Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ taxus chinensis

Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ Taxus chinensis, góp phần vào y học và sinh học.

• Tác giả: Bùi Thị Liên
• Người hướng dẫn: PGS. Phí Quyết Tiến
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Hoạt Tính Kháng Sinh Và Gây Độc Tế Bào Của Vi Nấm Nội Sinh Trên Cây Thông Đỏ (Taxus Chinensis)
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY DƯỢC LIỆU
• 1.1.1. Giới thiệu về vi nấm nội sinh
• 1.1.2. Sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh
• 1.1.2.1. Hoạt chất kháng khuẩn và kháng nấm
• 1.1.2.2. Hoạt chất gây độc tế bào ung thư
• 1.1.2.3. Hoạt chất kháng virus
• 1.1.3. Cây thông đỏ (Taxus spp.)
• 1.1.3.1. Các chất kháng sinh và gây độc tế bào ung thư từ vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ
• 1.1.3.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong sàng lọc vi nấm nội sinh sinh paclitaxel và dẫn xuất của paclitaxel
• 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠI VIỆT NAM VỀ VI NẤM NỘI SINH
• 1.3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.3.1. Hóa chất, thiết bị
• 1.3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.3.2.1. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
• 1.3.2.2. Tách chiết các hoạt chất sinh học thô từ vi nấm nội sinh
• 1.3.2.3. Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư
• 1.3.2.4. Khảo sát khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của các chủng tuyển chọn
• 1.3.2.5. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp paclitaxel thông qua sàng các gen chỉ thị
• 1.3.2.6. Xác định đặc điểm hình thái và bào tử của các chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn
• 1.3.2.7. Phân loại các chủng vi nấm nội sinh được tuyển chọn bằng giải và phân tích trình tự vùng ITS
• 1.3.2.8. Xử lý thống kê số liệu
• 1.4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 1.4.1. SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ
• 1.4.2. SÀNG LỌC HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH
• 1.4.3. NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TỪ DỊCH CHIẾT THÔ CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM
• 1.4.4. SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ SÀNG LỌC KHẢ NĂNG SINH PACLITAXEL CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM
• 1.4.5. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH TQF6, TQF25, TDF6, TDF7
• 1.4.5.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử và cuống sinh bào tử của các chủng vi nấm nội sinh được tuyển chọn
• 1.4.5.2. Phân loại các chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn bằng giải và phân tích trình tự ITS
• 2. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về vi nấm nội sinh

Vi nấm nội sinh là nhóm vi sinh vật sinh trưởng và phát triển trong các mô tế bào thực vật mà không cạnh tranh dinh dưỡng hay gây hại tới cây chủ. Chúng tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học để bảo vệ và giúp cây chủ chống lại tác nhân gây bệnh, đồng thời thúc đẩy sự phát triển của thực vật. Trong 10 năm qua, đã có khoảng 770 loại vi nấm nội sinh được công bố trên thực vật. Các chi nấm phổ biến như Altenaria, Aspergillus, và Penicillium đã được nghiên cứu nhiều. Tương tác giữa vi nấm và cây chủ không chỉ là trạng thái cân bằng giữa các yếu tố độc tính lây nhiễm và khả năng phòng vệ, mà còn là tương tác cộng sinh. Vi nấm nội sinh có thể bảo vệ cây chủ khỏi các tác nhân gây bệnh bằng cách sản sinh các chất đặc thù. Nghiên cứu về vi nấm nội sinh đang mở ra nhiều tiềm năng trong việc phát triển các sản phẩm dược phẩm mới.

II. Hoạt chất kháng khuẩn và kháng nấm

Các chất có hoạt tính kháng vi sinh vật được sinh tổng hợp từ vi nấm nội sinh, giúp bảo vệ cây chủ khỏi các tác nhân gây bệnh. Các hợp chất này không chỉ có thể được sử dụng trong lĩnh vực y-dược mà còn trong nông nghiệp và thực phẩm. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi nấm nội sinh có khả năng sản sinh các hợp chất kháng khuẩn mạnh mẽ. Ví dụ, chủng vi nấm nội sinh Penicillium cataractum từ cây bạch quả có khả năng kháng các chủng vi khuẩn gây bệnh như Staphylococcus aureus và Escherichia coli. Hợp chất fusaripeptide A từ chủng Fusarium sp. có khả năng kháng nấm men gây bệnh ngoài da. Những phát hiện này cho thấy tiềm năng lớn của vi nấm nội sinh trong việc phát triển các sản phẩm kháng sinh mới.

III. Hoạt chất gây độc tế bào ung thư

Vi nấm nội sinh không chỉ sản sinh các hợp chất kháng vi sinh vật mà còn có khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất có tính gây độc tế bào ung thư. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhiều chủng vi nấm nội sinh có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Ví dụ, một số chủng vi nấm nội sinh đã được chứng minh có khả năng ức chế tế bào ung thư phổi và ung thư vú. Việc khai thác các hoạt chất này từ vi nấm nội sinh có thể mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư, giúp giảm thiểu việc sử dụng các hóa chất độc hại trong y học. Điều này không chỉ có lợi cho sức khỏe con người mà còn góp phần bảo vệ môi trường.

IV. Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và độc tính

Nghiên cứu về hoạt tính kháng sinh và độc tính của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (Taxus chinensis) đã chỉ ra rằng các chủng vi nấm này có khả năng sản sinh các hợp chất kháng sinh và gây độc tế bào ung thư. Việc sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh cao là một trong những mục tiêu chính của nghiên cứu. Các kết quả cho thấy rằng vi nấm nội sinh có thể là nguồn nguyên liệu quý giá cho ngành dược phẩm, đặc biệt trong việc phát triển các sản phẩm mới với giá thành thấp. Điều này không chỉ giúp bảo tồn loài thông đỏ mà còn tạo ra các sản phẩm có giá trị cho sức khỏe con người.

V. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu

Việc sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu vi nấm nội sinh giúp xác định khả năng sinh tổng hợp paclitaxel và các hợp chất có hoạt tính sinh học khác. Các phương pháp phân tích gen hiện đại cho phép xác định các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp các hợp chất này. Điều này không chỉ giúp nâng cao hiệu quả trong việc tìm kiếm các chủng vi nấm có tiềm năng mà còn mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu và phát triển dược phẩm. Sự kết hợp giữa công nghệ sinh học và vi sinh vật học sẽ tạo ra những bước tiến mới trong việc phát triển các sản phẩm có giá trị từ vi nấm nội sinh.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong bối cảnh kháng thuốc kháng sinh gia tăng và nguy cơ tuyệt chủng của nhiều loài cây dược liệu quý hiếm, việc khai thác các nguồn hoạt chất sinh học mới từ vi sinh vật nội sinh trở thành hướng nghiên cứu cấp thiết. Vi nấm nội sinh, sinh trưởng trong mô tế bào thực vật mà không gây hại cho cây chủ, được xem là nguồn tài nguyên phong phú các hợp chất có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư và chống oxy hóa. Cây thông đỏ (Taxus chinensis), một loài dược liệu quý hiếm thuộc sách đỏ Việt Nam và thế giới, chứa paclitaxel – một thuốc điều trị ung thư được FDA công nhận từ năm 1992. Tuy nhiên, việc khai thác paclitaxel từ cây thông đỏ gặp nhiều khó khăn do năng suất thấp và nguy cơ suy giảm quần thể cây. Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ tại Hà Giang nhằm mục tiêu tuyển chọn các chủng vi nấm có tiềm năng sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học mới, góp phần bảo tồn nguồn gen quý hiếm và phát triển nguyên liệu dược phẩm thay thế. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào 25 chủng vi nấm nội sinh phân lập từ cây thông đỏ tại huyện Quản Bạ và Đồng Văn, tỉnh Hà Giang, trong năm 2019. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các sản phẩm kháng sinh và thuốc chống ung thư mới, đồng thời thúc đẩy bảo tồn đa dạng sinh học và phát triển bền vững nguồn dược liệu bản địa.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên lý thuyết về mối quan hệ cộng sinh giữa vi nấm nội sinh và cây chủ, trong đó vi nấm sinh tổng hợp các hợp chất sinh học để bảo vệ cây khỏi tác nhân gây bệnh và hỗ trợ phát triển. Giả thuyết chuyển gen ngang (HGT) giải thích khả năng vi nấm nội sinh sinh tổng hợp paclitaxel tương tự cây chủ. Các khái niệm chính bao gồm: hoạt tính kháng sinh, hoạt tính gây độc tế bào ung thư, hoạt tính chống oxy hóa và chỉ thị phân tử sàng lọc gen sinh tổng hợp paclitaxel (dbat, bapt, ts). Mô hình nghiên cứu tập trung vào sàng lọc hoạt tính sinh học của vi nấm nội sinh, xác định đặc điểm hình thái và phân loại bằng giải trình tự gen ITS.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu gồm 25 chủng vi nấm nội sinh phân lập từ cây thông đỏ tại Hà Giang, cùng 7 chủng vi sinh vật kiểm định và 2 dòng tế bào ung thư (A-549 và MCF-7). Phương pháp phân tích bao gồm:

• Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phương pháp đục lỗ thạch, đo đường kính vòng kháng khuẩn.
• Tách chiết hoạt chất sinh học thô bằng ethyl acetate từ dịch nuôi cấy vi nấm.
• Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro theo phương pháp nhuộm Sulforhodamine B (SRB), tính IC50.
• Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa qua khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH.
• Sàng lọc khả năng sinh tổng hợp paclitaxel bằng PCR khuếch đại gen dbat, bapt, ts.
• Xác định đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử và phân loại vi nấm bằng giải trình tự gen ITS.
• Thời gian nghiên cứu từ năm 2019 đến 2021, với cỡ mẫu 25 chủng vi nấm, chọn lọc 4 chủng tiềm năng cho phân tích sâu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Hoạt tính kháng sinh: Trong 25 chủng vi nấm nội sinh, 12 chủng (48%) có khả năng ức chế ít nhất một chủng vi sinh vật kiểm định. Tỷ lệ kháng cao nhất là với Staphylococcus epidermidis kháng methicilin (MRSE) chiếm 36%, tiếp theo là Bacillus cereus chiếm 32%. Bốn chủng TQF6, TQF25, TDF6, TDF7 thể hiện phổ kháng rộng trên ít nhất 5 chủng vi sinh vật với đường kính vòng kháng từ 7 đến 30 mm.

2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư: Cao chiết từ 4 chủng vi nấm tiềm năng cho thấy khả năng ức chế tế bào ung thư phổi A-549 và ung thư vú MCF-7 khác nhau. Chủng TDF7 có tỷ lệ ức chế cao nhất, đạt 93,91% trên A-549 và 89,22% trên MCF-7 với IC50 lần lượt là 13,4 µg/mL và 17,82 µg/mL. Chủng TDF6 cũng có hoạt tính mạnh với tỷ lệ ức chế trên 90% và IC50 dưới 20 µg/mL. Hai chủng TQF6 và TQF25 có hoạt tính gây độc tế bào thấp hơn 50%.

3. Hoạt tính chống oxy hóa: Cao chiết tổng của 4 chủng vi nấm có khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH cao, tăng theo nồng độ. Ở nồng độ 400 µg/mL, hoạt tính chống oxy hóa của TQF6 và TQF25 đạt trên 93%, TDF6 đạt 89%, trong khi TDF7 thấp hơn với 60,7%.

4. Khả năng sinh tổng hợp paclitaxel: Kết quả PCR cho thấy gen dbat được khuếch đại thành công ở 3 chủng TQF6, TQF25 và TDF6; gen bapt chỉ xuất hiện ở TQF25. Gen ts không được phát hiện ở các chủng này. Chủng TDF7 không có gen sinh paclitaxel nhưng vẫn có hoạt tính sinh học cao, cho thấy tiềm năng sản xuất các hợp chất khác.

Thảo luận kết quả

Hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ tại Hà Giang vượt trội so với một số nghiên cứu tương tự trên cây thông đỏ ở Nepal và các cây dược liệu khác, với tỷ lệ chủng có hoạt tính kháng sinh đạt gần 50%, cao hơn mức 23% và 8-27% trong các nghiên cứu trước. Sự khác biệt này có thể do điều kiện môi trường và đa dạng sinh học đặc thù của vùng nghiên cứu. Hoạt tính gây độc tế bào mạnh của chủng TDF6 và TDF7 tương đồng với các nghiên cứu quốc tế về nấm nội sinh trên cây thông đỏ và các cây dược liệu khác, khẳng định tiềm năng ứng dụng trong phát triển thuốc chống ung thư. Hoạt tính chống oxy hóa cao của các chủng vi nấm cũng phù hợp với vai trò bảo vệ cây chủ và tiềm năng ứng dụng trong y học. Việc phát hiện gen dbat và bapt trong các chủng vi nấm nội sinh chứng minh cơ chế chuyển gen ngang góp phần vào khả năng sinh tổng hợp paclitaxel, đồng thời cho thấy phương pháp PCR chỉ thị phân tử là công cụ hiệu quả để sàng lọc nhanh các chủng tiềm năng. Sự vắng mặt gen ts có thể do biến dị di truyền hoặc con đường sinh tổng hợp khác biệt ở vi nấm. Phân loại hình thái và phân tích gen ITS xác định chủng TQF6 thuộc Neofusicoccum italicum, TQF25 thuộc Hypoxylon sp., TDF6 và TDF7 thuộc Fusarium sp., các chi nấm này đều được biết đến với khả năng sản xuất các hợp chất sinh học đa dạng, phù hợp với kết quả hoạt tính sinh học thu nhận.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu điều kiện nuôi cấy và lên men: Thực hiện các nghiên cứu tối ưu môi trường nuôi cấy, pH, nhiệt độ và thời gian lên men nhằm tăng năng suất sinh tổng hợp paclitaxel và các hoạt chất sinh học từ các chủng TQF6, TQF25 và TDF6 trong vòng 12-18 tháng. Chủ thể thực hiện: Viện Công nghệ sinh học và các trung tâm nghiên cứu vi sinh vật.

2. Phát triển quy trình chiết tách và tinh chế: Xây dựng quy trình chiết tách, tinh chế paclitaxel và các hợp chất kháng sinh từ dịch lên men vi nấm với hiệu suất cao, đảm bảo độ tinh khiết và hoạt tính sinh học trong 12 tháng tiếp theo. Chủ thể thực hiện: Phòng thí nghiệm công nghệ sinh học và công nghiệp dược.

3. Nghiên cứu cơ chế tác động và thử nghiệm tiền lâm sàng: Tiến hành nghiên cứu cơ chế gây độc tế bào ung thư và kháng sinh của các hợp chất chiết xuất, đồng thời thực hiện thử nghiệm tiền lâm sàng trên mô hình động vật trong 24 tháng. Chủ thể thực hiện: Các viện nghiên cứu ung thư và dược lý.

4. Bảo tồn và phát triển nguồn gen vi nấm nội sinh: Thiết lập ngân hàng gen vi nấm nội sinh quý hiếm trên cây thông đỏ, đồng thời triển khai các chương trình bảo tồn quần thể cây thông đỏ tại Hà Giang trong 36 tháng. Chủ thể thực hiện: Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, các cơ quan quản lý bảo tồn thiên nhiên.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu sinh học và vi sinh vật: Luận văn cung cấp dữ liệu chi tiết về đa dạng vi nấm nội sinh, hoạt tính sinh học và phương pháp phân loại hiện đại, hỗ trợ nghiên cứu phát triển thuốc sinh học.

2. Chuyên gia công nghệ sinh học dược phẩm: Thông tin về khả năng sinh tổng hợp paclitaxel và các hợp chất kháng sinh từ vi nấm nội sinh giúp phát triển nguyên liệu thay thế trong sản xuất thuốc chống ung thư và kháng sinh.

3. Cơ quan quản lý bảo tồn và phát triển nguồn gen: Nghiên cứu góp phần bảo tồn loài cây thông đỏ quý hiếm và khai thác bền vững nguồn vi nấm nội sinh bản địa, hỗ trợ chính sách bảo vệ đa dạng sinh học.

4. Sinh viên và học viên cao học ngành sinh học thực nghiệm, công nghệ sinh học: Luận văn là tài liệu tham khảo quý giá về thiết kế nghiên cứu, phương pháp phân tích hoạt tính sinh học và ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu vi sinh vật.

Câu hỏi thường gặp

1. Vi nấm nội sinh là gì và tại sao chúng quan trọng trong nghiên cứu dược liệu?
   Vi nấm nội sinh là vi nấm sống bên trong mô tế bào thực vật mà không gây hại cho cây chủ. Chúng quan trọng vì có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất sinh học có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư và chống oxy hóa, mở ra nguồn nguyên liệu dược phẩm mới.

2. Phương pháp nào được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng sinh của vi nấm nội sinh?
   Phương pháp đục lỗ thạch được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng sinh, đo đường kính vòng kháng khuẩn trên môi trường thạch chứa vi sinh vật kiểm định, giúp xác định khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh.

3. Làm thế nào để xác định khả năng sinh paclitaxel của vi nấm nội sinh?
   Khả năng sinh paclitaxel được xác định bằng phương pháp PCR khuếch đại các gen chỉ thị dbat, bapt và ts, các gen mã hóa enzym quan trọng trong con đường sinh tổng hợp paclitaxel, giúp sàng lọc nhanh các chủng tiềm năng.

4. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư được đánh giá như thế nào trong nghiên cứu?
   Hoạt tính gây độc tế bào ung thư được đánh giá bằng phương pháp nhuộm Sulforhodamine B (SRB) trên các dòng tế bào ung thư A-549 và MCF-7, tính IC50 để xác định nồng độ ức chế 50% sự phát triển tế bào.

5. Tại sao việc bảo tồn cây thông đỏ lại quan trọng trong nghiên cứu này?
   Cây thông đỏ là nguồn cung cấp paclitaxel quý hiếm và có nguy cơ tuyệt chủng do khai thác quá mức. Bảo tồn cây giúp duy trì nguồn gen quý, đồng thời vi nấm nội sinh trên cây cũng là nguồn tài nguyên sinh học tiềm năng cần được bảo vệ và khai thác bền vững.

Kết luận

• Đã tuyển chọn và đánh giá 25 chủng vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ tại Hà Giang, trong đó 12 chủng có hoạt tính kháng sinh và 4 chủng có hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao.
• Phương pháp PCR chỉ thị phân tử thành công trong sàng lọc gen sinh tổng hợp paclitaxel, phát hiện gen dbat và bapt ở 3 chủng vi nấm.
• Các chủng TQF6, TQF25, TDF6 và TDF7 được phân loại thuộc các chi Neofusicoccum, Hypoxylon và Fusarium, có tiềm năng ứng dụng trong dược phẩm.
• Hoạt tính chống oxy hóa cao của các chủng vi nấm nội sinh góp phần bảo vệ cây chủ và mở rộng ứng dụng trong y học.
• Đề xuất nghiên cứu tiếp tục tối ưu quy trình nuôi cấy, chiết tách, thử nghiệm tiền lâm sàng và bảo tồn nguồn gen trong vòng 3 năm tới.

Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp dược phẩm hợp tác phát triển quy trình sản xuất paclitaxel từ vi nấm nội sinh, đồng thời tăng cường bảo tồn cây thông đỏ và đa dạng sinh học tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY DƯỢC LIỆU 1. Giới thiệu về vi nấm nội sinh Vi nấm nội sinh là nhóm vi sinh vật sinh trưởng và phát triển trong các mô tế bào thực vật mà không cạnh tranh dinh dưỡng hay gây hại tới cây chủ.

Vi nấm nội sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học để bảo vệ và giúp cây chủ chống lại tác nhân gây bệnh đồng thời thúc đẩy sự phát triển của thực vật [1]. Trong 10 năm qua, các nhà khoa học đã công bố khoảng 770 loại vi nấm nội sinh trên thực vật. Trong đó, các chi nấm phổ biến có thể được kể đến như Altenaria, Aspergillus, Colletrotrichum, Guignardia, Nigrospora, Penicillium, Phomopsis, Rhizoctonia và Xylaria [2]. Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về cơ chế nội sinh của vi nấm trên thực vật.

Giả thuyết về sự xâm chiếm không triệu chứng khẳng định cơ chế nội sinh là sự cân bằng đối kháng giữa vật chủ và nội sinh vật (Hình 1. Vi sinh vật nội sinh và gây bệnh đều mang các gen độc tính, giúp vi sinh vật xâm nhiễm cây chủ. Nếu độc tính lây nhiễm của vi nấm và khả năng bảo vệ của cây chủ cân bằng, thì quá trình nội sinh sẽ diễn ra theo và không gây tác động xấu tới cây chủ. Ở trạng thái cân bằng này, các yếu tố môi trường đóng vai trò chính.

Nếu quá trình đáp ứng miễn dịch xảy ra quá mạnh mẽ ở cây chủ thì nấm sẽ bị tiêu diệt bởi các chất và protein bảo vệ. Ngược lại, hiện tượng cây nhiễm bệnh nấm xảy ra khi cơ chế miễn dịch bảo vệ của cây không đủ để cân bằng hay tiêu diệt độc tính từ vi nấm (Hình 1. Hiện tượng này thường bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố chủ quan và khách quan như bản thân cây chủ và môi trường [4]. Tương tác giữa vi nấm và cây chủ có thể không chỉ là trạng thái cân bằng giữa các yếu tố độc tính lây nhiễm và khả năng phòng vệ, mà là tương tác cộng sinh.

Vi nấm nội sinh có thể bảo vệ các cây chủ khỏi các tác nhân gây bệnh bằng việc sản sinh các bằng cách bài tiết các chất đặc thù theo thuyết “hiệu ứng khảm”. Theo một giả thuyết khác, vi nấm có thể hỗ trợ và tăng cường khả năng miễn dịch của cây chủ [4]. Howitz và Sinclair đề xuất giả thuyết “xenohormesis” cho rằng ở trạng thái phòng vệ, cây chủ sản sinh các chất có khối lượng phân tử thấp truyền tín hiệu tới cộng đồng vi sinh vật dị dưỡng nội sinh. Nhờ đó, các vi sinh vật nội dinh có thể cảm nhận sự thay Luan van 4 đổi trong quá trình trao đổi chất của cây chủ và sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp hữu ích cho cây chủ.

Dưới áp lực tiến hoá chọn lọc, nhiều vi sinh vật đã mất các gen mã hoá protein tham gia sinh tổng hợp các chất này. Một số cụm gen không bị ảnh hưởng bởi quá trình thích nghi và tiến hoá vì cần thiết cho tương tác giữa cây chủ và vi sinh vật nội sinh hoặc giữa các vi sinh vật nội sinh với nhau. Ở giả thiết khác, các chất truyền tín hiệu từ thực vật cũng có thể là sản phẩm trao đổi chất của các vi sinh vật nội sinh được kích thích sinh tổng hợp bằng nhiều cơ chế điều hoà khác nhau của cây chủ [5]. Mối quan hệ giữa vi vật nội sinh và cây chủ [4] Ước tính đã có khoảng 7% trong số 1,5 triệu loài nấm đã được công bố.

Việc ứng dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới trong nghiên cứu về vi sinh vật góp phần củng cố lập luận mới cho rằng: hiện có khoảng 3,5 - 5,1 triệu loài nấm tồn tại trên trái đất [6]. Nhận định này trái ngược với báo cáo trước đó vào năm 2017 của Hawksworth và Lücking cho rằng có khoảng 2,2 đến 3,1 triệu loài nấm [7]. Trong đó, vi nấm nội sinh trên cây dược liệu chiếu 1 phần khá khiêm tốn. Chính vì vậy, vi nấm nội sinh có nhiều tiềm năng khai thác và không chỉ đa dạng loài mà còn đa dạng về khả năng sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học.

Sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh Vi nấm nội sinh khá đa dạng ở thực vật, đại diện cho nguồn tài nguyên sinh học dồi dào về hợp chất tự nhiên có tiềm năng khai thác trong lĩnh vực dược phẩm và nông nghiệp [8]. Tuy nhiên, vi nấm nội sinh vẫn chưa được khai thác nhiều [9]. Nhiều hợp chất được sản xuất bởi các loại vi nấm này có hoạt tính sinh học cao, thuộc các nhóm như alcaloid, flavonoid, steroid, terpenoid, peptide, polyketone, quinol và phenol. Cho đến năm 2003, khoảng 4.000 chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học đã được thu nhận từ vi nấm [10].

Rất nhiều thông tin về đa dạng di truyền, cơ chế tương tác và các chất có hoạt tính sinh học khác nhau từ vi nấm nội sinh đã được nghiên cứu trong ba thập kỷ qua. Hoạt chất kháng khuẩn và kháng nấm Các chất có hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh được sinh tổng hợp từ vi nấm nội sinh, hoặc là sản phẩm kết hợp giữa mối quan hệ tương tác giữa nấm và thực vật, giúp cho vi nấm nội sinh thích ứng tốt hơn và bảo vệ cây chủ khỏi những tác nhân gây bệnh. Đối với con người, các hợp chất kháng vi sinh vật không chỉ có thể được sử dụng làm trong lĩnh vực y-dược mà còn được sử dụng trong lĩnh vực nông nghiệp và thực phẩm. Trong những năm gần đây, số lượng các chất có hoạt tính kháng vi sinh vật đã từ vi nấm nội sinh ngày càng nhiều (Bảng 1.

Chủng vi nấm nội sinh Penicillium cataractum phân lập từ cây bạch quả (Ginkgo biloba) sản xuất penicimenolidyu AB, pasfonin có khả năng kháng các chủng vi khuẩn gây bệnh như Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trong khoảng 23–361 μM [6]. Nhiều chất kháng khuẩn từ chủng vi nấm nội sinh Armillaria mellea từ cây thiên ma (Gastrodia elata) đã được phân lập, thuộc một số lớp cấu trúc như alkaloid, peptit, steroid, terpenoit, phenol, quinin và flavonoid cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Gram (+), nấm men và nấm sợi. Ba hoạt chất mới gồm phomoenamide, phomonitroester và peacetylphomoxanthone B tách chiết từ dịch lên men nấm nội sinh Phomopsis sp. PSU-D15 có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh mạnh [11].

Đặc biệt, phomoenamide đã thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis H37Ra. Luan van 6 Hợp chất fusaripeptide A được phát hiện từ chủng Fusarium sp. phân lập từ rễ cây ngựa bạc hà (Mentha longifolia) có khả năng sinh kháng nấm men gây bệnh ngoài da (Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei) và nấm sợi (Aspergillus fumigates) [12]. Nấm nội sinh Phomopsis sp.

YM 311483 từ cây Neem Ấn Độ (Azadirachta indica) sinh tổng hợp bốn loại lactone mới, có hoạt tính kháng nấm Aspergillus niger, Botrytis cinere và Fusarium sp. Chủng Fusarium nội sinh trên cây dương xỉ (Selaginella pollescens) được thu thập trong khu bảo tồn Guanacaste của Costa Rica được chứng minh có khả năng ức chế mạnh C. Jesterone là hợp chất kháng nấm mới ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp được phân lập từ nấm Pestalotiopsis jester nội sinh trên cây gỗ trai (Fagraea bordenii Wernham) [14]. Chi Epichloë nội sinh trong các loài cỏ khác nhau có khả năng sản sinh nhiều alkaloid gây độc cho một số loài côn trùng gây hại và thậm chí cả động vật có xương sống [15].

Acid nodulisporic được sản xuất bởi nấm nội sinh Nodulisporium sp. cũng được báo cáo tác dụng kiểm soát côn trùng ăn cỏ vì với cơ chế kích hoạt glutamate trong các kênh clo của cơ và tế bào thần kinh côn trùng dẫn đến dòng chảy của các ion clo qua các kênh, dẫn đến tê liệt cơ thể [16]. Epicoccum nigrum cũng được biết đến với khả năng chống lại vi khuẩn và nấm gây bệnh trên thực vật [15]. nigrum đã cho thấy hoạt tính ức chế Pseudomonas savastanoi pv.

nigrum phân lập từ mía đã cho thấy khả năng chống lại nấm bệnh Sclerotinia sclerotiorum trên cây hướng dương và chống lại nấm Pythium sp. trên cây bông; kháng lại Phytoplasma và Monilinia sp. trên quả đào và quả xuân đào. Luan van 7 Bảng 1.

Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các chủng vi nấm nội sinh trên thực vật Chủng vi nấm Hoạt tính kháng VSV Cây chủ Chất kháng sinh TLTK nội sinh gây bệnh S. aureus 1-tetradecene, 8-octadecanone, S. epidermidis Thông đỏ 8-pentadecanone, B. subtilis Fusarium solani [18] (Taxus baccata) Octylcyclohexane, 10- Klebsiella pneumonia nonadecanone E.

coli Shigella flexneri E. coli Phomopsis Dây càng cua Oblongolide Y B. aeruginosa Cây dưa muối p-hydroxybenzaldehyde, Uracil, E. coli Chaetomium sp.

subtilis Penicillium Cây bạch quả Penicimenolidyu A , P. aeruginosa [6] cataractum (Ginkgo biloba) Penicimenolidyu B, Rasfonin K. albicans Ngựa bạc hà C. glabrata Fusarium sp.

fumigates Trúc đào thơm 3-O-methylviridicatin, Penicillium sp. graminearum [21] (Nerium indicum) Viridicatol Rhizopycnis Thuốc lá Rhizopycnin D, TMC-264 Magnaporthe oryzae [22] vagum (Nicotiana tabacum) Thạch hộc tía LL-P880γ, LL-P880α, Ergosta- Pestalotiopsis sp. fumigatus [23] (Dendrobium officinale) 5,7,22-trien-3β-ol Luan van 8 1. Hoạt chất gây độc tế bào ung thư Các sản phẩm trao đổi chất bậc hai thu được từ vi nấm nội sinh đã được chứng minh là nguồn cung cấp các chất gây độc tế bào ung thư mới.

Năm 2000, Demain và Vaishnav, ước tính rằng khoảng 57% các hợp chất trong thử nghiệm lâm sàng để điều trị ung thư là các sản phẩm tự nhiên và các dẫn xuất từ vi nấm [16]. Theo các nghiên cứu đánh giá, vi nấm nội sinh cung cấp hàng loạt các chất chuyển hóa thứ cấp hoạt tính sinh học có cấu trúc độc đáo, bao gồm: alkaloid, benzopyranones, chinones, flavonoid, acid phenolic, quinon, steroid, terpenoid, tetralon. Các báo cáo cho thấy rằng các hợp chất hoạt tính sinh học tự nhiên được phân lập từ vi nấm nội sinh có thể đóng vai trò là nguồn thay thế cho việc khám phá ra các loại thuốc chống ung thư mới [24]. Ergoflavin Camptothecin P Phaeosphoramide A (R=αC6H11) và B (R=βC6H11) Chaetominine Hình 1.

Một số các chất kháng ung thư từ vi nấm nội sinh [24, 25] Chất ergoflavin (Hình 1.2) được minh chứng là hoạt chất ức chế tế bào ung thư mới, được phân lập từ nấm nội sinh Claviceps purpurea phát triển trên lá của cây thuốc sến xanh (một loài thuộc họ hồng xiêm). Chủng nấm nội Luan van 9 sinh Penicillium brasilianum được tìm thấy ở vỏ rễ cây xoan, thúc đẩy sự sinh tổng hợp các amit phenylpropanoid (nhóm chất phenylpropanoid) hiệu quả trong điều trị ung thư. Chủng nấm Entrophospora infrequens SW116 được phân lập từ cây họ thụ đào (Nothapodytes foetida) - một cây thuốc có nguồn gốc từ Ghats, Ấn Độ, được phát hiện với khả năng sinh camptothecin (Hình 1.