Tổng quan nghiên cứu

Trong bối cảnh kháng thuốc kháng sinh gia tăng và nguy cơ tuyệt chủng của nhiều loài cây dược liệu quý hiếm, việc khai thác các nguồn hoạt chất sinh học mới từ vi sinh vật nội sinh trở thành hướng nghiên cứu cấp thiết. Vi nấm nội sinh, sinh trưởng trong mô tế bào thực vật mà không gây hại cho cây chủ, được xem là nguồn tài nguyên phong phú các hợp chất có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư và chống oxy hóa. Cây thông đỏ (Taxus chinensis), một loài dược liệu quý hiếm thuộc sách đỏ Việt Nam và thế giới, chứa paclitaxel – một thuốc điều trị ung thư được FDA công nhận từ năm 1992. Tuy nhiên, việc khai thác paclitaxel từ cây thông đỏ gặp nhiều khó khăn do năng suất thấp và nguy cơ suy giảm quần thể cây. Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ tại Hà Giang nhằm mục tiêu tuyển chọn các chủng vi nấm có tiềm năng sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học mới, góp phần bảo tồn nguồn gen quý hiếm và phát triển nguyên liệu dược phẩm thay thế. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào 25 chủng vi nấm nội sinh phân lập từ cây thông đỏ tại huyện Quản Bạ và Đồng Văn, tỉnh Hà Giang, trong năm 2019. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các sản phẩm kháng sinh và thuốc chống ung thư mới, đồng thời thúc đẩy bảo tồn đa dạng sinh học và phát triển bền vững nguồn dược liệu bản địa.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên lý thuyết về mối quan hệ cộng sinh giữa vi nấm nội sinh và cây chủ, trong đó vi nấm sinh tổng hợp các hợp chất sinh học để bảo vệ cây khỏi tác nhân gây bệnh và hỗ trợ phát triển. Giả thuyết chuyển gen ngang (HGT) giải thích khả năng vi nấm nội sinh sinh tổng hợp paclitaxel tương tự cây chủ. Các khái niệm chính bao gồm: hoạt tính kháng sinh, hoạt tính gây độc tế bào ung thư, hoạt tính chống oxy hóa và chỉ thị phân tử sàng lọc gen sinh tổng hợp paclitaxel (dbat, bapt, ts). Mô hình nghiên cứu tập trung vào sàng lọc hoạt tính sinh học của vi nấm nội sinh, xác định đặc điểm hình thái và phân loại bằng giải trình tự gen ITS.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu gồm 25 chủng vi nấm nội sinh phân lập từ cây thông đỏ tại Hà Giang, cùng 7 chủng vi sinh vật kiểm định và 2 dòng tế bào ung thư (A-549 và MCF-7). Phương pháp phân tích bao gồm:

  • Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phương pháp đục lỗ thạch, đo đường kính vòng kháng khuẩn.
  • Tách chiết hoạt chất sinh học thô bằng ethyl acetate từ dịch nuôi cấy vi nấm.
  • Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro theo phương pháp nhuộm Sulforhodamine B (SRB), tính IC50.
  • Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa qua khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH.
  • Sàng lọc khả năng sinh tổng hợp paclitaxel bằng PCR khuếch đại gen dbat, bapt, ts.
  • Xác định đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử và phân loại vi nấm bằng giải trình tự gen ITS.
  • Thời gian nghiên cứu từ năm 2019 đến 2021, với cỡ mẫu 25 chủng vi nấm, chọn lọc 4 chủng tiềm năng cho phân tích sâu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Hoạt tính kháng sinh: Trong 25 chủng vi nấm nội sinh, 12 chủng (48%) có khả năng ức chế ít nhất một chủng vi sinh vật kiểm định. Tỷ lệ kháng cao nhất là với Staphylococcus epidermidis kháng methicilin (MRSE) chiếm 36%, tiếp theo là Bacillus cereus chiếm 32%. Bốn chủng TQF6, TQF25, TDF6, TDF7 thể hiện phổ kháng rộng trên ít nhất 5 chủng vi sinh vật với đường kính vòng kháng từ 7 đến 30 mm.

  2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư: Cao chiết từ 4 chủng vi nấm tiềm năng cho thấy khả năng ức chế tế bào ung thư phổi A-549 và ung thư vú MCF-7 khác nhau. Chủng TDF7 có tỷ lệ ức chế cao nhất, đạt 93,91% trên A-549 và 89,22% trên MCF-7 với IC50 lần lượt là 13,4 µg/mL và 17,82 µg/mL. Chủng TDF6 cũng có hoạt tính mạnh với tỷ lệ ức chế trên 90% và IC50 dưới 20 µg/mL. Hai chủng TQF6 và TQF25 có hoạt tính gây độc tế bào thấp hơn 50%.

  3. Hoạt tính chống oxy hóa: Cao chiết tổng của 4 chủng vi nấm có khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH cao, tăng theo nồng độ. Ở nồng độ 400 µg/mL, hoạt tính chống oxy hóa của TQF6 và TQF25 đạt trên 93%, TDF6 đạt 89%, trong khi TDF7 thấp hơn với 60,7%.

  4. Khả năng sinh tổng hợp paclitaxel: Kết quả PCR cho thấy gen dbat được khuếch đại thành công ở 3 chủng TQF6, TQF25 và TDF6; gen bapt chỉ xuất hiện ở TQF25. Gen ts không được phát hiện ở các chủng này. Chủng TDF7 không có gen sinh paclitaxel nhưng vẫn có hoạt tính sinh học cao, cho thấy tiềm năng sản xuất các hợp chất khác.

Thảo luận kết quả

Hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ tại Hà Giang vượt trội so với một số nghiên cứu tương tự trên cây thông đỏ ở Nepal và các cây dược liệu khác, với tỷ lệ chủng có hoạt tính kháng sinh đạt gần 50%, cao hơn mức 23% và 8-27% trong các nghiên cứu trước. Sự khác biệt này có thể do điều kiện môi trường và đa dạng sinh học đặc thù của vùng nghiên cứu. Hoạt tính gây độc tế bào mạnh của chủng TDF6 và TDF7 tương đồng với các nghiên cứu quốc tế về nấm nội sinh trên cây thông đỏ và các cây dược liệu khác, khẳng định tiềm năng ứng dụng trong phát triển thuốc chống ung thư. Hoạt tính chống oxy hóa cao của các chủng vi nấm cũng phù hợp với vai trò bảo vệ cây chủ và tiềm năng ứng dụng trong y học. Việc phát hiện gen dbat và bapt trong các chủng vi nấm nội sinh chứng minh cơ chế chuyển gen ngang góp phần vào khả năng sinh tổng hợp paclitaxel, đồng thời cho thấy phương pháp PCR chỉ thị phân tử là công cụ hiệu quả để sàng lọc nhanh các chủng tiềm năng. Sự vắng mặt gen ts có thể do biến dị di truyền hoặc con đường sinh tổng hợp khác biệt ở vi nấm. Phân loại hình thái và phân tích gen ITS xác định chủng TQF6 thuộc Neofusicoccum italicum, TQF25 thuộc Hypoxylon sp., TDF6 và TDF7 thuộc Fusarium sp., các chi nấm này đều được biết đến với khả năng sản xuất các hợp chất sinh học đa dạng, phù hợp với kết quả hoạt tính sinh học thu nhận.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Tối ưu điều kiện nuôi cấy và lên men: Thực hiện các nghiên cứu tối ưu môi trường nuôi cấy, pH, nhiệt độ và thời gian lên men nhằm tăng năng suất sinh tổng hợp paclitaxel và các hoạt chất sinh học từ các chủng TQF6, TQF25 và TDF6 trong vòng 12-18 tháng. Chủ thể thực hiện: Viện Công nghệ sinh học và các trung tâm nghiên cứu vi sinh vật.

  2. Phát triển quy trình chiết tách và tinh chế: Xây dựng quy trình chiết tách, tinh chế paclitaxel và các hợp chất kháng sinh từ dịch lên men vi nấm với hiệu suất cao, đảm bảo độ tinh khiết và hoạt tính sinh học trong 12 tháng tiếp theo. Chủ thể thực hiện: Phòng thí nghiệm công nghệ sinh học và công nghiệp dược.

  3. Nghiên cứu cơ chế tác động và thử nghiệm tiền lâm sàng: Tiến hành nghiên cứu cơ chế gây độc tế bào ung thư và kháng sinh của các hợp chất chiết xuất, đồng thời thực hiện thử nghiệm tiền lâm sàng trên mô hình động vật trong 24 tháng. Chủ thể thực hiện: Các viện nghiên cứu ung thư và dược lý.

  4. Bảo tồn và phát triển nguồn gen vi nấm nội sinh: Thiết lập ngân hàng gen vi nấm nội sinh quý hiếm trên cây thông đỏ, đồng thời triển khai các chương trình bảo tồn quần thể cây thông đỏ tại Hà Giang trong 36 tháng. Chủ thể thực hiện: Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, các cơ quan quản lý bảo tồn thiên nhiên.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu sinh học và vi sinh vật: Luận văn cung cấp dữ liệu chi tiết về đa dạng vi nấm nội sinh, hoạt tính sinh học và phương pháp phân loại hiện đại, hỗ trợ nghiên cứu phát triển thuốc sinh học.

  2. Chuyên gia công nghệ sinh học dược phẩm: Thông tin về khả năng sinh tổng hợp paclitaxel và các hợp chất kháng sinh từ vi nấm nội sinh giúp phát triển nguyên liệu thay thế trong sản xuất thuốc chống ung thư và kháng sinh.

  3. Cơ quan quản lý bảo tồn và phát triển nguồn gen: Nghiên cứu góp phần bảo tồn loài cây thông đỏ quý hiếm và khai thác bền vững nguồn vi nấm nội sinh bản địa, hỗ trợ chính sách bảo vệ đa dạng sinh học.

  4. Sinh viên và học viên cao học ngành sinh học thực nghiệm, công nghệ sinh học: Luận văn là tài liệu tham khảo quý giá về thiết kế nghiên cứu, phương pháp phân tích hoạt tính sinh học và ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu vi sinh vật.

Câu hỏi thường gặp

  1. Vi nấm nội sinh là gì và tại sao chúng quan trọng trong nghiên cứu dược liệu?
    Vi nấm nội sinh là vi nấm sống bên trong mô tế bào thực vật mà không gây hại cho cây chủ. Chúng quan trọng vì có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất sinh học có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư và chống oxy hóa, mở ra nguồn nguyên liệu dược phẩm mới.

  2. Phương pháp nào được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng sinh của vi nấm nội sinh?
    Phương pháp đục lỗ thạch được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng sinh, đo đường kính vòng kháng khuẩn trên môi trường thạch chứa vi sinh vật kiểm định, giúp xác định khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh.

  3. Làm thế nào để xác định khả năng sinh paclitaxel của vi nấm nội sinh?
    Khả năng sinh paclitaxel được xác định bằng phương pháp PCR khuếch đại các gen chỉ thị dbat, bapt và ts, các gen mã hóa enzym quan trọng trong con đường sinh tổng hợp paclitaxel, giúp sàng lọc nhanh các chủng tiềm năng.

  4. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư được đánh giá như thế nào trong nghiên cứu?
    Hoạt tính gây độc tế bào ung thư được đánh giá bằng phương pháp nhuộm Sulforhodamine B (SRB) trên các dòng tế bào ung thư A-549 và MCF-7, tính IC50 để xác định nồng độ ức chế 50% sự phát triển tế bào.

  5. Tại sao việc bảo tồn cây thông đỏ lại quan trọng trong nghiên cứu này?
    Cây thông đỏ là nguồn cung cấp paclitaxel quý hiếm và có nguy cơ tuyệt chủng do khai thác quá mức. Bảo tồn cây giúp duy trì nguồn gen quý, đồng thời vi nấm nội sinh trên cây cũng là nguồn tài nguyên sinh học tiềm năng cần được bảo vệ và khai thác bền vững.

Kết luận

  • Đã tuyển chọn và đánh giá 25 chủng vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ tại Hà Giang, trong đó 12 chủng có hoạt tính kháng sinh và 4 chủng có hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao.
  • Phương pháp PCR chỉ thị phân tử thành công trong sàng lọc gen sinh tổng hợp paclitaxel, phát hiện gen dbat và bapt ở 3 chủng vi nấm.
  • Các chủng TQF6, TQF25, TDF6 và TDF7 được phân loại thuộc các chi Neofusicoccum, Hypoxylon và Fusarium, có tiềm năng ứng dụng trong dược phẩm.
  • Hoạt tính chống oxy hóa cao của các chủng vi nấm nội sinh góp phần bảo vệ cây chủ và mở rộng ứng dụng trong y học.
  • Đề xuất nghiên cứu tiếp tục tối ưu quy trình nuôi cấy, chiết tách, thử nghiệm tiền lâm sàng và bảo tồn nguồn gen trong vòng 3 năm tới.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp dược phẩm hợp tác phát triển quy trình sản xuất paclitaxel từ vi nấm nội sinh, đồng thời tăng cường bảo tồn cây thông đỏ và đa dạng sinh học tại Việt Nam.