MỞ ĐẦU Theo thông báo của tổ chức y tế thế giới WHO, tính đến hết năm 2015 trên thế giới có khoảng 2,1 tỉ ngƣời thừa cân và béo phì. Đây là một con số báo động đối với xã hội. Béo phì đƣợc đặc trƣng bởi một nhóm các rối loạn chuyển hóa mãn tính quan trọng, bao gồm tiểu đƣờng type 2, gan nhiễm mỡ, tăng huyết áp, ung thƣ. và đặc biệt là bệnh tim mạch.
Trong số các bệnh về tim thì bệnh về mạch vành gây tỷ lệ tử vong cao nhất. Tình trạng cao cholesterol trong máu làm tích tụ cholesterol trong động mạch vành, dẫn đến sự hình thành các mảng bám, gây xơ vữa động mạch, thúc đẩy sự phát triển của bệnh mạch vành. Số liệu cho thấy, nếu nồng độ cholesterol trong máu giảm 1% thì nguy cơ mắc các bệnh liên quan đến mạch vành giảm tới 3%. Những nghiên cứu gần đây cho thấy hệ vi sinh vật là một yếu tố môi trƣờng liên quan đến việc kiểm soát trọng lƣợng cơ thể.
Ở ngƣời, hệ vi sinh đƣờng ruột chứa khoảng 1014 tế bào vi khuẩn với bảy nhóm chính đó là Firmicutes, Bacteroides, Proteobacteria, Fusobacteria, Verrucomicrobia, Cyanobacteria và Actinobacteria [1]. Các mô hình thực nghiệm cho thấy ở các đối tƣợng động vật và ngƣời béo phì có sự thay đổi trong thành phần của hệ vi sinh vật đƣờng ruột so với đối tƣợng khỏe mạnh; hệ vi sinh của những đối tƣợng béo phì có số lƣợng Firmicutes lớn hơn và ít Bacteroidetes hơn, cũng nhƣ tính đa dạng vi khuẩn tổng số bị giảm [2]. Sự thay đổi các gen của vi khuẩn tiêu biểu đƣợc coi là nguyên nhân ảnh hƣởng đến các con đƣờng chuyển hóa trong cơ thể [3]. Trong số các vi khuẩn lactic có ảnh hƣởng lớn đến trao đổi chất ở ngƣời béo phì, thì chi Lactobacillus giữ một vai trò quan trọng.
Lactobacillus là vi khuẩn lactic do sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men carbohydrate là axit lactic. Vi khuẩn Lactobacillus đƣợc cho là sở hữu những lợi ích về sức khỏe khi đƣợc sử dụng dƣới các điều kiện khác nhau. Vi khuẩn này có vai trò quan trọng trong điều trị và phòng ngừa các bệnh nhiễm trùng đƣờng ruột và 4 luan an các hội chứng sau khi dùng kháng sinh. Một số vi khuẩn Lactobacillus có thể làm giảm sự tái phát của bệnh tiêu chảy liên quan đến vi khuẩn Clostridium difficile [4], có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh viêm ruột, ngăn ngừa ung thƣ đại trực tràng và điều trị hội chứng ruột kích thích [5].
Chi Lactobacillus đã đƣợc tìm thấy đa dạng về loài và số lƣợng trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời, nơi có pH axit và số lƣợng đáng kể muối mật, chứng tỏ chúng có khả năng chống chịu muối mật và pH thấp. Sản xuất enzyme thủy phân muối mật- BSH có thể là một cơ chế đề kháng mật thông thƣờng của chi vi khuẩn này [6]. Nghiên cứu của Yuji Aiba và cộng sự đã phân lập đƣợc L. johnsonii số 1088 đã đƣợc tìm thấy có khả năng kháng axit mạnh > 10% tế bào sống sót ở pH 1.Thí nghiệm của Rajesh Kumar và cộng sự cũng cho thấy sự sống sót của các chủng Lactobacilli ở pH 2.5 và 2% muối mật sau 3 giờ [6].
Các nghiên cứu khác cũng đã chứng minh các vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus có thể làm giảm mức độ cholesterol trong huyết thanh nhờ công dụng của hoạt tính thủy phân muối mật thông qua tác động trực tiếp vào quá trình chuyển đổi muối mật của vật chủ [6]. Enzyme thủy phân muối mât (Cholylglycine hydrolase, E.24) xúc tác quá trình thủy phân muối mật, cắt đứt liên kết peptide của axit mật tự do với gốc Glycine hoặc Taurin. Các axit mật tự do (dạng giải liên hợp) sau đó sẽ bị kết tủa ở pH thấp khiến cho chúng không thể đƣợc tái hấp thu qua ruột và sẽ đƣợc thải ra ngoài cơ thể. Cholesterol là cơ chất để tổng hợp nên axit mật, vì thế việc thủy phân muối mật sẽ làm lƣợng cholesterol trong máu giảm đi, giúp cơ thể khỏe mạnh hơn, tránh nguy cơ béo phì và các bệnh tim mạch [8].
Các chủng Lactobacillus phân lập và có những đặc điểm probiotics đặc trƣng trong nghiên cứu này có một tiềm năng rất lớn để trở thành sản phẩm probiotics, là liệu pháp khả thi cho việc giảm mức cholesterol thông qua khả năng sinh enzyme thủy phân muối mật BSH. Chính vì lí do nêu trên, tôi tiến hành thực hiện luận văn với tiêu đề: " Xác định khả năng phân giải muối mật của chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ hệ tiêu hóa của ngƣời." 5 luan an Với mục tiêu: Nhằm xác định khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn Lactobacillus và các đặc điểm probiotics của các chủng vi khuẩn này. Nhiệm vụ của đề tài: - Phân lập, tuyển chọn đƣợc các chủng vi khuẩn Lactobacillus có khả năng phân giải muối mật. - Xác định các đặc điểm sinh học và đặc điểm probiotic của các chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập đƣợc.
6 luan an CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTOBACILLUS 1. Vị trí, đặc điểm chung Lactobacillus - một thành viên chính trong nhóm vi khuẩn lactic, là một chi vi khuẩn Gram dƣơng, hình que, sống kỵ khí tùy tiện hoặc yếm khí, không sinh bào tử (Hình 1. Chúng đòi hỏi môi trƣờng giàu dinh dƣỡng để sinh trƣởng nhƣ carbohydrates, amino axit, peptide, các ester của axit béo, muối, dẫn xuất axit nucleic và vitamin [10].
Nguồn: https://www.com/ Vi khuẩn Lactobacillus đƣợc phân bố từ dạ dày đến ruột già ở ngƣời và động vật với số lƣợng thay đổi phụ thuộc vào loài, tuổi của vật chủ, hoặc vị trí trong ruột. Trong phân ngƣời trƣởng thành, vi khuẩn Lactobacillus chiếm một tỷ lệ nhỏ, khoảng 0,01% đến 0,6% tổng số lƣợng vi khuẩn với các loài chiếm ƣu thế nhƣ L. Ngoài ra các loài L. sakei cũng có thể đƣợc tìm thấy trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời với mức độ thay đổi thất thƣờng [12].
Vi khuẩn này đóng vai trò chính trong lên men thực phẩm có nguồn gốc từ động vật và thực vật từ thời xa xƣa. 7 luan an Vi khuẩn Lactobacillus đƣợc cho là sở hữu những lợi ích về sức khỏe khi đƣợc sử dụng dƣới các điều kiện khác nhau. Chúng có vai trò quan trọng trong điều trị và phòng ngừa các bệnh nhiễm trùng đƣờng ruột và các hội chứng sau khi dùng kháng sinh. Một số vi khuẩn Lactobacillus có thể làm giảm sự tái phát của bệnh tiêu chảy liên quan đến vi khuẩn Clostridium difficile [4], có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh viêm ruột, ngăn ngừa ung thƣ đại trực tràng và điều trị hội chứng ruột kích thích [5].
Đƣờng tiêu hóa là nơi chính mà vi khuẩn Lactobacillus thể hiện hầu hết các hoạt tính để kiểm soát sức khỏe. Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng chịu đƣợc điều kiện khắt khe của môi trƣờng sống. Các vi khuẩn lactic có tác dụng chống lại các tác nhân gây đột biến, phá hủy các tác nhân gây ung thƣ, chống lại các bệnh liên quan đến hệ tiêu hóa và làm tăng khả năng miễn dịch [5]. Chức năng sinh học và các đặc điểm probiotic của vi khuẩn Lactobacillus Quá trình trao đổi chất để sinh trƣởng và phát triển của các chủng Lactobacillus sống trong đƣờng tiêu hóa cũng đồng thời mang lại nhiều lợi ích cho vật chủ, vì thế vi khuẩn Lactobacillus đóng góp rất nhiều vai trò trong đời sống của con ngƣời.
Một số khả năng chuyển hóa của Lactobacillus đã đƣợc phát hiện bao gồm: 1. Phân giải protein Lactobacillus sản sinh enzyme proteinase phân giải protein thành các peptide mạch ngắn [13]. Hoạt tính này của vi khuẩn giúp cho protein đƣợc cơ thể vật chủ tiêu hoá dễ dàng. Vì vậy, các chế phẩm từ hoạt động lên men của Lactobacillus đƣợc đánh giá là nguồn dinh dƣỡng có giá trị cao cho các đối tƣợng nhƣ trẻ sơ sinh, ngƣời đang dƣỡng bệnh, ngƣời già hay gia súc non [14].
Ngoài ra, trong công nghệ thực phẩm, Lactobacillus còn dùng để làm tăng hƣơng vị và tham gia kết cấu sản phẩm. Phân giải đường lactose Lactose đƣợc enzyme β-galactosidases của vi khuẩn Lactobacillus chuyển hóa thành glucose và galactose. Glucose và galactose lại tiếp tục đƣợc chuyển hóa thành sản phẩm chính là axit lactic cùng với các sản phẩm phụ nhƣ axit béo chuỗi ngắn acetate, propionate, butyrate,… [15]. Về mặt sinh lý học, axit lactic có những ƣu điểm nhƣ: tăng cƣờng khả năng tiêu hoá protein sữa thông qua sự đông vón; tăng cƣờng hoạt tính Ca, P, Fe; kích thích sự tiết dịch vị; tăng nhanh cử động đẩy nhanh thức ăn đi xuống dƣới dạ dày và là nguồn năng lƣợng cho quá trình hô hấp.
Chính những ƣu điểm trên đã phần nào chứng minh hiệu quả của việc ứng dụng Lactobacillus làm probiotic. Tuỳ thuộc vào loài và điều kiện nuôi cấy, Lactobacillus sản xuất hai loại đồng phân quang học: D (-) và L (+) axit lactic (Hình 1. Ở ngƣời, cả hai loại đồng phân này đều đƣợc hấp thu trong đƣờng ruột [16]. Đồng phân quang học của axit lactic [16] L (+) axit lactic: đƣợc chuyển hoá hoàn toàn và nhanh chóng trong quá trình tổng hợp glycogen.
D (-) axit lactic: đƣợc chuyển hoá ít hơn và phần không chuyển hoá sẽ đƣợc bài tiết dƣới dạng urine. Sự hiện diện của axit không đƣợc chuyển hoá trong ống tiêu hoá sẽ gây tình trạng nhiễm axit trong trao đổi chất ở trẻ sơ sinh. Vi khuẩn Lactobacillus và cholesterol Tác dụng của vi khuẩn lactic lên tình trạng cao cholesterol trong máu đã phát hiện trong nhiều nghiên cứu trên động vật cũng nhƣ con ngƣời. Sử dụng vi khuẩn lactic theo đƣờng uống có tác dụng làm giảm đáng kể cholesterol từ 22 đến 33% hoặc làm giảm cholesterol ở chuột béo phì [6,17- 19].
Những tác dụng làm giảm cholesterol trong máu của vi khuẩn này có thể đƣợc thông qua: hoạt tính enzyme thủy phân muối mật [19], khả năng đồng hóa cholesterol [18]; hoạt tính gắn kết vào màng tế bào, và khả năng sản xuất các hợp chất nhƣ FA có tác dụng ức chế hoạt tính của các enzyme nhƣ HMG- CoA reductase. Các sản phẩm từ đậu nành đƣợc lên men bởi L. jugurti có thể làm giảm cholesterol trong máu, giảm lipid, triglyceride tổng số trong huyết thanh và gan ở chuột bị cao cholesterol trong máu [20]. plantarum KCTC 3928 cũng có tác dụng giảm cholesterol trong máu đạt đƣợc bằng cách tăng tổng hợp axit mật và bài tiết axit mật qua phân [21].
plantarum BBE7 với hoạt tính BSH cao đã đƣợc chọn lọc và hoạt tính giải liên hợp muối mật cũng nhƣ tác dụng loại bỏ cholesterol của nó ở quy mô phòng thí nghiệm đã đƣợc nghiên cứu. plantarum BBE có tác dụng làm giảm cholesterol lên đến 58% ở chuột [22]. Tác dụng làm giảm béo của vi khuẩn L. plantarum 14 thông qua hoạt động làm giảm nồng độ leptin và cholesterol tổng số.