Tổng quan nghiên cứu

Ngành nuôi trồng thủy sản đóng góp khoảng 3 – 4% tổng GDP của Việt Nam, tạo công ăn việc làm cho hàng triệu lao động và cung cấp nguồn thực phẩm quan trọng. Tuy nhiên, dịch bệnh do vi khuẩn, đặc biệt là các chủng thuộc chi Vibrio, đang đe dọa nghiêm trọng sự phát triển bền vững của ngành. Ví dụ, Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) với tỷ lệ chết lên đến 100% trên tôm. Theo một nghiên cứu tại vùng sông Mê Kông, V. parahaemolyticus được phát hiện trong 86,2% sản phẩm thủy hải sản và 78,1% mẫu nước nuôi. Việc lạm dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc, tồn dư kháng sinh trong sản phẩm và ô nhiễm môi trường, gây thiệt hại kinh tế lớn.

Trong bối cảnh đó, bacteriocin – các peptide kháng khuẩn có phổ hẹp, không gây độc và thân thiện với môi trường – được xem là giải pháp thay thế tiềm năng. Tuy nhiên, các chế phẩm hiện nay chủ yếu dựa trên vi sinh vật trên cạn, chưa tối ưu cho môi trường nước mặn. Luận văn tập trung nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin đối kháng với Vibrio spp., nhằm phát triển các chế phẩm sinh học ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản nước mặn tại Việt Nam. Thời gian nghiên cứu từ tháng 02/2020 đến 02/2021 tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, với phạm vi thu mẫu từ các sinh vật biển như tôm, cá, rong biển và bọt biển tại vùng biển Nha Trang và Phú Quý. Kết quả nghiên cứu góp phần giảm thiểu sử dụng kháng sinh, nâng cao chất lượng sản phẩm và phát triển ngành nuôi trồng thủy sản bền vững.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu về vi khuẩn biển, bacteriocin và cơ chế hoạt động của chúng. Vi khuẩn biển là nhóm vi sinh vật đa dạng, thích nghi với môi trường khắc nghiệt, có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất sinh học có hoạt tính kháng khuẩn. Bacteriocin là peptide nhỏ (<100 amino acid), được tổng hợp trên ribosome, có phổ kháng khuẩn hẹp, thường tiêu diệt các vi khuẩn gần giống chủng sinh. Phân loại bacteriocin theo hệ thống Abriouel gồm ba nhóm chính dựa trên kích thước, độ bền nhiệt và cấu trúc: nhóm 1 (<5 kDa, bền nhiệt, cấu trúc biến đổi sau dịch mã), nhóm 2 (<10 kDa, bền nhiệt, cấu trúc không biến đổi), nhóm 3 (>10 kDa, nhạy nhiệt). Cơ chế hoạt động của bacteriocin bao gồm tạo lỗ trên màng tế bào vi khuẩn mục tiêu, ức chế tổng hợp vách tế bào hoặc thủy phân thành phần cấu trúc vách, dẫn đến chết vi khuẩn. Bacteriocin có ưu điểm vượt trội so với kháng sinh như không gây độc, phổ kháng khuẩn hẹp, hiệu quả ở nồng độ thấp và không gây kháng thuốc.

Các khái niệm chính bao gồm: vi khuẩn biển, bacteriocin, phổ kháng khuẩn, cơ chế tác động của bacteriocin, và ứng dụng bacteriocin trong nuôi trồng thủy sản.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là các mẫu sinh vật biển (tôm, cá, rong biển, bọt biển) thu tại vùng biển Nha Trang và Phú Quý. Vi khuẩn biển được phân lập bằng phương pháp pha loãng bậc 10 trên môi trường TSA và TCBS bổ sung 50% nước biển tự nhiên, ủ ở 30 ℃ trong 48-72 giờ. Tổng số mẫu thu nhận và phân lập khoảng vài trăm chủng vi khuẩn biển.

Phương pháp khảo sát hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. sử dụng phương pháp cấy dọc trên môi trường LPMA, với ba chủng chỉ thị gồm Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus và Vibrio cholerae. Phổ kháng khuẩn được xác định trên 7 chủng vi sinh vật chỉ thị (4 vi khuẩn Gram âm, 2 Gram dương và 1 vi nấm) bằng phương pháp cấy dọc đối kháng.

Khả năng sinh chất kháng khuẩn trong môi trường lỏng được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch với dịch lọc từ môi trường nuôi cấy. Bản chất protein của chất kháng khuẩn được xác định qua xử lý enzyme phân giải protein (pronase E, proteinase K, trypsin, lysozyme) và đánh giá mất hoạt tính kháng khuẩn.

Phân tích trình tự gen 16S rRNA được thực hiện để định danh các chủng vi khuẩn tiềm năng, sử dụng PCR với cặp mồi 27F/1492R, giải trình tự Sanger và phân tích bằng phần mềm MEGA X.

Khảo sát độ bền nhiệt của hợp chất kháng khuẩn được tiến hành bằng xử lý dịch nuôi cấy ở 60 ℃ và 80 ℃ trong 60 phút, đánh giá hoạt tính còn lại bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch.

Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng sinh chất kháng khuẩn được khảo sát qua đo mật độ tế bào (OD600) và hoạt tính kháng khuẩn tại các thời điểm 3, 6, 9, 12, 24, 27, 30, 33 và 48 giờ trong môi trường LPMB.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Phân lập và sàng lọc vi khuẩn biển: Từ các mẫu sinh vật biển thu tại vùng biển Nha Trang và Phú Quý, đã phân lập được khoảng 150 chủng vi khuẩn biển trên môi trường TSA và TCBS. Trong đó, 30 chủng biểu hiện hoạt tính đối kháng rõ rệt với Vibrio spp. qua phương pháp cấy dọc, chiếm khoảng 20% tổng số chủng phân lập.

  2. Phổ kháng khuẩn rộng: 30 chủng vi khuẩn biển được tuyển chọn có khả năng ức chế không chỉ các chủng Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae mà còn có hoạt tính đối kháng với các vi khuẩn Gram dương như Bacillus cereus, Staphylococcus aureus và vi nấm Candida albicans. Tỷ lệ chủng có phổ kháng khuẩn rộng chiếm khoảng 40% trong số 30 chủng.

  3. Bản chất protein của chất kháng khuẩn: Sau xử lý enzyme pronase E, proteinase K, trypsin, hoạt tính kháng khuẩn của dịch nuôi cấy bị mất hoàn toàn, chứng tỏ hợp chất kháng khuẩn có bản chất protein, tương tự bacteriocin. Độ bền nhiệt của hợp chất kháng khuẩn được khảo sát cho thấy hoạt tính còn lại trên 70% sau xử lý ở 60 ℃ và khoảng 50% ở 80 ℃, phù hợp với đặc tính của bacteriocin nhóm 1 và 2.

  4. Định danh gen và phân loại: Phân tích trình tự gen 16S rRNA cho thấy các chủng vi khuẩn biển có hoạt tính kháng khuẩn mạnh thuộc các chi Bacillus, Enterococcus, Proteus và Providencia, với độ tương đồng gen trên 98% so với các chủng đã biết. Cây phân loại cho thấy sự đa dạng sinh học cao trong các chủng vi khuẩn biển phân lập.

  5. Ảnh hưởng thời gian lên men: Hoạt tính kháng khuẩn đạt đỉnh tại thời điểm 24 giờ lên men, tương ứng với mật độ tế bào cao nhất (OD600 khoảng 1,2). Sau 24 giờ, hoạt tính giảm nhẹ, cho thấy thời gian lên men tối ưu để thu nhận bacteriocin là 24 giờ.

Thảo luận kết quả

Kết quả phân lập và sàng lọc cho thấy vi khuẩn biển là nguồn tiềm năng phong phú để thu nhận bacteriocin có hoạt tính kháng Vibrio spp. và các vi sinh vật gây bệnh khác. Tỷ lệ chủng có hoạt tính đối kháng khoảng 20% phù hợp với các nghiên cứu quốc tế, trong đó một nghiên cứu tại Mỹ ghi nhận khoảng 5% chủng Vibrio spp. có khả năng sinh bacteriocin. Phổ kháng khuẩn rộng của một số chủng mở ra khả năng ứng dụng đa dạng trong bảo vệ sức khỏe thủy sản và con người.

Bản chất protein và độ bền nhiệt của hợp chất kháng khuẩn phù hợp với các đặc tính của bacteriocin nhóm 1 và 2, cho thấy khả năng ứng dụng trong môi trường nuôi trồng thủy sản nước mặn, nơi nhiệt độ và pH có thể biến động. Định danh gen 16S rRNA giúp xác định chính xác các chủng vi khuẩn tiềm năng, hỗ trợ cho việc phát triển các chế phẩm sinh học.

Thời gian lên men tối ưu 24 giờ tương tự với các nghiên cứu khác về sản xuất bacteriocin, giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất và thu nhận hợp chất kháng khuẩn. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng khuẩn theo thời gian lên men và bảng so sánh phổ kháng khuẩn của các chủng.

Kết quả nghiên cứu góp phần mở rộng hiểu biết về tiềm năng của vi khuẩn biển trong việc sản xuất bacteriocin, đồng thời cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các chế phẩm sinh học thay thế kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản, góp phần phát triển bền vững ngành.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Phát triển chế phẩm sinh học từ vi khuẩn biển: Tập trung nghiên cứu và phát triển các chế phẩm bacteriocin từ các chủng vi khuẩn biển đã được tuyển chọn, nhằm kiểm soát các bệnh do Vibrio spp. gây ra trong nuôi trồng thủy sản. Thời gian thực hiện dự kiến 2-3 năm, do các viện nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học phối hợp thực hiện.

  2. Ứng dụng bacteriocin trong xử lý môi trường nuôi: Sử dụng bacteriocin như một thành phần trong các chế phẩm vi sinh xử lý môi trường nước nuôi, giúp giảm thiểu vi khuẩn gây bệnh và hạn chế sử dụng kháng sinh. Mục tiêu giảm tỷ lệ bệnh do Vibrio xuống dưới 10% trong vòng 1 năm tại các vùng nuôi trọng điểm.

  3. Đào tạo và chuyển giao công nghệ: Tổ chức các khóa đào tạo, hội thảo cho người nuôi trồng thủy sản về lợi ích và cách sử dụng các chế phẩm bacteriocin, đồng thời chuyển giao công nghệ sản xuất cho các doanh nghiệp vừa và nhỏ. Thời gian triển khai trong 12 tháng, do các viện nghiên cứu phối hợp với các sở nông nghiệp địa phương.

  4. Nghiên cứu sâu về cơ chế và tính ổn định: Tiếp tục nghiên cứu cơ chế tác động của bacteriocin trong môi trường nước mặn, khảo sát độ bền pH, nhiệt độ và tương tác với các yếu tố môi trường khác để tối ưu hóa hiệu quả sử dụng. Thời gian nghiên cứu 1-2 năm, do các nhóm nghiên cứu chuyên sâu thực hiện.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành sinh học, công nghệ sinh học: Luận văn cung cấp kiến thức chuyên sâu về vi khuẩn biển, bacteriocin và phương pháp phân lập, sàng lọc, giúp mở rộng hiểu biết và phát triển đề tài nghiên cứu mới.

  2. Doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học và kháng sinh thay thế: Thông tin về các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh bacteriocin và quy trình nghiên cứu giúp doanh nghiệp phát triển sản phẩm mới thân thiện môi trường, hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản.

  3. Người nuôi trồng thủy sản và quản lý vùng nuôi: Hiểu biết về tiềm năng ứng dụng bacteriocin giúp người nuôi áp dụng các biện pháp phòng bệnh hiệu quả, giảm thiểu sử dụng kháng sinh, nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.

  4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách: Cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng chính sách khuyến khích phát triển công nghệ sinh học trong nuôi trồng thủy sản, hướng tới phát triển bền vững và bảo vệ môi trường.

Câu hỏi thường gặp

  1. Bacteriocin là gì và khác gì so với kháng sinh?
    Bacteriocin là peptide kháng khuẩn do vi khuẩn sinh ra, có phổ kháng khuẩn hẹp, tiêu diệt vi khuẩn gần giống chủng sinh. Khác với kháng sinh phổ rộng, bacteriocin ít gây tác động lên vi khuẩn có lợi và không gây kháng thuốc. Ví dụ, nisin là bacteriocin được sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm.

  2. Tại sao cần tìm bacteriocin từ vi khuẩn biển?
    Vi khuẩn biển thích nghi với môi trường khắc nghiệt, sản sinh các hợp chất sinh học độc đáo, có hoạt tính kháng khuẩn mạnh và ổn định trong môi trường nước mặn, phù hợp cho ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản nước mặn.

  3. Phương pháp phân lập vi khuẩn biển như thế nào?
    Mẫu sinh vật biển được rửa sạch, nghiền hoặc lấy ruột, pha loãng và cấy trên môi trường chọn lọc như TSA và TCBS bổ sung nước biển tự nhiên, ủ ở 30 ℃ để phân lập vi khuẩn biển thuần khiết.

  4. Làm thế nào để xác định bacteriocin có bản chất protein?
    Chất kháng khuẩn được xử lý với các enzyme phân giải protein như pronase E, proteinase K, trypsin. Nếu hoạt tính kháng khuẩn mất đi sau xử lý, chứng tỏ hợp chất có bản chất protein, tương tự bacteriocin.

  5. Ứng dụng bacteriocin trong nuôi trồng thủy sản có hiệu quả không?
    Nghiên cứu cho thấy bacteriocin có khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh như Vibrio spp., giúp giảm tỷ lệ bệnh và hạn chế sử dụng kháng sinh. Tuy nhiên, cần nghiên cứu thêm để tối ưu hóa hiệu quả trong môi trường nuôi thực tế.

Kết luận

  • Đã phân lập và sàng lọc thành công 30 chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin đối kháng với Vibrio spp. và các vi sinh vật gây bệnh khác.
  • Hợp chất kháng khuẩn có bản chất protein, độ bền nhiệt phù hợp với đặc tính bacteriocin nhóm 1 và 2.
  • Các chủng vi khuẩn được định danh thuộc các chi Bacillus, Enterococcus, Proteus và Providencia, đa dạng sinh học cao.
  • Thời gian lên men tối ưu để sinh bacteriocin là 24 giờ, tương ứng với mật độ tế bào cao nhất và hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất.
  • Kết quả nghiên cứu mở ra hướng phát triển các chế phẩm sinh học thân thiện môi trường, thay thế kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản nước mặn tại Việt Nam.

Next steps: Phát triển quy trình sản xuất chế phẩm bacteriocin quy mô pilot, thử nghiệm ứng dụng thực tế tại các vùng nuôi trọng điểm, đồng thời nghiên cứu sâu về cơ chế tác động và tính ổn định của bacteriocin trong môi trường nuôi.

Call to action: Các nhà nghiên cứu, doanh nghiệp và cơ quan quản lý cần phối hợp thúc đẩy nghiên cứu và ứng dụng bacteriocin từ vi khuẩn biển để phát triển ngành nuôi trồng thủy sản bền vững, giảm thiểu tác động môi trường và nâng cao giá trị sản phẩm.