Tổng quan luận án

Ung thư phổi là bệnh lý ác tính có tỷ lệ mắc mới và tử vong hàng đầu trên phạm vi toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Theo thống kê của Globocan 2012, thế giới ghi nhận khoảng 1,82 triệu ca mắc mới và 1,59 triệu ca tử vong do ung thư phổi. Tại Việt Nam, tỷ lệ mới mắc ung thư phổi ở nam giới thuộc nhóm cao nhất thế giới (> 33 trường hợp/100.000 dân) và đứng thứ 4 ở nữ giới (8,1 - 14,0/100.000 dân). Trong giai đoạn 2000 - 2010, tỷ lệ mắc ở nữ giới tăng hơn 200% (đạt 6,4/100.000 dân vào năm 2010). Mặc dù phẫu thuật là phương pháp điều trị mang lại hiệu quả cao ở giai đoạn sớm, có khoảng 50% bệnh nhân khi được phát hiện đã ở giai đoạn muộn, không còn chỉ định phẫu thuật và phải chuyển sang hóa xạ trị với hiệu quả hạn chế kèm nhiều tác dụng phụ.

Nghiên cứu cơ chế phân tử chỉ ra rằng ung thư phát sinh từ sự tích lũy các đột biến soma và biến đổi di truyền, dẫn đến kích hoạt gen sinh ung thư (oncogene) và bất hoạt gen áp chế ung thư (tumor suppressor gene). Con đường tín hiệu p53 - MDM2 đóng vai trò trung tâm trong duy trì tính ổn định của bộ gen, kiểm soát chu kỳ tế bào và kích hoạt quá trình chết theo chương trình (apoptosis). Các đa hình đơn nucleotid (Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs) trên gen TP53 và MDM2 có thể làm thay đổi mức độ biểu hiện gen hoặc cấu trúc protein, từ đó làm thay đổi tính nhạy cảm di truyền đối với ung thư phổi. Trước thời điểm nghiên cứu, tại Việt Nam đã có một số công trình khảo sát đột biến TP53, nhưng chưa có nghiên cứu nào đánh giá toàn diện tính đa hình của gen TP53 và gen MDM2 liên quan đến nguy cơ mắc ung thư phổi.

Luận án tiến sĩ y học của nghiên cứu sinh Trần Khánh Chi (chuyên ngành Hóa sinh, mã số 62720112, Trường Đại học Y Hà Nội, năm 2019) được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Trần Huy Thịnh và PGS. Nguyễn Thị Hà, nhằm giải quyết 2 mục tiêu cụ thể:

  1. Xác định tỷ lệ kiểu gen của một số đa hình gen TP53 và gen MDM2 ở bệnh nhân ung thư phổi và người bình thường.
  2. Phân tích mối liên quan giữa một số đa hình gen TP53 và gen MDM2 với nguy cơ ung thư phổi.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu bao gồm:

  • Nhóm bệnh: 220 bệnh nhân được chẩn đoán xác định ung thư phổi nguyên phát bằng kết quả xét nghiệm mô bệnh học tại Trung tâm Hô hấp và Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu - Bệnh viện Bạch Mai.
  • Nhóm chứng: 230 người khỏe mạnh đến khám tại Khoa Khám bệnh - Bệnh viện Bạch Mai, tương đồng về tuổi và giới tính, không mắc ung thư phổi hay các bệnh lý ác tính khác.
  • Thời gian thu thập mẫu: Từ tháng 10 năm 2013 đến tháng 12 năm 2014.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các tài liệu dịch tễ học, cơ chế phân tử và các nghiên cứu về đa hình di truyền liên quan đến ung thư phổi:

Dịch tễ học và các yếu tố nguy cơ

Tác giả dẫn chứng số liệu dịch tễ toàn cầu và Hoa Kỳ (năm 2016 có khoảng 224.390 ca mắc mới và 158.080 ca tử vong, chiếm 26,5% tổng số tử vong do ung thư). Tại Trung tâm Hô hấp - Bệnh viện Bạch Mai, số bệnh nhân ung thư phổi nhập viện tăng liên tục qua các giai đoạn (1969 - 1972: 89 ca; 1974 - 1978: 186 ca; 1981 - 1985: 285 ca; 1996 - 2000: 639 ca, chiếm 16,6% tổng số bệnh nhân điều trị). Về căn nguyên, hút thuốc lá là yếu tố chính liên quan đến 80 - 85% trường hợp, làm tăng nguy cơ mắc bệnh từ 10 - 20 lần; khói thuốc chứa hơn 4.000 hóa chất và hơn 60 chất gây ung thư, đặc biệt là các hydrocarbon thơm đa vòng (PAHs) như 3,4-benzopyrene, nitrosamin và hạt alpha từ polonium. Các yếu tố khác bao gồm khí phóng xạ radon trong nhà và môi trường nghề nghiệp, amiăng, silic, kim loại nặng và tính nhạy cảm di truyền gia đình.

Các biến đổi phân tử trong ung thư phổi

Luận án điểm lại các con đường tín hiệu thông qua thụ thể tyrosine kinase (RTKs) như EGFR, MET, HER2, c-KIT, IGF-1R và EML4-ALK kích hoạt dòng thác RAS/RAF/MEK/MAPK, PI3K/AKT và JAK/STAT (theo Herbst, Brambilla, Pass và cộng sự):

  • Đột biến gen EGFR: Gặp ở các exon 18 - 21, gồm nhóm I (mất đoạn exon 19 ΔLRE, chiếm 45%), nhóm II (đột biến điểm L858R ở exon 21 chiếm 41%, G719 chiếm 5%), nhóm III (lặp đoạn/thêm đoạn exon 20 chiếm 1%).
  • Dung hợp gen EML4-ALK: Do đảo đoạn trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 2 inv(2)(p21;p23), xuất hiện ở khoảng 7% (3 - 13%) bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN).
  • Đột biến KRAS: Chiếm 15 - 25% UTPKTBN, chủ yếu ở codon 12 (82%) và codon 13 (17%) thuộc exon 2.
  • Các biến đổi khác: Đột biến BRAF (V600E 50%, G469A 39%, D594G 11%), dung hợp ROS1 (với CD74, SLC34A2, FIG chiếm ~2%), tái sắp xếp RET (KIF5B-RET chiếm chủ yếu), đột biến MAP2K1 (~1%), MET, và đột biến các gen áp chế ung thư như TP53 (gặp ở 90% ung thư phổi tế bào nhỏ và 65% UTPKTBN), PTEN (~5%), LKB1/STK11 (11 - 30% ung thư biểu mô tuyến).

Các nghiên cứu quốc tế về đa hình gen TP53 và MDM2

  • Gen TP53: Đa hình codon 72 (Arg72Pro hay R72P) đã được Kawajiri (1993) và Fan (2000) báo cáo làm tăng nguy cơ ung thư phổi ở người hút thuốc (kiểu gen Pro/Pro tăng 1,7 lần nguy cơ). Phân tích gộp của Li và cộng sự trên 23 nghiên cứu (15.495 bệnh nhân và 8.362 chứng) ghi nhận nguy cơ tương đối ở kiểu gen Pro/Pro là OR = 1,221 và ở người mang alen Pro là OR = 1,148; ở người châu Á, Pro/Pro có OR = 1,395; người mang alen Pro có hút thuốc có OR = 1,44. Phân tích của Wang và cộng sự trên quần thể châu Á ghi nhận OR = 1,14. Nghiên cứu của Felley-Bosco và Mostaid (2014) khảo sát đa hình codon 47 (P47S).
  • Gen MDM2: Đa hình promoter SNP309 T>G (rs2279744) làm tăng ái lực gắn của yếu tố phiên mã SP1, dẫn đến tăng tổng hợp MDM2 gấp 2,5 lần ở kiểu gen G/G so với T/T, làm suy giảm chức năng p53. Phân tích gộp của Gui và cộng sự trên 6.063 bệnh nhân và 6.678 chứng cho thấy kiểu gen G/G có nguy cơ mắc ung thư phổi cao hơn (OR = 1,17; 95% CI: 1,02 - 1,34). Bai và cộng sự (2009) ghi nhận kiểu gen G/G làm tăng nguy cơ ung thư phổi ở người không hút thuốc lên 1,36 lần (OR = 1,36; 95% CI: 1,10 - 1,68). Nghiên cứu của Wenwu He và Wenlei Zhuo chỉ ra nguy cơ tăng ở nữ giới và nhóm không hút thuốc, trong khi một số tác giả tại Hàn Quốc và Trung Quốc ghi nhận sự phối hợp giữa TP53 R72P và MDM2 SNP309 làm tăng mạnh OR lên 4,56 (và OR = 10,41 khi kết hợp thêm yếu tố hút thuốc lá).

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án hướng tới là xác định tần số phân bố kiểu gen, alen của 7 vị trí đa hình trên gen TP53 và SNP309 trên gen MDM2, đồng thời phân tích mối liên quan của các đa hình này độc lập và phối hợp với yếu tố hút thuốc lá trên bệnh nhân ung thư phổi người Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết

Luận án dựa trên cơ sở sinh học phân tử của con đường p53 - MDM2:

  • Protein p53: Phosphoprotein 53 kDa gồm 393 acid amin, mã hóa bởi gen TP53 tại 17p13.1 (dài 20 kb, 11 exon). Protein gồm 3 vùng: vùng hoạt hóa N tận (chứa miền 1-42 tương tác MDM2 và miền 61-94 giàu prolin quy định chức năng apoptosis), vùng gắn DNA (102-292), và vùng C tận (324-355 tetramer hóa; 363-393 điều hòa). p53 kiểm soát chu kỳ tế bào qua p21 (ức chế cyclin E-CDK2 và cyclin D1-CDK4, duy trì pRB không phosphoryl hóa để giữ E2F), GADD45 và 14-3-3δ (ngăn phức hợp cyclin B/CDC2 để dừng pha G2/M); kích hoạt apoptosis qua con đường nội sinh/ty thể (Bax, Puma, Noxa, Apaf-1) và con đường thụ thể ngoại sinh (Fas/CD95, DR5/KILLER).
  • Protein MDM2: Protein 491 acid amin, mã hóa bởi gen MDM2 tại cánh dài nhiễm sắc thể số 12 (12 exon, 1 intron). MDM2 có vùng N tận gắn p53, vùng RING ở C tận mang hoạt tính E3 ubiquitin ligase vận chuyển p53 ra khỏi nhân để thoái giáng tại proteasome, tạo vòng điều hòa ngược âm tính với p53.
Gen Vị trí nhiễm sắc thể Đa hình khảo sát Vị trí phân tử Ý nghĩa chức năng
TP53 17p13.1 dup16 Intron 3 Thêm đoạn 16bp, làm giảm biểu hiện protein p53
TP53 17p13.1 P34P Exon 4 (Codon 34: CCC→CCA) Đa hình đồng nghĩa (Prolin), ảnh hưởng dịch mã/gắn MDM2
TP53 17p13.1 P36P Exon 4 (Codon 36: CCG→CCA) Đa hình đồng nghĩa (Prolin), nằm ở vùng tương tác N tận
TP53 17p13.1 P47S Exon 4 (Codon 47: CCG→TCG) Thay Prolin bằng Serin, giảm phosphoryl hóa Ser46, giảm apoptosis
TP53 17p13.1 R72P Exon 4 (Codon 72: CGC→CCC) Thay Arginin bằng Prolin, thay đổi hoạt tính bắt giữ chu kỳ/apoptosis
TP53 17p13.1 V217M Exon 6 (Codon 217: GTG→ATG) Thay Valin bằng Methionin tại vùng gắn DNA
TP53 17p13.1 G360A Exon 10 (Codon 360: GGG→GCG) Thay Glycin bằng Alanin tại vùng nối C tận
MDM2 12q SNP309 T>G Intron 1 (Promoter) Tăng ái lực SP1, tăng nồng độ MDM2 gấp 2,5 lần, ức chế p53

Phương pháp nghiên cứu

  • Thiết kế: Nghiên cứu mô tả cắt ngang có đối chứng (Case-Control Study).
  • Cỡ mẫu: Áp dụng công thức so sánh hai tỷ lệ của Tổ chức Y tế Thế giới ($P_1 = 0,3$; $P_2 = 0,2$), cỡ mẫu tối thiểu là 178 bệnh nhân và 178 đối chứng. Luận án thu thập thực tế 220 bệnh nhân và 230 đối chứng.
  • Tiêu chuẩn bệnh nhân: Chẩn đoán xác định ung thư phổi nguyên phát bằng mô bệnh học; loại trừ ung thư phổi thứ phát hoặc ung thư phối hợp.
  • Thu thập dữ liệu lâm sàng: Phỏng vấn theo mẫu bệnh án nghiên cứu gồm tuổi, giới, tiền sử hút thuốc lá (tính theo số bao-năm: số bao hút/ngày $\times$ số năm hút, 20 điếu = 1 bao).

Kỹ thuật sinh học phân tử và trang thiết bị

  1. Thu thập và xử lý mẫu: Lấy 2 ml máu toàn phần chống đông bằng EDTA, bảo quản ở nhiệt độ $-80^\circ\text{C}$.
  2. Tách chiết DNA: Sử dụng kit thương mại của Promega. Đo nồng độ và độ tinh sạch DNA bằng máy quang phổ NanoDrop 1000 tại bước sóng 260 nm và 280 nm (tiêu chuẩn đạt: nồng độ $\ge 20\text{ ng/µl}$, tỷ số $A_{260}/A_{280}$ từ 1,8 đến 2,0; pha loãng các mẫu $> 300\text{ ng/µl}$ về mức $< 100\text{ ng/µl}$). Kiểm tra độ nguyên vẹn của DNA bằng điện di gel agarose.
  3. Kỹ thuật xác định đa hình:
    • Đa hình dup16 gen TP53: Khuếch đại vùng gen chứa intron 3 bằng kỹ thuật PCR trên máy GeneAmp PCR System 9700. Điện di sản phẩm trên gel agarose 3% cùng thang chuẩn DNA 100 bp. Đoạn gen nguyên thủy có kích thước 119 bp, đoạn mang đột biến thêm 16 bp có kích thước 135 bp. Kiểu gen $A_1A_1$ (đồng hợp không lặp) xuất hiện 1 băng 119 bp; kiểu gen $A_1A_2$ (dị hợp) xuất hiện 2 băng 119 bp và 135 bp; kiểu gen $A_2A_2$ (đồng hợp lặp) xuất hiện 1 băng 135 bp.
    • Đa hình TP53 R72P và MDM2 SNP309: Phân tích bằng kỹ thuật PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng hệ thống Promega Wizard SV gel clean-up và ủ cắt với enzym giới hạn đặc hiệu: enzym BstUI (nhận biết vị trí cắt $\text{CG}\downarrow\text{CG}$ tại codon 72 gen TP53, sản xuất bởi ThermoFisher Scientific) và enzym MspA1I (nhận biết vị trí cắt $\text{CCG}\downarrow\text{CTG}$ tại vị trí 309 gen MDM2, sản xuất bởi Promega).
    • Các đa hình khác và giải trình tự kiểm chứng: Sử dụng bộ kit BigDye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing và phân tích trình tự tự động trên hệ thống máy giải trình tự ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer.
  4. Trang thiết bị hỗ trợ: Hệ thống điện di ngang Mupid (Nhật Bản), máy soi gel và chụp ảnh tự động Chemidoc EQ Bio-Rad (Hoa Kỳ), máy ly tâm Eppendorf (Đức) và Beckman (Hoa Kỳ).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 cung cấp tổng quan cơ sở lý luận và y văn về dịch tễ học ung thư phổi, các yếu tố nguy cơ nội sinh và ngoại sinh, cơ chế phân tử điều hòa tế bào, và tổng quan chi tiết về cấu trúc, chức năng của gen TP53 và MDM2:

  • Phân tích số liệu gánh nặng bệnh tật của ung thư phổi trên thế giới và tại Việt Nam, đặc biệt là tốc độ gia tăng mắc bệnh ở nữ giới và tỷ lệ nhập viện gia tăng tại Bệnh viện Bạch Mai.
  • Làm rõ cơ chế sinh ung thư do khói thuốc qua các hợp chất hydrocarbon thơm đa vòng (PAHs) và sự hình thành các gốc tự do ($10^{15}$ gốc/gam ở pha hơi và $10^{17}$ gốc/gam ở pha hạt).
  • Trình bày chi tiết các đột biến kích hoạt oncogene (EGFR, EML4-ALK, KRAS, BRAF, ROS1, RET, MET, MAP2K1) và đột biến làm mất chức năng của gen áp chế ung thư (TP53, PTEN, LKB1).
  • Khái quát định nghĩa SNP (chiếm ~80% biến dị di truyền người, tần số $\ge 1%$), phân loại SNPs chức năng và SNPs liên kết, cùng ứng dụng trong nghiên cứu so sánh toàn hệ gen (GWAS).
  • Trình bày chi tiết cấu trúc phân tử của protein p53 (393 acid amin, các miền hoạt hóa, gắn DNA, tetramer hóa) và protein MDM2 (491 acid amin, miền RING mang hoạt tính E3 ligase), cơ chế điều hòa ngược p53 - MDM2, cùng các bằng chứng quốc tế về đa hình codon 72, codon 47, intron 3 của TP53 và SNP309 của MDM2.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu:

  • Xây dựng tiêu chuẩn chọn mẫu chặt chẽ cho 220 ca bệnh ung thư phổi nguyên phát và 230 ca đối chứng tại Bệnh viện Bạch Mai.
  • Thiết lập quy trình thu thập thông tin dịch tễ, phân loại mô bệnh học và tính toán chỉ số gói-năm (pack-years) để định lượng mức độ phơi nhiễm khói thuốc lá.
  • Mô tả quy trình chuẩn hóa từ khâu lấy máu, bảo quản mẫu ở $-80^\circ\text{C}$, tách chiết DNA bằng kit Promega và kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch bằng máy NanoDrop 1000 ($A_{260}/A_{280} = 1,8 - 2,0$).
  • Quy chuẩn điều kiện phản ứng PCR, điều kiện cắt enzym giới hạn (BstUI cho TP53 R72P; MspA1I cho MDM2 SNP309), kỹ thuật điện di gel agarose nồng độ 3% và quy trình giải trình tự gen chu kỳ trên hệ thống tự động ABI PRISM 3100-Avant.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt lý luận và khoa học

  • Luận án là công trình đầu tiên tại Việt Nam tiến hành khảo sát đồng thời tính đa hình của gen TP53 (bao gồm đa hình dup16 tại intron 3 và 6 SNPs trên các exon 4, 6, 10) và gen MDM2 (SNP309 T>G) trên bệnh nhân ung thư phổi so sánh với nhóm chứng người Việt Nam.
  • Cung cấp dữ liệu nhân trắc di truyền phân tử về tần số xuất hiện của các alen và kiểu gen bình thường cũng như biến thể của TP53 và MDM2 trong quần thể người Việt, bổ sung dữ liệu cho cơ sở dữ liệu hệ gen khu vực Đông Nam Á và châu Á.
  • Làm sáng tỏ vai trò độc lập và sự tương tác giữa các kiểu gen đa hình của TP53 và MDM2 với yếu tố môi trường (thói quen hút thuốc lá) trong việc làm thay đổi nguy cơ mắc ung thư phổi.

Đóng góp về mặt thực tiễn

  • Chuẩn hóa quy trình kỹ thuật sinh học phân tử kết hợp giữa PCR, PCR-RFLP và giải trình tự gen trực tiếp Sanger để xác định chính xác các kiểu gen đa hình TP53 và MDM2 từ mẫu máu ngoại vi.
  • Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học hỗ trợ định hướng sàng lọc các cá thể mang kiểu gen nhạy cảm có nguy cơ cao (đặc biệt ở nhóm đối tượng có tiền sử hút thuốc lá), tạo tiền đề cho việc ứng dụng y học cá thể hóa trong dự phòng và phát hiện sớm ung thư phổi.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

  • Nghiên cứu được thực hiện theo thiết kế mô tả cắt ngang có đối chứng tại một trung tâm y tế tuyến cuối (Bệnh viện Bạch Mai) trong giai đoạn 2013 - 2014, chưa bao phủ toàn bộ các vùng địa lý khác nhau tại Việt Nam.
  • Luận án tập trung vào đánh giá tính đa hình DNA từ máu ngoại vi và phân tích nguy cơ mắc bệnh, chưa kết hợp định lượng nồng độ biểu hiện protein p53 và MDM2 trong mô khối u để đối chiếu trực tiếp mức độ biến đổi chức năng.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Mở rộng nghiên cứu theo dõi dọc trên bệnh nhân ung thư phổi mang các kiểu gen đa hình khác nhau để đánh giá mối liên quan với đáp ứng điều trị hóa chất, xạ trị, các liệu pháp nhắm trúng đích và thời gian sống thêm (OS, PFS).
  • Khảo sát mở rộng thêm các SNPs khác trên các gen thuộc con đường sửa chữa DNA (như con đường NER: MMS19L, RRM1, ERCC5) và phân tích đa biến tương tác gen - gen, gen - môi trường trên cỡ mẫu lớn hơn.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo cho:

  • Bác sĩ lâm sàng chuyên ngành Ung bướu và Hô hấp: Cung cấp kiến thức về cơ chế bệnh sinh phân tử, các biến đổi di truyền nhạy cảm và mối liên quan giữa yếu tố nguy cơ hút thuốc lá với các biến dị gen trong ung thư phổi.
  • Nhà nghiên cứu và học viên sau đại học chuyên ngành Hóa sinh Y học, Di truyền Y học và Sinh học Phân tử: Tham khảo quy trình thiết kế nghiên cứu bệnh - chứng, kỹ thuật chiết tách DNA chuẩn hóa, thiết kế mồi, phản ứng PCR-RFLP sử dụng enzym cắt giới hạn (BstUI, MspA1I) và phương pháp giải trình tự gen Sanger trên hệ thống tự động ABI PRISM 3100-Avant.

Câu hỏi thường gặp

1. Hai mục tiêu chính của luận án là gì?

Mục tiêu 1 là xác định tỷ lệ kiểu gen của một số đa hình gen TP53 và gen MDM2 ở bệnh nhân ung thư phổi và người bình thường. Mục tiêu 2 là phân tích mối liên quan giữa một số đa hình gen TP53 và gen MDM2 với nguy cơ mắc ung thư phổi.

2. Cỡ mẫu và tiêu chuẩn lựa chọn nhóm bệnh, nhóm chứng được xác định ra sao?

Cỡ mẫu nghiên cứu gồm 220 bệnh nhân ung thư phổi nguyên phát (được xác định bằng mô bệnh học tại Bệnh viện Bạch Mai, không mắc ung thư thứ phát hay ung thư kết hợp) và 230 người khỏe mạnh làm chứng (đến khám tại Khoa Khám bệnh - Bệnh viện Bạch Mai, không mắc bệnh ác tính, tương đồng về tuổi và giới). Cỡ mẫu được tính theo công thức so sánh 2 tỷ lệ của WHO với yêu cầu tối thiểu 178 đối tượng mỗi nhóm.

3. Những vị trí đa hình nào trên gen TP53 và MDM2 được phân tích trong nghiên cứu?

  • Gen TP53: Đa hình thêm đoạn 16bp tại intron 3 (dup16); SNP P34P (codon 34, exon 4); SNP P36P (codon 36, exon 4); SNP P47S (codon 47, exon 4); SNP R72P (codon 72, exon 4); SNP V217M (codon 217, exon 6); SNP G360A (codon 360, exon 10).
  • Gen MDM2: Đa hình SNP309 T>G (rs2279744) tại vùng promoter thuộc intron 1.

4. Luận án đã sử dụng những kỹ thuật sinh học phân tử nào để phát hiện các kiểu gen?

Tác giả sử dụng kỹ thuật PCR phân tích kích thước đoạn khuếch đại trên gel agarose 3% để phát hiện đa hình dup16 gen TP53; kỹ thuật PCR-RFLP sử dụng enzym cắt giới hạn BstUI (cho SNP codon 72 gen TP53) và enzym MspA1I (cho SNP309 gen MDM2); và kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp bằng kit BigDye Terminator v3.0 trên hệ thống ABI PRISM 3100-Avant. Độ tinh sạch của DNA được kiểm định bằng máy NanoDrop 1000.

5. Cơ chế phân tử của đa hình MDM2 SNP309 T>G tác động lên sự hình thành ung thư như thế nào?

Biến thể nucleotid từ T thành G tại vị trí 309 trong vùng promoter (intron 1) làm gia tăng ái lực liên kết của yếu tố phiên mã SP1 với gen MDM2. Sự liên kết này làm tăng tổng hợp protein MDM2 lên 2,5 lần ở kiểu gen đồng hợp tử G/G so với T/T. Nồng độ MDM2 tăng cao làm tăng giáng hóa và ức chế protein áp chế khối u p53, khiến tế bào mất khả năng kiểm soát chu kỳ và giảm đáp ứng chết theo chương trình, tạo điều kiện thuận lợi cho tế bào ung thư phát sinh và tiến triển.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của Trần Khánh Chi đã thực hiện nghiên cứu mô tả cắt ngang có đối chứng trên 220 bệnh nhân ung thư phổi nguyên phát và 230 đối chứng tại Bệnh viện Bạch Mai nhằm đánh giá tính đa hình của gen TP53 và MDM2. Bằng việc chuẩn hóa các kỹ thuật PCR, PCR-RFLP và giải trình tự gen Sanger, luận án đã xác định tỷ lệ phân bố kiểu gen của 7 đa hình trên gen TP53 cùng đa hình SNP309 trên gen MDM2. Công trình làm rõ mối liên quan giữa các biến dị di truyền này với nguy cơ ung thư phổi trong mối tương tác với thói quen hút thuốc lá. Đây là tài liệu khoa học có giá trị tham khảo cao về phương pháp luận và kỹ thuật xét nghiệm sinh học phân tử trong chuyên ngành Hóa sinh Y học và Ung bướu.