Luận văn tốt nghiệp: Phân lập và tạo chế phẩm enzyme phytase từ vi sinh vật đất Hòa Vang, Đà Nẵng

• Tác giả: Lê Trần Diệu Linh
• Người hướng dẫn: PGS.TS Đỗ Thu Hà
• Trường học: Đại học Đà Nẵng
• Chuyên ngành: Khoa Sinh – Môi Trường
• Đề tài: Nghiên Cứu Phân Lập, Tuyển Chọn Và Tạo Chế Phẩm Thô Của Vi Sinh Vật Sinh Enzyme Phytase Từ Đất Thuộc Địa Bàn Huyện Hòa Vang – Thành Phố Đà Nẵng
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Đà Nẵng

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE
• 1.2. Nguốc gốc enzyme phytase
• 1.3. Đặc điểm enzyme phytase
• 1.4. Ứng dụng của enzyme phytase
• 1.5. LÊN MEN XỐP
• 1.6. Khái niệm lên men xốp
• 1.7. Ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật lên men xốp
• 1.8. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM
• 1.9. ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI SINH VẬT BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
• 1.10. ĐẶC ĐIỂM TỰ NHIÊN KHU VỰC NGHIÊN CỨU
• 1.10.1. Địa hình và đất đai
• 1.10.2. Đặc điểm khí hậu và thổ nhưỡng
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 2.3. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 2.3.1. Địa điểm thu mẫu ngoài thực địa
• 2.3.2. Địa điểm và phạm vi nghiên cứu thí nghiệm
• 2.3.3. Thời gian nghiên cứu
• 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.4.1. Phương pháp lấy mẫu và xử lí mẫu đất
• 2.4.2. Phương pháp phân lập vi sinh vật có khả năng sinh phytase ngoại bào
• 2.4.3. Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật (theo phương pháp Koch)
• 2.4.4. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme phytase
• 2.4.5. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy và hình thái các chủng tuyển chọn
• 2.4.6. Giữ giống VSV
• 2.4.7. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử
• 2.4.8. Phương pháp tạo chế phẩm enzyme phytase
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
• 3.1. PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE
• 3.2. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ NUÔI CẤY CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE TUYỂN CHỌN
• 3.3. ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE ĐƯỢC TUYỂN CHỌN
• 3.3.1. Nhân trình tự gen 18S rRNA của các mẫu nấm NM1 và NM4
• 3.3.2. Giải trình tự và lập cây phân loại
• 3.4. KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH ENZYME PHYTASE TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN XỐP
• 3.5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Giới thiệu về enzyme phytase

Enzyme phytase là một loại enzyme quan trọng trong việc thủy phân axit phytic, một hợp chất kháng dinh dưỡng phổ biến trong thực vật. Enzyme này có khả năng xúc tác cho phản ứng thủy phân từng bước axit phytic thành myo-inositol và các nhóm phosphate. Phytase được phân loại thành hai dạng chính: 3-phytase và 6-phytase, dựa trên vị trí nhóm phosphate đầu tiên bị tấn công. Enzyme này có mặt rộng rãi trong tự nhiên, bao gồm cả thực vật, động vật và vi sinh vật. Đặc biệt, phytase từ vi sinh vật có tiềm năng lớn trong ứng dụng sản xuất công nghiệp, nhờ vào khả năng hoạt động ở nhiệt độ và pH đa dạng. Việc sử dụng phytase trong thức ăn chăn nuôi giúp tăng cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng và giảm thiểu ô nhiễm môi trường từ phân động vật.

1.1. Nguồn gốc enzyme phytase

Phytase được tìm thấy trong nhiều loài vi sinh vật, bao gồm cả vi khuẩn và nấm. Các chủng vi khuẩn như Bacillus và Escherichia coli là những nguồn phổ biến của enzyme này. Ngoài ra, các loài nấm thuộc chi Aspergillus cũng được biết đến với khả năng sinh phytase mạnh. Việc nghiên cứu và khai thác phytase từ các nguồn vi sinh vật này không chỉ giúp cải thiện hiệu quả dinh dưỡng trong chăn nuôi mà còn góp phần vào việc phát triển bền vững trong nông nghiệp.

II. Tình hình nghiên cứu enzyme phytase tại Việt Nam

Mặc dù enzyme phytase đã được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới, nhưng tại Việt Nam, các nghiên cứu về enzyme này vẫn còn hạn chế. Phần lớn các chế phẩm enzyme phytase hiện nay trên thị trường chủ yếu được nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao. Việc phát triển các nghiên cứu trong nước về enzyme phytase không chỉ giúp giảm chi phí mà còn tạo ra các sản phẩm phù hợp với điều kiện địa phương. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, việc khai thác phytase từ vi sinh vật địa phương có thể mang lại những lợi ích kinh tế và môi trường đáng kể.

2.1. Các nghiên cứu điển hình

Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng phytase từ các chủng vi sinh vật địa phương có thể hoạt động hiệu quả trong điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng của Việt Nam. Việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh enzyme phytase từ đất huyện Hòa Vang, Đà Nẵng là một trong những bước đi quan trọng nhằm phát triển nguồn enzyme này trong nước. Các nghiên cứu này không chỉ giúp nâng cao hiệu quả dinh dưỡng trong chăn nuôi mà còn góp phần vào việc cải thiện chất lượng đất và môi trường.

III. Ứng dụng enzyme phytase trong nông nghiệp

Enzyme phytase có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, đặc biệt là trong lĩnh vực chăn nuôi. Việc bổ sung phytase vào thức ăn gia súc giúp tăng cường khả năng hấp thụ phospho, từ đó cải thiện hiệu quả tăng trưởng của vật nuôi. Ngoài ra, phytase còn được sử dụng trong cải tạo đất, giúp tăng cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng của cây trồng. Các nghiên cứu cho thấy, việc sử dụng chế phẩm vi sinh chứa phytase có thể làm tăng năng suất cây trồng và cải thiện chất lượng sản phẩm nông nghiệp.

3.1. Lợi ích kinh tế và môi trường

Việc ứng dụng enzyme phytase không chỉ mang lại lợi ích kinh tế cho người chăn nuôi mà còn góp phần bảo vệ môi trường. Bằng cách giảm thiểu lượng phospho thải ra từ phân động vật, phytase giúp hạn chế ô nhiễm môi trường và cải thiện chất lượng đất. Điều này đặc biệt quan trọng trong bối cảnh hiện nay, khi mà vấn đề ô nhiễm môi trường đang ngày càng trở nên nghiêm trọng.

Tổng quan nghiên cứu

Enzyme phytase là một nhóm enzyme có khả năng thủy phân axit phytic, một hợp chất kháng dinh dưỡng phổ biến trong các loại hạt ngũ cốc và cây họ đậu, chiếm từ 50-80% lượng photpho tổng trong hạt. Axit phytic liên kết chặt với các ion khoáng như Ca, Zn, Fe, làm giảm khả năng hấp thu dinh dưỡng của vật nuôi và con người. Việc ứng dụng enzyme phytase trong chăn nuôi giúp tăng khả năng hấp thu phospho và khoáng chất, đồng thời giảm lượng phospho thải ra môi trường, góp phần giảm ô nhiễm môi trường. Tại Việt Nam, enzyme phytase chủ yếu được nhập khẩu với giá thành cao, trong khi tiềm năng khai thác enzyme phytase từ vi sinh vật bản địa còn rất lớn.

Luận văn tập trung nghiên cứu phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh enzyme phytase ngoại bào mạnh từ đất tại huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng, khảo sát các điều kiện môi trường tối ưu cho quá trình lên men xốp nhằm tạo chế phẩm enzyme phytase thô. Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 7/2017 đến tháng 4/2018, với phạm vi lấy mẫu tại 5 xã thuộc huyện Hòa Vang. Kết quả nghiên cứu góp phần phát triển nguồn enzyme phytase nội địa, giảm chi phí nhập khẩu, đồng thời ứng dụng trong chăn nuôi và cải tạo đất, hướng tới phát triển nông nghiệp bền vững.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cấu trúc và tính chất axit phytic: Axit phytic (myo-inositol hexakisphosphate, IP6) là este photphate của inositol, tạo muối phytate với các ion kim loại, làm giảm khả năng hấp thu khoáng chất và protein do tạo phức không tan trong đường tiêu hóa.

• Phân loại enzyme phytase: Phytase được phân thành 3 loại theo pH hoạt động tối ưu (acid, trung tính, kiềm) và 3 loại theo cơ chế xúc tác (histidine acid phosphatase, ß-propeller phytase, purple acid phosphatase). Enzyme phytase vi sinh vật thường hoạt động tốt ở pH khoảng 4-6 và nhiệt độ 35-63°C.

• Lên men xốp (Solid-state fermentation): Quá trình lên men vi sinh vật trên cơ chất rắn có độ ẩm thấp, vừa làm giá thể vừa cung cấp dinh dưỡng, thích hợp cho sản xuất enzyme với ưu điểm môi trường nuôi cấy đơn giản, sản phẩm đậm đặc, ít chất thải.

• Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử: Sử dụng trình tự gen bảo thủ 18S rARN để xác định chủng nấm mốc, áp dụng phương pháp PCR và giải trình tự ADN, lập cây phân loại bằng phần mềm MEGA7.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Thu thập 60 mẫu đất từ các vùng trồng đậu, trồng lúa và chăn nuôi tại 5 xã thuộc huyện Hòa Vang, Đà Nẵng. Phân lập 30 chủng vi sinh vật sinh enzyme phytase trên môi trường PSM có bổ sung CaCl2.

• Phương pháp phân tích: Xác định hoạt tính enzyme phytase bằng phản ứng màu với amonium molypdate đo quang phổ tại bước sóng 700 nm, xây dựng đường chuẩn photphate tự do. Định danh vi sinh vật bằng PCR nhân gen 18S rARN, điện di agarose, giải trình tự và phân tích đa dạng di truyền.

• Phương pháp chọn mẫu: Lấy mẫu đất ở độ sâu 0-20 cm, xử lý khô, nghiền và rây qua sàng 2 mm. Pha loãng mẫu theo phương pháp Koch để phân lập vi sinh vật.

• Phương pháp lên men xốp: Sử dụng cơ chất ngô vỡ và cám gạo với tỷ lệ khác nhau, làm ẩm 50-60%, khử trùng, lên men với tỷ lệ giống 15% ở nhiệt độ 30-50°C trong 3-5 ngày. Khảo sát ảnh hưởng của cơ chất, nhiệt độ, thời gian và pH đến hoạt tính enzyme.

• Timeline nghiên cứu: Thực hiện từ tháng 7/2017 đến tháng 4/2018, gồm các giai đoạn lấy mẫu, phân lập, tuyển chọn, định danh, khảo sát điều kiện lên men và tạo chế phẩm enzyme phytase thô.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật sinh phytase: Từ 60 mẫu đất, phân lập được 30 chủng vi sinh vật sinh enzyme phytase, trong đó 16 chủng nấm mốc (53,33%) và 14 chủng vi khuẩn (46,67%). Các chủng sinh phytase mạnh chiếm 33,33%, gồm 3 chủng nấm mốc (NM-1, NM-4, NM-5) và 2 chủng vi khuẩn (VK-1, VK-4) với đường kính vòng phân giải acid phytate từ 12,3 đến 22,8 mm.

2. Đặc điểm môi trường phân bố vi sinh vật: Vi sinh vật sinh phytase mạnh chủ yếu phân bố trong đất thịt trung bình, độ ẩm 50-55%, pH 6,5-7,0. Đất trồng lúa với độ ẩm cao và pH hơi chua có mật độ vi sinh vật sinh phytase thấp hơn do điều kiện kém thuận lợi.

3. Đặc điểm hình thái và nuôi cấy: Chủng vi khuẩn VK-1 thuộc Bacillus sp., có khuẩn lạc trắng kem, tế bào hình que Gram dương. Chủng nấm mốc NM-1 và NM-4 thuộc chi Aspergillus, sinh trưởng tốt trên môi trường PDA, Czapek và Waksman ở 25-26°C.

4. Ảnh hưởng điều kiện lên men xốp đến hoạt tính enzyme: Cơ chất ngô vỡ phối trộn với cám gạo (50:50) cho hoạt tính enzyme phytase cao nhất, đạt khoảng 120 U/g. Nhiệt độ tối ưu lên men là 35°C, thời gian lên men 72 giờ cho hoạt tính enzyme đạt đỉnh (khoảng 130 U/g). pH môi trường tối ưu là 6,0-6,5.

Thảo luận kết quả

Kết quả phân lập và tuyển chọn cho thấy tiềm năng lớn của vi sinh vật bản địa huyện Hòa Vang trong sản xuất enzyme phytase, phù hợp với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa và đặc điểm đất đai địa phương. Mật độ vi sinh vật sinh phytase cao ở đất thịt trung bình và đất thịt nhẹ phản ánh điều kiện vi khí hậu thuận lợi, tương tự các nghiên cứu quốc tế về ảnh hưởng của pH và độ ẩm đất đến sự phát triển vi sinh vật.

Đặc điểm hình thái và định danh phân tử khẳng định chủng vi khuẩn Bacillus sp. và nấm Aspergillus là nguồn enzyme phytase phổ biến, phù hợp với các nghiên cứu trước đây. Kết quả khảo sát điều kiện lên men xốp phù hợp với đặc tính sinh học của các chủng vi sinh vật, cho thấy lên men xốp là phương pháp hiệu quả để tạo chế phẩm enzyme phytase thô với hoạt tính cao.

So sánh với các nghiên cứu trong và ngoài nước, hoạt tính enzyme phytase thu được tương đương hoặc vượt trội, chứng tỏ quy trình phân lập và lên men xốp được tối ưu tốt. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ hoạt tính enzyme theo thời gian lên men, nhiệt độ và pH để minh họa rõ ràng ảnh hưởng các yếu tố môi trường.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển quy trình sản xuất chế phẩm enzyme phytase thô quy mô công nghiệp: Áp dụng quy trình lên men xốp với cơ chất ngô vỡ phối trộn cám gạo, nhiệt độ 35°C, thời gian 72 giờ để sản xuất enzyme phytase với hoạt tính cao. Thời gian thực hiện trong 12-18 tháng, chủ thể thực hiện là các doanh nghiệp công nghệ sinh học và viện nghiên cứu.

2. Mở rộng khảo sát và phân lập thêm các chủng vi sinh vật sinh phytase từ các vùng đất khác của Đà Nẵng và miền Trung: Tăng cường đa dạng nguồn enzyme, nâng cao hiệu quả sản xuất. Thời gian 6-12 tháng, chủ thể là các trường đại học và trung tâm nghiên cứu.

3. Ứng dụng chế phẩm enzyme phytase trong chăn nuôi và cải tạo đất: Thử nghiệm bổ sung enzyme phytase vào thức ăn gia súc, gia cầm để tăng hấp thu phospho, giảm ô nhiễm môi trường; đồng thời sử dụng trong cải tạo đất trồng nhằm tăng khả năng phân giải phospho hữu cơ. Thời gian 12 tháng, chủ thể là các trang trại, doanh nghiệp nông nghiệp.

4. Nâng cao năng lực nghiên cứu và đào tạo về công nghệ enzyme tại các cơ sở đào tạo và nghiên cứu trong nước: Tổ chức các khóa đào tạo, hội thảo chuyên sâu về enzyme phytase và công nghệ lên men xốp. Thời gian liên tục, chủ thể là các trường đại học và viện nghiên cứu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành công nghệ sinh học, vi sinh vật: Nghiên cứu sâu về enzyme phytase, kỹ thuật phân lập, tuyển chọn và lên men xốp, áp dụng trong sản xuất enzyme.

2. Doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học và thức ăn chăn nuôi: Áp dụng quy trình sản xuất enzyme phytase thô từ vi sinh vật bản địa, giảm chi phí nhập khẩu, nâng cao chất lượng sản phẩm.

3. Người làm công tác quản lý và phát triển nông nghiệp bền vững: Hiểu rõ vai trò enzyme phytase trong cải thiện hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi và bảo vệ môi trường, từ đó xây dựng chính sách hỗ trợ phát triển công nghệ enzyme.

4. Các cơ sở đào tạo và trung tâm nghiên cứu về môi trường và nông nghiệp: Sử dụng luận văn làm tài liệu tham khảo trong giảng dạy và nghiên cứu ứng dụng enzyme phytase trong cải tạo đất và xử lý môi trường.

Câu hỏi thường gặp

1. Enzyme phytase là gì và tại sao nó quan trọng trong chăn nuôi?
   Enzyme phytase thủy phân axit phytic trong thức ăn, giúp vật nuôi hấp thu phospho và khoáng chất hiệu quả hơn, giảm chi phí thức ăn và ô nhiễm môi trường do phospho thải ra. Ví dụ, bổ sung phytase giúp lợn tăng trọng 16,4% và giảm chi phí thức ăn 8%.

2. Tại sao chọn lên men xốp để sản xuất enzyme phytase?
   Lên men xốp sử dụng cơ chất rắn có độ ẩm thấp, tạo môi trường nuôi cấy đơn giản, sản phẩm enzyme đậm đặc, ít chất thải và giảm nguy cơ nhiễm khuẩn. Đây là phương pháp phù hợp với vi sinh vật sinh phytase như nấm mốc và Bacillus.

3. Các yếu tố môi trường nào ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme phytase?
   Nhiệt độ tối ưu khoảng 35°C, pH môi trường 6,0-6,5, cơ chất giàu phytate như ngô vỡ phối trộn cám gạo giúp tăng hoạt tính enzyme. Thời gian lên men 72 giờ cho hiệu suất cao nhất.

4. Làm thế nào để định danh chính xác các chủng vi sinh vật sinh phytase?
   Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử, nhân gen 18S rARN qua PCR, giải trình tự ADN và phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm chuyên dụng như MEGA7, giúp xác định chủng và lập cây phân loại chính xác.

5. Ứng dụng thực tiễn của chế phẩm enzyme phytase từ nghiên cứu này là gì?
   Chế phẩm enzyme phytase có thể bổ sung vào thức ăn gia súc, gia cầm để tăng hấp thu dinh dưỡng, giảm chi phí và ô nhiễm môi trường; đồng thời ứng dụng trong cải tạo đất trồng, tăng khả năng phân giải phospho hữu cơ, góp phần phát triển nông nghiệp bền vững.

Kết luận

• Phân lập và tuyển chọn thành công 30 chủng vi sinh vật sinh enzyme phytase từ đất huyện Hòa Vang, trong đó 33,33% có hoạt tính mạnh với đường kính vòng phân giải acid phytate trên 10 mm.
• Xác định được điều kiện lên men xốp tối ưu gồm cơ chất ngô vỡ phối trộn cám gạo (50:50), nhiệt độ 35°C, pH 6,0-6,5 và thời gian 72 giờ cho hoạt tính enzyme phytase cao nhất.
• Định danh phân tử các chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus và vi khuẩn Bacillus sp., phù hợp với các nghiên cứu enzyme phytase trên thế giới.
• Nghiên cứu mở ra hướng phát triển chế phẩm enzyme phytase nội địa, giảm chi phí nhập khẩu và ứng dụng trong chăn nuôi, cải tạo đất.
• Đề xuất triển khai sản xuất quy mô công nghiệp, mở rộng khảo sát nguồn vi sinh vật và ứng dụng thực tiễn trong nông nghiệp bền vững.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các tổ chức nghiên cứu và doanh nghiệp phối hợp phát triển quy trình sản xuất chế phẩm enzyme phytase, đồng thời mở rộng nghiên cứu ứng dụng trong chăn nuôi và cải tạo đất. Để biết thêm chi tiết và hợp tác nghiên cứu, vui lòng liên hệ với Khoa Sinh - Môi trường, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng.