Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn actinobacteria từ hải miên Hà Tiên với khả năng kháng vi sinh vật

LỜI CẢM ƠN

TÓM TẮT

ABSTRACT

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH SÁCH BẢNG

DANH SÁCH HÌNH

TỪ VIẾT TẮT

1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1. Mục tiêu đề tài

1.2. Mục tiêu tổng quát

1.3. Mục tiêu cụ thể

1.4. Đối tượng nghiên cứu

1.5. Phạm vi nghiên cứu

1.6. Nội dung nghiên cứu

1.7. Đóng góp mới của luận án

1.8. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án

1.8.1. Ý nghĩa khoa học

1.8.2. Ý nghĩa thực tiễn

2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Phân loại khoa học và phân bố

2.2. Đặc điểm cấu tạo

2.3. Đặc điểm sinh sản, sinh trưởng và phát triển của hải miên

2.3.1. Sự sinh sản vô tính

2.3.2. Sự sinh sản hữu tính

2.4. Đa dạng VSV sống cùng với hải miên

2.4.1. Vi khuẩn liên kết với hải miên

2.4.2. Nấm và tảo liên kết với hải miên

2.4.3. VKS liên kết với hải miên

2.4.4. Cổ vi khuẩn (Archaea) liên kết với hải miên

2.5. Vi khuẩn sợi (xạ khuẩn) (Actinobacteria)

2.5.1. Phân bố của VKS trong tự nhiên

2.5.2. Đặc điểm sinh học của VKS

2.5.3. Sự hình thành của bào tử VKS

2.5.4. Các phương pháp nuôi cấy để thu nhận kháng sinh ở VKS

2.6. Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ VKS

2.6.1. Khái quát về các con đường sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học

2.6.2. Phân loại các kháng sinh từ VKS

2.6.3. Những hợp chất có hoạt tính sinh học hình thành từ VKS

2.6.4. Một số nhóm chất có hoạt tính kháng khuẩn tiêu biểu từ VKS Streptomyces sp. có nguồn gốc từ biển

2.7. Một số VSV gây bệnh

2.7.1. Vi khuẩn Bacillus cereus

2.7.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus

2.7.3. Vi khuẩn Escherichia coli

2.7.4. Vi khuẩn Salmonella

2.7.5. Nấm Candida albicans

2.8. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

3. CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.2. Phương tiện nghiên cứu

3.2.1. Nguyên vật liệu

3.2.2. Thiết bị - dụng cụ

3.3. Hóa chất - môi trường

3.4. Phương pháp nghiên cứu

3.4.1. Thu thập và xử lý mẫu

3.4.2. Phân lập và nuôi cấy VKS

3.4.2.1. Mục tiêu thí nghiệm

3.4.2.2. Sơ đồ quy trình phân lập VKS từ hải miên

3.4.2.3. Các bước tiến hành thí nghiệm

3.5. Các chỉ tiêu theo dõi

3.6. Đánh giá khả năng kháng khuẩn

3.6.1. Mục tiêu thí nghiệm

3.6.2. Sơ đồ quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn

3.6.3. Các bước tiến hành thí nghiệm

3.6.4. Chỉ tiêu theo dõi

3.7. Phân tích kết quả

3.8. Nhận diện VKS bằng phương pháp sinh học phân tử

3.8.1. Mục tiêu thí nghiệm

3.8.2. Các bước tiến hành thí nghiệm

3.8.3. Phân tích kết quả

3.9. Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS

3.9.1. Mục tiêu thí nghiệm

3.9.2. Các bước tiến hành thí nghiệm

3.9.3. Phân tích kết quả

3.10. Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ VKS tiềm năng được tuyển chọn

3.10.1. Mục tiêu thí nghiệm

3.10.2. Chuẩn bị dịch nuôi cấy VKS

3.10.3. Chiết tách các chất từ dịch nuôi cấy VKS với ethyl acetate

3.10.4. Phương pháp sắc ký cột

3.11. Xác định cấu trúc hóa học bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

3.12. Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ (GC -MS)

4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Các dòng VKS phân lập được từ hải miên

4.1.1. Số lượng, nguồn gốc các dòng VKS phân lập được

4.1.2. Đặc điểm các dòng VKS phân lập được

4.1.2.1. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng VKS phân lập được

4.2. Đặc điểm tế bào của các dòng VKS phân lập được

4.3. Khả năng kháng khuẩn của các dòng VKS phân lập được

4.4. Tuyển chọn và định danh các dòng VKS phân lập được

4.5. Nhận diện các gen PKS-I, PKS-II và NRPS ở các dòng VKS

4.6. Chất kháng khuẩn được sinh ra từ VKS

4.6.1. Chất kháng khuẩn từ S

4.6.1.1. Kết quả phân tích cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

4.6.1.2. Kết quả phân tích sắc ký ghép khối phổ (GC-MS)

4.6.2. Chất kháng khuẩn từ M

5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Phụ lục 1: Một số hình của thí nghiệm

1. Hình ảnh thu mẫu hải miên

2. Hình một số mẫu hải miên thu tại các địa điểm

Phụ lục 2: Ký hiệu, nguồn gốc các dòng VKS phân lập

Phụ lục 3: Đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của các dòng VKS

Phụ lục 4: Kết quả đo vòng kháng khuẩn của các dòng VKS đối với các VSV thử nghiệm (mm)

Phụ lục 5: Kết quả định danh 23 VKS tuyển chọn

5.1. Phổ điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR sử dụng cặp

5.2. Trình tự đoạn gen và kết quả so sánh với dữ liệu ngân hàng gen của 23 dòng VKS được tuyển chọn

5.3. Kết quả định danh của 23 dòng VKS tuyển chọn

Phụ lục 6: Kết quả khảo sát sự hiện diện các gen PKS-I, PKS-II và NRPS ở 23 dòng VKS tuyển chọn

6.1. Phổ điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi A3F/A7R nhân bản cho gen NRPS (700–800 bp) của 23 dòng VKS tuyển chọn

6.2. Phổ điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi K1F/M6R nhân bản cho gen PKS-I (1.400 bp) của 23 dòng VKS tuyển chọn

6.3. Phổ điện di trên gel aga rose của sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi KSαF/KSαR nhân bản cho gen PKS-II (600 bp) của 23 dòng VKS tuyển chọn

Phụ lục 7: Kết quả phân tích cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) của chất được tinh sạnh từ S

7.1. Phổ MS của hợp chất ND1.7a

7.2. Phổ proton của hợp chất ND1.7a

7.3. Phổ carbon 13 của hợp chất ND1.7a

7.4. Phổ DEPT của hợp chất ND1.7a

7.5. Phổ HSQC của hợp chất ND1.7a

7.6. Phổ HMBC của hợp chất ND1.7a

Phụ lục 8 : Kết quả phân tích sắc ký ghép khối phổ (GC -MS) các chất chiết xuất từ dòng VKS S

8.1. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS S.7a phân đoạn hexane -acetone

8.2. Phổ MS hợp chất 2 -Pentanone, 4-hydroxy-4-methyl ở phút 4,64

8.3. Phổ MS hợp chất cyclohexasiloxane, dodecamethyl ở phút 13,15

8.4. Phổ MS hợp chất cycloheptasiloxane, tetradecamethyl ở phút 15,803

8.5. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS S.7a phân đoạn acetone -methanol

8.6. Phổ MS hợp chất oxime-, methoxy-phenyl ở phút 5,09

8.7. Phổ MS hợp chất hexanedioic acid, bis(2-ethylhexyl) ester ở phút 30,82

8.8. Phổ MS hợp chất diisooctyl phthalate ở phút 33,07

Phụ lục 9 : Kết quả phân tích sắc ký ghép khối phổ (GC -MS) các chất chiết xuất từ dòng VKS M

9.1. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M

9.2. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M

9.3. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M

9.4. Phổ GC-MS của dung môi acetone

9.5. Bảng tổng hợp kết quả giải phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M

Phụ lục 10: Kết quả phân tích thống kê

10.1. Kết quả phân tích thống kê khả năng kháng của các dòng VKS phân lập với các VSV thử nghiệm

10.2. Kết quả phân tích thống kê khả năng kháng của 23 dòng VKS được tuyển chọn với các VSV thử nghiệm

I. Giới thiệu

Luận án này tập trung vào việc phân lập và tuyển chọn vi khuẩn actinobacteria từ hải miên ở vùng biển Hà Tiên. Mục tiêu chính là xác định các dòng vi khuẩn có khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh. Nghiên cứu đã thu thập 198 dòng vi khuẩn, trong đó 130 dòng cho thấy khả năng kháng lại ít nhất một trong năm loài vi sinh vật được thử nghiệm. Kết quả cho thấy sự đa dạng sinh học cao của các dòng vi khuẩn này, mở ra hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực biotechnology và biological activity.

1.1 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu của nghiên cứu là phân lập và tuyển chọn các dòng actinobacteria từ hải miên có khả năng sản xuất các hợp chất kháng vi sinh vật. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về hệ sinh thái của hải miên mà còn có thể dẫn đến việc phát triển các sản phẩm sinh học mới có giá trị trong y học.

1.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng trong việc phát triển các loại thuốc kháng sinh mới từ các hợp chất sinh học được sản xuất bởi actinobacteria. Điều này có thể giúp giải quyết vấn đề kháng thuốc hiện nay, đồng thời bảo vệ sức khỏe con người. Việc khai thác biodiversity từ hải miên cũng góp phần bảo tồn và phát triển bền vững nguồn tài nguyên sinh học.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp hiện đại để phân lập vi khuẩn từ mẫu hải miên. Các mẫu được thu thập từ vùng biển Hà Tiên và được xử lý bằng các phương pháp nuôi cấy chọn lọc. Kết quả cho thấy 198 dòng vi khuẩn được phân lập, trong đó 130 dòng có khả năng kháng lại ít nhất một trong năm loài vi sinh vật thử nghiệm. Phương pháp giải trình tự gen được sử dụng để xác định các dòng vi khuẩn tiềm năng, từ đó đánh giá khả năng kháng sinh của chúng.

2.1 Quy trình phân lập

Quy trình phân lập bao gồm việc thu thập mẫu, nuôi cấy và đánh giá khả năng kháng khuẩn. Các dòng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường thích hợp và được kiểm tra khả năng kháng lại các vi sinh vật gây bệnh. Kết quả cho thấy sự hiện diện của nhiều dòng vi khuẩn có khả năng kháng mạnh, điều này cho thấy tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm sinh học.

2.2 Phân tích gen

Phân tích gen được thực hiện để xác định các dòng vi khuẩn có khả năng sản xuất hợp chất kháng sinh. Các gen PKS-I, PKS-II và NRPS được kiểm tra để đánh giá khả năng sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học. Kết quả cho thấy sự hiện diện của các gen này trong nhiều dòng vi khuẩn, điều này mở ra khả năng phát triển các sản phẩm kháng sinh mới.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy 23 dòng vi khuẩn được tuyển chọn có khả năng kháng lại ít nhất hai loại vi sinh vật thử nghiệm. Các dòng vi khuẩn này thuộc bốn họ khác nhau, bao gồm Actinomycetaceae, Microbacteriaceae, Nocardiaceae và Gordoniaceae. Sự khác biệt về tỷ lệ hiện diện các gen chỉ thị sản xuất các chất có hoạt tính sinh học được xác định, cho thấy tiềm năng lớn trong việc phát triển các hợp chất kháng sinh mới từ actinobacteria.

3.1 Đặc điểm các dòng vi khuẩn

Các dòng vi khuẩn được phân lập có đặc điểm sinh học đa dạng, cho thấy khả năng thích nghi cao với môi trường sống. Việc phân tích khả năng kháng khuẩn cho thấy một số dòng có khả năng kháng mạnh đối với các vi sinh vật gây bệnh, điều này chứng tỏ tiềm năng ứng dụng trong y học.

3.2 Hợp chất sinh học

Nghiên cứu đã xác định được nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học từ các dòng vi khuẩn được tuyển chọn. Các hợp chất này đã được công bố có khả năng kháng nấm và kháng khuẩn, mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc phát triển các loại thuốc kháng sinh từ nguồn tài nguyên sinh học tự nhiên.

Luận án tiến sĩ: Phân lập vi khuẩn actinobacteria từ hải miên Hà Tiên và nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật