Luận văn tốt nghiệp: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Methylobacterium sp từ lá dương xỉ Marattiaceae

Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi khuẩn methylobacterium sp từ lá dương xỉ marattiaceae, góp phần vào sinh học và ứng dụng thực tiễn.

• Tác giả: Đặng Thị Mỹ Triều
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Thị Mỹ
• Trường học: Đại học Đà Nẵng
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Phân Lập Và Tuyển Chọn Vi Khuẩn Methylobacterium Sp Từ Lá Dương Xỉ (Marattiaceae)
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Đà Nẵng

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ METHYLOBACTERIUM SP.
• 1.2. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
• 3.1. PHÂN LẬP VI KHUẨN TỪ MẪU LÁ DƯƠNG XỈ
• 3.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI TẾ BÀO VÀ CÁC TEST SINH HÓA CỦA CÁC CHỦNG VK ĐƯỢC TUYỂN CHỌN
• 3.3. ĐỊNH DANH 2 CHỦNG VK T6, T12 BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
• 3.4. KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TRƯỞNG CỦA 2 CHỦNG VK T6 VÀ T12
• 3.5. NGHIÊN CỨU ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA 2 CHỦNG VK T6 VÀ T12
• MỞ ĐẦU
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Methylobacterium sp

Chi Methylobacterium bao gồm nhiều loài vi khuẩn có sắc tố hồng, thuộc nhóm dinh dưỡng methyl tuỳ ý (PPFM). Chúng chủ yếu cư ngụ trên lá thực vật, nhưng cũng có thể tìm thấy trong đất và nước. Methylobacterium sp. có khả năng sử dụng methanol từ thực vật làm nguồn carbon, đồng thời tổng hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật như auxin và cytokinin. Điều này cho thấy tầm quan trọng của chúng trong nông nghiệp, đặc biệt là trong việc tăng năng suất cây trồng. Ngoài ra, Methylobacterium còn có khả năng xử lý ô nhiễm môi trường nhờ vào khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ độc hại. Nghiên cứu về Methylobacterium sp. không chỉ giúp hiểu rõ hơn về sinh học phân tử mà còn mở ra hướng đi mới trong ứng dụng công nghệ sinh học.

1.1. Đặc điểm sinh học của Methylobacterium sp.

Các loài Methylobacterium thường có hình dạng que, kích thước từ 0,8 - 1 x 1 - 8µm và là vi khuẩn gram âm. Chúng có khả năng di động nhờ tiêm mao và thường tạo thành khuẩn lạc có màu hồng hoặc đỏ cam. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng dao động từ 25°C đến 30°C, và một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn. Methylobacterium sp. có khả năng tổng hợp hormone thực vật và vitamine B12, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm.

II. Phương pháp phân lập và định danh

Phương pháp phân lập Methylobacterium sp. thường sử dụng môi trường methanol mineral salts (MMS), nơi mà vi khuẩn này có thể phát triển tốt nhất. Việc sử dụng cycloheximide cũng giúp tăng cường hiệu quả phân lập. Sau 2-3 ngày nuôi cấy, khuẩn lạc có thể được nhận diện nhờ màu sắc đặc trưng. Các phương pháp định danh hiện đại như kỹ thuật sinh học phân tử cũng được áp dụng để xác định chính xác các chủng vi khuẩn. Điều này không chỉ giúp phân loại mà còn mở ra cơ hội nghiên cứu sâu hơn về đặc tính sinh học của chúng.

2.1. Kỹ thuật sinh học phân tử trong định danh

Kỹ thuật sinh học phân tử, đặc biệt là giải trình tự gen 16S rRNA, đã được sử dụng để định danh các chủng Methylobacterium sp.. Phương pháp này cho phép xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài vi khuẩn, từ đó cung cấp thông tin quý giá cho các nghiên cứu tiếp theo. Việc áp dụng công nghệ này không chỉ nâng cao độ chính xác trong việc phân loại mà còn giúp phát hiện các loài mới, mở rộng hiểu biết về sự đa dạng của Methylobacterium trong tự nhiên.

III. Ứng dụng thực tiễn của Methylobacterium sp

Các chủng Methylobacterium sp. đã được nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Chúng có khả năng kích thích sự sinh trưởng của nhiều loại cây trồng, từ lúa đến bông vải. Ngoài ra, Methylobacterium còn có tiềm năng trong việc sản xuất nhựa sinh học PHB, một loại nhựa thân thiện với môi trường. Việc sử dụng Methylobacterium sp. trong nông nghiệp không chỉ giúp tăng năng suất mà còn góp phần bảo vệ môi trường, nhờ vào khả năng xử lý ô nhiễm và giảm thiểu sử dụng hóa chất độc hại.

3.1. Tác động đến cây trồng

Nghiên cứu cho thấy Methylobacterium sp. có khả năng kích thích sự phát triển của nhiều loại cây trồng thông qua việc tổng hợp các chất dinh dưỡng cần thiết. Chúng không chỉ giúp cây trồng phát triển tốt hơn mà còn tăng cường khả năng kháng bệnh. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm sinh học mới, giúp nông dân giảm thiểu phụ thuộc vào hóa chất trong canh tác.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Chi vi khuẩn Methylobacterium là nhóm vi khuẩn có sắc tố hồng, dinh dưỡng methyl tuỳ ý, có khả năng sử dụng methanol làm nguồn carbon chính. Theo ước tính, nhóm vi khuẩn này phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đặc biệt tập trung ở vùng lá của hơn 100 loài thực vật. Methylobacterium không chỉ đóng vai trò quan trọng trong chu trình carbon mà còn có tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp, môi trường và công nghiệp sinh học. Các chủng vi khuẩn này có khả năng tổng hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật như auxin, cytokinin, salicylic acid, vitamin B12 và enzyme urease, ACC deaminase, góp phần tăng năng suất cây trồng và kháng bệnh.

Mục tiêu nghiên cứu là phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Methylobacterium từ lá dương xỉ thuộc họ Marattiaceae tại thành phố Đà Nẵng, nhằm tạo cơ sở dữ liệu khoa học phục vụ ứng dụng thực tiễn. Nghiên cứu được thực hiện trên 10 mẫu lá dương xỉ thu thập từ các xã thuộc huyện Hòa Vang và quận Liên Chiểu, trong khoảng thời gian năm 2018. Ý nghĩa của đề tài không chỉ nằm ở việc lưu giữ nguồn gen quý mà còn mở ra hướng nghiên cứu sâu hơn về sinh lý, sinh hóa và ứng dụng sản xuất protein đơn bào, nhựa sinh học PHB, cũng như các chất điều hòa sinh trưởng thực vật.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Lý thuyết dinh dưỡng methyl tuỳ ý (PPFM): Vi khuẩn Methylobacterium sử dụng các hợp chất một carbon như methanol, formaldehyde làm nguồn năng lượng và carbon, theo chu trình serine liên kết với chu trình tricarboxylic (TCA) và chu trình tổng hợp poly-β-hydroxybutyrate (PHB).
• Mô hình tương tác vi sinh vật - thực vật: Vi khuẩn Methylobacterium cư trú chủ yếu trên lá thực vật, tổng hợp các phytohormone (auxin, cytokinin) và vitamin, góp phần kích thích sinh trưởng và tăng khả năng kháng bệnh cho cây trồng.
• Khái niệm về nhựa sinh học PHB: PHB là polymer sinh học được tổng hợp và dự trữ trong tế bào vi khuẩn, có ứng dụng trong y dược và công nghiệp thân thiện môi trường.
• Phương pháp phân lập vi khuẩn chọn lọc: Sử dụng môi trường methanol mineral salts (MMS) bổ sung 1% methanol để phân lập vi khuẩn Methylobacterium có sắc tố hồng đặc trưng.
• Kỹ thuật sinh học phân tử: Định danh vi khuẩn đến cấp độ loài dựa trên giải trình tự gen 16S rRNA và so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: 10 mẫu lá dương xỉ thu thập tại các xã Hòa Nhơn, Hòa Liên, Hòa Phong (huyện Hòa Vang), phường Hòa Khánh Nam (quận Liên Chiểu), thành phố Đà Nẵng.
• Phương pháp thu mẫu: Mẫu được thu theo tiêu chuẩn TCVN 8551:2010, bảo quản lạnh 4°C và phân lập trong vòng 24 giờ.
• Phương pháp phân lập: Sử dụng môi trường MMS bổ sung 1% methanol, cấy loang trên đĩa petri, nuôi cấy ở 28-30°C trong 5-7 ngày để thu nhận khuẩn lạc có sắc tố hồng.
• Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và sinh hóa: Test Gram nhanh với KOH 3%, nhuộm Gram, quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi, thử nghiệm di động trong thạch mềm, test catalase và urease.
• Phương pháp định danh sinh học phân tử: Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB, khuếch đại gen 16S rRNA bằng PCR với cặp mồi 27F và 1492R, giải trình tự và so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI.
• Khảo sát yếu tố ảnh hưởng sinh trưởng: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ methanol (0.5%, 1%, 5%), nhiệt độ (20-50°C), pH (4-10) trên môi trường CMS bổ sung methanol 1%, đo mật độ tế bào bằng CFU sau 4 ngày nuôi cấy.
• Xây dựng đường cong sinh trưởng: Nuôi cấy 2 chủng được tuyển chọn trong 120 giờ, lấy mẫu định kỳ 4 giờ, đếm CFU để xác định pha sinh trưởng và thời điểm sinh khối cực đại.
• Xử lý số liệu: Thí nghiệm lặp lại 3 lần, phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn: Từ 10 mẫu lá dương xỉ, phân lập được 34 chủng vi khuẩn có khả năng sống trên môi trường MMS bổ sung 1% methanol. Trong đó, 15 chủng có sắc tố hồng đặc trưng, phù hợp với chi Methylobacterium.

2. Đặc điểm hình thái và sinh hóa: Qua test KOH và nhuộm Gram, 7 chủng trong số 15 chủng hồng thuộc nhóm Gram âm, có hình que, di động, catalase và urease dương tính. Hai chủng tiêu biểu T6 và T12 có khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, kích thước 1-1.2 mm, tế bào hình que, di động nhờ tiêm mao.

3. Định danh sinh học phân tử: Giải trình tự gen 16S rRNA cho thấy chủng T6 có độ tương đồng 99% với Methylobacterium extorquens, chủng T12 tương đồng 99% với Methylobacterium zatmanii.

4. Ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến sinh trưởng:

   • Nồng độ methanol 1% là tối ưu cho sinh trưởng của cả hai chủng, với mật độ tế bào cao nhất đạt khoảng 6.3×10^6 CFU/ml (T6) và 7.1×10^6 CFU/ml (T12). Nồng độ methanol cao hơn 1% gây ức chế sinh trưởng.
   • Nhiệt độ tối ưu là 25-30°C, cao hơn 45°C làm giảm mật độ tế bào đáng kể.
   • pH tối ưu dao động từ 6 đến 7, với sinh khối cực đại tại pH 6.5.

5. Đường cong sinh trưởng: Chủng T6 đạt sinh khối cực đại sau 68 giờ, chủng T12 sau 52 giờ nuôi cấy. Sau thời điểm này, mật độ tế bào giảm do cạn kiệt dinh dưỡng và tích tụ sản phẩm chuyển hóa ức chế.

Thảo luận kết quả

Kết quả phân lập và định danh phù hợp với các nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn Methylobacterium phân bố trên lá thực vật. Việc chọn môi trường MMS bổ sung methanol 1% đã tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nhóm vi khuẩn methylotrophic, đồng thời sắc tố hồng giúp nhận diện nhanh các chủng thuộc chi này.

Ảnh hưởng của methanol, nhiệt độ và pH đến sinh trưởng của hai chủng T6 và T12 tương đồng với các báo cáo trước, khẳng định điều kiện nuôi cấy tối ưu cho vi khuẩn Methylobacterium là methanol 1%, nhiệt độ 30°C và pH trung tính nhẹ. Đường cong sinh trưởng cho thấy sự khác biệt về thời gian đạt sinh khối cực đại giữa hai chủng, phản ánh đặc tính sinh học riêng biệt, có thể ảnh hưởng đến ứng dụng trong sản xuất sinh khối hoặc các sản phẩm sinh học.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ đường cong sinh trưởng, biểu đồ cột so sánh mật độ tế bào ở các điều kiện methanol, nhiệt độ và pH khác nhau, giúp minh họa rõ ràng ảnh hưởng của các yếu tố môi trường.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Mở rộng khảo sát nguồn cacbon: Thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn cacbon khác như sucrose, acetate, ethanol, methylamine lên sinh trưởng và sản xuất sinh khối của Methylobacterium extorquens và Methylobacterium zatmanii nhằm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy (thời gian 6-12 tháng, chủ thể: nhóm nghiên cứu sinh học phân tử).

2. Phát triển quy trình sản xuất protein đơn bào: Nghiên cứu thu nhận và tinh chế protein đơn bào từ hai chủng vi khuẩn trên quy mô phòng thí nghiệm, hướng tới ứng dụng trong thức ăn thủy sản hoặc làm nguồn protein thay thế (thời gian 12 tháng, chủ thể: phòng công nghệ sinh học).

3. Khảo sát khả năng tổng hợp nhựa sinh học PHB: Đánh giá tiềm năng sản xuất PHB của các chủng phân lập, tối ưu điều kiện nuôi cấy để tăng hiệu suất tích lũy nhựa sinh học (thời gian 9 tháng, chủ thể: phòng công nghệ sinh học và môi trường).

4. Ứng dụng trong nông nghiệp: Thử nghiệm sử dụng các chủng Methylobacterium tuyển chọn để cải thiện tỉ lệ nảy mầm, kích thích sinh trưởng và tăng khả năng kháng bệnh cho cây trồng tại địa phương (thời gian 12-18 tháng, chủ thể: trung tâm nghiên cứu nông nghiệp).

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu vi sinh vật học và công nghệ sinh học: Có thể sử dụng dữ liệu phân lập và đặc điểm sinh học của các chủng Methylobacterium để phát triển các nghiên cứu chuyên sâu về sinh lý, di truyền và ứng dụng vi sinh vật.

2. Chuyên gia nông nghiệp và phát triển cây trồng: Tham khảo các kết quả về khả năng tổng hợp phytohormone và tác động tích cực của vi khuẩn lên cây trồng để ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp bền vững.

3. Doanh nghiệp công nghệ sinh học và thực phẩm: Khai thác tiềm năng sản xuất protein đơn bào, nhựa sinh học PHB và các sản phẩm giá trị từ vi khuẩn Methylobacterium phục vụ ngành thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và vật liệu sinh học.

4. Cơ quan quản lý môi trường và phát triển bền vững: Sử dụng thông tin về khả năng phân giải các hợp chất độc hại và xử lý ô nhiễm môi trường của vi khuẩn để xây dựng các giải pháp sinh học thân thiện môi trường.

Câu hỏi thường gặp

1. Vi khuẩn Methylobacterium có đặc điểm gì nổi bật?
   Trả lời: Đây là nhóm vi khuẩn Gram âm, có sắc tố hồng đặc trưng, dinh dưỡng methyl tuỳ ý, sử dụng methanol làm nguồn carbon chính và có khả năng tổng hợp các phytohormone như auxin, cytokinin, góp phần kích thích sinh trưởng thực vật.

2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Methylobacterium trong nghiên cứu này là gì?
   Trả lời: Sử dụng môi trường methanol mineral salts (MMS) bổ sung 1% methanol để chọn lọc vi khuẩn có khả năng sử dụng methanol, đồng thời dựa vào sắc tố hồng đặc trưng để nhận diện khuẩn lạc.

3. Hai chủng vi khuẩn được định danh trong nghiên cứu là gì?
   Trả lời: Chủng T6 được xác định là Methylobacterium extorquens, chủng T12 là Methylobacterium zatmanii, dựa trên trình tự gen 16S rRNA với độ tương đồng 99% so với dữ liệu NCBI.

4. Yếu tố môi trường nào ảnh hưởng lớn nhất đến sinh trưởng của vi khuẩn?
   Trả lời: Nồng độ methanol 1% là tối ưu, nhiệt độ 25-30°C và pH 6-7 là điều kiện thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của hai chủng vi khuẩn được nghiên cứu.

5. Ứng dụng tiềm năng của vi khuẩn Methylobacterium là gì?
   Trả lời: Vi khuẩn này có thể được ứng dụng trong nông nghiệp để tăng năng suất cây trồng, sản xuất protein đơn bào làm thức ăn thủy sản, tổng hợp nhựa sinh học PHB thân thiện môi trường và xử lý ô nhiễm các hợp chất hữu cơ độc hại.

Kết luận

• Phân lập thành công 34 chủng vi khuẩn từ lá dương xỉ tại Đà Nẵng, trong đó 15 chủng có sắc tố hồng đặc trưng, phù hợp với chi Methylobacterium.
• Hai chủng tiêu biểu T6 và T12 được xác định là Methylobacterium extorquens và Methylobacterium zatmanii qua kỹ thuật sinh học phân tử.
• Điều kiện sinh trưởng tối ưu của hai chủng là môi trường CMS bổ sung 1% methanol, pH 6.5 và nhiệt độ 30°C.
• Đường cong sinh trưởng cho thấy thời điểm sinh khối cực đại khác nhau giữa hai chủng, phản ánh đặc tính sinh học riêng biệt.
• Đề xuất mở rộng nghiên cứu về nguồn cacbon, sản xuất protein đơn bào, tổng hợp nhựa sinh học và ứng dụng trong nông nghiệp.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp khai thác tiềm năng của vi khuẩn Methylobacterium trong các lĩnh vực sinh học ứng dụng, đồng thời phát triển các quy trình nuôi cấy và sản xuất quy mô lớn.

Liên hệ để hợp tác nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn nhằm phát huy giá trị nguồn gen vi khuẩn quý này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ METHYLOBACTERIUM SP.1 Lịch sử phát hiện và phân loại VK Methylobacterium sp. Chi Methylobacterium bao gồm nhiều loài vi khuẩn (VK) có sắc tố hồng dinh dưỡng methyl tuỳ ý (pink-pigmented facultatively methylotrophic, PPFM). Chúng có khả năng sử dụng các hợp chất chỉ chứa một nguyên tử carbon như fomate, formaldehyde, methanol hay các hợp chất chứa nhiều nguyên tử carbon làm nguồn cung cấp năng lượng và nguồn carbon cho quá trình sinh trưởng [23].

Vị trí phân loại chi Methylobacterium trong giới vi sinh vật như sau: Giới: Bacteria, ngành: Proteobacterium, lớp: Alphaproteobacteria, bộ: Rhizobiales, họ: Methylobacteriaceae. Mặc dù, VK Methylobacterium sp. hiện diện rất phổ biến trong đất hay trên các sinh vật nhưng trong một thời gian dài nhóm vi khuẩn này không được nghiên cứu nhiều. Những năm 1960-1970 khi các nghiên cứu tập trung vào con đường đồng hóa các hợp chất một carbon thì nhóm vi khuẩn dinh dưỡng methyl được phân lập, nghiên cứu, trong đó tập trung vào các phương thức biến dưỡng năng lượng và những ứng dụng.

Trong đó, loài Methylobacterium sp. được Bassalik phân lập lần đầu tiên vào năm 1913 từ giun đất và được đặt tên lúc đầu là Bacillus extorquens [20], [23]. Trong giai đoạn trước năm 1960, một số loài VK thuộc chi Methylobacterium đã được phân lập nhưng do không có đầy đủ thông tin nên các loài này được phân loại vào các chi VK khác nhau chẳng hạn như: Pseudomonas, Flavobacterium, Protaminobacter, Arthrobacter, Corynebacterium, Vibrio… [20], [23], [36]. Năm 1976, Patt và cộng sự phân lập được loài Methylobacterium sp.

đầu tiên có khả năng sử dụng methane. Loài này sắp xếp vào một chi mới là Methylobacterium với tên loài là Methylobacterium organophilum (loài chuẩn cho Chi) [41]. Năm 1982, Green và Bousfield nhận thấy chủng M. organophilum có nhiều đặc điểm rất giống với các loài VK Methylobacterium sp.

đã được công bố trước đây (không có khả năng sử dụng methane) và căn cứ trên sự tương đồng trên 70% của 140 đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái của 149 chủng với loài M. organophilum, Green và Bousfield Luan van 4 đã đề nghị sắp xếp các loài VK Methylobacterium sp. vào chi Methylobacterium [20], [23]. Từ năm 1992 đến nay, dựa sự phát triển của các phương pháp sinh học phân tử, hơn 50 loài Methylobacterium sp.

mới được công bố trên hệ thống NCBI [21], [25], [26], [51].2 Đặc điểm phân bố VK Methylobacterium sp. phân bố rộng trong tự nhiên, hiện diện ở nhiều môi trường khác nhau: môi trường đất, nước, không khí, băng ở hai cực, sần rễ thực vật và tập trung chủ yếu ở vùng lá thực vật [21], [23]. VK Methylobacterium sp. là những vi khuẩn hiếu khí hoàn toàn, do vậy các vi khuẩn này có thể được phân lập môi trường nước sạch nào có chứa oxy hòa tan.

Ngoài ra, VK Methylobacterium sp. còn có khả năng kháng với ion Cl- nên chúng vẫn hiện diện trong nước sạch dùng để sinh hoạt [24], [27]. VK Methylobacterium sp. được phân lập trên bề mặt lá, thân, rễ của thực vật nhưng mật độ ở mỗi cơ quan thì khác nhau [29].

Chúng có mặt chủ yếu trên vùng lá của hơn 100 loài thực vật và có mối quan hệ mật thiết với thực vật [18], [38], [40]. Thông qua phương pháp sử dụng carbon phóng xạ (C14) Green đã làm sáng tỏ khả năng sử dụng các hợp chất methanol từ thực vật của VK Methylobacterium sp., điều này giải thích nguyên nhân sự hiện diện của chi VK Methylobacterium sp. trên thực vật [23], [28], [39]. VK Methylobacterium sp.

thường lan truyền qua không khí, có khả năng sử dụng các hợp chất có tính độc với sinh vật làm nguồn cung cấp carbon và nitơ: tetrachloromethane, trimethylamine. Chính vì vậy, các VK Methylobacterium sp. còn đóng vai trò quan trọng trong chu trình carbon trong tự nhiên [23], [48], ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường [49]. Tuy nhiên, vai trò của chúng trong hệ sinh thái vẫn chưa được sáng tỏ [38].3 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lí Hầu hết các loài Methylobacterium sp.

thường có hình que kích thước 0,8 - 1 x 1- 8µm và là VK gram âm, thường ở dạng tế bào đơn hay kết đôi lại theo dạng hoa hồng (rosettes) [22], [23]. Hầu hết các chủng Methylobacterium sp. đều có khả năng Luan van 5 di động nhờ một tiêm mao ở cực hay gần cực và chúng cho phản ứng dương tính với catalase [23]. Chúng thường tăng sinh chậm, khuẩn lạc có màu hồng hay đỏ cam, một vài chủng không tăng trưởng trên môi trường nutrient agar.

Sắc tố hồng của VK Methylobacterium sp. không tan trong nước và là hợp chất carotenoid, không phát ánh sáng huỳnh quang, hấp thu bước sóng cực đại ở 473, 499 và 532nm [21]. Ở môi trường lỏng nuôi cấy tĩnh VK Methylobacterium tạo thành một lớp mỏng trên bề mặt, điều này cho thấy hầu hết các chủng đều là hiếu khí bắt buộc [23]. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của các loài thuộc chi Methylobacterium dao động từ 250C đến 300C.

Một vài loài vẫn có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 370C hay 510C. Mặc dù đa số các loài đều tăng trưởng ở khoảng pH trung tính nhưng cũng có một số loài vẫn có khả năng phát triển ở các giá trị pH cực đoan (pH=4; pH=10). Tất cả các loài đều không đòi hỏi các nhân tố tăng trưởng và không có khả năng phân giải các hợp chất như: casein, tinh bột, gelatin, cellulose, lecithin và DNA. Khả năng phân giải các hợp chất lipid chỉ có ở một số loài.

Tất cả các loài đều không tạo ra các enzyme: β-galactosidase, L-ornithine decarboxylase, L-lysine decarboxylase, L- arginine dihydrolase (ngoại trừ Urease lại hiện diện ở tất cả các loài) [21], [23], [24]. VK Methylobacterium sp. có tính kháng cao với chất khử, nhiệt độ lạnh, Cl-, tia UV phóng xạ ion, nhiệt độ cao. Phần lớn các loài trong Methylobacterium sp.

đều nhạy cảm với kháng sinh như: kanamycine, albamycine T, streptomycine, framycine và tetracyline. Trong đó, tetracyline có ức chế mạnh đối với VK Methylobacterium sp [23]. Phương thức chuyển hóa các hợp chất một cacbon ở tất cả các loài VK Methylobacterium sp. đều theo chu trình serine.

Trong đó có sự gắn kết giữa chu trình serine và chu trình tricarboxylic (TCA) để tạo ra các sản phẩm hữu cơ cuối cùng cho VK sử dụng. Ngoài ra, các chu trình này còn gắn kết với chu trình PHB để tạo ra các sản phẩm dự trữ cho VK (poly-β-hydroxybutyrate). Một số chủng có khả năng tổng hợp hormone thực vật (phytohormone) trong môi trường nuôi cấy, một số loài có khả năng tổng hợp vitamine B12 và một số khác [39]. Khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ cung cấp cung cấp nguồn cacbon và năng lượng của chủng VK Methylobacterium sp.

thuộc chi Methylobacterium sp. rất Luan van 6 đặc trưng. Hầu hết các chủng có khả năng sử dụng betaine, trimethylanine, serbactae,. Trong khi một số loài khác có khả năng sử dụng cyanate, thiocianate, formaldehyde, TNT (2,4,6-trinitrotoluene), HMX (octahydro-1,3,5,7-tetranitro- 1,3,5,7-tetrazicine hay high-melting-point explosive), RDX (hexahydro-trinitro- 1,3,5-triazine hay royal explosive),.

Do vậy, có thể phân biệt các loài VK Methylobacterium sp. nhờ căn cứ vào khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ của các chủng này [21], [23], [24].4 Phương pháp phân lập và định danh Methylobacterium sp. là những vi khuẩn có khả năng sử dụng methanol làm nguồn cung cấp carbon và năng lượng, vì thế môi trường methanol mineral salts (MMS) là môi trường thích hợp để phân lập vi khuẩn Methylobacterium sp. Ngoài ra, VK Methylobacterium sp.

có sắc tố hồng đặc trưng nên rất dễ nhận diện trên môi trường phân lập [23]. Khoảng nhiệt độ thường được sử dụng để phân lập Methylobacterium sp. Vi khuẩn có tốc độ tăng trưởng tương đối chậm, trên môi trường MMS sau 2 đến 3 ngày mới hình thành khuẩn lạc, khuẩn lạc đạt đường kính tối đa 1-3 mm sau 7 ngày nuôi cấy. Đôi khi vi khuẩn mọc nhanh, có màu đậm hơn trên môi trường Glycerol-Peptone Agar và môi trường này thường được sử dụng trong giữ giống các chủng VK Methylobacterium sp.

Ngoài việc sử dụng methanol làm tác nhân chọn lọc thì việc sử dụng cycloheximide cũng giúp cho quá trình phân lập được thuận lợi hơn. Khi sử dụng môi trường MMS làm môi trường phân lập thì những khuẩn lạc màu hồng có đường kính khoảng 1 mm thường là vi khuẩn Methylobacterium sp., trong môi trường này nhóm nấm men hay nhóm vi khuẩn có sắc tố hồng không phải là phổ biến [23], [36].5 Các loài vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium Theo thống kê của ngân hàng dữ liệu NCBI [51] thì đã có tổng cộng 52 loài tính đến tháng 4. Luan van 7 Bảng 1.1 Danh mục các loài Methylobacterium sp. đã được đặt tên.

STT (Lựa chọn dựa trên công bố của các tạp chí trong ngân hàng NCBI [51]) STT STT TÊN LOÀI TÊN LOÀI TÊN LOÀI 1 M.6 Một số ứng dụng của chi Methylobacterium a.Tác động lên thực vật Khả năng tương tác với thực vật cùng với việc hấp thu các chất tiết ra từ thực vật thì VK Methylobacterium sp. có thể tổng hợp và tiết ra các chất khác nhau có lợi cho quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Chủng Methylobacterium được Basile và cộng sự (1969) phát triển kích thích sinh trưởng ở cây rêu (Scapania nemorosa) trong điều kiện in vitro. Trong những nghiên cứu ban đầu, họ mô tả VK này có thể kích thích sự tăng trưởng và tái sinh của rêu nuôi cấy mô.

Sau đó, họ chỉ Luan van 8 ra rằng VK Methylobacterium sp. sản xuất vitamine B12 (cyanocobalamine) và sự bổ sung vitamine này khi trồng rêu Jungermannia leiantha và Gymnocolea inflata có thể kích thích sự tăng trưởng và phát triển của cây. VK Methylobacterium sp. có tác động đối với một số lượng lớn các loài cây trồng có giá trị như: thuốc lá, bông, dâu tây, lúa, bông vải, mía, cà chua, hướng dương, đậu phụng [9], [35], [36].

Tuy nhiên, hiệu quả cho từng loại cây trồng không phải do một loài mà là do sự tác động tổng hợp của nhiều loài VK Methylobacterium sp. Ngoài khả năng kích thích sự tăng trưởng và phát triển của một số loài cây trồng, VK Methylobacterium sp. còn có khả năng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh trên thực vật chẳng hạn như: Xanthomonas camprestris, Pseudomonas syringae, Erwinia carotovora, Clavibacter michiganense và Agrobacterium tumefaciens, Fusarium solani (gây bệnh trên cây tiêu), Guignardia citricarpa hay Xylella fastidiosa (gây bệnh nghiêm trọng trên các loài cây có múi). Madhaiyan ghi nhận khả năng kháng bệnh ở cây lúa và cây đậu phộng có liên quan tới sự thay đổi hệ enzyme polyphenol trong cây [35].

Penalvera và Poonguzhali ghi nhận khả năng sinh tổng hợp các phân tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone, điều này giúp VK Methylobacterium sp. cạnh tranh với các loài VK gây bệnh khác trong quá trình cư trú trên thực vật [42]. Các nghiên cứu này ghi nhận khả năng giúp cây trồng kháng lại với các tác nhân gây bệnh nhưng chưa làm sáng tỏ các cơ chế. Tuy nhiên, những ghi nhận này cũng cho thấy tiềm năng sử dụng VK Methylobacterium sp.