc xác định bằng phản ứng ngƣng kết hay 6 theo kiểu hấp phụ ngƣng kết chéo với kháng nguyên tƣơng đồng [3].
Mặc dù không dựa vào nhóm huyết thanh để phân loại Leptospira nhƣng chúng rất có ý nghĩa về mặt dịch tễ học. Các nhóm huyết thanh của L. interrogans và một số phân loài phổ biến đƣợc thể hiện qua Bảng 1. Nhóm huyết thanh và một số serovar của L.
interrogans Số TT Nhóm Serovar (s) huyết thanh 1 Icterohaemorrhagiae icterohaemorrhagiae, copenhageni, lai, zimbabwe 2 Hebdomadis hebdomadis, jules, kremastos 3 Autumnalis autumnalis, fortbragg, bim, weerasinghe 4 Pyrogenes pyrogenes 5 Bataviae bataviae 6 Gryppotyphosa gryppotyphosa, canalzonae, ratnapura 7 Canicola canicola 8 Australis australis, bratislava, lora 9 Pomona pomona 10 Javanica javanica 11 Sejroe sejroe, saxkoebing, hardjo 12 Panama panama, mangus 13 Cynopteri cynopteri 14 Djasiman djasiman 15 Sarmin sarmin 16 Mini mini, georgia 17 Tarassovi tarassovi 18 Ballum ballum, aroborea 19 Celledoni celledoni 20 Louisiana louisiana, lanka 7 Số TT Nhóm Serovar (s) huyết thanh 21 Ranarum ranarum 22 Manhao manhao 23 Shermani shermani 24 Hurstbridge hurstbridge [3]. Theo các nhà nghiên cứu huyết thanh học, hiện nay có trên 260 serovar gây bệnh đƣợc xếp vào 24 serogroup huyết thanh và 60 serovar thuộc nhóm hoại sinh [6]. Các serovar gây bệnh đƣợc phân chia thành các serogroup dựa trên mối quan hệ kháng nguyên đƣợc xác định bằng phản ứng ngƣng kết và tiếp theo đƣợc chia thành các serovar theo kiểu hấp thụ ngƣng kết. Việc phân loại kiểu hình của Leptospira đã đƣợc thay thế bằng kiểu gen, trong đó gen phổ biến bao gồm tất cả các serovar của cả L.
Hiện tại, các serovar gây bệnh còn đƣợc tìm thấy trong 10 loài Leptospira interrogans, L. Trong đó, một serovar mới đã đƣợc bổ sung L. fainei serovar Hurstbridge [7], Hệ thống phân loại mới dễ bị lẫn lộn bởi vì nhiều serovar và serogroup gây bệnh cũng nhƣ không gây bệnh có thể nằm trong cùng một loài, ngƣợc lại một serovar hoặc serogroup cũng có thể nằm trong nhiều loài khác nhau. Điều này cho thấy không có sự tƣơng đồng giữa hệ thống phân loại dựa trên cấu trúc kháng nguyên bề mặt và hệ thống phân loại dựa trên cấu trúc gen.
Sự nhận dạng và phân loại đến loài trong chi Leptospira là rất quan trọng, bởi vì chúng có tính gây bệnh trên các loài động vật khác nhau. Việc tái phân loại Leptospira dựa trên nền tảng kiểu gen là chính xác về mặt danh pháp và cung cấp cơ sở vững chắc cho định loại xoắn khuẩn này trong tƣơng lai. Bên cạnh đó, việc phân loại dựa vào cơ sở phân tử cũng gặp một số khó khăn đối với các nhà nghiên cứu lâm sàng, bởi vì hệ thống này không tƣơng hợp rõ ràng với hệ thống serovar (chủng)/serogroups (nhóm huyết thanh) lâu nay đã đƣợc sử dụng trong chẩn đoán xác định xoắn khuẩn Leptospira và trong các nghiên cứu về dịch tễ học [8]. 8 Hiện nay một số kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc ứng dụng để xác định và mô tả đặc điểm của Leptospira spp.
đã xác định đƣợc 20 loài Leptospira spp. trong đó có 9 loài Leptospira gây bệnh [6]. Việc phân loại này dựa trên kết quả phân tích phát sinh loài, gen 16S rRNA đƣợc xem nhƣ thử nghiệm sàng lọc ban đầu để xác định Leptospira trong các mẫu lâm sàng nghi ngờ nhiễm Leptospira [9, 10]. Cấu trúc hình thái Leptospira là những vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, có hình móc câu, xoắn, chuyển động không theo quy luật nào, có thể di chuyển thẳng, xoay tròn, theo hình sóng… Leptospira có kích thƣớc: khoảng rộng 0,1-0,2 µm; dài 6-20 µm, khoảng cách giữa các vòng xoắn là 0,5 µm [3].
Vi khuẩn bắt màu nâu đen với phƣơng pháp nhuộm thấm bạc, bộ phận di động của vi khuẩn gồm một trục ở giữa và thân xoắn nhƣ lò xo quanh trục. Ngoài cùng có một vỏ mềm co giãn đƣợc chứa nhiều kháng nguyên, tiếp theo là màng bao bọc tế bào chất bao gồm 3-5 lớp, ở giữa là nhân không có màng ngăn cách với nguyên sinh chất đảm nhận chức năng di truyền. Do có cấu trúc đặc biệt nhƣ vậy nên Leptospira vận động rất uyển chuyển và có khả năng co giãn dễ dàng, chúng có thể chui qua da, niêm mạc của gia súc hoặc của ngƣời khi ngâm nƣớc hoặc có vết trầy xƣớc. Khi cho qua lọc Seitz với kích thƣớc lỗ lọc 0,1-0,45 µm, hầu hết các vi khuẩn đều bị giữ lại nhƣng chỉ có xoắn khuẩn Leptospira có thể chui qua đƣợc dễ dàng.
Hình dạng Leptospira interrogans dƣới kính hiển vi điện tử quét [11]. Đặc tính nuôi cấy xoắn khuẩn Leptospira Leptospira có thể phát triển trên môi trƣờng nuôi cấy nhân tạo. Vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ thích hợp 28-30oC. pH hơi kiềm 7,2 – 7,5 và thời gian phân 9 chia của mỗi thế hệ kéo dài khoảng 7-10 ngày đối với các chủng mới phân lập, do vậy khó phát hiện bằng phƣơng pháp nuôi cấy thông thƣờng ở phòng thí nghiệm.
Môi trƣờng nuôi cấy xoắn khuẩn Leptospira cần phải có huyết thanh thỏ tƣơi nhƣ môi trƣờng Terskich, môi trƣờng Korthof. Trong các môi trƣờng này xoắn khuẩn Leptospira mọc chậm khoảng 1 tuần, làm môi trƣờng đục nhẹ. Ngoài ra vi khuẩn có thể phát triển trong phôi gà. Xoắn khuẩn có thể phát triển trong môi trƣờng Ellinghausen- McCullough- Johnson-Harris (EMJH) nhƣng sự phát triển của Leptospira rất chậm, có đôi khi kéo dài đến 3 tháng.
Ở nhiệt độ 28-30oC có thể nhận thấy đƣợc sự phát triển của các chủng gây bệnh sau 4-7 ngày nuôi cấy, còn sự phát triển của các chủng hoại sinh chỉ sau 2-3 ngày ở nhiệt độ 11-130C. Do đó có thể dựa vào khả năng phát triển ở 130C để phân biệt các loài Leptospira hoại sinh hay loài Leptospira gây bệnh [3]. Trong cùng một điều kiện môi trƣờng nuôi cấy những loài hoại sinh sẽ phát triển nhanh hơn các loài gây bệnh do chúng thƣờng sống trong môi trƣờng nƣớc đọng hay hòa lẫn trong đất ẩm cho nên khi nuôi cấy phải thƣờng xuyên kiểm tra, ít nhất mỗi tuần 1 lần dƣới kính hiển vi nền đen để có đƣợc kết quả chính xác [12]. Leptospira interrogans dƣới KHV nền đen (x400) [13].
Trong quá trình nuôi cấy Leptospira, để tránh sự vấy nhiễm của các vi khuẩn trong giai đoạn đầu nuôi cấy, đặc biệt các mẫu có nguồn gốc từ động vật bệnh có biểu hiện triệu chứng lâm sàng hoặc từ môi trƣờng, cần bổ sung thêm kháng sinh 5- fluorouracil vào môi trƣờng nuôi cấy làm hạn chế sự phát triển của các vi khuẩn vấy nhiễm khác nhƣng không làm giảm sự tăng trƣởng của Leptospira [3, 11]. Sức đề kháng của mầm bệnh 10 Sự tồn tại của Leptospira gây bệnh trong môi trƣờng phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ pH hay nhiệt độ môi trƣờng. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, Leptospira trong nƣớc ở nhiệt độ phòng vẫn duy trì đƣợc trong nhiều tháng ở pH=7,2 đến pH=8,0. Trong nƣớc thải cống rãnh Leptospira có thể sống đƣợc trong vài tuần lễ.
Ở trong đất có tính axit (pH= 6,2) Leptospira serovar Australis có thể sống sau 7 tuần và đất ngập nƣớc mƣa sống đƣợc ít nhất 3 tuần. Trong đất ẩm ƣớt Leptospira có thể tồn tại 180 ngày và nhiều tháng trong nƣớc mặt và khi đất bị ô nhiễm nƣớc tiểu từ chuột nhiễm Leptospira, Leptospira sống đƣợc khoảng 2 tuần [3]. Tính sinh miễn dịch Miễn dịch đối với Leptospira là miễn dịch đặc hiệu cho từng nhóm huyết thanh, một số trƣờng hợp cho thấy có miễn dịch chéo giữa L. Khi mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể gia súc, xoắn khuẩn có tác động lên hệ miễn dịch của cơ thể ký chủ, kích thích cơ thể tạo ra kháng thể.
Kháng thể là một globulin miễn dịch có phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên. Globulin miễn dịch đƣợc chia làm 5 nhóm IgA, IgG, IgE, IgM, và IgD, trong đó IgG và IgM là quan trọng nhất. Thƣờng thì khi có tác động của kháng nguyên, sau 7 ngày trong cơ thể đã xuất hiện IgM và đạt cao nhất vào ngày thứ 10, trong khi IgG xuất hiện sau khi nhiễm mầm bệnh vài tuần và đạt cao nhất vào ngày thứ 20-30, sau đó hàm lƣợng kháng thể này giảm dần. Kháng thể IgM không đặc hiệu, có thể ngƣng kết với nhiều chủng huyết thanh, trong khi IgG có đặc tính đặc hiệu cao đối với từng chủng huyết thanh gây bệnh.
Việc xuất hiện kháng thể IgM và IgG cho phép ta suy diễn về các giai đoạn của bệnh. Thời gian tồn tại của kháng thể động vật dài hay ngắn tùy thuộc từng loại kháng thể và tính chất cùa bệnh. Tuy nhiên, do Leptospira thƣờng khu trú ở hệ thống ống lƣợn của thận, dịch não tủy, dịch của mắt và trong lòng ống cơ quan sinh dục cho nên tác động của kháng thể ở những nơi này rất hạn chế. Điều này giải thích cho sự tồn tại dai dẳng của mầm bệnh ở con vật bị nhiễm [14].
Việc chủng ngừa Leptospira bằng vắc xin có hiệu quả làm giảm tỷ lệ nhiễm, nhƣng không bảo vệ hoàn toàn chống lại sự nhiễm do có nhiều chủng huyết thanh gây bệnh khác nhau.