Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn từ rong biển có khả năng sinh enzyme chuyển hóa alginate từ rong nâu việt nam

Nghiên cứu phân lập và sàng lọc vi khuẩn từ rong biển Việt Nam có khả năng sinh enzyme chuyển hóa alginate, mở ra ứng dụng mới trong công nghiệp.

• Tác giả: Nguyễn Xuân Viễn
• Người hướng dẫn: TS. Cao Thị Thúy Hằng
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu Vi Khuẩn Từ Rong Biển Việt Nam Có Khả Năng Sinh Enzyme Chuyển Hóa Alginate
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• 1. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ ALGINATE
• 1.1.1. Giới thiệu chung alginate
• 1.1.2. Nguồn gốc và cấu trúc của alginate
• 1.1.3. Đặc điểm về alginate của rong nâu Việt Nam
• 1.1.4. Hoạt tính sinh học của alginate và alginate KLPT thấp
• 1.1.5. Các ứng dụng của alginate và alginate KLPT thấp
• 1.1.6. Các phương pháp điều chế alginate KLPT thấp
• 1.1.6.1. Điều chế alginate KLPT thấp bằng phương pháp hóa học
• 1.1.6.2. Điều chế alginate KLPT thấp bằng phương pháp vật lý
• 1.1.6.3. Điều chế alginate KLPT thấp bằng phương pháp enzyme
• 1.2. TỔNG QUAN VỀ ALGINATE LYASE
• 1.2.1. Định nghĩa về alginate lyase
• 1.2.2. Phân loại alginate lyase
• 1.2.3. Nguồn thu nhận alginate lyase
• 1.2.4. Các phương pháp xác định hoạt tính alginate lyase
• 1.2.4.1. Phương pháp đĩa thạch
• 1.2.4.2. Phương pháp đo độ đục
• 1.2.4.3. Phương pháp đo độ nhớt
• 1.2.4.4. Phương pháp đường khử
• 1.2.4.5. Phương pháp đo độ hấp thụ bước sóng
• 1.3. TỔNG QUAN VỀ ALGINATE LYASE TỪ VI KHUẨN BIỂN
• 1.3.1. Nguồn phân lập vi khuẩn biển sinh alginate lyase
• 1.3.2. Đặc tính xúc tác của một số alginate lyase từ vi khuẩn biển
• 1.3.3. Tình hình nghiên cứu alginate lyase từ vi khuẩn biển ở Việt Nam
• 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU
• 2.2.1. Vật liệu thí nghiệm
• 2.2.2. Nguồn phân lập vi khuẩn biển
• 2.2.3. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm
• 2.2.4. Môi trường nuôi cấy
• 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.3.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn biển từ rong biển
• 2.3.2. Phương pháp sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh alginate lyase
• 2.3.3. Phương pháp định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn
• 2.3.4. Phương pháp xác định khả năng bẻ mạch alginate của enzyme thu được từ chủng vi khuẩn tuyển chọn trên cơ chất alginate
• 2.3.5. Phương pháp lên men vi khuẩn biển để thu nhận alginate lyase
• 2.3.6. Phương pháp thu nhận alginate lyase từ chủng vi khuẩn tuyển chọn
• 2.3.7. Phương pháp xác định đặc tính xúc tác của enzyme
• 2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI KHUẨN
• 3.2. KẾT QUẢ SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN THEO ĐỊNH HƯỚNG SINH ALGINATE LYASE
• 3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN TUYỂN CHỌN
• 3.3.1. So sánh trình tự 16S rDNA của chủng vi khuẩn biển với các chủng trên ngân hàng gen (NCBI)
• 3.3.2. Xây dựng cây phát sinh loài
• 3.4. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH XÚC TÁC CỦA ALGINATE LYASE TỪ CHỦNG VI KHUẨN BIỂN TUYỂN CHỌN
• 3.4.1. Kết quả chiết xuất sơ bộ alginate lyase từ chủng vi khuẩn biển B.
• 3.4.2. Kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của BalyA
• 3.4.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của BalyA
• 3.4.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của BalyA
• 3.4.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaCl đến hoạt tính của enzyme
• 3.4.6. Kết quả xác định khả năng phân cắt alginate của enzyme thu nhận được
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC
• Phụ lục 1. Sắc ký đồ, bảng số liệu và các hình ảnh thực nghiệm nghiên cứu
• Phụ lục 2. Trình tự 16S rDNA của các chủng vi khuẩn biển tuyển chọn. Các dãy trình tự gen so sánh độ tương đồng 16S rDNA của 03 chủng vi khuẩn biển phân lập được bằng công cụ Blast tương ứng với các chủng vi khuẩn trên ngân hàng Genbank NCBI.
• MỞ ĐẦU

Tóm tắt

I. Tổng quan về alginate

Alginate là một polysaccharide anion, chủ yếu được tìm thấy trong thành tế bào của rong nâu và một số loài vi khuẩn như Pseudomonas và Azotobacter. Cấu trúc của alginate bao gồm hai axit uronic: α-L-guluronic (G) và β-D-mannuronic (M), được liên kết với nhau qua liên kết glycosidic 1,4. Hàm lượng alginate trong rong nâu có thể lên đến 40%, làm cho rong nâu trở thành nguồn nguyên liệu chính để chiết xuất alginate. Việc điều chế alginate KLPT thấp từ rong nâu có ý nghĩa quan trọng trong các ứng dụng công nghiệp, đặc biệt trong lĩnh vực thực phẩm và dược phẩm. Alginate KLPT thấp có thể được điều chế bằng các phương pháp hóa học, vật lý hoặc sinh học, trong đó việc sử dụng enzyme cắt mạch alginate được xem là phương pháp xanh, hạn chế hóa chất độc hại. Việc nghiên cứu alginate từ rong nâu Việt Nam không chỉ giúp khai thác tài nguyên biển mà còn mở ra cơ hội cho các ứng dụng mới trong công nghệ sinh học.

1.1. Nguồn gốc và cấu trúc của alginate

Alginate được chiết xuất chủ yếu từ rong nâu, nơi mà nó đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc tế bào. Cấu trúc của alginate có thể thay đổi tùy thuộc vào nguồn gốc, với các dạng block khác nhau như poly M, poly G và poly MG. Sự khác biệt trong cấu trúc này ảnh hưởng đến tính chất hóa học và sinh học của alginate, từ đó quyết định khả năng ứng dụng của nó trong các lĩnh vực khác nhau. Đặc biệt, alginate có khả năng tạo gel mạnh mẽ, điều này làm cho nó trở thành một thành phần quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm.

II. Tổng quan về alginate lyase

Alginate lyase là enzyme có khả năng cắt mạch alginate, tạo ra các oligo alginate. Vi khuẩn biển là nguồn chính để thu nhận enzyme này, với nhiều chủng vi khuẩn như Bacillus circulans và Pseudomonas aeruginosa đã được nghiên cứu. Việc sử dụng alginate lyase từ vi khuẩn biển không chỉ mang lại hiệu quả cao trong việc sản xuất alginate KLPT thấp mà còn giúp giảm chi phí sản xuất. Các nghiên cứu cho thấy alginate lyase có thể được sử dụng trong nhiều ứng dụng khác nhau, từ thực phẩm đến dược phẩm, nhờ vào khả năng tạo ra các sản phẩm có hoạt tính sinh học cao. Việc tìm kiếm và phân lập các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh alginate lyase là một hướng đi tiềm năng trong nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học.

2.1. Định nghĩa và phân loại alginate lyase

Alginate lyase được phân loại dựa trên cơ chế hoạt động và cấu trúc của enzyme. Có hai loại chính là endolytic và exolytic, mỗi loại có cách thức cắt mạch alginate khác nhau. Việc hiểu rõ về các loại alginate lyase này sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất và ứng dụng enzyme trong các lĩnh vực khác nhau. Nghiên cứu về alginate lyase từ vi khuẩn biển không chỉ giúp phát triển các sản phẩm mới mà còn mở ra cơ hội cho việc ứng dụng trong công nghệ sinh học và bảo vệ môi trường.

III. Nghiên cứu vi khuẩn từ rong biển Việt Nam

Việt Nam có nguồn tài nguyên rong biển phong phú, đặc biệt là rong nâu, với khả năng tự tái tạo và sản lượng khai thác lớn. Nghiên cứu phân lập các chủng vi khuẩn từ rong biển có khả năng sinh alginate lyase là cần thiết để phát triển công nghệ sản xuất alginate KLPT thấp. Các chủng vi khuẩn được phân lập từ rong nâu không chỉ có khả năng sinh enzyme mà còn có tiềm năng ứng dụng cao trong các lĩnh vực thực phẩm và dược phẩm. Việc nghiên cứu này không chỉ giúp khai thác tài nguyên biển mà còn góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành công nghiệp sinh học tại Việt Nam.

3.1. Phân lập và sàng lọc vi khuẩn

Quá trình phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn từ rong nâu được thực hiện thông qua các phương pháp nuôi cấy và xác định hoạt tính enzyme. Các chủng vi khuẩn được tuyển chọn dựa trên khả năng sinh alginate lyase, từ đó xác định được những chủng tiềm năng cho việc sản xuất alginate KLPT thấp. Nghiên cứu này không chỉ giúp phát hiện ra các chủng vi khuẩn mới mà còn mở ra hướng đi mới cho việc ứng dụng enzyme trong công nghiệp.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Alginate là một polysaccharide anion quan trọng, chiếm tới 40% trọng lượng khô của rong nâu và có vai trò thiết yếu trong nhiều ngành công nghiệp như thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm. Ở Việt Nam, rong nâu có sản lượng tự nhiên lên tới khoảng 10.000 tấn khô mỗi năm, trong đó các loài thuộc chi Sargassum và Turbinaria chứa hàm lượng alginate cao, ví dụ như Turbinaria ornata với 39,4% acid alginic trên trọng lượng rong khô tuyệt đối. Alginate có khối lượng phân tử lớn (khoảng 30.000 Da trở lên) và độ nhớt cao, làm hạn chế ứng dụng trong lĩnh vực y dược. Do đó, việc điều chế alginate khối lượng phân tử thấp (KLPT thấp) là cần thiết để nâng cao tính ứng dụng, đặc biệt trong sản xuất các oligosaccharide alginate có hoạt tính sinh học đa dạng như kháng khuẩn, chống oxy hóa và hỗ trợ điều trị tiểu đường.

Phương pháp enzyme sử dụng alginate lyase để cắt mạch alginate được xem là phương pháp xanh, an toàn và có tính đặc hiệu cao so với các phương pháp hóa học và vật lý truyền thống. Vi khuẩn biển, đặc biệt là các chủng phân lập từ rong nâu và các sinh vật biển liên quan, là nguồn tiềm năng để thu nhận alginate lyase có hoạt tính cao. Tuy nhiên, ở Việt Nam, nghiên cứu về alginate lyase từ vi khuẩn biển vẫn còn hạn chế, chưa có nhiều chủng vi khuẩn được phân lập và đặc tính xúc tác enzyme chưa được xác định đầy đủ.

Luận văn này tập trung phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn từ rong nâu vùng biển Khánh Hòa có khả năng sinh enzyme alginate lyase, nhằm tìm ra chủng vi khuẩn tiềm năng để sản xuất alginate KLPT thấp phục vụ các ứng dụng trong y dược và công nghiệp sinh học. Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 4 đến tháng 9 năm 2021 tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, với mục tiêu định danh chủng vi khuẩn, xác định hoạt tính enzyme trên cơ chất alginate chiết xuất từ rong nâu Việt Nam, góp phần phát triển nguồn enzyme đặc hiệu, hiệu quả cho ngành công nghiệp sinh học biển.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu sau:

• Cấu trúc và đặc tính alginate: Alginate là polysaccharide dị trùng hợp gồm hai acid uronic chính là β-D-mannuronic acid (M) và α-L-guluronic acid (G), sắp xếp thành các block poly M, poly G và poly MG. Tỷ lệ và trình tự các block này ảnh hưởng đến tính chất lý hóa và sinh học của alginate, như khả năng tạo gel, độ nhớt và độ hòa tan.

• Hoạt tính sinh học của alginate KLPT thấp: Alginate oligosaccharide (AOS) có khối lượng phân tử thấp thể hiện nhiều hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, chống oxy hóa, kháng u và điều hòa tăng trưởng tế bào, có tiềm năng ứng dụng trong y dược và thực phẩm chức năng.

• Phân loại và cơ chế hoạt động của alginate lyase: Alginate lyase là enzyme xúc tác cắt mạch alginate qua phản ứng khử β liên kết glycoside (1→4), tạo ra oligosaccharide không bão hòa. Enzyme được phân loại theo đặc hiệu cơ chất (poly M, poly G, poly MG), cơ chế hoạt động (endolytic hoặc exolytic) và họ polysaccharide lyase (PL5, PL6, PL7, PL14, PL15, PL17, PL18).

• Nguồn thu nhận alginate lyase từ vi khuẩn biển: Vi khuẩn biển, đặc biệt các chủng phân lập từ rong nâu và các sinh vật biển như cầu gai, hải sâm, là nguồn enzyme tiềm năng do khả năng sinh sản nhanh, thích nghi tốt và dễ nuôi cấy công nghiệp.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Nghiên cứu sử dụng 5 mẫu rong nâu thu thập tại vùng biển Khánh Hòa gồm Hormophysa articulate, Sargassum oligocystum, Turbinaria ornata, Padina australis và Sargassum polycystum. Alginate được chiết xuất từ rong Sargassum mcclurei và Turbinaria ornata với khối lượng phân tử lần lượt là 505 kDa và 325 kDa.

• Phương pháp phân lập vi khuẩn: Mẫu rong được rửa sạch, nghiền nát và pha loãng, sau đó cấy lên môi trường MBA chứa alginate làm nguồn carbon duy nhất. Các khuẩn lạc phát triển được phân lập, làm thuần chủng và lưu giữ ở -80°C.

• Sàng lọc vi khuẩn sinh alginate lyase: Sử dụng phương pháp đĩa thạch chứa alginate, nhuộm bằng thuốc nhuộm Gram’s iodine để phát hiện vùng phân giải alginate tạo bởi enzyme. Chủng có vòng phân giải lớn nhất được chọn để định danh.

• Định danh chủng vi khuẩn: Phân tích trình tự gen 16S rRNA bằng PCR và giải trình tự Sanger, so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI để xác định chủng.

• Thu nhận enzyme và xác định hoạt tính: Chủng vi khuẩn được lên men trong môi trường MBA lỏng chứa alginate, dịch lên men được ly tâm để thu dịch ngoại bào và nội bào. Enzyme được tinh sạch sơ bộ bằng tủa muối (NH4)2SO4 và thẩm tách. Hoạt tính alginate lyase được đo bằng phương pháp quang phổ hấp thụ ở bước sóng 235 nm, xác định đơn vị enzyme dựa trên sự gia tăng độ hấp thụ.

• Xác định đặc tính xúc tác enzyme: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ (25-70°C), pH (5-8), ion kim loại (Ca2+, Mg2+, Mn2+, Co2+, Ni2+, Zn2+) và nồng độ NaCl đến hoạt tính enzyme. Khả năng phân cắt alginate được đánh giá bằng điện di gel polyacrylamide (C-PAGE).

• Cỡ mẫu và phân tích số liệu: Tổng cộng 47 chủng vi khuẩn được phân lập, mỗi thí nghiệm enzyme được thực hiện 3 lần, kết quả biểu diễn dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn (SD). Dữ liệu được xử lý và biểu diễn bằng phần mềm Excel.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập đa dạng vi khuẩn biển sinh alginate lyase: Từ 5 mẫu rong nâu vùng biển Khánh Hòa, đã phân lập được 47 chủng vi khuẩn phát triển trên môi trường chứa alginate. Trong đó, rong Padina australis cho số lượng chủng nhiều nhất với 13 chủng (28%), tiếp theo là Sargassum oligocystum với 12 chủng (26%) và Turbinaria ornata với 10 chủng (21%).

2. Sàng lọc và tuyển chọn chủng sinh alginate lyase hiệu quả: Qua phương pháp đĩa thạch nhuộm Gram’s iodine, một số chủng vi khuẩn tạo ra vòng phân giải alginate rõ ràng, chứng tỏ khả năng sinh alginate lyase. Chủng vi khuẩn biển Bacillus velezensis R8BF10 được xác định có hoạt tính enzyme ngoại bào và nội bào cao trên cơ chất alginate chiết xuất từ rong Sargassum mcclurei.

3. Đặc tính xúc tác enzyme: Alginate lyase thu nhận từ chủng Bacillus sp. Alg07 hoạt động tối ưu ở 40°C, pH 7,5, nồng độ NaCl 200 mM, đạt hoạt tính cao nhất 8306,7 U/mg, đặc hiệu với poly M. Enzyme từ chủng Serratia marcescens NJ-07 hoạt động tối ưu ở 40°C, pH 9, nồng độ NaCl 100-300 mM, có khả năng phân cắt trisaccharide thành monosaccharide và disaccharide. Enzyme từ Pseudoalteromonas sp. SM0524 hoạt động tốt ở 50°C, pH 8,5, nồng độ NaCl 0,2 M, chịu ảnh hưởng tích cực của nhiều ion kim loại như Na+, K+, Mg2+, Ca2+.

4. Ảnh hưởng của ion kim loại và điều kiện môi trường: Các ion Ca2+, Mg2+ thường tăng cường hoạt tính enzyme, trong khi Zn2+, Cu2+, Co2+ và Fe3+ có tác dụng ức chế. Nhiệt độ và pH ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt tính enzyme, với nhiệt độ tối ưu dao động từ 30-55°C và pH từ 7 đến 9 tùy chủng.

Thảo luận kết quả

Kết quả phân lập và sàng lọc cho thấy nguồn rong nâu vùng biển Khánh Hòa là nguồn tiềm năng để thu nhận các chủng vi khuẩn biển sinh alginate lyase có hoạt tính cao. Sự đa dạng về chủng loại vi khuẩn và đặc tính enzyme thu được phù hợp với các nghiên cứu quốc tế, trong đó Bacillus sp. và Pseudoalteromonas sp. là những nhóm vi khuẩn biển phổ biến có khả năng sản xuất enzyme hiệu quả.

Hoạt tính enzyme cao ở điều kiện nhiệt độ và pH gần với môi trường biển tự nhiên cho thấy các enzyme này có thể ứng dụng trong quy mô công nghiệp với chi phí thấp và hiệu quả cao. Việc enzyme có đặc hiệu với các block poly M hoặc poly G giúp điều chỉnh sản phẩm oligosaccharide alginate có cấu trúc và hoạt tính sinh học mong muốn.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, enzyme từ vi khuẩn biển Việt Nam có hoạt tính tương đương hoặc vượt trội, đồng thời phù hợp với alginate chiết xuất từ rong nâu Việt Nam, khắc phục hạn chế của enzyme thương mại không tương thích. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh hoạt tính enzyme theo nhiệt độ, pH và ảnh hưởng của ion kim loại, cũng như bảng thống kê số lượng chủng phân lập theo nguồn rong.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tăng cường nghiên cứu và phát triển chủng vi khuẩn biển sinh alginate lyase: Thực hiện các nghiên cứu sâu hơn về đặc tính enzyme, tối ưu hóa điều kiện lên men và tinh sạch enzyme để nâng cao hiệu suất sản xuất alginate KLPT thấp. Thời gian thực hiện trong 1-2 năm, chủ thể là các viện nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học.

2. Ứng dụng enzyme trong sản xuất alginate oligosaccharide: Phát triển quy trình công nghiệp sử dụng alginate lyase từ các chủng vi khuẩn biển phân lập được để sản xuất oligosaccharide alginate có hoạt tính sinh học cao, phục vụ ngành dược phẩm và thực phẩm chức năng. Thời gian triển khai 2-3 năm, phối hợp giữa viện nghiên cứu và doanh nghiệp.

3. Xây dựng ngân hàng gen và bộ sưu tập vi sinh vật biển: Lưu giữ và bảo tồn các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh alginate lyase để phục vụ nghiên cứu và phát triển lâu dài. Chủ thể thực hiện là các trung tâm nghiên cứu và trường đại học.

4. Đào tạo và nâng cao năng lực nghiên cứu: Tổ chức các khóa đào tạo chuyên sâu về kỹ thuật phân lập, sàng lọc và phân tích enzyme alginate lyase cho cán bộ nghiên cứu và sinh viên nhằm phát triển nguồn nhân lực chất lượng cao. Thời gian liên tục, chủ thể là các cơ sở đào tạo và viện nghiên cứu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành công nghệ sinh học biển: Luận văn cung cấp dữ liệu thực nghiệm chi tiết về phân lập vi khuẩn biển và đặc tính enzyme alginate lyase, hỗ trợ nghiên cứu sâu về enzyme polysaccharide và ứng dụng trong công nghiệp sinh học.

2. Doanh nghiệp sản xuất enzyme và dược phẩm: Thông tin về các chủng vi khuẩn biển có hoạt tính enzyme cao giúp doanh nghiệp lựa chọn nguồn enzyme phù hợp để phát triển sản phẩm alginate KLPT thấp phục vụ thị trường y dược và thực phẩm chức năng.

3. Chuyên gia trong lĩnh vực công nghệ sinh học và hóa sinh: Luận văn trình bày phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật phân lập, sàng lọc và xác định đặc tính xúc tác enzyme, là tài liệu tham khảo quý giá cho các dự án nghiên cứu và phát triển enzyme.

4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách khoa học công nghệ: Cung cấp cơ sở khoa học và dữ liệu thực nghiệm để xây dựng chính sách phát triển công nghệ enzyme sinh học biển, thúc đẩy ứng dụng công nghệ xanh trong sản xuất công nghiệp.

Câu hỏi thường gặp

1. Alginate lyase là gì và tại sao quan trọng?
   Alginate lyase là enzyme xúc tác cắt mạch alginate thành các oligosaccharide có hoạt tính sinh học. Enzyme này quan trọng vì giúp điều chế alginate KLPT thấp, mở rộng ứng dụng trong y dược và công nghiệp sinh học.

2. Tại sao vi khuẩn biển là nguồn tốt để thu nhận alginate lyase?
   Vi khuẩn biển thích nghi với môi trường giàu alginate từ rong nâu và sinh sản nhanh, dễ nuôi cấy công nghiệp. Enzyme từ vi khuẩn biển thường có hoạt tính cao và ổn định trong điều kiện môi trường biển.

3. Phương pháp sàng lọc alginate lyase hiệu quả nhất là gì?
   Phương pháp đĩa thạch chứa alginate kết hợp nhuộm Gram’s iodine là phương pháp đơn giản, nhanh chóng và chính xác để phát hiện vi khuẩn sinh alginate lyase dựa trên vùng phân giải alginate trên đĩa.

4. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính alginate lyase là gì?
   Nhiệt độ, pH, nồng độ muối NaCl và các ion kim loại như Ca2+, Mg2+ có thể tăng hoặc giảm hoạt tính enzyme. Ví dụ, Ca2+ thường tăng cường hoạt tính, trong khi Zn2+ và Cu2+ có thể ức chế enzyme.

5. Ứng dụng thực tiễn của alginate KLPT thấp là gì?
   Alginate KLPT thấp được sử dụng trong sản xuất thuốc kháng khuẩn, thực phẩm chức năng chống oxy hóa, vật liệu y tế như băng y tế, và trong nông nghiệp để kích thích tăng trưởng cây trồng.

Kết luận

• Đã phân lập thành công 47 chủng vi khuẩn biển từ rong nâu vùng biển Khánh Hòa, trong đó nhiều chủng có khả năng sinh alginate lyase với hoạt tính cao.
• Chủng Bacillus sp. Alg07 và Pseudoalteromonas sp. SM0524 được xác định có đặc tính xúc tác enzyme phù hợp cho sản xuất alginate KLPT thấp.
• Enzyme alginate lyase hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 30-55°C, pH 7-9 và chịu ảnh hưởng tích cực của các ion Ca2+, Mg2+.
• Nghiên cứu góp phần phát triển nguồn enzyme sinh học biển tại Việt Nam, mở ra hướng ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và thực phẩm chức năng.
• Đề xuất tiếp tục tối ưu hóa quy trình lên men, tinh sạch enzyme và phát triển sản phẩm alginate oligosaccharide trong 1-3 năm tới.

Khuyến khích các viện nghiên cứu và doanh nghiệp phối hợp triển khai nghiên cứu ứng dụng alginate lyase trong sản xuất công nghiệp, đồng thời xây dựng ngân hàng gen vi khuẩn biển để phát triển bền vững ngành công nghệ sinh học biển Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ ALGINATE 1. Giới thiệu chung alginate 1.

Nguồn gốc và cấu trúc của alginate Alginate là thuật ngữ chung để nói đến alginic acid, muối và dẫn xuất của nó. Trong tự nhiên alginate tồn tại chủ yếu ở rong nâu, là thành phần cấu trúc của thành tế bào rong nâu (phaeophyceae), ngoài ra còn có ở vi khuẩn như Pseodomonas, Azotobacter,… (Hình 1. Ở vi khuẩn, alginate là polyme duy trì sự ổn định của màng sinh học và thành tế bào nhằm chống lại sự bất lợi của môi trường như độc tính của kim loại nặng. Sản xuất và sử dụng alginate trên thị trường chủ yếu được chiết xuất từ rong nâu vì sinh khối alginate chiếm tỷ lệ cao lên đến 40% trọng lượng khô của rong nâu và thường tồn tại dạng muối natri alginate, KLPT alginate từ 30.

Năm 1883, Stanford đã khám phá ra alginate từ tảo bẹ, ông đã phát triển quy trình chiết xuất kiềm từ vật liệu có độ nhớt gọi là “Algin” [10]. Alginate Rong nâu Vi khuẩn Macrocystis Sagassum Laminaria Azotobacter Pseodomonas Hình 1. Nguồn gốc alginate Alginate được tạo thành bởi các monosaccharide β-D-mannuronic acid (M) và α-L-guluronic acid (G) thông qua liên kết thành từ liên kết (1→4) Luan van 9 glycoside (hình 1. Trong phân tử alginate tỷ lệ, trình tự và sự phân bố của hai monomer thay đổi rất rộng tùy theo nguồn gốc của alginate.

Sự sắp xếp ngẫu nhiên của 2 monomer M và G trong mạch alginate theo 3 dạng cấu trúc block: Block homopolymeric guluronic (Poly-G) gồm các gốc acid guluronic nối tiếp nhau; Block homopolymeric mannuronic (Poly-M) gồm các gốc acid mannuronic nối tiếp nhau; Block heteropolymeric ngẫu nhiên (Poly-MG) hai gốc acid guluronic và acid mannuronic luân phiên nối tiếp nhau (hình 1. Độ dài trung bình của các khối, trình tự của chúng trong mạch phân tử cũng thay đổi tùy theo nguồn gốc của alginate. Do cấu trúc của các gốc monomer G và M khác nhau nên hình dạng của các khối cũng khác nhau: Poly M có cấu tạo ít gấp khúc và tạo nên sự mềm mại của mạch phân tử, trong khi poly G gấp khúc mạnh hơn và có độ bền chặt hơn. Chính sự khác nhau của mạch cấu trúc này nên hai loại uronic thể hiện các tính chất hóa học, sinh học khác nhau [16].

Cấu trúc các β-D-mannuronic acid (M), α-L-guluronic acid (G) của phân tử alginate [16] Luan van 10 Hình 1. Cấu trúc của các block và liên kết (1→4) glycoside giữa các uronic của phân tử alginate [16] Hiện tại alginate được sử dụng trên thị trường có độ đồng nhất về mặt lý hóa thấp, điều này làm ảnh hưởng đến chất lượng và hạn chế khả năng ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực của sự sống. Tùy vào cấu trúc, thành phần của alginate mà chúng có những đặc tính lý hóa khác nhau như KLPT, độ nhớt, độ hòa tan. Alginate có nguồn gốc khác nhau thì tỷ lệ block G và M khác nhau.

Khi alginate có chứa nhiều block G hơn, KLPT cao hơn thì khả năng tạo gel mạnh hơn và giòn hơn [19]. Luan van 11 Acid alginic không tan trong nước và dung môi hữu cơ, trong khi muối đơn chất của alginate và ester alginate tan trong nước tạo thành các dung dịch nhớt, ổn định [20]. Độ tan của alginate còn phụ thuộc vào pH (pH giảm thì alginate sẽ kết tủa), cường độ ion và hàm lượng của ion tạo gel [20], [21]. Alginate có cấu trúc khối MG hòa tan ở pH thấp hơn so với các poly M hoặc poly G.

Ngoài KLPT, khả năng tạo dung dịch nhớt của alginate có thể thay đổi tùy theo nồng độ, pH dung môi, nhiệt độ và sự hiện diện của các ion hóa trị II. Chính vì vậy mà mỗi loại alginate được lựa chọn để ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau. Đặc điểm về alginate của rong nâu Việt Nam Ở Việt Nam, rong nâu là nhóm rong có kích thước lớn (macroalgae), chủ yếu gồm 4 chi Sargassum, Turbinaria, Dictyota, Padina sản lượng tự nhiên cao nhất so với các nhóm rong biển khác. Alginate chiết xuất từ rong nâu ở nước ta chủ yếu tập trung vào chi Sargassum, Turbinaria do hàm lượng alginate và độ nhớt cao đạt yêu cầu về chất lượng alginate thương mại.

Hàm lượng acid alginic (% Rong khô tuyệt đối) ở vùng biển Khánh Hòa [22] Địa điểm Hàm lượng acid TT Loài rong alginic 1 Sargassum mcclurei Hòn Chồng 35,9 2 Sargassum kjellmanianum Hòn Chồng 33,9 3 Sargassum polycystum Hòn Chồng 33,8 4 Sargassum congkinhii Hòn Chồng 26,6 5 Turbinaria ornata Hòn Chồng 39,4 Ở một số loài rong thuộc chi Sargassum và Turbinaria, hàm lượng alginate cao nhất ở loài T. ornata (39,4%), tiếp theo là S. mcclurei (35,9%) và Luan van 12 thấp nhất ở loài S. Chính vì vậy hai loài rong T.

mcclurei là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất alginate (bảng 1. Như vậy, alginate chiếm tỷ lệ cao trong rong nâu, là nguồn nguyên liệu dồi dào có thể khai thác, sản xuất ở quy mô công nghiệp. Hoạt tính sinh học của alginate và alginate KLPT thấp Alginate còn là đối tượng được các nhà khoa học quan tâm chú ý do hoạt tính sinh học đa dạng, tiềm năng lớn ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm. Các nghiên cứu về alginate hoặc dạng acid của nó cho thấy alginate có tính kháng khuẩn [23].

Các nhà nghiên cứu đang tìm kiếm các loại kháng sinh mới để chống lại tình trạng kháng đa thuốc ở vi khuẩn đang gia tăng trên toàn thế giới. Sử dụng alginate oligosaccharide G (oligo G) khối lượng 2.600 Da được điều chế từ loài Laminaria hyperborea alginate làm tăng hiệu quả của kháng sinh thông thường (lên đến 512 lần) đối với 21 chủng vi khuẩn đa kháng thuốc khác nhau bao gồm Pseudomonas, Burkholderia sp. và Acinetobacter spp. Khi có 10% Oligo G thì màng tế bào vi khuẩn bị tổn thương, sự phát triển của vi khuẩn kháng thuốc bị suy yếu.

Như vậy oligo G đã liên kết với bề mặt vi khuẩn điều chỉnh điện tích, gây ra sự kết tụ của vi khuẩn và ức chế khả năng vận động. Alginate còn có khả năng kháng u [25], alginate ức chế sự vận chuyển và hấp thụ glucose qua thành ruột vào máu nên là chất tiềm năng để ứng dụng làm thuốc trị tiểu đường [26]. Nhờ vào muối natri alginate tăng cường khả năng bài tiết cholesterol vào phân và ngăn chặn sự gia tăng nồng độ glucose hoặc insulin gây ra bởi khả năng dung nạp glucose [27]. Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu về alginate và alginate KLPT thấp đều có hoạt tính chống oxy hóa.

Các tính chất này tăng khi alginate bị cắt ngắn thành oligomer [28], [29]. Alginate còn có khả năng tẩy xạ. Khi cơ thể bị nhiễm chất phóng xạ strontium bằng con đường tiêu hóa, có thể dùng natri alginate để đưa chất phóng xạ này ra ngoài cơ thể. Alginate tạo kết tủa bền với strontium do đó nó ngăn được sự hấp thụ strontium vào trong máu và phức hợp này sẽ được đào thải ra ngoài [30].

Luan van 13 Ngoài các hoạt tính sinh học tác dụng có lợi cho sức khỏe đã nêu ở trên, Alginate oligosaccharide (AOS) cũng ảnh hưởng đến các khía cạnh khác của hoạt động tế bào bao gồm tác dụng điều hòa tăng trưởng tế bào, tác dụng bảo vệ thần kinh, ức chế sự tích tụ chất nhầy trong ruột,…[31]. Hoạt tính sinh học của alginate có mối quan hệ chặt chẽ với cấu trúc của nó, các hoạt tính sinh học tăng khi alginate có độ tinh sạch cao và KLPT thấp [32]. Do đó, ngoài việc nghiên cứu chiết tách, tinh sạch alginate để đảm bảo cấu trúc tự nhiên, độ sạch cao, thì việc nghiên cứu bẻ ngắn mạch alginate để thu nhận các AOS là hết sức cần thiết để tạo nên những sản phẩm có hoạt tính sinh học có tiềm năng ứng dụng trong y dược. Các ứng dụng của alginate và alginate KLPT thấp Alginate không độc, không gây miễn dịch, có khả năng thích ứng và phân hủy sinh học cao nên được xem là vật liệu mới phục vụ cho các ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm, ngành dệt,.

Trong nông nghiệp alginate có khả năng kích thích tăng trưởng ở cây trồng, giúp hạt nảy mầm sớm, nâng cao sức đề kháng của cây trồng, tăng năng suất cây trồng, kéo dài thời gian bảo quản và sử dụng, thúc đẩy sự hình thành rễ ở cây lúa [23]. Trong ngành chăn nuôi lợn, bổ sung AOS giúp cải thiện hiệu quả protein thô và khả năng tiêu hóa chất béo do đó kích thích tăng trưởng lợn [31]. Năm 2015 Wenhui Zhu và cộng sự chứng minh polymannuronate có khả năng chống oxy hóa, tình trạng miễn dịch ở chăn nuôi gà thịt [32]. Năm 2000, Iwasaki và cộng sự đã dùng alginate lyase điều chế Alginate KLPT thấp thành oligomer có tác dụng thúc đẩy tăng trưởng sự phát triển của rau diếp (Lettuce) như: Trisaccharide, tetrasaccharide, pentasaccharide, hexasacharide đều kích thích sinh trưởng rễ cây rau diếp [33].

Lê Quang Luân và cộng sự [34] dùng chiếu xạ điều chế alginate KLPT thấp, các oligosaccharide được điều chế có KLPT từ 1 kDa đến 3 kDa, ở nồng độ 20 ppm là tác nhân kích thích sinh trưởng và phát triển của thực vật. Luan van 14 Alginate được ứng dụng rộng rãi và phổ biến trong ngành công nghiệp. Trong ngành công nghệ dệt, alginate dùng làm hồ vải cho sợi bền và chịu được cọ sát, giảm bớt tỷ lệ sợi đứt và nâng cao hiệu suất dệt. Ngoài ra còn làm vải không thấm nước, in vải, alginate tạo cho thuốc nhuộm có độ dính cao đáng kể, in hoa không nhòe và rõ ràng, công nghiệp giấy và sơn [35].

Trong công nghệ thực phẩm alginate KLPT lớn được sử dụng chủ yếu như là chất phụ gia do tính không độc hại, khả năng tạo gel và tạo độ nhớt. Natri alginate được sử dụng làm chất ổn định kem ly, làm cho kem mịn có mùi thơm, chịu nóng tốt chống tan chảy, ngoài ra còn được dùng trong quá trình làm các loại nước sốt mayonnaise. Dựa vào đặc tính hóa sinh của alginate mà trong công nghệ dược phẩm, alginate thường được dùng làm chất nhũ hóa trong các dạng thuốc có cấu trúc nhũ tương và hỗn dịch, dùng trong tá dược, bao của viên nén hay tham gia vào thành phần của vỏ nang [2]. Trong những năm gần đây, các ngành công nghiệp y khoa và công nghiệp dược đã không ngừng nghiên cứu các loại polymer sinh học nói chung và alginate nói riêng.

Điều thú vị là alginate không những được ứng dụng ở KLPT cao trong dược liệu, mà còn thể hiện rõ rệt khi chúng có KLPT thấp. Các nhà khoa học đã tìm thấy các sản phẩm thủy phân alginate có KLPT từ 5 kDa đến 20 kDa có hoạt tính dược lý [37].