ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, việc ứng dụng công nghệ sinh học để nâng cao chất lƣợng, hiệu quả sản phẩm và chất lƣợng môi trƣờng trong nuôi trồng đang là hƣớng đi chủ đạo, mang tính khoa học và có ý nghĩa rất lớn đến việc phát triển bền vững. Công nghệ enzyme đƣợc xem nhƣ là phƣơng án thích hợp, tham gia vào việc giải quyết, nâng cao hiệu quả thức ăn và giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng từ hoạt động chăn nuôi [17]. Nhiều nghiên cứu về vai trò của enzyme tiêu hóa nhƣ lipase, protease, amylase và phytase bổ sung vào thức ăn vật nuôi. Đặc biệt trong các enzyme trên thì phytase là một trong những enzyme có rất nhiều ứng dụng trong thực tiễn.
Sử dụng phytase vào thức ăn chăn nuôi, giúp vật nuôi tăng trọng lƣợng rất hiệu quả. Do enzyme có tác dụng thủy phân chất kháng dinh dƣỡng axit phytic (chiếm 50-80% phospho trong các loại hạt ngũ cốc), giúp vật nuôi tăng cƣờng hấp thu hiệu quả các protein và khoáng chất nhƣ: Ca, Zn, Fe… trong thức ăn chăn nuôi[15]. Mặt khác sử dụng enzyme còn giúp làm giảm lƣợng phospho dƣ thừa thải qua phân của vật nuôi, hạn chế tình trạng ô nhiễm phân, góp phần quan trọng vào ngành chăn nuôi sạch và bền vững. Ngoài ra, phytase bắt đầu đƣợc sử dụng trong thực phẩm của ngƣời, điều chế các dẫn xuất myo-inositol phosphate cho ngành dƣợc phẩm, sử dụng trong công nghiệp giấy, ứng dụng cải tạo đất trồng [26].
Chính vì những lợi ích của enzyme phytase mang lại, mà trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về enzyme phytase và các nhà khoa học vẫn không ngừng nghiên cứu, tìm tòi enzyme phytase từ những chủng vi sinh vật sinh phytase chƣa ai nghiên cứu tới. Để tìm ra các ƣu thế vƣợt trội hoặc tìm ra các giải pháp thay thế, vƣớng mắc trong việc mua bán bản quyền, vần đề cạnh tranh giữa các công ty. Tuy nhiên, ở Việt Nam các nghiên cứu về enzyme phytase vẫn còn nhiều hạn chế, việc sản xuất các chế phẩm phytase cũng chƣa đƣợc quan tâm. Vì vậy, phần lớn chế phẩm enzyme phytase trên thị trƣờng hiện nay, chủ yếu là đƣợc nhập khẩu từ các nƣớc Trung Quốc, Hoa kì, Nhật Bản…với giá thành rất cao[17].
Trong tự nhiên, enzyme phytase phân bố rất rộng rãi, có thể đƣợc tìm thấy trong mô thực vật, một số mô động vật và vi sinh vật. Trong đó, phytase từ vi sinh Luan van 2 vật có tiềm năng lớn trong ứng dụng sản xuất ở quy mô công nghiệp. Một số loài vi khuẩn sinh phytase đã đƣợc nghiên cứu nhƣ Bacillus sp, Escherichia.coli, Enterobacter, Lactobacillus, Klebsiella, Pseudomonas, Citrobacter… Và một số chủng nấm mốc, đặc biệt là các chủng thuộc chi Aspergillus, Penicillium, Mucor và Rhizopus[7],[15],[24]. Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, đa dạng về địa hình và hệ sinh thái đã tạo nên sự đa dạng về các loài vi sinh vật, cũng nhƣ do nhu cầu và tầm quan trọng của các sản phẩm phytase thƣơng mại, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và tạo chế phẩm thô của vi sinh vật sinh enzyme phytase từ đất thuộc địa bàn huyện Hòa Vang- thành phố Đà Nẵng” nhằm tìm kiếm các loài vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phytase cao và an toàn, đáp ứng nhu cầu sử dụng chế phẩm enzyme trong nông nghiệp hiện nay.
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh enzyme phytase ngoại bào mạnh từ đất tại một số xã thuộc huyện Hòa Vang- thành phố Đà Nẵng, khảo sát và lựa chọn các điều kiện môi trƣờng tối ƣu cho quá trình lên men xốp tạo chế phẩm enzyme phytase thô. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI - Tuyển chọn và lƣu trữ một số chủng vi sinh vật sinh enzyme phytase ngoại bào có hoạt tính mạnh tại địa bàn huyện Hòa Vang – TP Đà Nẵng. - Xác định một số điều kiện và môi trƣờng tối ƣu cho quy trình lên men xốp tạo chế phẩm enzyme thô. Góp phần tạo chế phẩm sinh học ứng dụng vào các lĩnh vực khác nhau của nghành nông nghiệp, đặc biệt là chăn nuôi.
Luan van 3 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE Axit Phytic là este photphate của inositol, có công thức phân tử là myo- inositol 1,2,3,4,5,6 hexakisphotphat ( IP6 ) là thành phần chính của phopho ( P ) trong thực vật đƣợc dự trữ chủ yếu ở các cây ngũ cốc, cây họ đậu và các loại hạt chứa dầu và đƣợc phát hiện năm 1903. Cấu trúc của inositol Axit phytic trong thực vật không tồn tại tự do mà thƣờng tạo muối phytate với một số nguyên tố khoáng nhƣ Mg, K, Ca, cũng nhƣ tham gia liên kết với các protein. Và tạo phức với protein thành hợp chất gọi là Phytin hay phytate.
Axit phytic đƣợc coi là một hợp chất kháng dinh dƣỡng (an anti-nutritional compound) do khả năng tạo phức chặt chẽ với các ion kim loại và các hợp chất khác nhƣ tinh bột, protein làm giảm khả năng tiêu hóa và hấp thu các chất này. Muối phytate và các liên kết với ion kim loại và protein Luan van 4 Muối này gọi là phytate (hay phytin), thông thƣờng chiếm khoảng 1 đến vài phần trăm trọng lƣợng khô của nhiều hạt và trong vài trƣờng hợp nó chiếm khoảng 50-80% lƣợng photpho tổng của hạt. Không có hạt trƣởng thành nào mà không có phytate mặc dù nó có thể không có ở một số mô hạt nhất định nào đó nhƣ nội nhũ chứa tinh bột của những hạt ngũ cốc. Phytate cũng có ở hạt phấn , bào tử túi và mô sinh dƣỡng nhƣ rễ, cuống và lá.
Phytate hầu nhƣ không có mặt trong nội nhũ của lúa mỳ và lúa nƣớc mà tập trung trong mầm và trong lớp vỏ Alơron của tế bào hạt. Ở đậu Hà Lan, 99% phytate của hạt tìm đƣợc trong lá mầm và 1% trong phôi mầm. Ngô là loại ngũ cốc có hàm lƣợng phytate cao nhất (chiếm 0.22% khối lƣợng hạt). Trong số các cây họ đậu, đậu dolique (dolique beans) có hàm lƣợng phytate cao nhất (5.15% khối lƣợng hạt)[15].
Sự phân bố của Phytate ở hạt của một số cây trồng Axit phytic có hiệu ứng kháng dinh dƣỡng rất mạnh đối với động vật. Do cấu trúc phân tử đặc biệt (hình 1.1), axit phytic có thể liên kết chặt chẽ với protein, các nguyên tố khoáng và tạo thành phức hợp không tan trong đƣờng tiêu hóa. Hiệu ứng này dẫn đến ức chế quá trình tiêu hoá protein và hạn chế khả năng hấp thụ các ion khoáng nhƣ Ca, Mg, Zn…Kẽm là một nguyên tố vi lƣợng mà hoạt tính sinh học của nó bị ảnh hƣởng lớn nhất bởi axit phytic. Thử nghiệm trên chuột cho thấy axit phytic bổ sung vào thức ăn làm giảm mạnh khả năng hấp thụ ion Zn2+ và trọng lƣợng của chuột [17].
ENZYME PHYTASE Phytase (myo-inositol hexakisphosphate hydrolases) là một nhóm enzyme đặc biệt trong số các enzyme phosphatase, có khả năng xúc tác cho phản ứng thủy phân từng bƣớc acid phytic thành myo-inositol, các nhóm phosphate (Pi) và các Luan van 5 myo-inositol phosphate trung gian (IP5, IP4, IP3, IP2, IP1) [25]. Trong một vài trƣờng hợp phản ứng có thể giải phóng myo-inositol tự do (hình 1. Phản ứng xúc tác của enzyme phytase Ủy ban danh pháp enzyme thuộc Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (The Enzyme Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry) phân loại phytase thành hai dạng là: Dạng 1: kí hiệu (EC 3.8) Tên đề xuất: 3-phytase Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate 3 phosphohydrolase Tên khác: phytase; phytate-3-phosphatase Dạng 2: kí hiệu (EC 3.26) Tên đề xuất: 6-phytase Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate 6 phosphohydrolase Tên khác: phytase; phytate-6-phosphatase Sự phân loại này dựa trên cơ sở vị trí nhóm phosphat đầu tiên bị phytase tấn công. Enzyme 3-phytase (EC 3.8) tấn công vào nhóm phosphat ở vị trí thứ 3; đây là dạng phytase điển hình của vi sinh vật và enzyme 6-phytase (EC 3.26) tấn công đầu tiên vào nhóm phốt phát số 6; đây là dạng điển hình cho phytase từ thực vật [26].
Dựa trên pH hoạt động tối ƣu, phytase đƣợc chia thành 3 loại: phytase ƣa acid, Luan van 6 ƣa kiềm và trung tính. Ngoài ra, dựa vào cấu hình trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác, phytase đƣợc phân thành 3 loại khác nhau là: histidine acid phosphatase (HAP) phytases, ß- propeller phytase (BPP) và purple acid phosphatase (PAP) phytase [21]. Phytase đƣợc phân bố rộng rãi trong tự nhiên bao gồm ở thực vật, động vật và các loài vi sinh vật. Phytase có mặt ở nhiều loài vi sinh vật bao gồm cả vi khuẩn, nấm, nấm men và động vật nguyên sinh [11].
Từ các nguồn thu enzyme khiến điều kiện hoạt động của phytase không giống nhau. Các enzyme phytase từ thực vật thƣờng hoạt động tốt ở nhiệt độ 45-60oC, trong khi phytase thu từ vi sinh vật hoạt động ở phạm vi nhiệt độ rộng hơn, từ 35oC đến 63oC [19]. Khối lƣợng phân tử phytase của vi khuẩn biến thiên từ 35-50 kDa (trừ phytase từ Klebsiella aerogenes là có 2 dạng phân tử cảm ứng). Phytase từ eukaryote nhƣ nấm men, nấm sợi, thực vật và động vật thƣờng đƣợc glycosyl hóa và có khối lƣợng phân tử cao hơn, nằm trong khoảng từ 85-150 kDa đối với nấm mốc, khoảng 500 kDa đối với phytase của nấm men và từ 50-150 kDa đối với phytase của thực vật và động vật [22].
Nguốc gốc enzyme phytase Phytase rất phổ biến trong tự nhiên, nó đã đƣợc tìm thấy từ mô thực vật, động vật và rất nhiều loài vi sinh vật. Phytase từ vi sinh vật Phytase đƣợc tìm thấy trong các nhóm vi khuẩn nhƣ: Aerobacter aerogenes, Pseudomonas sp, Bacillus subtilis, Klebsiella sp, B. subtilis, Escherichia coli, Enterobacter sp. Những vi khuẩn sinh phytase ngoại bào là những chủng thuộc về chi Bacillus và Enterobacter.
coli lại là enzyme nội bào (periplasmic enzyme). Ngoài ra, phytase còn có trong các chủng nấm mốc đặc biệt ở các loài A.fumigatus thuộc chi Aspergillus và một số nấm men nhƣ Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida, Debaryomyces castelii, Luan van 7 Debaryomyces occidentalis, Kluyveromyces fragilis và Schwanniomyces castelii, cũng có khả năng sản sinh phytase [7], [18], [31]. Phytase đƣợc thu từ các loài nấm mốc thuộc chi Aspergillus đƣợc sử dụng nhƣ một chế phẩm vi sinh trong việc cải tạo đất trồng. Sự tăng trƣởng đáng kể về kích thƣớc, chiều dài rễ cũng nhƣ chiều cao cây của các cây gieo trồng khi đƣợc bổ sung chế phẩm vi sinh chứa enzyme phytase cho thấy đây là một tiềm năng ứng dụng to lớn [7].
Trong một số loài khác của chi Aspergillus nhƣ A.rugulosus cho thấy việc sử dụng hiệu quả enzyme phytase trong việc cải thiện hàm lƣợng chất chất khô và sản lƣợng các các loại ngũ cốc. Ngoài ra phytase từ các nguồn vi sinh vật đã đƣợc bổ sung vào thức ăn gia súc, gia cầm nhằm giúp vật nuôi có thể hấp thụ đƣợc phosphoric.