MỞ ĐẦU Phế cầu khuẩn (Streptococcus pneumoniae) là tác nhân vi khuẩn chủ yếu gây bệnh nghiêm trọng ở trẻ em và người già như viêm phổi, viêm màng não mủ và nhiễm khuẩn huyết. Viêm màng não do phế cầu có tỷ lệ tử vong cao hơn hẳn so với viêm màng não do các căn nguyên khác. Ước tính có khoảng 0,7 - 1 triệu trường hợp tử vong hàng năm xảy ra ở trẻ nhỏ dưới 5 tuổi được xác định do phế cầu khuẩn gây ra. Hơn nữa, di chứng để lại sau viêm màng não do phế cầu rất nặng nề.
Vi khuẩn Streptococcus pneumoniae là song cầu khuẩn Gram dương, tan huyết alpha, kỵ khí tùy tiện, có thể có vỏ hoặc không có vỏ polysaccharide. Kháng nguyên vỏ là kháng nguyên quan trọng để phân loại S.pneumoniae, đồng thời kháng nguyên này đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh bệnh và lan truyền bệnh trong cộng đồng. Dựa trên sự khác biệt tính kháng nguyên vỏ, người ta phân loại vi khuẩn S. pneumoniae thành trên 90 typ huyết thanh khác nhau.
Kháng thể kháng vỏ thường là kháng thể đặc hiệu và có hiệu lực bảo vệ. Vắc xin phế cầu đang sử dụng là vắc xin cộng hợp, bao gồm một số loại kháng nguyên vỏ polysaccharide của vi khuẩn S. Phương pháp kinh điển cho chẩn đoán typ huyết thanh của vi khuẩn Streptococcus pneumoniae là phản ứng phồng vỏ Quellung. Phương pháp này thường rất tốn kém, mất nhiều thời gian, dễ gây dương tính giả do phản ứng chéo giữa các kháng huyết thanh.
Ngoài ra, phương pháp nuôi cấy kinh điển khó phát hiện các trường hợp đồng nhiễm nhiều typ huyết thanh của vi khuẩn S. pneumoniae, là yếu tố góp phần dẫn đến hiện tượng chuyển đảo typ huyết thanh sau sử dụng vắc xin phòng phế cầu. Trong vài năm gần đây, nhiều nước trên thế giới đã phát triển kỹ thuật PCR để định typ huyết thanh có ưu điểm là nhanh, nhạy, ít tốn kém, có tỉ lệ phát hiện và tỉ lệ đồng nhiễm các typ huyết thanh cao hơn so với phương pháp thông thường [10]. Tuy nhiên, các kỹ thuật PCR đã công bố thường chỉ phù hợp cho từng khu vực nghiên cứu cụ thể và còn hạn chế về số lượng các typ huyết thanh được phát hiện.
Việc tìm ra một quy trình xét nghiệm có độ nhạy và độ đặc hiệu cao cho chẩn đoán phần lớn các typ huyết thanh lưu hành của phế cầu ở mỗi khu vực, mỗi quốc gia là vấn đề hết sức cần thiết. 13 z Nhiễm trùng do S. pneumoniae có thể dự phòng bằng vắc xin và điều trị bằng kháng sinh thích hợp. Tuy nhiên, việc lạm dụng kháng sinh đã làm xuất hiện và lan truyền gen kháng thuốc gây cản trở tiến trình và hiệu quả điều trị.
Mặc dù tình hình kháng kháng sinh có thể thay đổi theo từng khu vực hay từng quốc gia, nhưng nghiên cứu đã chỉ ra châu Á là một tâm điểm của kháng kháng sinh. Tỷ lệ các chủng kháng kháng sinh ở vi khuẩn gây bệnh đã tăng lên nhanh chóng. Tuy nhiên, nguồn lực cũng như cơ sở hạ tầng cho giám sát y tế cộng đồng còn rất nghèo nàn ở nhiều quốc gia [77]. Với hơn 70% dân số trên thế giới sống ở khu vực châu Á Thái Bình Dương thì kháng kháng sinh ở khu vực này trở thành một vấn đề toàn cầu.
Tổ chức Y tế thế giới xếp Việt Nam vào nhóm các nước có tỉ lệ kháng kháng sinh cao nhất thế giới. Theo số liệu của Bộ Y tế, có tới 88% kháng sinh tại thành thị được bán ra mà không cần kê đơn, ở nông thôn tỉ lệ này lên đến 91%, dẫn đến việc tạo ra những chủng vi khuẩn có sức đề kháng mạnh. Sử dụng kháng sinh không hợp lý, không hiệu quả đang là vấn đề có phạm vi ảnh hưởng rộng khắp ở mọi cấp độ chăm sóc y tế, là nguyên nhân làm tăng đáng kể chi phí khám chữa bệnh. WHO dự tính đến năm 2050, trên thế giới, cứ 3 giây sẽ có 1 người tử vong do các siêu vi khuẩn kháng thuốc, tương đương với khoảng 10 triệu người mỗi năm.
Việc giám sát vi khuẩn kháng thuốc để có biện pháp phòng ngừa sự gia tăng đề kháng là hết sức cần thiết. Mô hình bệnh tật và xu hướng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn có thể thay đổi khác nhau giữa các quốc gia, các khu vực, các vùng địa lý, thậm chí khác nhau giữa các bệnh viện và các khoa điều trị. Vì vậy, mỗi địa phương cần phải có được các số liệu về mức độ đề kháng kháng sinh của riêng mình. Dựa vào áp lực chọn lọc của kháng sinh và áp lực chọn lọc vắc xin, những typ huyết thanh không được bao phủ trong vắc xin hoặc các chủng vi khuẩn đề kháng với kháng sinh sẽ tồn tại và gia tăng về số lượng, gây hậu quả nghiêm trọng.
Việc phân tích mối liên quan giữa tình trạng kháng kháng sinh và các typ huyết thanh ở nhóm typ được bao phủ trong vắc xin và các typ không có trong vắc xin cho thấy được hiệu quả của vắc xin trong việc làm giảm sự lưu hành các gen kháng kháng sinh. Bên cạnh đó còn dự đoán được xu hướng các typ huyết thanh nổi trội trong tương lai sẽ biến đổi như thế nào sau khi 14 z triển khai tiêm chủng vắc xin cộng hợp cho trẻ để có biện pháp thay đổi chiến lược dự phòng trong tương lai. Chương trình giám sát về tỉ lệ mắc, sự lưu hành các typ huyết thanh và tính kháng kháng sinh của các tác nhân vi khuẩn gây nhiễm trùng hô hấp cấp tính trong đó có S.pneumoniae đã được thiết lập ở nhiều nước trên thế giới nhưng chưa có ở Việt Nam. Phương pháp xác định typ huyết thanh sử dụng cho hầu hết các nghiên cứu trước đây ở Việt Nam cũng chỉ là những kỹ thuật nuôi cấy kinh điển.
Thêm vào đó, thông tin về tính kháng thuốc và cơ chế gen gây kháng thuốc còn hạn chế. Đặc biệt, chưa có một nghiên cứu nào phân tích về mối liên quan giữa các typ huyết thanh và tính kháng kháng sinh cũng như xu hướng dịch chuyển typ huyết thanh ưu thế. Xuất phát từ tính cần thiết và ý nghĩa thực tiễn của vấn đề, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu sự lưu hành các typ huyết thanh và gen kháng kháng sinh của Streptococcus pneumoniae gây bệnh bằng kỹ thuật PCR đa mồi tại một số địa phương ở Việt Nam. Mục tiêu nghiên cứu: 1.
Xác định được sự phân bố các typ huyết thanh của các chủng phế cầu gây bệnh tại một số địa phương ở Việt Nam; 2. Xác định được tình trạng kháng kháng sinh của các chủng phế cầu gây bệnh tại một số địa phương ở Việt Nam; 3. Phân tích được mối liên quan giữa typ huyết thanh và tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Streptococcus pneumoniae. Để phục vụ mục tiêu này, nội dung của luận án bao gồm: - Định danh lại vi khuẩn S.
pneumoniae bằng kỹ thuật nuôi cấy và sinh học phân tử. - Áp dụng và cải tiến quy trình PCR đa mồi xác định typ huyết thanh và gen kháng kháng sinh. - Xác định sự phân bố typ huyết thanh của các chủng phế cầu bằng kỹ thuật PCR đa mồi. - Xác định tình trạng kháng kháng sinh của phế cầu gây bệnh bằng kỹ thuật PCR đa mồi và kỹ thuật nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).
15 z - Xác định mối liên quan giữa typ huyết thanh và tính kháng kháng sinh của phế cầu gây bệnh. Tính mới của luận án: Nghiên cứu đã áp dụng và cải tiến được quy trình PCR đa mồi xác định typ huyết thanh của vi khuẩn Streptoccus pneumoniae phù hợp với điều kiện tại Việt Nam. Kỹ thuật này có ưu điểm là nhanh, nhạy, ít tốn kém, có tỉ lệ phát hiện và tỉ lệ đồng nhiễm các typ huyết thanh cao hơn so với phương pháp thông thường. Đưa ra được số liệu tổng quan về các typ huyết thanh lưu hành và tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn Streptoccus pneumoniae làm cơ sở cho việc hoạch định chiến lược triển khai vắc xin dự phòng và lựa chọn kháng sinh thích hợp.
Cung cấp số liệu cho các chương trình giám sát của vi khuẩn Streptoccus pneumoniae trong nước và các nước trong khu vực. Hiện nay chưa có nghiên cứu nào tại Việt Nam có những phân tích về mối liên quan giữa typ huyết thanh và gen kháng kháng sinh. Phân tích này bên cạnh việc cho thấy được hiệu quả của vắc xin trong việc làm giảm sự lưu hành các gen kháng kháng sinh, còn dự đoán được xu hướng các typ huyết thanh nổi trội sau khi triển khai tiêm vắc xin cho trẻ để có biện pháp thay đổi chiến lược dự phòng. Điểm mới trong phân tích tình trạng kháng kháng sinh theo nồng độ kháng sinh giúp dự báo xu hướng dịch chuyển mức độ đề kháng kháng sinh trong tương lai.
VI KHUẨN Streptococcus pneumoniae, KHẢ NĂNG GÂY BỆNH VÀ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC 1. Đặc điểm vi khuẩn Streptococcus pneumoniae Vi khuẩn Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), thuộc họ Streptococaceae, bộ Lactobacillales, còn gọi là phế cầu khuẩn, là vi khuẩn Gram dương, kỵ khí tuỳ tiện, tan huyết alpha, thuộc nhóm liên cầu khuẩn, có khả năng tan trong muối mật và không sinh enzym catalase. Phế cầu khuẩn là một tác nhân quan trọng gây bệnh ở người được phát hiện là nguyên nhân chủ yếu gây viêm phổi vào cuối thế kỷ 19.pneumoniae là đối tượng của nhiều nghiên cứu bệnh miễn dịch học và cơ chế bệnh sinh.
Ngoài viêm phổi, phế cầu còn là nguyên nhân gây nhiều căn bệnh xâm lấn khác như viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, viêm xương, viêm tai giữa, viêm phế quản, viêm xoang cấp, viêm tai giữa, viêm nội mạc tử cung, viêm màng ngoài tim, viêm màng não và áp xe não [139]. Phế cầu là nguyên nhân phổ biến nhất gây viêm màng não mủ và viêm tai giữa ở các nước công nghiệp. Viêm phổi do S. pneumoniae gây ra thường gặp ở trẻ nhỏ và người già [32].
pneumoniae nhạy cảm với optochin, có thể sử dụng khoanh giấy optochin để phân biệt được với các liên cầu Streptococcus viridans tan huyết alpha khác.pneumoniae bắt màu Gram dương, đứng thành cặp hoặc có thể đứng thành chuỗi ngắn, hiếm khi đứng riêng rẽ. Phế cầu có thể có vỏ hoặc không vỏ. Vỏ polysaccharide là yếu tố độc lực của tế bào, kháng lại thực bào, đến nay đã phát hiện được trên 90 typ huyết thanh vỏ khác nhau. Chủng mang các typ huyết thanh khác nhau về độc lực, tỷ lệ lưu hành theo từng vùng địa lý và tính kháng kháng sinh [57].
Phế cầu khuẩn (S. pneumoniae) là loại cầu khuẩn thường xếp nối nhau tạo hình cặp “mắt kính”, bắt màu Gram dương, có vỏ và không di động.