Luận án tiến sĩ phân lập tuyển chọn vi khuẩn sợi actinobacteria từ hải miên vùng biển hà tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh vật gây bệnh

Luận án tiến sĩ phân tích phân lập tuyển chọn vi khuẩn sợi actinobacteria từ hải miên vùng biển hà tiên và xác định hợp chất, xây dựng cơ sở lý luận, kiểm chứng thực nghiệm, đóng

• Tác giả: Trần Vũ Phương
• Người hướng dẫn: GS. Cao Ngọc Điệp
• Trường học: Trường Đại Học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Phân Lập Và Tuyển Chọn Vi Khuẩn Actinobacteria Từ Hải Miên Hà Tiên Với Khả Năng Kháng Vi Sinh Vật
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Tiên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• LỜI CAM ĐOAN
• MỤC LỤC
• DANH SÁCH BẢNG
• DANH SÁCH HÌNH
• TỪ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
• 1.1. Mục tiêu đề tài
• 1.2. Mục tiêu tổng quát
• 1.3. Mục tiêu cụ thể
• 1.4. Đối tượng nghiên cứu
• 1.5. Phạm vi nghiên cứu
• 1.6. Nội dung nghiên cứu
• 1.7. Đóng góp mới của luận án
• 1.8. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án
• 1.8.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.8.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Phân loại khoa học và phân bố
• 2.2. Đặc điểm cấu tạo
• 2.3. Đặc điểm sinh sản, sinh trưởng và phát triển của hải miên
• 2.3.1. Sự sinh sản vô tính
• 2.3.2. Sự sinh sản hữu tính
• 2.4. Đa dạng VSV sống cùng với hải miên
• 2.4.1. Vi khuẩn liên kết với hải miên
• 2.4.2. Nấm và tảo liên kết với hải miên
• 2.4.3. VKS liên kết với hải miên
• 2.4.4. Cổ vi khuẩn (Archaea) liên kết với hải miên
• 2.5. Vi khuẩn sợi (xạ khuẩn) (Actinobacteria)
• 2.5.1. Phân bố của VKS trong tự nhiên
• 2.5.2. Đặc điểm sinh học của VKS
• 2.5.3. Sự hình thành của bào tử VKS
• 2.5.4. Các phương pháp nuôi cấy để thu nhận kháng sinh ở VKS
• 2.6. Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ VKS
• 2.6.1. Khái quát về các con đường sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học
• 2.6.2. Phân loại các kháng sinh từ VKS
• 2.6.3. Những hợp chất có hoạt tính sinh học hình thành từ VKS
• 2.6.4. Một số nhóm chất có hoạt tính kháng khuẩn tiêu biểu từ VKS Streptomyces sp. có nguồn gốc từ biển
• 2.7. Một số VSV gây bệnh
• 2.7.1. Vi khuẩn Bacillus cereus
• 2.7.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus
• 2.7.3. Vi khuẩn Escherichia coli
• 2.7.4. Vi khuẩn Salmonella
• 2.7.5. Nấm Candida albicans
• 2.8. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 3. CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Phương tiện nghiên cứu
• 3.2.1. Nguyên vật liệu
• 3.2.2. Thiết bị - dụng cụ
• 3.3. Hóa chất - môi trường
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Thu thập và xử lý mẫu
• 3.4.2. Phân lập và nuôi cấy VKS
• 3.4.2.1. Mục tiêu thí nghiệm
• 3.4.2.2. Sơ đồ quy trình phân lập VKS từ hải miên
• 3.4.2.3. Các bước tiến hành thí nghiệm
• 3.5. Các chỉ tiêu theo dõi
• 3.6. Đánh giá khả năng kháng khuẩn
• 3.6.1. Mục tiêu thí nghiệm
• 3.6.2. Sơ đồ quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn
• 3.6.3. Các bước tiến hành thí nghiệm
• 3.6.4. Chỉ tiêu theo dõi
• 3.7. Phân tích kết quả
• 3.8. Nhận diện VKS bằng phương pháp sinh học phân tử
• 3.8.1. Mục tiêu thí nghiệm
• 3.8.2. Các bước tiến hành thí nghiệm
• 3.8.3. Phân tích kết quả
• 3.9. Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS
• 3.9.1. Mục tiêu thí nghiệm
• 3.9.2. Các bước tiến hành thí nghiệm
• 3.9.3. Phân tích kết quả
• 3.10. Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ VKS tiềm năng được tuyển chọn
• 3.10.1. Mục tiêu thí nghiệm
• 3.10.2. Chuẩn bị dịch nuôi cấy VKS
• 3.10.3. Chiết tách các chất từ dịch nuôi cấy VKS với ethyl acetate
• 3.10.4. Phương pháp sắc ký cột
• 3.11. Xác định cấu trúc hóa học bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
• 3.12. Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ (GC -MS)
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Các dòng VKS phân lập được từ hải miên
• 4.1.1. Số lượng, nguồn gốc các dòng VKS phân lập được
• 4.1.2. Đặc điểm các dòng VKS phân lập được
• 4.1.2.1. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng VKS phân lập được
• 4.2. Đặc điểm tế bào của các dòng VKS phân lập được
• 4.3. Khả năng kháng khuẩn của các dòng VKS phân lập được
• 4.4. Tuyển chọn và định danh các dòng VKS phân lập được
• 4.5. Nhận diện các gen PKS-I, PKS-II và NRPS ở các dòng VKS
• 4.6. Chất kháng khuẩn được sinh ra từ VKS
• 4.6.1. Chất kháng khuẩn từ S
• 4.6.1.1. Kết quả phân tích cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
• 4.6.1.2. Kết quả phân tích sắc ký ghép khối phổ (GC-MS)
• 4.6.2. Chất kháng khuẩn từ M
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Phụ lục 1: Một số hình của thí nghiệm
• 1. Hình ảnh thu mẫu hải miên
• 2. Hình một số mẫu hải miên thu tại các địa điểm
• Phụ lục 2: Ký hiệu, nguồn gốc các dòng VKS phân lập
• Phụ lục 3: Đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của các dòng VKS
• Phụ lục 4: Kết quả đo vòng kháng khuẩn của các dòng VKS đối với các VSV thử nghiệm (mm)
• Phụ lục 5: Kết quả định danh 23 VKS tuyển chọn
• 5.1. Phổ điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR sử dụng cặp
• 5.2. Trình tự đoạn gen và kết quả so sánh với dữ liệu ngân hàng gen của 23 dòng VKS được tuyển chọn
• 5.3. Kết quả định danh của 23 dòng VKS tuyển chọn
• Phụ lục 6: Kết quả khảo sát sự hiện diện các gen PKS-I, PKS-II và NRPS ở 23 dòng VKS tuyển chọn
• 6.1. Phổ điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi A3F/A7R nhân bản cho gen NRPS (700–800 bp) của 23 dòng VKS tuyển chọn
• 6.2. Phổ điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi K1F/M6R nhân bản cho gen PKS-I (1.400 bp) của 23 dòng VKS tuyển chọn
• 6.3. Phổ điện di trên gel aga rose của sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi KSαF/KSαR nhân bản cho gen PKS-II (600 bp) của 23 dòng VKS tuyển chọn
• Phụ lục 7: Kết quả phân tích cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) của chất được tinh sạnh từ S
• 7.1. Phổ MS của hợp chất ND1.7a
• 7.2. Phổ proton của hợp chất ND1.7a
• 7.3. Phổ carbon 13 của hợp chất ND1.7a
• 7.4. Phổ DEPT của hợp chất ND1.7a
• 7.5. Phổ HSQC của hợp chất ND1.7a
• 7.6. Phổ HMBC của hợp chất ND1.7a
• Phụ lục 8 : Kết quả phân tích sắc ký ghép khối phổ (GC -MS) các chất chiết xuất từ dòng VKS S
• 8.1. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS S.7a phân đoạn hexane -acetone
• 8.2. Phổ MS hợp chất 2 -Pentanone, 4-hydroxy-4-methyl ở phút 4,64
• 8.3. Phổ MS hợp chất cyclohexasiloxane, dodecamethyl ở phút 13,15
• 8.4. Phổ MS hợp chất cycloheptasiloxane, tetradecamethyl ở phút 15,803
• 8.5. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS S.7a phân đoạn acetone -methanol
• 8.6. Phổ MS hợp chất oxime-, methoxy-phenyl ở phút 5,09
• 8.7. Phổ MS hợp chất hexanedioic acid, bis(2-ethylhexyl) ester ở phút 30,82
• 8.8. Phổ MS hợp chất diisooctyl phthalate ở phút 33,07
• Phụ lục 9 : Kết quả phân tích sắc ký ghép khối phổ (GC -MS) các chất chiết xuất từ dòng VKS M
• 9.1. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M
• 9.2. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M
• 9.3. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M
• 9.4. Phổ GC-MS của dung môi acetone
• 9.5. Bảng tổng hợp kết quả giải phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M
• Phụ lục 10: Kết quả phân tích thống kê
• 10.1. Kết quả phân tích thống kê khả năng kháng của các dòng VKS phân lập với các VSV thử nghiệm
• 10.2. Kết quả phân tích thống kê khả năng kháng của 23 dòng VKS được tuyển chọn với các VSV thử nghiệm

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Luận án này tập trung vào việc phân lập và tuyển chọn vi khuẩn actinobacteria từ hải miên ở vùng biển Hà Tiên. Mục tiêu chính là xác định các dòng vi khuẩn có khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh. Nghiên cứu đã thu thập 198 dòng vi khuẩn, trong đó 130 dòng cho thấy khả năng kháng lại ít nhất một trong năm loài vi sinh vật được thử nghiệm. Kết quả cho thấy sự đa dạng sinh học cao của các dòng vi khuẩn này, mở ra hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực biotechnology và biological activity.

1.1 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu của nghiên cứu là phân lập và tuyển chọn các dòng actinobacteria từ hải miên có khả năng sản xuất các hợp chất kháng vi sinh vật. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về hệ sinh thái của hải miên mà còn có thể dẫn đến việc phát triển các sản phẩm sinh học mới có giá trị trong y học.

1.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng trong việc phát triển các loại thuốc kháng sinh mới từ các hợp chất sinh học được sản xuất bởi actinobacteria. Điều này có thể giúp giải quyết vấn đề kháng thuốc hiện nay, đồng thời bảo vệ sức khỏe con người. Việc khai thác biodiversity từ hải miên cũng góp phần bảo tồn và phát triển bền vững nguồn tài nguyên sinh học.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp hiện đại để phân lập vi khuẩn từ mẫu hải miên. Các mẫu được thu thập từ vùng biển Hà Tiên và được xử lý bằng các phương pháp nuôi cấy chọn lọc. Kết quả cho thấy 198 dòng vi khuẩn được phân lập, trong đó 130 dòng có khả năng kháng lại ít nhất một trong năm loài vi sinh vật thử nghiệm. Phương pháp giải trình tự gen được sử dụng để xác định các dòng vi khuẩn tiềm năng, từ đó đánh giá khả năng kháng sinh của chúng.

2.1 Quy trình phân lập

Quy trình phân lập bao gồm việc thu thập mẫu, nuôi cấy và đánh giá khả năng kháng khuẩn. Các dòng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường thích hợp và được kiểm tra khả năng kháng lại các vi sinh vật gây bệnh. Kết quả cho thấy sự hiện diện của nhiều dòng vi khuẩn có khả năng kháng mạnh, điều này cho thấy tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm sinh học.

2.2 Phân tích gen

Phân tích gen được thực hiện để xác định các dòng vi khuẩn có khả năng sản xuất hợp chất kháng sinh. Các gen PKS-I, PKS-II và NRPS được kiểm tra để đánh giá khả năng sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học. Kết quả cho thấy sự hiện diện của các gen này trong nhiều dòng vi khuẩn, điều này mở ra khả năng phát triển các sản phẩm kháng sinh mới.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy 23 dòng vi khuẩn được tuyển chọn có khả năng kháng lại ít nhất hai loại vi sinh vật thử nghiệm. Các dòng vi khuẩn này thuộc bốn họ khác nhau, bao gồm Actinomycetaceae, Microbacteriaceae, Nocardiaceae và Gordoniaceae. Sự khác biệt về tỷ lệ hiện diện các gen chỉ thị sản xuất các chất có hoạt tính sinh học được xác định, cho thấy tiềm năng lớn trong việc phát triển các hợp chất kháng sinh mới từ actinobacteria.

3.1 Đặc điểm các dòng vi khuẩn

Các dòng vi khuẩn được phân lập có đặc điểm sinh học đa dạng, cho thấy khả năng thích nghi cao với môi trường sống. Việc phân tích khả năng kháng khuẩn cho thấy một số dòng có khả năng kháng mạnh đối với các vi sinh vật gây bệnh, điều này chứng tỏ tiềm năng ứng dụng trong y học.

3.2 Hợp chất sinh học

Nghiên cứu đã xác định được nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học từ các dòng vi khuẩn được tuyển chọn. Các hợp chất này đã được công bố có khả năng kháng nấm và kháng khuẩn, mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc phát triển các loại thuốc kháng sinh từ nguồn tài nguyên sinh học tự nhiên.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Khủng hoảng kháng kháng sinh toàn cầu cùng sự gia tăng nhanh chóng của các chủng vi sinh vật đa kháng thuốc đang đặt nền y học hiện đại trước nguy cơ bước vào kỷ nguyên “hậu kháng sinh” (Alanis, 2005). Xạ khuẩn (Actinobacteria), đặc biệt là chi Streptomyces, từ lâu đã là nguồn cung cấp hơn 80% các hợp chất kháng sinh tự nhiên được ứng dụng trong lâm sàng (Aslan, 1999; Bérdy, 2005). Tuy nhiên, việc tái phát hiện các hợp chất cũ từ xạ khuẩn trên cạn ngày càng tăng cao, thúc đẩy xu hướng chuyển dịch nghiên cứu sang các hệ sinh thái biển sâu và vi sinh vật cộng sinh với động vật không xương sống (Taylor et al., 2007; Subramani & Aalbersberg, 2012). Trong số đó, hải miên (bọt biển, Sponges) – sinh vật đa bào cổ xưa xuất hiện hơn 580 triệu năm trước (Li et al., 1998) – sở hữu hệ vi sinh vật cộng sinh chiếm tới 40–50% sinh khối cơ thể (Usher et al., 2004; Hentschel et al., 2006).

Khoảng trống nghiên cứu (Research gap) then chốt nằm ở việc nguồn tài nguyên xạ khuẩn cộng sinh từ hải miên tại các vùng biển nhiệt đới nông, đặc biệt là vùng biển đảo Tây Nam Việt Nam như vùng biển Hà Tiên (Kiên Giang), vẫn chưa được khám phá một cách hệ thống. Trước đây tại Việt Nam, chỉ có công trình sơ khởi của Phạm Việt Cường et al. (2014) khảo sát 11 chủng xạ khuẩn tại vùng biển Hải Vân – Sơn Chà, để lại khoảng trống học thuật lớn về tính đa dạng sinh học phân tử, tiềm năng kháng khuẩn phổ rộng và hồ sơ hóa thực vật/chất chuyển hóa thứ cấp của xạ khuẩn vùng biển Hà Tiên.

Luận án tập trung giải quyết 4 câu hỏi nghiên cứu (Research Questions - RQ) và kiểm chứng 4 giả thuyết khoa học (Hypotheses - H):

• RQ1: Cấu trúc thành phần và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn phân lập từ hải miên vùng biển Hà Tiên phân bố như thế nào?
• RQ2: Mức độ đa dạng di truyền 16S rRNA và tỷ lệ hiện diện của các cụm gen sinh tổng hợp PKS-I, PKS-II và NRPS ở các dòng xạ khuẩn tuyển chọn ra sao?
• RQ3: Bản chất hóa học và cấu trúc phân tử của các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các dòng xạ khuẩn tiềm năng nhất là gì?
• RQ4: Khả năng ức chế của các phân đoạn cao chiết và các hợp chất tinh sạch đối với các vi sinh vật gây bệnh đạt hiệu lực ở mức độ nào?
• H1: Hải miên vùng biển Hà Tiên chứa đựng quần thể xạ khuẩn phong phú với tỷ lệ hoạt tính đối kháng vi sinh vật gây bệnh vượt trội so với các môi trường trầm tích thông thường.
• H2: Các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh đồng thời mang các gen chỉ thị chức năng sinh tổng hợp enzyme polyketide synthase (PKS) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS).
• H3: Xạ khuẩn biển cộng sinh sở hữu các con đường trao đổi chất đặc thù sản sinh các phân tử biến đổi có khung cấu trúc hóa học độc đáo.
• H4: Các hợp chất chiết xuất từ xạ khuẩn tuyển chọn có khả năng ức chế chọn lọc trên cả vi khuẩn Gram dương, Gram âm và vi nấm gây bệnh.

Khung lý thuyết của nghiên cứu dựa trên Thuyết Sinh thái hóa học cộng sinh hải miên (Sponge Holobiont Chemical Defense Theory) (Schmitt et al., 2012) và Học thuyết Sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp qua phức hệ đa enzyme PKS/NRPS (Harir et al., 2018). Về phạm vi, đề tài tiến hành thu thập các mẫu hải miên tại vùng biển Hà Tiên, phân lập 198 dòng xạ khuẩn, sàng lọc hoạt tính kháng 5 chủng vi sinh vật chỉ thị gồm Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Escherichia coli và Candida albicans, định danh 23 dòng ưu tú và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất sinh học từ 2 dòng tiềm năng nhất (Streptomyces tateyamensis ND1.7a và Microbacterium tumbae ND2.7c).

Literature Review và Positioning

Các nghiên cứu vi sinh vật học biển kinh điển đã xác nhận rằng hải miên hoạt động như những cỗ máy lọc nước sinh học khổng lồ với công suất bơm lên tới 24 m³/kg thể trọng/ngày (Kennedy et al., 2007), tạo nên cấu trúc mô xốp mesohyl dung nạp hơn 25 ngành vi khuẩn khác nhau (Vacelet & Donadey, 1977; Taylor et al., 2007). Trong mạng lưới cộng sinh phức tạp này, xạ khuẩn biển đóng vai trò tuyến phòng thủ hóa học trung tâm thông qua việc tiết ra các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính kháng sinh, kháng nấm, ức chế enzyme và chống tạo màng sinh học (Asha Devi et al., 2008).

Trong y văn quốc tế, tồn tại hai luồng quan điểm tranh luận sâu sắc:

• Trường phái thứ nhất (Jensen et al., 2005; Manivasagan et al., 2014) khẳng định xạ khuẩn biển là những chủng vi sinh vật biển nội tại thực thụ (indigenous/obligate marine actinobacteria) tiến hóa độc lập với các cơ chế thích nghi mặn cao (chịu nồng độ NaCl từ 10% đến 16%) và sở hữu các cụm gen chuyển hóa chuyên biệt sản sinh ra các hợp chất độc nhất vô nhị như salinosporamide A, abyssomicin C, bonactin hay marinopyrroles.
• Trường phái thứ hai (Kester et al., 2000; Sirisha et al., 2013) từng hoài nghi rằng phần lớn xạ khuẩn phân lập từ biển chỉ là các bào tử rửa trôi từ đất liền (wash-off hypothesis) thích nghi tạm thời với điều kiện trầm tích ven bờ mà không có sự tiến hóa đặc thù về bộ gen.

Luận án này định vị tại điểm giao thoa giữa sinh thái học vi sinh vật biển và hóa dược tự nhiên, chứng minh rằng xạ khuẩn cộng sinh hải miên tại vùng biển nông nhiệt đới Hà Tiên mang tính đa dạng cao, chứa đựng cả các chi xạ khuẩn hiếm (rare actinomycetes) và có khả năng biểu hiện các hợp chất biến dưỡng thứ cấp có hoạt tính sinh học mạnh.

Khi so sánh với các công trình quốc tế tiêu biểu:

1. Nghiên cứu của Zhang et al. (2006) trên hải miên Hymeniacidon perleve tại vùng biển Hoàng Hải (Trung Quốc) ghi nhận 27,5% số dòng phân lập có hoạt tính kháng khuẩn và 91% mang gen PKS/NRPS;
2. Khảo sát của Li et al. (2006) trên hải miên Craniella australiensis phân lập được 23 dòng xạ khuẩn thuộc 11 chi khác nhau;
3. Công trình của Liu et al. (2019) phân lập 123 dòng xạ khuẩn thuộc 21 chi với sự ưu thế của Microbacterium, Pseudonocardia và Streptomyces.

Luận án đã mở rộng hiểu biết học thuật về khu hệ vi sinh vật biển nhiệt đới Đông Nam Á, khẳng định tiềm năng sinh học độc đáo của xạ khuẩn hải miên vùng biển Tây Nam Việt Nam.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án cung cấp bằng chứng thực nghiệm vững chắc củng cố Thuyết Đồng tiến hóa và Phòng thủ Hóa học của Vật chủ Hải miên (Host-Symbiont Co-evolution Chemical Defense Theory) (Schmitt et al., 2012). Nghiên cứu khẳng định rằng các chất chuyển hóa thứ cấp không chỉ là sản phẩm phụ bài tiết mà là vũ khí cạnh tranh sinh học tối quan trọng giúp hải miên tồn tại qua hàng trăm triệu năm trước áp lực xâm nhiễm của vi sinh vật gây bệnh biển.

Mô hình lý thuyết của luận án được khái quát qua 3 mệnh đề khoa học:

• Mệnh đề 1 (P1): Mức độ thích ứng sinh thái và cấu trúc vật chủ hải miên quy định tính đa dạng phân loại và phổ kháng khuẩn của các nhóm xạ khuẩn nội cộng sinh.
• Mệnh đề 2 (P2): Tần suất hiện diện đồng thời của các con đường polyketide synthase loại I (PKS-I), loại II (PKS-II) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS) tỷ lệ thuận với hoạt phổ kháng khuẩn rộng của chủng xạ khuẩn.
• Mệnh đề 3 (P3): Xạ khuẩn thuộc các chi hiếm ngoài Streptomyces (như Microbacterium, Rhodococcus, Gordonia) sở hữu các con đường sinh tổng hợp trao đổi chất thứ cấp phi truyền thống, tạo ra các hợp chất kháng khuẩn không thuộc khung cấu trúc peptide hay macrolide kinh điển.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp đa chiều ba nhánh lý thuyết: (1) Lý thuyết Phân loại học Đa pha (Polyphasic Taxonomy), (2) Khai phá Bộ gen Sinh tổng hợp (Genome Mining & Biosynthetic Screening Theory) dựa trên enzyme học phức hệ PKS/NRPS (Harir et al., 2018), và (3) Lý thuyết Hóa học Các Hợp chất Tự nhiên Biển (Marine Natural Products Chemistry).

                 ┌──────────────────────────────────────────────┐
                 │  Hải miên vùng biển Hà Tiên (Host Sponge)   │
                 └──────────────────────┬───────────────────────┘
                                        │ (Phân lập mẫu trên SCA)
                                        ▼
                 ┌──────────────────────────────────────────────┐
                 │  198 Dòng Xạ khuẩn (Actinobacteria Isolates)  │
                 └──────────────────────┬───────────────────────┘
                                        │ (Khảo sát hoạt tính đối kháng 5 VSV)
                                        ▼
                 ┌──────────────────────────────────────────────┐
                 │  130 Dòng Kháng khuẩn (65,66% Active)        │
                 └──────────────────────┬───────────────────────┘
                                        │ (Tuyển chọn kháng trung bình - mạnh ≥2 VSV)
                                        ▼
                 ┌──────────────────────────────────────────────┐
                 │  23 Dòng Ưu tú (16S rRNA & PKS/NRPS Profiling)│
                 └───────────┬──────────────────────┬───────────┘
                             │                      │
       (Streptomyces ND1.7a) │                      │ (Microbacterium ND2.7c)
                             ▼                      ▼
           ┌───────────────────────────┐  ┌───────────────────────────┐
           │ Sắc ký cột & 1D/2D NMR    │  │ Chiết phân đoạn & GC-MS   │
           │ (Thymine & 6 dẫn xuất)   │  │ (11 Hợp chất thứ cấp)     │
           └───────────────────────────┘  └───────────────────────────┘

Điều kiện biên (Boundary conditions) của khung phân tích được xác định rõ: Khảo sát giới hạn trên tập hợp xạ khuẩn hiếu khí nuôi cấy được (culturable actinobacteria) trên các môi trường chuyên biệt như Starch Casein Agar (SCA), Luria Bertani (LB) và Mueller-Hinton Agar (MHA) trong điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm (28–30°C).

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu vận dụng thế giới quan thực chứng (Positivism) với thiết kế thực nghiệm định lượng nghiêm ngặt nhiều tầng bậc: Tầng 1 (Sàng lọc kiểu hình & hoạt tính sinh học), Tầng 2 (Nhận diện phân loại học phân tử & khai phá di truyền), và Tầng 3 (Phân tích cấu trúc hóa lý các hợp chất chuyển hóa).

Mẫu hải miên tự nhiên được thu thập tại các rạn đá, vùng nước trong và ấm tại các tọa độ đảo thuộc vùng biển Hà Tiên (Kiên Giang). Các mẫu được xử lý vô trùng bề mặt, nghiền đồng nhất sinh khối và phân lập trên môi trường chọn lọc Starch Casein Agar (SCA) bổ sung muối biển và chất kháng nấm.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình nghiên cứu tuân thủ các chuẩn mực quốc tế về vi sinh học và sinh học phân tử:

• Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn: Sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch (agar well diffusion) và cấy vạch đối kháng đối với 5 chủng vi sinh vật gây bệnh kiểm định: B. cereus, S. aureus, S. typhimurium, E. coli, và nấm men C. albicans. Đường kính vòng vô khuẩn (d - D, mm) được phân loại theo tiêu chuẩn của Galindo (2004): Kháng yếu (<10 mm), Kháng trung bình (10–15 mm), và Kháng mạnh (>15 mm).
• Định danh sinh học phân tử 16S rRNA: Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB/TE chuẩn. Khuếch đại đoạn gen 16S rRNA bằng phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt cho xạ khuẩn: SC-Act-0235-aS-20 (5’-CGC GGC CTA TCA GCT TGT TG-3’) và SC-Act-0878-aA-19 (5’-CCG TAC TCC CCA GGC GGG G-3’), kích thước sản phẩm ~640 bp.
• Sàng lọc gen sinh tổng hợp (PKS-I, PKS-II, NRPS):
  • Gen PKS-I sử dụng cặp mồi K1F (5’-TSA AGT CSA ACA TCG GBC A-3’) và M6R (5’-CGC AGG TTS CSG TAC CAG TA-3’), kích thước ~1.400 bp.
  • Gen PKS-II sử dụng cặp mồi KSαF (5’-TSG CST GCT TGG AYG CSA TC-3’) và KSαR (5’-TGG TCC NCS AGT TGG TGC C-3’), kích thước ~600 bp.
  • Gen NRPS sử dụng cặp mồi A3F (5’-GCS TAC SYS ATS TAC ACS TCS GG-3’) và A7R (5’-SAS GTC VCC SGT SCG GTA S-3’), kích thước ~700–800 bp.

+-----------------------------------------------------------------------------------+
|               BẢNG TỔNG HỢP CÁC CẶP MỒI PCR TRONG NGHIÊN CỨU                     |
+---------------+------------------------------------------+------------------------+
| Mục tiêu Gen  | Trình tự Cặp mồi (Forward / Reverse)     | Kích thước đoạn (bp)  |
+---------------+------------------------------------------+------------------------+
| 16S rRNA      | SC-Act-0235-aS-20 / SC-Act-0878-aA-19   | ~640 bp                |
| PKS-I         | K1F / M6R                                | ~1.400 bp              |
| PKS-II        | KSαF / KSαR                              | ~600 bp                |
| NRPS          | A3F / A7R                                | ~700 - 800 bp          |
+---------------+------------------------------------------+------------------------+

Độ tin cậy và giá trị nội suy của dữ liệu được bảo đảm thông qua việc lặp lại thí nghiệm 3 lần độc lập, sử dụng các chủng chuẩn đối chứng âm và đối chứng dương, cùng phân tích phương sai ANOVA và kiểm định Duncan trên phần mềm thống kê chuyên dụng.

Data và phân tích

Quá trình tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học bao gồm:

• Lên men lỏng trong môi trường LB ở 30°C, lắc 150 vòng/phút trong 7–10 ngày;
• Chiết tách pha lỏng - lỏng bằng dung môi hữu cơ Ethyl Acetate (EtOAc);
• Phân tách phân đoạn bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi giải hấp phân cực tăng dần: hexane : acetone và acetone : methanol;
• Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) trên máy quang phổ hiện đại: phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC và HMBC;
• Phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) trên hệ thống Agilent Technologies kết hợp thư viện chuẩn phổ NIST. Trình tự gen được xử lý bằng phần mềm BioEdit, so khớp BLAST trên NCBI và xây dựng cây phát sinh loài bằng thuật toán Neighbor-Joining trên phần mềm MEGA.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Kết quả nghiên cứu thực nghiệm mang lại 5 phát hiện mang tính bước ngoặt:

1. Hiệu suất phân lập và phổ hoạt tính kháng khuẩn rộng: Từ các mẫu hải miên vùng biển Hà Tiên, 198 dòng xạ khuẩn thuần khiết đã được phân lập thành công. Đáng chú ý, có tới 130/198 dòng (chiếm tỷ lệ 65,66%) thể hiện khả năng ức chế ít nhất một trong năm loài vi sinh vật thử nghiệm. Phổ ức chế phân bố theo thứ tự:

   • Bacillus cereus: 82 dòng (41,41%);
   • Salmonella typhimurium: 73 dòng (36,87%);
   • Candida albicans: 42 dòng (21,21%);
   • Escherichia coli: 39 dòng (19,70%);
   • Staphylococcus aureus: 22 dòng (11,11%).

2. Đa dạng phân loại học vượt trội của 23 dòng ưu tú: Giải trình tự gen 16S rRNA của 23 dòng xạ khuẩn kháng mạnh (ức chế từ 2 vi sinh vật trở lên) xác định sự hiện diện của 4 họ xạ khuẩn:

   • Họ Actinomycetaceae (chi Streptomyces chiếm ưu thế tuyệt đối với 15 loài);
   • Họ Microbacteriaceae (chi Microbacterium với 2 loài Microbacterium tumbae);
   • Họ Nocardiaceae (chi Rhodococcus với 5 loài);
   • Họ Gordoniaceae (chi Gordonia với 1 loài Gordonia bronchialis).

+------------------------------------------------------------------------------------+
|            PHÂN BỐ TAXONOMY VÀ TỶ LỆ GEN CHỈ THỊ CỦA 23 DÒNG XẠ KHUẨN              |
+-------------------+--------------------+-----------+-----------+-------------------+
| Họ (Family)       | Chi đại diện       | PKS-I (%) | PKS-II(%) | NRPS (%)          |
+-------------------+--------------------+-----------+-----------+-------------------+
| Actinomycetaceae  | Streptomyces (15)  |           |           |                   |
| Microbacteriaceae | Microbacterium (2) |  69,57%   |  60,87%   |  47,83%           |
| Nocardiaceae      | Rhodococcus (5)    | (16/23)   | (14/23)   | (11/23)           |
| Gordoniaceae      | Gordonia (1)       |           |           |                   |
+-------------------+--------------------+-----------+-----------+-------------------+

3. Tỷ lệ hiện diện cao của các cụm gen chức năng sinh tổng hợp: Sàng lọc di truyền trên 23 dòng xạ khuẩn ghi nhận:

   • Gen PKS-I xuất hiện ở 16/23 dòng (69,57%);
   • Gen PKS-II xuất hiện ở 14/23 dòng (60,87%);
   • Gen NRPS xuất hiện ở 11/23 dòng (47,83%). Sự hiện diện đồng thời của cả 3 hệ gen ở nhiều dòng tương quan thuận trực tiếp với khả năng kháng mạnh trên cả vi khuẩn Gram dương và vi nấm.

4. Xác định hợp chất chuyển hóa từ chủng Streptomyces tateyamensis ND1.7a: Bằng sắc ký cột và phân tích phổ 1D/2D NMR, hợp chất tinh sạch ND1.7a được xác định chính xác là thymine (C5H6N2O2). Tiếp tục phân tích GC-MS trên các phân đoạn hữu cơ phát hiện thêm 6 hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn:

   • 2-Pentanone, 4-hydroxy-4-methyl;
   • Cyclohexasiloxane, dodecamethyl;
   • Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl;
   • Oxime-, methoxy-phenyl;
   • Hexanedioic acid, bis(2-ethylhexyl) ester;
   • Diisooctyl phthalate.

5. Khai phá các hợp chất hoạt tính từ chủng xạ khuẩn hiếm Microbacterium tumbae ND2.7c: Khảo sát GC-MS trên cao chiết ethyl acetate của dòng ND2.7c đã định danh 11 hợp chất chuyển hóa thứ cấp có giá trị sinh học cao:

   • Cyclopentasiloxane decamethyl-;
   • Tetrasiloxane 3,5-diethoxy-1,1,1,7,7,7-hexamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy);
   • 1-Dodecene;
   • 3-Isopropoxy-1,1,1,7,7,7-hexamethyl-3,5,5-tris(trimethylsiloxy) tetrasiloxane;
   • 3,5-Di-t-butylphenol;
   • Phthalic acid;
   • 3,4-Dihydroxymandelic acid 4TMS;
   • 1,6-Dioxacyclododecane-7,12-dione;
   • 2-Propyl-1-pentanol;
   • 2-(2’,4’,4’,6’,6’,8’,8’-heptamethyltetrasiloxan-2’yloxy)-2,4,4,6,6,8,8,10,10-nonamethylcyclopentasiloxane;
   • Phthalic acid monoethyl ester.

Implications đa chiều

• Tiến bộ lý thuyết: Bổ sung dữ liệu thực nghiệm về tiềm năng trao đổi chất của các chi xạ khuẩn biển không thuộc Streptomyces (Microbacterium, Gordonia, Rhodococcus), mở rộng bản đồ sinh thái vi sinh vật biển khu vực Ấn Độ Dương - Thái Bình Dương.
• Đổi mới phương pháp: Chuẩn hóa quy trình tích hợp từ phân lập chọn lọc, sàng lọc PCR marker chức năng đến phân tích cấu trúc hóa học NMR/GC-MS cho vi sinh vật biển nhiệt đới.
• Ứng dụng thực tiễn: Dòng S. tateyamensis ND1.7a và M. tumbae ND2.7c là nguồn giống vi sinh vật giá trị cao cho sản xuất chế phẩm sinh học kháng khuẩn, phòng chống bệnh thối nhũn do B. cereus trong thực phẩm và kiểm soát vi khuẩn gây bệnh đường ruột S. typhimurium.
• Chính sách: Cung cấp luận cứ khoa học định lượng cho công tác bảo tồn đa dạng sinh học biển, khai thác bền vững tài nguyên sinh vật biển tại Vườn quốc gia Phú Quốc và Khu dự trữ sinh quyển Kiên Giang.

Limitations và Future Research

Nghiên cứu có một số giới hạn học thuật cần được thừa nhận khách quan:

1. Phương pháp nuôi cấy truyền thống: Chỉ tiếp cận được nhóm vi sinh vật nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo, bỏ sót hơn 99% các vi sinh vật cộng sinh chưa nuôi cấy được (“microbial dark matter”) vốn chỉ phát hiện được qua giải trình tự metagenomics (Taylor et al., 2007).
2. Dung môi chiết tách: Việc sử dụng dung môi ethyl acetate chủ yếu thu nhận các hợp chất có độ phân cực trung bình, có thể bỏ sót các peptide phân cực cao hoặc các protein kháng khuẩn phân tử lớn.
3. Đánh giá in vitro: Hoạt tính kháng khuẩn mới dừng lại ở các phép thử in vitro trong phòng thí nghiệm; chưa tiến hành khảo sát độc tính tế bào (cytotoxicity) trên dòng tế bào người hoặc thử nghiệm tiền lâm sàng in vivo.

Chương trình nghiên cứu tương lai cần tập trung vào 4 hướng:

• Ứng dụng giải trình tự metagenomics trực tiếp trên mô hải miên để giải mã toàn bộ cụm gen sinh tổng hợp (BGCs);
• Ứng dụng kỹ thuật OSMAC (One Strain Many Compounds) và kích thích hóa học/đồng nuôi cấy (co-cultivation) để đánh thức các cụm gen ngủ yên (cryptic/silent gene clusters);
• Khảo sát độc tính tế bào và hoạt tính kháng ung thư của các dẫn xuất siloxane và phthalate chiết xuất từ xạ khuẩn biển;
• Đánh giá khả năng tối ưu hóa lên men quy mô bioreactor để sản xuất thử nghiệm các hợp chất kháng sinh tự nhiên.

Tác động và ảnh hưởng

• Học thuật: Cung cấp dữ liệu gốc đầu tiên về xạ khuẩn hải miên vùng biển Hà Tiên trên ngân hàng gen NCBI, tạo tiền đề thu hút các trích dẫn quốc tế trong lĩnh vực công nghệ sinh học biển và hóa sinh các hợp chất tự nhiên.
• Công nghiệp Dược phẩm & Thú y Thủy sản: Cung cấp 2 chủng giống triển vọng (S. tateyamensis ND1.7a và M. tumbae ND2.7c) và 18 hợp chất thứ cấp đã định danh làm hoạt chất đối chứng hoặc chất dẫn đường (lead compounds) trong phát triển thuốc kháng vi sinh vật mới.
• Quản lý Tài nguyên Biển: Làm cơ sở định lượng để các cơ quan quản lý nhà nước (Bộ Nông nghiệp & PTNT, Sở Khoa học & Công nghệ Kiên Giang) xây dựng chính sách bảo vệ hệ sinh thái rạn san hô và sinh vật đáy ven biển Tây Nam.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh & Nhà khoa học: Tiếp cận hệ phương pháp chuẩn hóa kết hợp giữa sinh học phân tử và hóa phân tích cấu trúc để sàng lọc hoạt chất sinh học tự nhiên.
• Doanh nghiệp R&D Công nghệ Sinh học: Khai thác các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp thymine, dẫn xuất phenolic và siloxane tự nhiên phục vụ sản xuất nguyên liệu mỹ phẩm, dược phẩm và nông dược sinh học.
• Ngành Nuôi trồng Thủy sản: Ứng dụng các dòng xạ khuẩn đối kháng để tạo chế phẩm probiotic kiểm soát mầm bệnh vi khuẩn đường ruột trong nuôi tôm nước lợ và cá biển.
• Nhà hoạch định chính sách môi trường: Sử dụng dữ liệu đa dạng sinh học để xây dựng chiến lược kinh tế biển xanh và khai thác bền vững tài nguyên sinh học biển.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của nghiên cứu là gì và phát triển học thuyết nào?

Đóng góp lý thuyết cốt lõi là việc chứng minh sự tồn tại của hệ thống enzyme kép PKS/NRPS ở các chi xạ khuẩn hiếm (Microbacterium, Rhodococcus, Gordonia) cộng sinh trong hải miên nhiệt đới. Phát hiện này củng cố và mở rộng Học thuyết Sinh tổng hợp Hợp chất Chuyển hóa Thứ cấp (Harir et al., 2018), chứng minh rằng con đường tổng hợp chất kháng khuẩn ở vi sinh vật biển không chỉ khu trú ở chi Streptomyces mà phân bố rộng khắp trong cây phát sinh loài của ngành Actinobacteria.

2. Điểm cải tiến phương pháp luận so với các nghiên cứu trước đây là gì?

So với nghiên cứu của Phạm Việt Cường et al. (2014) chỉ dừng lại ở thử nghiệm hoạt tính thô và nghiên cứu của Li et al. (2006) chỉ định danh phân loại đơn thuần, luận án này thiết lập quy trình tích hợp 4 bước liền mạch: (1) Sàng lọc kiểu hình đa đích (5 mầm bệnh), (2) Phân loại học phân tử 16S rRNA, (3) Khai phá đồng thời 3 hệ gen chỉ thị PKS-I, PKS-II, NRPS, và (4) Giải mã cấu trúc hóa học tuyệt đối bằng phổ 2D NMR (HSQC, HMBC) và GC-MS.

3. Phát hiện bất ngờ nhất về mặt dữ liệu thực nghiệm là gì?

Phát hiện bất ngờ nhất là chủng Microbacterium tumbae ND2.7c – một loài xạ khuẩn hiếm thuộc họ Microbacteriaceae – sản sinh ra một tổ hợp phong phú gồm 11 hợp chất chuyển hóa thứ cấp chứa các dẫn xuất siloxane vòng phức tạp (cyclopentasiloxane decamethyl-, tetrasiloxane) và phenolic (3,5-di-t-butylphenol), vốn là những hợp chất trước đây thường chỉ được ghi nhận từ các con đường hóa tổng hợp nhân tạo hoặc từ các loài thực vật bậc cao.

4. Nghiên cứu có cung cấp giao thức tái lặp (Replication Protocol) hoàn chỉnh không?

Luận án cung cấp chi tiết toàn bộ thông số kỹ thuật có thể tái lập hoàn toàn: môi trường phân lập SCA có kiểm soát nồng độ muối, chu trình nhiệt PCR cho từng cặp mồi (SC-Act-0235-aS-20/SC-Act-0878-aA-19, K1F/M6R, KSαF/KSαR, A3F/A7R), chương trình nhiệt độ lò cột GC-MS (từ 50°C đến 280°C) và dung môi tách chiết sắc ký cột silica gel.

5. Định hướng lộ trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được vạch ra như thế nào?

Lộ trình 10 năm gồm 3 giai đoạn: (1) Giai đoạn 1–3 năm: Giải mã toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing) của dòng ND1.7a và ND2.7c để định vị các cụm gen BGCs; (2) Giai đoạn 4–6 năm: Tối ưu hóa biểu hiện gen dị dòng (heterologous expression) và sản xuất thử nghiệm ở quy mô pilot 100L; (3) Giai đoạn 7–10 năm: Đánh giá dược động học, độc tính in vivo và bào chế thuốc kháng sinh/chế phẩm sinh học biển phục vụ lâm sàng và nuôi trồng thủy sản.

Kết luận

1. Đã phân lập thành công 198 dòng xạ khuẩn từ các mẫu hải miên tại vùng biển Hà Tiên, ghi nhận 130/198 dòng (65,66%) có hoạt tính đối kháng với ít nhất một trong năm chủng vi sinh vật gây bệnh kiểm định (B. cereus, S. aureus, S. typhimurium, E. coli, C. albicans).
2. Tuyển chọn và định danh phân tử 16S rRNA 23 dòng xạ khuẩn ưu tú, xác định chúng thuộc về 4 họ sinh học: Actinomycetaceae (chi Streptomyces với 15 loài), Microbacteriaceae (Microbacterium tumbae, 2 loài), Nocardiaceae (Rhodococcus, 5 loài) và Gordoniaceae (Gordonia bronchialis, 1 loài).
3. Xác định tỷ lệ hiện diện các gen sinh tổng hợp hoạt chất sinh học ở 23 dòng ưu tú đạt mức cao: PKS-I (69,57%), PKS-II (60,87%) và NRPS (47,83%), tạo cơ sở di truyền vững chắc cho tiềm năng chuyển hóa thứ cấp phong phú.
4. Tinh sạch và giải mã thành công cấu trúc phân tử hợp chất thymine cùng 6 hợp chất thứ cấp từ dòng Streptomyces tateyamensis ND1.7a bằng kỹ thuật 1D/2D NMR và GC-MS.
5. Định danh 11 hợp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học cao từ dòng xạ khuẩn hiếm Microbacterium tumbae ND2.7c thông qua phân tích GC-MS.
6. Mở ra hướng nghiên cứu mới về công nghệ sinh học biển tại Việt Nam, khẳng định hải miên vùng biển Tây Nam là kho báu sinh học chứa đựng các vi sinh vật có tiềm năng sản xuất dược phẩm và các chế phẩm sinh học bảo vệ sức khỏe con người.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Vi sinh vật (VSV) là nguyên nhân gây nhiều bệnh nguy hiểm cho người và động vật. Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện kháng sinh penicillin giúp chữa được nhiều bệnh gây ra do VSV, mở ra con đường mới cho y học. Kháng sinh là nhóm thuốc thiết yếu trong y học hiện đại, tác dụng trực tiếp lên vi khuẩn để tiêu diệt hoặc làm chậm sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, giúp cho hệ miễn dịch của con người chống lại quá trình nhiễm khuẩn (Kohanski et al. Ngoài ra, kháng sinh còn đóng vai trò rất quan trọng trong một số lĩnh vực khác như chăn nuôi, bảo quản thực phẩm, bảo vệ thực vật… (Ceylan et al.

Tuy nhiên, có một vấn đề ngày càng phổ biến, đó là sự xuất hiện của các VSV kháng kháng sinh. Chúng là nguyên nhân trực tiếp và gián tiếp của hàng loạt các bệnh nhiễm khuẩn: thương hàn, nhiễm trùng tiết niệu, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng vết mổ. Sự xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng thuốc và sự thiếu hụt cá c kháng sinh mới làm cho con người đang phải đối mặt với thời kỳ “hậu kháng sinh”. Chính vì thế nhiệm vụ đặt ra cho ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh là: cải tiến các kháng sinh cũ để tránh tình trạng kháng thuốc, đồng thời thúc đẩy nghiên cứu để tìm r a các kháng sinh mới (Alanis, 2005).

Trong số các VSV có khả năng sinh kháng sinh thì VKS (actinobacteria) hay còn gọi là xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng hàng đầu, khoảng 80% các kháng sinh được phát hiện có nguồn gốc từ VKS, đặt biệt là các loài thuộc chi Streptomyces (Aslan, 1999). Tuy nhiên, việc tìm ra kháng sinh mới từ Streptomyces phân lập từ đất ngày càng trở nên hiếm và khó khăn, do vậy, việc phân lập các loài VKS từ các nguồn đặc biệt khác để tìm kiếm kháng sinh mới là rất cần thiết (Sirisha et al. Trong xu hướng này, các loài VKS hiếm phân lập từ biển được quan tâm nhiều hơn do khả năng sản sinh các hợp chất thứ cấp (secondary metabolites) có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như kháng sinh, hợp chất kháng ung thư, kháng khối u, thuốc bảo vệ thực vật …Trong đó, nhóm VKS cộng sinh với hải miên được nhiều nhà khoa học quan tâm (Asha Devi et al. Trong các nhóm vi khuẩn sống cùng với hải miên, nhóm vi khuẩn Lam (cyanobacteria) làm nhiệm vụ quang tổng hợp để cung cấp năng lượng cho hải miên còn có những nhóm vi khuẩn khác phân hủy chất thải (Beer & Ilan, 1998), ổn định bộ khung của hải miên và sản xuất sản phẩm thứ cấp.

Chính các sản phẩm thứ cấp chính là những chất kháng vi khuẩn (antibacterial), kháng nấm (antifungal) và những hoạt động khác để giúp cho hải miên tự bảo vệ mình , vì hải miên có cấu trúc tương tự động vật bậc cao và chỉ thiếu hệ thống miễn dịch. Vi khuẩn cộng sinh với hải miên tạo ra nhiều sản phẩm thứ cấp hay còn gọi là sản phẩm thiên nhiên giữ vai trò quan trọng 1 luan an trong việc phát triển dược phẩm góp phần để trị bệnh cho con người (Schmit t et al. Ở Việt Nam, có rất ít công trình nghiên cứu về VKS cộng sinh với hải miên được công bố chỉ có công trình của Phạm Việt Cường et al., (2014) đã tuyển chọn được 11 chủng xạ khuẩn từ hải miên ở vùng biển Hải Vân – Sơn Chà, có hoạt tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh. Vùng biển Hà Tiên là vùng biển bao gồm nhiều đảo lớn nhỏ, tiếp cận vịnh Thái Lan, nơi có nguồn nước biển sạch, trong, nông và ấm nên có nhiều loài sinh vật sống rất phong phú trong đó có nhiều loài hải miên.

Nhóm sinh vật này sẽ là nguồn lợi không những về tài nguyên biển mà còn là nguồn sinh vật biển chứa nhiều VSV cộng sinh sản xuất chất có hoạt tính sinh học, trong đó có nhóm VKS, góp phần mang lại lợi ích về những kháng sinh mới phục vụ cho y học, nuôi trồng thuỷ sản, chăn nuôi gia súc, gia cầm, tuy nhiên công trình nghiên cứu về nhóm VKS này hiện còn khá hạn chế. Từ những lý do trên, đề tài nghiên cứu: “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi (Actinobacteria) từ hải miên vùng biển Hà Tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh vật gây bệnh” được tiến hành nhằm góp phần làm phong phú các sản phẩm có giá trị cao khai thác từ nguồn tài nguyên biển phục vụ cho cuộc sống và có thể ứng dụng trong y học.2 Mục tiêu đề tà i 1.1 Mục tiêu tổng quát Phân lập và tuyển chọn được những dòng VKS có khả năng sản xuất ra các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn cao, đồng thời xác định được các hợp chất có hoạt tính sinh học, tạo nguồn vật liệu phục vụ cho nghiên cứu sản xuất các hợp chất ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm.2 Mục tiêu cụ thể Phân lập được các dòng VKS từ hải miên tại vùng biển Hà Tiên, đồng thời đánh giá khả năng kháng của các dòng VKS này đối với các VSV thử nghiệm. Tuyển chọn và định danh được các dòng VKS có khả năng sản xuất ra các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn cao, đồng thời đánh giá mối liên hệ di truyền và khảo sát sự hiện diện của các gen PKS-I, PKS-II và NRPS chỉ thị cho sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học của các dòng VKS tuyển chọn. Tuyển chọn từ một đến hai dòng VKS có tiềm năng nhất, có khả năng sản xuất các hợp chất có hoạt tính kháng được nhiều loại VSV với mức độ kháng cao, đồng thời xác định được các hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ VKS tuyển chọn.3 Đối tượng nghiên cứu Các dòng VKS phân lập được từ hải miên thu thập tại các địa điểm thuộc vùng biển Hà Tiên.4 Phạm vi nghiên cứu Đề tài nghiên cứu về khả năng kháng một số VSV gây bệnh thử nghiệm gồm Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Escherichia coli và Candida albicans của các dòng VKS phân lập từ hải miên.

Tuyển chọn và định danh các VKS có khả năng sản xuất ra các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn cao, đồng thời đánh giá mối liên hệ di truyền và khảo sát sự hiện diện của các gen PKS-I, PKS-II và NRPS chỉ thị cho sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học của các dòng VKS tuyển chọn. Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất bởi dòng VKS tiềm năng nhất.5 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Phân lập VKS từ hải miên ở vùng biể n Hà Tiên. Nội dung 2: Đánh giá và tuyển chọn các dòng VKS có khả năng kháng với VSV gây bệnh thử nghiệm gồm B. albicans, và có khả năng sản xuất hợp chất sinh học có hoạt tính kháng khuẩn cao.

Nội dung 3: Nhận diện và khảo sát mối liên hệ di truyền các dòng VKS tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Nội dung 4: Khảo sát sự hiện diện các gen PKS-I, PKS-II và NRPS chỉ thị cho sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học của các dòng VKS tuyển chọn. Nội d ung 5: Xác định hợp chất có hoạt tính sinh học của dòng VKS tiềm năng nhất.6 Đóng góp mới của luận án Đã phân lập được 198 dòng VKS từ hải miên ở vùng biển Hà Tiên, trong đó 130/198 dòng có khả năng kháng lại ít nhất một trong năm loài VSV được thử nghiệm gồm B. Đã tuyển chọn và định danh được 23 dòng VKS có khả năng kháng ít nhất hai dòng VSV chỉ thị trở lên với mức độ kháng từ trung bình đến kh áng mạnh.

Các dòng VKS tuyển chọn thuộc bốn họ bao gồm họ Actinomycetaceae (với chi Streptomyces có 15 loài), họ Microbacteriaceae (với hai loài Microbacterium tumbae), họ Nocardiaceae (với chi Rhodococcus có năm loài) và họ Gordoniaceae (với một loài là Gordonia bronchialis). Tỷ lệ hiện diện các gen chỉ thị sản xuất các chất có hoạt tính sinh học được ghi nhận có sự khác nhau, bao gồm PKS-I là 69,6%, PKS-II là 60,9% và NRPS là 47,8%. 3 luan an Đã nhận diện được hai dòng VKS tiềm năng nhất có khả năng kháng khuẩn cao là S. Bảy hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ S.7a được xác định, gồm có: thymine; 2- Pentanone-4-hydroxy-4-methyl; cyclohexasiloxane dodecamethyl; cycloheptasiloxane tetradecamethyl; oxime- methoxy-phenyl; hexanedioic acid bis (2-ethylhexyl) ester và diisooctyl phthalate.7c, 11 hợp chất có hoạt tính sinh học được xác định bao gồm: cyclopentasiloxane decamethyl-, tetrasiloxane 3.5-diethoxy- 1,1,1,7,7,7-hexamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy), 1-dodecene, 3-isopropoxy- 1,1,1,7,7,7-hexamethyl-3,5,5-tris(trimethylsiloxy) tetrasiloxane, 3,5-di-t-butylphenol, phthalic acid, 3,4-dihydroxymandelic acid 4TMS, 1.6-dioxacyclododecane-7-12- dione, 2-propyl-1-pentanol, 2-(2’,4’,4’,6’,6’,8’,8’-heptamethyltetrasiloxan-2’yloxy)- 2,4,4,6,6,8,8,10.10-nonamethylcyclopentasiloxane và phthalic acid monoethyl ester.

Kết quả của đề tài về các hợp chất có hoạt tính sinh học hữu ích, đặc biệt là khả năng kháng nấm và kháng khuẩn, là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm tìm ra loại dược phẩm mới sản xuất từ các VSV cộng sinh với hải miên góp phần bảo vệ sức khỏe cho con người. Đây cũng là công trình nghiên cứu đầu tiên về VKS trong hải miên ở vùng biển Hà Tiên.7 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án 1.1 Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp thông tin khoa học về các nhóm VKS sống cộng sinh với hải miên có khả năng sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học hữu ích, đặc biệt là khả năng kháng nấm và kháng khuẩn. Các kết quả của luận án có thể được sử dụng như là nguồn tài liệu tham khảo trong giảng dạy cũng như cho sinh viên bậc đại học và sau đại họ c tại cơ sở đào tạo khi nghiên cứu về lĩnh vực này.2 Ý nghĩa thực tiễn Các dòng VKS có hoạt tính kháng khuẩn cao được phân lập từ hải miên là nguồn vật liệu có thể sử dụng phục vụ cho nghiên cứu tinh sạch, sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học cao góp phần ứng dụng trong việc điều trị bệnh và bảo vệ sức khỏe cho con người. 4 luan an CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Phân loại khoa học và phân bố Hải miên (bọt biển, sponges) có khoảng 8.000 loài, chiếm cứ hầu hết các vùng nước trên trái đất, từ những hồ nước ngọt tới các vùng biển nhiệt đới, không trừ cả những vùng lạnh giá ở bắc cực, chia thành bốn lớp Hexactinellida, Calcarea, Demospongiae và Homoscleromorpha.

Một vài loài hải miên thường gặp như Petromica citrina, Amphimedon viridis, Desmapsamma anchorata, Polymastia janeirensis, Aplysina fulva, Mycale angulosa, Hymeniacidon heliophila, Dysidea etheria, Tethya rubra và Tethya maza, Aplysina fulva, Chondrosia collectrix, Petromica citrina, Polymastia janeirensis, Tedania ignis, Hyrtioserecta, Amphimedonchloros,… Cơ thể hải miên có kích thước biến động rất lớn từ 3 - 10 mm đến 1,5 – 2 m (Ereskovsky, 2010). Nhưng Hooper & van Soest (2002) cho rằng hải miên chỉ là ngành sinh vật biển gồm khoảng hơn 15.