Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường

Luận án tiến sĩ nghiên cứu sinh học nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn burkholderia, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng dụng

• Tác giả: Trần Thị Lệ Quyên
• Người hướng dẫn: TS. Trịnh Thành Trung
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• 1.2. DANH MỤC CÁC HÌNH
• 1.3. DANH MỤC BẢNG
• 2. VI KHUẨN Burkholderia pseudomallei VÀ BỆNH NHIỄM TRÙNG MELIOIDOSIS
• 2.1. Giới thiệu về chi vi khuẩn Burkholderia và loài B. pseudomallei
• 2.2. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn B. pseudomallei
• 2.3. Bệnh nhiễm trùng melioidosis
• 2.4. Phân bố vi khuẩn B. pseudomallei và ca nhiễm melioidosis
• 3. NGHIÊN CỨU VỀ B. pseudomallei VÀ MELIOIDOSIS TẠI VIỆT NAM
• 3.1. Nghiên cứu về B. pseudomallei
• 3.2. Nghiên cứu điều tra ca nhiễm melioidosis
• 4. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM VI KHUẨN B. pseudomallei TỪ MẪU BỆNH PHẨM LÂM SÀNG
• 4.1. Các phương pháp xét nghiệm phụ thuộc nuôi cấy
• 4.2. Các phương pháp xét nghiệm không phụ thuộc nuôi cấy
• 5. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN B. pseudomallei NGOÀI MÔI TRƯỜNG
• 5.1. Phương pháp nuôi cấy
• 5.2. Phương pháp sinh học phân tử
• 6. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN
• 6.1. Cách tiếp cận của nghiên cứu phát triển kỹ thuật xét nghiệm nhanh melioidosis
• 6.2. Các tiếp cận của nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện vi khuẩn B. pseudomallei
• 7. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 7.1. Nguyên vật liệu
• 7.2. Hóa chất và thiết bị
• 7.3. Phương pháp nghiên cứu
• 7.3.1. Kỹ thuật ELISA xét nghiệm nhanh melioidosis
• 7.3.2. Kỹ thuật nuôi cấy làm giàu phát hiện B. pseudomallei ngoài môi trường
• 7.3.3. Định lượng vi khuẩn B. pseudomallei từ mẫu môi trường
• 7.3.4. Phương pháp phân tích đa hình trình tự các kiểu gen MLST
• 7.3.5. Thống kê xử lý số liệu
• 8. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 8.1. Phát triển kỹ thuật ELISA xét nghiệm nhanh melioidosis
• 8.2. Đánh giá hiệu quả xét nghiệm melioidosis của WC/Hcp1-ELISA
• 8.3. Phát triển kỹ thuật nuôi cấy phát hiện B. pseudomallei ngoài môi trường
• 8.4. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy làm giàu hai bước trong điều tra sự có mặt của B. pseudomallei ngoài môi trường
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ
• LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu về vi khuẩn Burkholderia pseudomallei

Vi khuẩn Burkholderia pseudomallei là một trong những tác nhân gây bệnh melioidosis, một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm với tỷ lệ tử vong cao. Vi khuẩn này thường sống trong đất và nước ở các vùng nhiệt đới. Theo các nghiên cứu, Việt Nam nằm trong khu vực có nguy cơ cao về melioidosis, với ước tính hàng ngàn ca nhiễm mỗi năm. Tuy nhiên, số ca được ghi nhận thực tế lại rất thấp, cho thấy sự cần thiết phải cải thiện các phương pháp phát hiện vi khuẩn này. Việc phát hiện sớm và chính xác vi khuẩn này là rất quan trọng để điều trị kịp thời cho bệnh nhân. Các phương pháp hiện tại như nuôi cấy vi sinh và xét nghiệm PCR có những hạn chế nhất định, đặc biệt là về thời gian và độ nhạy. Do đó, nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới để phát hiện Burkholderia pseudomallei là rất cần thiết.

II. Các phương pháp phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng có hai phương pháp chính để phát hiện Burkholderia pseudomallei: nuôi cấy vi sinh và xét nghiệm PCR. Phương pháp nuôi cấy vi sinh được coi là tiêu chuẩn vàng nhưng thường kéo dài từ 3 đến 5 ngày, trong khi bệnh nhân có thể tử vong trong vòng 48 giờ nếu không được điều trị kịp thời. Ngược lại, xét nghiệm PCR cho kết quả nhanh hơn nhưng không thể thay thế cho nuôi cấy vi sinh. Do đó, việc phát triển các kỹ thuật xét nghiệm nhanh như ELISA là cần thiết. Kỹ thuật này không chỉ giúp phát hiện nhanh mà còn có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp cải thiện khả năng chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân melioidosis.

III. Phát triển kỹ thuật ELISA trong phát hiện melioidosis

Luận án đã phát triển thành công kỹ thuật ELISA sử dụng kháng nguyên từ Burkholderia pseudomallei với độ nhạy lên tới 98,4% và độ đặc hiệu 95,1%. Kỹ thuật này cho phép phát hiện nhanh melioidosis từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng trong thời gian dưới 2 giờ. Việc ứng dụng kỹ thuật này tại các bệnh viện như Bệnh viện Đa khoa tỉnh Hà Tĩnh và Bệnh viện Trung ương Huế đã cho thấy hiệu quả rõ rệt trong việc chẩn đoán sớm bệnh. Điều này không chỉ giúp giảm tỷ lệ tử vong mà còn nâng cao chất lượng điều trị cho bệnh nhân. Kỹ thuật ELISA này có thể được coi là một bước tiến quan trọng trong việc phát hiện và điều trị melioidosis.

IV. Kỹ thuật nuôi cấy làm giàu trong phát hiện vi khuẩn ngoài môi trường

Nghiên cứu cũng đã phát triển kỹ thuật nuôi cấy làm giàu hai bước để phát hiện Burkholderia pseudomallei trong môi trường. Kỹ thuật này cho thấy tỷ lệ phát hiện cao hơn gần 2 lần so với phương pháp nuôi cấy chuẩn. Việc áp dụng kỹ thuật này trong điều tra sự có mặt của vi khuẩn tại các khu vực như Triệu Sơn và Sóc Sơn đã cho kết quả khả quan. Điều này không chỉ giúp nâng cao khả năng phát hiện vi khuẩn mà còn cung cấp thông tin quan trọng cho các nghiên cứu về dịch tễ học và độc lực của Burkholderia pseudomallei. Kỹ thuật này có thể được áp dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về vi sinh vật và sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Burkholderia pseudomallei là trực khuân Gram âm sống hoại sinh trong đất và trong nước ở các vùng nhiệt đới. Loài vi khuẩn này là căn nguyên gây nhiễm trùng melioidosis - bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, có tỉ lệ tử vong cao (40%) và nhanh. Việt Nam được coi là nước nam trong tam điểm lưu hành của melioidosis ở cấp báo động đỏ (cấp cao nhất) trên bản đồ dịch tễ học toàn cầu với dự đoán 10.430 ca nhiễm mỗi năm, trong đó 4.703 ca tử vong. Tuy nhiên, theo số liệu điều tra trong 7 tháng năm 2015 tại 5 bệnh viện ở Bắc Trung Bộ, chỉ có 70 ca nhiễm melioidosis được ghi nhận.

Số liệu này phản ánh tỷ lệ phát hiện melioidosis tại nước ta còn rất xa so với số ca nhiễm dự đoán (chỉ bằng khoảng 1,5%). Trong chân đoán melioidosis, nuôi cấy vi sinh được xem là “tiêu chuẩn vàng”. Tuy nhiên, xét nghiệm vi sinh tại các bệnh viện gap rất nhiều khó khăn và đòi hỏi người xét nghiệm phải được dao tạo và có nhiều kinh nghiệm trong việc nhận dạng khuẩn lạc B. Hơn nữa, xét nghiệm B.

pseudomallei theo quy trình nuôi cấy và phân loại thường quy thường kéo dài từ 3 đến 5 ngày, trong khi đó các bệnh nhân melioidosis sốc nhiễm khuẩn huyết có thể tử vong trong 48 giờ nhập viện nếu không được điều tri kịp thời và đúng phác đồ kháng sinh. Điều này đặt ra yêu cầu cấp thiết cần phải có các quy trình xét nghiệm nhanh vi khuẩn B. pseudomallei dé phục vụ cho điều trị bệnh nhân kịp thời. Bên cạnh đó, do B.

pseudomallei tồn tại tự nhiên ngoài môi trường nên việc hiểu về dịch tễ học vi khuẩn rất có ý nghĩa với sức khỏe cộng đồng. Hiện nay, hai phương pháp chính được dùng trong điều tra B. pseudomallei ngoài môi trường là nuôi cấy phân lập và real-time PCR gen đặc hiệu vi khuẩn B. Trong đó, phương pháp nuôi cấy phân lập theo hướng dẫn chuẩn tuy đã có những thành công trong việc phát hiện B.

pseudomallei từ đất, nhưng độ nhạy của phương pháp chưa cao và không đồng đều ở các địa điểm nghiên cứu. Trong khi đó, phương pháp real-time PCR cho độ nhạy cao hơn so với nuôi cấy phân lập, nhưng kết quả đương tính chỉ là nhận định ban đầu về khu vực nguy cơ 6 nhiễm vi khuẩn mà không thé thay thế cho nuôi cay phan lập được chung vi khuẩn vừa dé khẳng định sự có mặt của vi khuẩn ngoài môi trường vừa dé phục vụ cho các nghiên cứu về độc lực và dịch tễ học. Vì vậy, việc phát triển phương pháp nuôi cấy phân lập có độ nhạy cao trong điều tra vi khuan B. pseudomallei ngoài môi trường vẫn được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu.

Đề tài “Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật mới ứng dụng để phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và ngoài môi trường” được thực hiện nhằm phát triển kỹ thuật mới phục vụ xét nghiệm nhanh melioidosis trong lâm sàng, và điều tra vi khuẩn B. pseudomallei ngoài môi trường với độ nhạy cao. Mục tiêu của nghiên cứu: - Phát triển và ứng dụng được kỹ thuật miễn dịch xét nghiệm nhanh melioidosis từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng. - Phát triển và ứng dụng được kỹ thuật nuôi cấy có độ nhạy cao đề điều tra vi khuẩn B.

pseudomallei ngoài môi trường. Tính mới của luận án: - Phát triển thành công kỹ thuật WC/Hcp1-ELISA sử dụng kháng nguyên chủng B. pseudomallei VTCC 70157 thuộc ST46 phổ biến ở Việt Nam để xét nghiệm melioidosis ở người Việt có độ nhạy và độ đặc hiệu cao (tương ứng 98,4% và 95,1%) với thời gian xét nghiệm nhanh dưới 2 giờ. Kỹ thuật được ứng dụng dé xét nghiệm melioidosis tại bệnh viện đa khoa tỉnh Hà Tĩnh và bệnh viện Trung ương Huế.

- Phát triển thành công kỹ thuật nuôi cấy làm giàu hai bước (TBSS-C50 48 giờ + EM 96 giờ) điều tra B. pseudomallei trong đất với tỷ lệ phát hiện cao hơn gần 2 lần so với hướng dẫn chuẩn (TBSS-C50 48 gid) khi đánh giá bằng real-time PCR TTSS1; cao hơn 6 lần khi đánh giá bằng phân lập trên đĩa thạch Ashdown. Kỹ thuật được ứng dụng điều tra sự có mặt của vi khuan B. pseudomallei ngoài môi trường tại Triệu Sơn (tỉnh Thanh Hóa) và Sóc Sơn (thành phố Hà Nội).

VI KHUAN Burkholderia pseudomallei VÀ BỆNH NHIEM TRÙNG MELIOIDOSIS 1. Giới thiệu về chi vi khuẩn Burkholderia và loài B. pseudomallei Chi vi khuẩn Burkholderia thuộc họ Burkholderiaceae, bộ Burkholderiales, lớp Betaproteobacteria, ngành Proteobacteria (Vio et al. Một trong các loài đầu tiên của chi Burkholderia được mô tả là Burkholderia caryophylli (trước đây được gọi là Phytomonas caryophylli) - gây bệnh thối thân ở thực vật (Dowson, 1929).

Năm 1942, loài vi khuẩn này đã được nhà vi sinh vật học người Mỹ là Walter Burkholder phân loại lại vào chi Pseudomonas nhóm II với tên gọi là Pseudomonas caryophylli (Burkholder, 1942). Sau đó, Walter Burkholder cũng phat hiện và mô ta một loài vi khuẩn là tác nhân gây thối củ hành tây có tên là Pseudomonas cepacia (Burkholder, 1950). Năm 1992, Yabuuchi và cs đã phân loại lai chi Pseudomonas nhóm II thành chỉ Burkholderia gồm 7 loài (Yabuuchi et al. Tên “Burkholderia” được đặt để vinh danh nhà vi sinh vật học Walter Burkholder (Yabuuchi et al.

Là những loài đầu tiên thuộc chi Burkholderia, B. mallei là tác nhân gây bệnh cho người và động vật; B. gladioli gây bệnh trên thực vật; loài B. cepacia theo mô tả ban đầu là tác nhân gây bệnh thối củ trên hành tây; riêng 2 loài B.

solanacearum gay bệnh trên thực vật và B. pickettii gây bệnh co hội trên người sau đó được chuyển sang chi Ralstonia (Eberl and Vandamme, 2016). cepacia sau đó được chỉ định là loài chuẩn thuộc chi này, và được biết đến như là tác nhân gây nhiễm trùng ở bệnh nhân xơ nang và suy giảm miễn dịch (Depoorter et al. Những năm sau đó, hệ thống phân loại của chỉ Burkholderia liên tục được cập nhật.

Sawana va cs đã sử dụng trình tự gen 16S rRNA của 45 loài thuộc chi Burkholderia, và 21 loại protein có độ bảo thủ cao dé nghiên cứu su mat hoặc chèn trình tự bảo thủ (conserved sequence insertions or deletions - CSIs) (Sawana et al. Kết qua của nghiên cứu cho thấy sự phân tách chi Burkholderia thành 2 nhánh chính: nhánh I là chi Burkholderia chỉ gồm hon 30 loài Burkholderia có liên quan đến khả năng gây bệnh trên người, động vật và thực vật; và nhánh II là 74 loài còn lại chủ yếu được phân lập từ môi trường và không được ghi nhận gây bệnh cho các sinh vật bậc cao. Từ đó, chỉ Paraburkholderia đã được đề xuất cho các loài thuộc nhánh II này (Vio et al. Tuy nhiên, các quan điểm của giới khoa học trong sự phân chia chi Burkholderia còn trái chiều, vì hai nhóm không được phân biệt rõ ràng (Eberl and Vandamme, 2016).

Do vậy, Ủy ban Quốc tế về Hệ thống hóa Sinh vật Nhân sơ, Tiểu ban Phân loại Rhizobium va Agrobacterium gần đây đã nêu ra sự cần thiết phải có một phương pháp tiếp cận thuyết phục hơn để làm sáng tỏ phân loại chi Burkholderia (de Lajudie and Young, 2017). Sự phân nhánh của Burkholderia sensu lato (Vio et al., 2020) Số Ạ Nhánh lượng Đặc điểm thân nhánh Loài đại diện Ỹ N (loài) la B. cepacia complex Có khả năng TY v2 TẠI ¬“ I ALA Ð B. pseudomallei và các loài có i Burkholderia >30 gây bệnh trên người, động vat Pp quan héc hohẹ hang gan sensu stricto và thực vật Ic Các loài gây bệnh thực vật như B.

gladioli Phân lập từ môi Ta Các loài Burkholderia Sp. ` ` chưa được đặt tên trường và II $74 không được ghi lb Các loài Burkholderia sp. Paraburkholderia nhận gây bệnh phân lập từ môi trường cho các sinh vật _ | Burkholderia sp. JPY347 và bậc cao Khác _ B.

rhizoxinica Thuộc chi Burkholderia, loài B. pseudomallei là vi khuan gây nhiễm trùng melioidosis - bệnh được Whitmore và Krishnaswami mô tả lần đầu tiên ở Rangoon, Myanmar vào năm 1912 (Whitmore and Krishnaswami, 1912). Do có sự tương đồng về các đặc điểm sinh học với loài vi khuan B. mailei (trước đây gọi là Bacillus mallei) gây bệnh glander, vi khuan này đã được đặt tên là Bacillus pseudomallei.

Trong quá trình phân loại, vi khuẩn này còn được biết đến với nhiều tên khác nhau như Bacillus whitmorii, Malleomyces pseudomallei, Pseudomonas pseudomallei va cuối cùng là B. pseudomallei (Yabuuchi et al. Do độc lực cao, khả năng gây bệnh nguy hiém cho người và động vật cùng với môi lo ngại về việc lây truyén qua đường khí dung, B. pseudomallei đã được Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh Hoa Kỳ (US CDC) phân loại là tác nhân gây khủng bồ sinh học ở cấp độ vi sinh vật nguy hiểm loại B (Rotz et al.

Trên cây phát sinh chủng loại, B. pseudomallei cùng với 2 loài B. thailandensis có quan hệ rất gần gũi với nhau (Hình 1. mallei ký sinh bắt buộc trên động vật và cũng được CDC xếp vào nhóm tác nhân đe dọa sinh học cấp độ B (Rotz et al.

thailandensis phân bỗ tự nhiên trong đất và trong nước và không gây bệnh cho người và động vat (Brett et al.005 = Burkholderia lata 383" (CP000150) Burkholderiapaludis MSh1" (KT159931) Burkholderia cenocepacia J2315" (AM747720) Burkholderia anthina R-4183" (AJ420880) Burkholderia seminalis R-24196T (AM747631) 59' Burkholderia cepacia ATCC 25416! (AXBO01000009) 61 Burkholderia metallica R-16017' (AM747632) TT — Burkholderia diffusa R-15930" (AM747629) [ t Burkholderia ambifaria AMMD' (CP000442) 52 61 Burkholderia stabilisLMG 14294" (AF 148554) 97L Burkholderia pyrrociniaLMG 141917 (U96930) Burkholderia multivorans ATCC BAA-247T (ALIW01000278) r~ Burkholderia latens R-5630" (AM747628) | |e vietnamiensis LMG 109297 (AF097534) 58 — Burkholderia dolosa LMG 18943 (JX986970) Burkholderia ubonensis CIP 107078! (EU024179) s2 Burkholderia pseudomultivorans LMG 26883" (HE962386) 97 a Burkholderia rinojensis A396" (KF650996) Burkholderia glumae LMG 2196" (AMRF01000003) 7| T———— Burkholderia plantarii LMG 9035" (U96933) 85 L————— Burkholderia gladioliC|P 105410" (EU024168) Burkholderia oklahomensis C6786" (ABBG01000575) ra Burkholderia thailandensis E264" (CP000086) 95 Burkholderia pseudomallei ATCC 23343" (DQ108392) 99 |_ Burkholderia mallei ATCC 23344! (CP000011) Burkholderia caryophylliATCC 25418" (AB021423) 99 Burkholderia dabaoshanensis GIMN1. Cay phat sinh chung loai cua B. pseudomallei va cac loai quan hé ho hang. Cay được xây dung dựa trên trình tự gen 16S rRNA của các loài nghiên cứu (Ong et al.

Đặc điểm sinh học của vi khuẩn B. Đặc điểm hình thái B. pseudomallei là vì khuẩn Gram âm, hình que, kích thước (0,4-0,8) x (2,0- 5,0) um, bắt màu đậm ở hai đầu khi nhuộm Gram, có khả năng di động nhờ cụm lông roi ở đầu tế bào (Yabuuchi et al. Hai loại hình thái khuẩn lạc phổ biến thường được quan sát thấy ở vi khuẩn B.

pseudomallei là dạng khuân lạc thô ráp và nhẫn mịn (Nicholls, 1930; Chantratita et al. Thông thường, trên môi trường chọn lọc thạch Ashdown, sau 3-5 ngày nuôi cay ở 37°C, khuẩn lạc vi khuẩn có màu tím, khô và nhăn.