Tổng quan nghiên cứu

Alginate là một polysaccharide anion quan trọng, chiếm tới 40% trọng lượng khô của rong nâu và có vai trò thiết yếu trong nhiều ngành công nghiệp như thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm. Ở Việt Nam, rong nâu có sản lượng tự nhiên lên tới khoảng 10.000 tấn khô mỗi năm, trong đó các loài thuộc chi Sargassum và Turbinaria chứa hàm lượng alginate cao, ví dụ như Turbinaria ornata với 39,4% acid alginic trên trọng lượng rong khô tuyệt đối. Alginate có khối lượng phân tử lớn (khoảng 30.000 Da trở lên) và độ nhớt cao, làm hạn chế ứng dụng trong lĩnh vực y dược. Do đó, việc điều chế alginate khối lượng phân tử thấp (KLPT thấp) là cần thiết để nâng cao tính ứng dụng, đặc biệt trong sản xuất các oligosaccharide alginate có hoạt tính sinh học đa dạng như kháng khuẩn, chống oxy hóa và hỗ trợ điều trị tiểu đường.

Phương pháp enzyme sử dụng alginate lyase để cắt mạch alginate được xem là phương pháp xanh, an toàn và có tính đặc hiệu cao so với các phương pháp hóa học và vật lý truyền thống. Vi khuẩn biển, đặc biệt là các chủng phân lập từ rong nâu và các sinh vật biển liên quan, là nguồn tiềm năng để thu nhận alginate lyase có hoạt tính cao. Tuy nhiên, ở Việt Nam, nghiên cứu về alginate lyase từ vi khuẩn biển vẫn còn hạn chế, chưa có nhiều chủng vi khuẩn được phân lập và đặc tính xúc tác enzyme chưa được xác định đầy đủ.

Luận văn này tập trung phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn từ rong nâu vùng biển Khánh Hòa có khả năng sinh enzyme alginate lyase, nhằm tìm ra chủng vi khuẩn tiềm năng để sản xuất alginate KLPT thấp phục vụ các ứng dụng trong y dược và công nghiệp sinh học. Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 4 đến tháng 9 năm 2021 tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, với mục tiêu định danh chủng vi khuẩn, xác định hoạt tính enzyme trên cơ chất alginate chiết xuất từ rong nâu Việt Nam, góp phần phát triển nguồn enzyme đặc hiệu, hiệu quả cho ngành công nghiệp sinh học biển.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu sau:

  • Cấu trúc và đặc tính alginate: Alginate là polysaccharide dị trùng hợp gồm hai acid uronic chính là β-D-mannuronic acid (M) và α-L-guluronic acid (G), sắp xếp thành các block poly M, poly G và poly MG. Tỷ lệ và trình tự các block này ảnh hưởng đến tính chất lý hóa và sinh học của alginate, như khả năng tạo gel, độ nhớt và độ hòa tan.

  • Hoạt tính sinh học của alginate KLPT thấp: Alginate oligosaccharide (AOS) có khối lượng phân tử thấp thể hiện nhiều hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, chống oxy hóa, kháng u và điều hòa tăng trưởng tế bào, có tiềm năng ứng dụng trong y dược và thực phẩm chức năng.

  • Phân loại và cơ chế hoạt động của alginate lyase: Alginate lyase là enzyme xúc tác cắt mạch alginate qua phản ứng khử β liên kết glycoside (1→4), tạo ra oligosaccharide không bão hòa. Enzyme được phân loại theo đặc hiệu cơ chất (poly M, poly G, poly MG), cơ chế hoạt động (endolytic hoặc exolytic) và họ polysaccharide lyase (PL5, PL6, PL7, PL14, PL15, PL17, PL18).

  • Nguồn thu nhận alginate lyase từ vi khuẩn biển: Vi khuẩn biển, đặc biệt các chủng phân lập từ rong nâu và các sinh vật biển như cầu gai, hải sâm, là nguồn enzyme tiềm năng do khả năng sinh sản nhanh, thích nghi tốt và dễ nuôi cấy công nghiệp.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Nghiên cứu sử dụng 5 mẫu rong nâu thu thập tại vùng biển Khánh Hòa gồm Hormophysa articulate, Sargassum oligocystum, Turbinaria ornata, Padina australis và Sargassum polycystum. Alginate được chiết xuất từ rong Sargassum mcclurei và Turbinaria ornata với khối lượng phân tử lần lượt là 505 kDa và 325 kDa.

  • Phương pháp phân lập vi khuẩn: Mẫu rong được rửa sạch, nghiền nát và pha loãng, sau đó cấy lên môi trường MBA chứa alginate làm nguồn carbon duy nhất. Các khuẩn lạc phát triển được phân lập, làm thuần chủng và lưu giữ ở -80°C.

  • Sàng lọc vi khuẩn sinh alginate lyase: Sử dụng phương pháp đĩa thạch chứa alginate, nhuộm bằng thuốc nhuộm Gram’s iodine để phát hiện vùng phân giải alginate tạo bởi enzyme. Chủng có vòng phân giải lớn nhất được chọn để định danh.

  • Định danh chủng vi khuẩn: Phân tích trình tự gen 16S rRNA bằng PCR và giải trình tự Sanger, so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI để xác định chủng.

  • Thu nhận enzyme và xác định hoạt tính: Chủng vi khuẩn được lên men trong môi trường MBA lỏng chứa alginate, dịch lên men được ly tâm để thu dịch ngoại bào và nội bào. Enzyme được tinh sạch sơ bộ bằng tủa muối (NH4)2SO4 và thẩm tách. Hoạt tính alginate lyase được đo bằng phương pháp quang phổ hấp thụ ở bước sóng 235 nm, xác định đơn vị enzyme dựa trên sự gia tăng độ hấp thụ.

  • Xác định đặc tính xúc tác enzyme: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ (25-70°C), pH (5-8), ion kim loại (Ca2+, Mg2+, Mn2+, Co2+, Ni2+, Zn2+) và nồng độ NaCl đến hoạt tính enzyme. Khả năng phân cắt alginate được đánh giá bằng điện di gel polyacrylamide (C-PAGE).

  • Cỡ mẫu và phân tích số liệu: Tổng cộng 47 chủng vi khuẩn được phân lập, mỗi thí nghiệm enzyme được thực hiện 3 lần, kết quả biểu diễn dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn (SD). Dữ liệu được xử lý và biểu diễn bằng phần mềm Excel.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Phân lập đa dạng vi khuẩn biển sinh alginate lyase: Từ 5 mẫu rong nâu vùng biển Khánh Hòa, đã phân lập được 47 chủng vi khuẩn phát triển trên môi trường chứa alginate. Trong đó, rong Padina australis cho số lượng chủng nhiều nhất với 13 chủng (28%), tiếp theo là Sargassum oligocystum với 12 chủng (26%) và Turbinaria ornata với 10 chủng (21%).

  2. Sàng lọc và tuyển chọn chủng sinh alginate lyase hiệu quả: Qua phương pháp đĩa thạch nhuộm Gram’s iodine, một số chủng vi khuẩn tạo ra vòng phân giải alginate rõ ràng, chứng tỏ khả năng sinh alginate lyase. Chủng vi khuẩn biển Bacillus velezensis R8BF10 được xác định có hoạt tính enzyme ngoại bào và nội bào cao trên cơ chất alginate chiết xuất từ rong Sargassum mcclurei.

  3. Đặc tính xúc tác enzyme: Alginate lyase thu nhận từ chủng Bacillus sp. Alg07 hoạt động tối ưu ở 40°C, pH 7,5, nồng độ NaCl 200 mM, đạt hoạt tính cao nhất 8306,7 U/mg, đặc hiệu với poly M. Enzyme từ chủng Serratia marcescens NJ-07 hoạt động tối ưu ở 40°C, pH 9, nồng độ NaCl 100-300 mM, có khả năng phân cắt trisaccharide thành monosaccharide và disaccharide. Enzyme từ Pseudoalteromonas sp. SM0524 hoạt động tốt ở 50°C, pH 8,5, nồng độ NaCl 0,2 M, chịu ảnh hưởng tích cực của nhiều ion kim loại như Na+, K+, Mg2+, Ca2+.

  4. Ảnh hưởng của ion kim loại và điều kiện môi trường: Các ion Ca2+, Mg2+ thường tăng cường hoạt tính enzyme, trong khi Zn2+, Cu2+, Co2+ và Fe3+ có tác dụng ức chế. Nhiệt độ và pH ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt tính enzyme, với nhiệt độ tối ưu dao động từ 30-55°C và pH từ 7 đến 9 tùy chủng.

Thảo luận kết quả

Kết quả phân lập và sàng lọc cho thấy nguồn rong nâu vùng biển Khánh Hòa là nguồn tiềm năng để thu nhận các chủng vi khuẩn biển sinh alginate lyase có hoạt tính cao. Sự đa dạng về chủng loại vi khuẩn và đặc tính enzyme thu được phù hợp với các nghiên cứu quốc tế, trong đó Bacillus sp. và Pseudoalteromonas sp. là những nhóm vi khuẩn biển phổ biến có khả năng sản xuất enzyme hiệu quả.

Hoạt tính enzyme cao ở điều kiện nhiệt độ và pH gần với môi trường biển tự nhiên cho thấy các enzyme này có thể ứng dụng trong quy mô công nghiệp với chi phí thấp và hiệu quả cao. Việc enzyme có đặc hiệu với các block poly M hoặc poly G giúp điều chỉnh sản phẩm oligosaccharide alginate có cấu trúc và hoạt tính sinh học mong muốn.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, enzyme từ vi khuẩn biển Việt Nam có hoạt tính tương đương hoặc vượt trội, đồng thời phù hợp với alginate chiết xuất từ rong nâu Việt Nam, khắc phục hạn chế của enzyme thương mại không tương thích. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh hoạt tính enzyme theo nhiệt độ, pH và ảnh hưởng của ion kim loại, cũng như bảng thống kê số lượng chủng phân lập theo nguồn rong.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Tăng cường nghiên cứu và phát triển chủng vi khuẩn biển sinh alginate lyase: Thực hiện các nghiên cứu sâu hơn về đặc tính enzyme, tối ưu hóa điều kiện lên men và tinh sạch enzyme để nâng cao hiệu suất sản xuất alginate KLPT thấp. Thời gian thực hiện trong 1-2 năm, chủ thể là các viện nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học.

  2. Ứng dụng enzyme trong sản xuất alginate oligosaccharide: Phát triển quy trình công nghiệp sử dụng alginate lyase từ các chủng vi khuẩn biển phân lập được để sản xuất oligosaccharide alginate có hoạt tính sinh học cao, phục vụ ngành dược phẩm và thực phẩm chức năng. Thời gian triển khai 2-3 năm, phối hợp giữa viện nghiên cứu và doanh nghiệp.

  3. Xây dựng ngân hàng gen và bộ sưu tập vi sinh vật biển: Lưu giữ và bảo tồn các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh alginate lyase để phục vụ nghiên cứu và phát triển lâu dài. Chủ thể thực hiện là các trung tâm nghiên cứu và trường đại học.

  4. Đào tạo và nâng cao năng lực nghiên cứu: Tổ chức các khóa đào tạo chuyên sâu về kỹ thuật phân lập, sàng lọc và phân tích enzyme alginate lyase cho cán bộ nghiên cứu và sinh viên nhằm phát triển nguồn nhân lực chất lượng cao. Thời gian liên tục, chủ thể là các cơ sở đào tạo và viện nghiên cứu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành công nghệ sinh học biển: Luận văn cung cấp dữ liệu thực nghiệm chi tiết về phân lập vi khuẩn biển và đặc tính enzyme alginate lyase, hỗ trợ nghiên cứu sâu về enzyme polysaccharide và ứng dụng trong công nghiệp sinh học.

  2. Doanh nghiệp sản xuất enzyme và dược phẩm: Thông tin về các chủng vi khuẩn biển có hoạt tính enzyme cao giúp doanh nghiệp lựa chọn nguồn enzyme phù hợp để phát triển sản phẩm alginate KLPT thấp phục vụ thị trường y dược và thực phẩm chức năng.

  3. Chuyên gia trong lĩnh vực công nghệ sinh học và hóa sinh: Luận văn trình bày phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật phân lập, sàng lọc và xác định đặc tính xúc tác enzyme, là tài liệu tham khảo quý giá cho các dự án nghiên cứu và phát triển enzyme.

  4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách khoa học công nghệ: Cung cấp cơ sở khoa học và dữ liệu thực nghiệm để xây dựng chính sách phát triển công nghệ enzyme sinh học biển, thúc đẩy ứng dụng công nghệ xanh trong sản xuất công nghiệp.

Câu hỏi thường gặp

  1. Alginate lyase là gì và tại sao quan trọng?
    Alginate lyase là enzyme xúc tác cắt mạch alginate thành các oligosaccharide có hoạt tính sinh học. Enzyme này quan trọng vì giúp điều chế alginate KLPT thấp, mở rộng ứng dụng trong y dược và công nghiệp sinh học.

  2. Tại sao vi khuẩn biển là nguồn tốt để thu nhận alginate lyase?
    Vi khuẩn biển thích nghi với môi trường giàu alginate từ rong nâu và sinh sản nhanh, dễ nuôi cấy công nghiệp. Enzyme từ vi khuẩn biển thường có hoạt tính cao và ổn định trong điều kiện môi trường biển.

  3. Phương pháp sàng lọc alginate lyase hiệu quả nhất là gì?
    Phương pháp đĩa thạch chứa alginate kết hợp nhuộm Gram’s iodine là phương pháp đơn giản, nhanh chóng và chính xác để phát hiện vi khuẩn sinh alginate lyase dựa trên vùng phân giải alginate trên đĩa.

  4. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính alginate lyase là gì?
    Nhiệt độ, pH, nồng độ muối NaCl và các ion kim loại như Ca2+, Mg2+ có thể tăng hoặc giảm hoạt tính enzyme. Ví dụ, Ca2+ thường tăng cường hoạt tính, trong khi Zn2+ và Cu2+ có thể ức chế enzyme.

  5. Ứng dụng thực tiễn của alginate KLPT thấp là gì?
    Alginate KLPT thấp được sử dụng trong sản xuất thuốc kháng khuẩn, thực phẩm chức năng chống oxy hóa, vật liệu y tế như băng y tế, và trong nông nghiệp để kích thích tăng trưởng cây trồng.

Kết luận

  • Đã phân lập thành công 47 chủng vi khuẩn biển từ rong nâu vùng biển Khánh Hòa, trong đó nhiều chủng có khả năng sinh alginate lyase với hoạt tính cao.
  • Chủng Bacillus sp. Alg07 và Pseudoalteromonas sp. SM0524 được xác định có đặc tính xúc tác enzyme phù hợp cho sản xuất alginate KLPT thấp.
  • Enzyme alginate lyase hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 30-55°C, pH 7-9 và chịu ảnh hưởng tích cực của các ion Ca2+, Mg2+.
  • Nghiên cứu góp phần phát triển nguồn enzyme sinh học biển tại Việt Nam, mở ra hướng ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và thực phẩm chức năng.
  • Đề xuất tiếp tục tối ưu hóa quy trình lên men, tinh sạch enzyme và phát triển sản phẩm alginate oligosaccharide trong 1-3 năm tới.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các viện nghiên cứu và doanh nghiệp phối hợp triển khai nghiên cứu ứng dụng alginate lyase trong sản xuất công nghiệp, đồng thời xây dựng ngân hàng gen vi khuẩn biển để phát triển bền vững ngành công nghệ sinh học biển Việt Nam.