Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam giữ vị trí trọng yếu trong cơ cấu nông nghiệp với tổng đàn khoảng 20 triệu con vào đầu năm 2020 (theo số liệu từ Tổng cục Thống kê). Tuy nhiên, dịch bệnh đường hô hấp phức hợp (PRDC) thường xuyên gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng, đặc biệt là ở giai đoạn lợn sau cai sữa và nuôi thịt. Trong các căn nguyên vi khuẩn gây bệnh kế phát đường hô hấp, ba loài vi khuẩn gồm Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis xuất hiện với tần suất cao, diễn tiến bệnh tích nặng và làm tăng tỷ lệ tử vong.

Trước thời điểm luận án được thực hiện, các chế phẩm vacxin nhập ngoại phòng bệnh hô hấp lợn (như Porcilis, M+PAC, Bayovac SuiShot, Coglapix, Hyogen) có giá thành cao và chứa các chủng huyết thanh chưa hoàn toàn tương đồng với đặc tính dịch tễ học của các chủng thực địa tại Việt Nam. Ở thị trường trong nước, vacxin đa giá phòng viêm phổi lợn được cấp phép duy nhất của Công ty Cổ phần Thuốc thú y Marphavet (kế thừa từ đề tài cấp Nhà nước của Viện Thú y năm 2014) sử dụng chất bổ trợ keo phèn (nhôm hydroxit). Bổ trợ keo phèn tồn tại hạn chế về khả năng tạo đáp ứng miễn dịch kéo dài và hiệu lực bảo hộ chưa tối ưu, đòi hỏi phải tiêm nhắc lại nhiều lần. Tại Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt kết hợp cả ba loài vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida, S. suis sử dụng chất bổ trợ nhũ dầu nhằm nâng cao hiệu lực và kéo dài thời gian bảo hộ. Luận án của nghiên cứu sinh Đỗ Tất Đạt được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống kỹ thuật và thực tiễn này.

Mục tiêu nghiên cứu

  1. Mục tiêu chung: Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý và xây dựng giải pháp phòng chống bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis bằng vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu.
  2. Mục tiêu cụ thể:
    • Mục tiêu 1: Xác định được đặc điểm biến đổi bệnh lý chủ yếu (triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể) của lợn mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây ra qua gây nhiễm thực nghiệm.
    • Mục tiêu 2: Đánh giá tính ổn định về đặc tính sinh học của bộ giống vi khuẩn sử dụng sản xuất vacxin.
    • Mục tiêu 3: Xây dựng quy trình sản xuất, quy trình kiểm nghiệm, quy trình sử dụng và bảo quản vacxin viêm phổi đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu đạt hiệu quả phòng bệnh cao trên đàn lợn.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu:
    • Các chủng vi khuẩn giống gốc (Master seed) lưu giữ tại Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Vacxin - Công ty Cổ phần Thuốc thú y Marphavet, bao gồm: Actinobacillus pleuropneumoniae (các serotype 2, 5a, 5b); Pasteurella multocida (các serotype A, D); Streptococcus suis (serotype 2).
    • Động vật thí nghiệm: Lợn mắc bệnh viêm phổi tự nhiên và lợn gây nhiễm thực nghiệm; chuột nhắt trắng phục vụ kiểm tra độc lực, tính an toàn và hiệu lực vacxin.
  • Phạm vi không gian: Đề tài được triển khai tại Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia; Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Phòng thí nghiệm trọng điểm Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Vacxin và Nhà máy sản xuất vacxin đạt tiêu chuẩn GMP-WHO thuộc Công ty Cổ phần Thuốc thú y Marphavet, cùng một số trang trại chăn nuôi lợn thực địa.
  • Phạm vi thời gian: Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 6 năm 2016 đến tháng 6 năm 2020.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trong và ngoài nước

  1. Nghiên cứu về vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae và bệnh viêm phổi - màng phổi:

    • Phát hiện ban đầu: Bệnh viêm phổi - màng phổi được Pattison & cs. ghi nhận năm 1957; Shope (1964) mô tả thể cấp tính tại Argentina dưới tên Haemophilus pleuropneumoniae; sau đó được Kilian & cs. (1978) và Pohl & cs. định danh lại thành Actinobacillus pleuropneumoniae.
    • Độc tố và kháng nguyên: Frey & cs. (1993) xác định 3 loại ngoại độc tố protein RTX chính gồm ApxI (105-110 kDa, gây dung huyết mạnh), ApxII (103-105 kDa, gây dung huyết yếu), và ApxIII (120 kDa, gây độc tế bào mạnh lên đại thực bào phế nang). Các nghiên cứu của Inzana & cs., Cruijsen & cs., Chiers & cs. (1998), Van Den Bosch & Frey (2003) khẳng định vai trò cốt lõi của độc tố Apx và kháng nguyên màng ngoài (OMP, OmlA, TbpB, FhuA, HgbA) trong sinh bệnh học và kích thích miễn dịch.
    • Tình hình nghiên cứu vacxin A. pleuropneumoniae: Phát triển từ vacxin vô hoạt toàn khuẩn (Nielsen, 1984, 1985; Jolie & cs., 1995; Higgins & cs.), vacxin tiểu đơn vị chứa ngoại độc tố Apx (Van Overbeke & cs., 2002; Tumamao & cs.), đến vacxin đột biến nhược độc (Prideaux & cs., 1998; Ramjeet & cs., 2008a, 2008b) và vacxin "bóng tế bào" (Witte & cs.).
    • Tại Việt Nam: Các công trình của Cù Hữu Phú (2005, 2011), Nguyễn Thị Kim Lan & cs. (2017 tại Bắc Ninh ghi nhận tỷ lệ serotype 2 chiếm 63,63% và serotype 5 chiếm 36,36%), Phan Kim Thanh & cs. (2018 tại Bến Tre phân lập các serotype 4, 6, 9, 10, 11).

  2. Nghiên cứu về vi khuẩn Pasteurella multocida và bệnh tụ huyết trùng/viêm phổi lợn:

    • Kháng nguyên và serotype: Carter (1967) phân loại 5 serotype kháng nguyên giáp mô (A, B, D, E, F); trong đó serotype A và D là tác nhân chính gây viêm phổi và viêm teo mũi tiến triển (PAR) ở lợn (Pijoan & cs., 1984, 1987, 1990; Jacques & Foiry, 1987).
    • Tác động lâm sàng: Nghiên cứu của Bahnson (1994) và Dee (1997) xác định P. multocida là tác nhân thứ phát quan trọng trong hội chứng hô hấp phức hợp (PRDC). Khảo sát tổn thương phổi tại lò mổ dao động từ 30% đến 80%.
    • Tại Việt Nam: Bùi Quang Anh & cs. (2008), Nguyễn Bá Hiên & cs., Nguyễn Thị Kim Lan & cs. đã phân lập và đánh giá tính mẫn cảm kháng sinh của các chủng P. multocida serotype A và D.

  3. Nghiên cứu về vi khuẩn Streptococcus suis:

    • Định danh và phân loại: Jansen & Van Dorssen (1951) tại Hà Lan và Field & cs. (1954) tại Anh lần đầu công bố; De Moor (1963) phân nhóm Lancefield R, S, RS, T; Elliott (1966), Windsor & Elliott (1975) chuẩn hóa tên gọi S. suis; Kilpper-Bälz & Schleifer (1987) chính thức công nhận là loài riêng biệt. Hiện có 35 serotype vỏ capsular được mô tả (Perch & cs., 1988; Gottschalk & cs., 1989; Higgins & Gottschalk, 1996), trong đó serotype 2 chiếm ưu thế toàn cầu gây bệnh bại huyết, viêm màng não, viêm khớp và viêm phổi (Vecht & cs., 1985; Kataoka & cs., 1991).
    • Độc lực: Kháng nguyên giáp mô, protein MRP, yếu tố ngoại bào EF, độc tố suilysin (sly) và hệ thống arcA quyết định khả năng xâm lấn và chống thực bào.
    • Tại Việt Nam: Khương Thị Bích Ngọc (1996) thử nghiệm vacxin keo phèn; Lê Văn Dương (2013) nghiên cứu autovaccine phòng bệnh; Bùi Thị Hiền & cs. (2015) khảo sát tỷ lệ mang trùng tại Thừa Thiên Huế.

  4. Nghiên cứu về chất bổ trợ vacxin nhũ dầu:

    • Ramon (1924) định nghĩa chất bổ trợ; Cox & Coulter (1997), Singh & O'Hagan (2003), Pashine & cs. (2005) phân tích cơ chế giải phóng chậm (hiệu ứng kho) và kích thích miễn dịch bẩm sinh.
    • Tập đoàn Seppic (Pháp) phát triển dòng chất bổ trợ vi nhũ dầu Montanide IMS (đặc biệt là Montanide IMS 1313 VG N) tạo nhũ tương nước trong dầu dễ tiêm, dung nạp tốt, kích thích miễn dịch dịch thể cao và hạn chế áp xe hạt tại vị trí tiêm so với bổ trợ khoáng vô cơ truyền thống (Glenny & cs.).

Khoảng trống nghiên cứu luận án giải quyết

Mặc dù các nghiên cứu đơn lẻ về từng loại vi khuẩn đã được thực hiện, việc đánh giá hệ thống đặc tính bệnh lý gây nhiễm thực nghiệm đồng thời cả ba loại vi khuẩn (A. pleuropneumoniae, P. multocida, S. suis serotype 2) trên cùng một mô hình lợn thí nghiệm tại Việt Nam còn thiếu đồng bộ. Đặc biệt, việc nghiên cứu tối ưu hóa quy trình sản xuất vacxin phối hợp đa giá vô hoạt sử dụng chất bổ trợ vi nhũ dầu Montanide IMS 1313 VG N nhằm thay thế vacxin keo phèn truyền thống, giúp kéo dài thời gian bảo hộ và giảm liều tiêm trên thực địa chưa từng được hoàn thiện ở quy mô phòng thí nghiệm và chuẩn hóa quy trình sử dụng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và khái niệm sử dụng

  • Cơ sở bệnh lý học vi sinh thú y: Phân tích quá trình tương tác giữa yếu tố độc lực vi khuẩn (ngoại độc tố RTX, độc tố dermonecrotic, suilysin, kháng nguyên vỏ capsule, fimbriae) với niêm mạc đường hô hấp và hệ thống miễn dịch của lợn.
  • Cơ sở miễn dịch học vacxin học: Cơ chế đáp ứng miễn dịch dịch thể (tạo kháng thể đặc hiệu IgG, IgA) và kích hoạt đại thực bào thông qua hiệu ứng lưu giữ kháng nguyên chậm của tá dược vi nhũ dầu Montanide IMS 1313 VG N.
                  +----------------------------------------------+
                  |           BỘ GIỐNG VI KHUẨN GỐC              |
                  | A. pleuropneumoniae (serotype 2, 5a, 5b)     |
                  | P. multocida (serotype A, D)                 |
                  | S. suis (serotype 2)                         |
                  +----------------------+-----------------------+
                                         |
                                         v
                  +----------------------------------------------+
                  |         KIỂM TRA SINH HỌC & SINH PHÂN TỬ     |
                  | - Đặc tính nuôi cấy, hình thái, sinh hóa     |
                  | - Định danh gen: omlA, apx, kmt1, hyaD, dcbF |
                  |   gdh, sly, mrp, arcA, cps1, 2, 7, 9         |
                  | - Thử độc lực trên chuột nhắt trắng & lợn    |
                  +----------------------+-----------------------+
                                         |
                                         v
                  +----------------------------------------------+
                  |    QUY TRÌNH LÊN MEN & CHẾ TẠO KHÁNG NGUYÊN  |
                  | - Lên men sục khí (DO, pH kiểm soát)         |
                  | - Bất hoạt mầm bệnh bằng Formalin            |
                  | - Đạt đậm độ tế bào tiêu chuẩn               |
                  +----------------------+-----------------------+
                                         |
                                         v
                  +----------------------------------------------+
                  |    PHỐI CHẾ VACXIN ĐA GIÁ BỔ TRỢ NHŨ DẦU     |
                  | - Kháng nguyên đa giá (50%)                  |
                  | - Bổ trợ Montanide IMS 1313 VG N (50%)       |
                  +----------------------+-----------------------+
                                         |
                                         v
                  +----------------------------------------------+
                  |        KIỂM NGHIỆM & ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG        |
                  | - Vô trùng, thuần khiết, an toàn             |
                  | - Hiệu lực trên chuột (thay thế) & lợn       |
                  | - So sánh hiệu giá kháng thể (ELISA/Huyết    |
                  |   thanh học) giữa bổ trợ Nhũ dầu vs Keo phèn |
                  | - Xác định liều dùng, độ ổn định bảo quản    |
                  +----------------------------------------------+

Phương pháp nghiên cứu thực tế

Luận án sử dụng phương pháp nghiên cứu thực nghiệm định lượng kết hợp các kỹ thuật vi sinh học cổ điển, sinh học phân tử, bệnh lý học thực nghiệm và kiểm nghiệm dược lý học thú y:

  1. Phương pháp vi sinh học và sinh hóa:
    • Phân lập, nuôi cấy trên môi trường thạch máu bổ sung NAD/cấy kèm Staphylococcus aureus tạo hiện tượng vệ tinh (cho A. pleuropneumoniae), thạch BHI, TSB, THB, TYE.
    • Giám định đặc tính sinh hóa: Phản ứng Oxidase, Catalase, Indol, Urease, phân giải đường (Glucose, Lactose, Sucrose, Trehalose, Sorbitol, Mannitol, Xylose...).
  2. Phương pháp sinh học phân tử (PCR):
    • Tách chiết DNA tổng số.
    • Phản ứng PCR xác định gen omlA và các gen quy định độc tố apx (apxICA, apxIICA, apxIIICA, apxIBD, apxIIIBD) của A. pleuropneumoniae.
    • Phản ứng PCR xác định loài P. multocida (gen kmt1) và phân loại serotype A (gen hyaD-hyaC), serotype D (gen dcbF).
    • Phản ứng PCR xác định loài S. suis qua gen gdh (theo Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8400-2:2010), các gen mã hóa yếu tố độc lực (sly, mrp, arcA) và định type huyết thanh 1, 2, 7, 9 (gen cps1J, cps2J, cps7H, cps9J).
  3. Phương pháp đánh giá độc lực và bệnh lý học thực nghiệm:
    • Xác định liều gây chết tối thiểu ($LD_{100}$) hoặc $LD_{50}$ trên chuột nhắt trắng qua đường tiêm xoang bụng.
    • Gây nhiễm thực nghiệm trên lợn con sạch mầm bệnh theo đường khí quản/đường mũi; theo dõi triệu chứng lâm sàng hàng ngày (nhiệt độ thân nhiệt, tần số hô hấp, phản xạ, trạng thái phân, ho); mổ khám xác định bệnh tích đại thể và vi thể ở phổi, màng phổi, khí quản, hạch lympho, khớp và não.
  4. Phương pháp công nghệ sản xuất và phối chế vacxin:
    • Nuôi cấy vi khuẩn trong hệ thống nồi lên men sục khí có kiểm soát tự động nhiệt độ, pH và nồng độ oxy hòa tan (DO).
    • Vô hoạt sinh khối vi khuẩn bằng dung dịch Formalin nồng độ và thời gian thích hợp.
    • Phối chế bán thành phẩm: Trộn kháng nguyên vô hoạt của 3 loài vi khuẩn theo tỷ lệ xác định với chất bổ trợ Montanide IMS 1313 VG N theo tỷ lệ thể tích/thể tích 50:50 ở nhiệt độ phòng bằng máy khuấy thích hợp.
  5. Phương pháp kiểm nghiệm vacxin:
    • Kiểm tra độ vô trùng trên các môi trường thạch thường, canh thang, thạch máu, môi trường kỵ khí.
    • Kiểm tra tính thuần khiết và an toàn trên chuột nhắt trắng (tiêm phúc mạc) và lợn (tiêm bắp liều gấp đôi liều khuyến cáo).
    • Thử nghiệm hiệu lực bảo hộ: Phương pháp thử thách công cường độc thay thế trên chuột nhắt trắng; phương pháp kiểm tra hiệu lực trên lợn; xác định hiệu giá kháng thể huyết thanh bằng kỹ thuật ELISA và các phản ứng ngưng kết huyết thanh học định kỳ sau tiêm phòng (ngày 7, 14, 21, 28, 45, 60, 90, 120, 150, 180).
    • So sánh đối chứng song song với vacxin đa giá bổ trợ keo phèn.
    • Thử nghiệm độ ổn định và thời hạn bảo quản ở nhiệt độ phòng ($18-25^\circ\text{C}$) và nhiệt độ mát ($4-8^\circ\text{C}$).
  6. Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê sinh học, tính toán giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, khoảng tin cậy (CI) và so sánh sự sai khác bằng các thuật toán thống kê trên phần mềm chuyên dụng.

Bảng tổng hợp các cặp mồi PCR sử dụng trong nghiên cứu

Đối tượng vi khuẩn Gen mục tiêu Kích thước sản phẩm (bp) Mục đích xác định
A. pleuropneumoniae omlA Đặc hiệu loài Xác định loài A. pleuropneumoniae
A. pleuropneumoniae apxICA, apxIICA, apxIIICA Tùy cặp mồi Gen cấu trúc độc tố Apx I, II, III
A. pleuropneumoniae apxIBD, apxIIIBD Tùy cặp mồi Gen bài xuất độc tố Apx I, III
P. multocida kmt1 ~460 bp Xác định loài P. multocida
P. multocida hyaD - hyaC ~1044 bp Xác định Serotype A
P. multocida dcbF ~657 bp Xác định Serotype D
S. suis gdh 688 bp Xác định loài S. suis (TCVN 8400-2:2010)
S. suis sly, mrp, arcA Tùy cặp mồi Gen mã hóa độc tố Suilysin, MRP, ArcA
S. suis cps1J, cps2J, cps7H, cps9J Tùy cặp mồi Phân loại Serotype 1, 2, 7, 9

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu và Đặt vấn đề

Trình bày tổng quan về tầm quan trọng của ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam, sự nguy hại của hội chứng hô hấp phức hợp do vi khuẩn, hạn chế của các vacxin keo phèn hiện hành và vacxin nhập ngoại. Thiết lập mục tiêu nghiên cứu, phạm vi, đối tượng, tính cấp thiết và ý nghĩa khoa học - thực tiễn của đề tài.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Hệ thống hóa toàn bộ các công trình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam về ba loài vi khuẩn gây bệnh hô hấp lợn:

  • Đặc tính sinh học, hình thái, nuôi cấy, phân loại serotype và cơ chế sinh bệnh học của Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcus suis.
  • Phân tích chi tiết các loại độc tố: họ độc tố RTX (ApxI, ApxII, ApxIII, ApxIV), độc tố gây teo mũi tiến triển của P. multocida, độc tố suilysin của S. suis.
  • Lịch sử phát triển các dạng vacxin: vacxin toàn khuẩn vô hoạt, vacxin nhược độc, vacxin tiểu đơn vị tái tổ hợp, vacxin bóng tế bào và vacxin DNA.
  • Khảo sát các chất bổ trợ miễn dịch: muối khoáng (keo phèn nhôm hydroxit), chất nhũ tương dầu và vi nhũ dầu thế hệ mới Montanide (Montanide ISA 206 VG, Montanide IMS 1313 VG N).

Phần 3: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết vật liệu nghiên cứu (các chủng vi khuẩn gốc A1, A2, A3, P4, P5, St lưu giữ tại Marphavet; động vật thí nghiệm gồm chuột nhắt trắng chủng Swiss mice và lợn con thực nghiệm); địa điểm và thời gian thực hiện. Thiết lập các quy trình kỹ thuật chuẩn (SOP) cho nuôi cấy vi sinh vật, phản ứng sinh hóa, quy trình luân nhiệt PCR, kỹ thuật lên men sục khí sinh khối vi khuẩn, quy trình bất hoạt bằng formalin, quy trình phối trộn nhũ dầu Montanide IMS 1313 VG N và các phương pháp kiểm nghiệm chất lượng theo quy chuẩn thú y.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

1. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh thực nghiệm

Gây nhiễm thực nghiệm trên đàn lợn thí nghiệm bằng các chủng vi khuẩn phân lập cho thấy độc lực cao của các chủng nghiên cứu:

  • Lợn gây nhiễm A. pleuropneumoniae: Lợn sốt cao ($40,5 - 41,8^\circ\text{C}$), khó thở nghiêm trọng, thở thể bụng, ho, hắt hơi, ủ rũ, bỏ ăn. Khi mổ khám thấy hiện tượng viêm phổi - màng phổi tơ huyết, phổi dính chặt vào thành lồng ngực, bề mặt phổi phủ lớp fibrin dày, khí quản và phế quản ứ đọng nhiều bọt khí nhầy lẫn máu, các ổ hoại tử xuất huyết tập trung tại thùy tim và thùy hoành.
  • Lợn gây nhiễm P. multocida: Triệu chứng sốt, khó thở, ho khan sau chuyển sang ho ướt, da vùng bụng, tai và đùi đổi màu đỏ tím do nhiễm độc tố huyết. Bệnh tích đại thể điển hình là viêm phổi thùy, tập trung ở thùy đỉnh, thùy tim và mặt sau thùy hoành; nhu mô phổi đông đặc màu đỏ sẫm chuyển sang xám gan hóa; phế mạc mờ đục và có dịch thẩm dịch trong xoang bao tim.
  • Lợn gây nhiễm S. suis: Sốt cao liên tục, khó thở, ủ rũ, co giật, run rẩy, đi đứng không vững, liệt hai chân sau (biểu hiện thần kinh), sưng to các khớp chân (viêm khớp có dịch mủ). Mổ khám ghi nhận viêm màng não xung huyết xuất huyết, viêm phế quản phổi có mủ, viêm màng bao tim và viêm bao khớp tích dịch fibrin.

Bảng tổng hợp triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể điển hình

Tiêu chí Do A. pleuropneumoniae Do P. multocida Do S. suis
Triệu chứng lâm sàng chính Sốt cao, thở thể bụng kịch liệt, ho, hắt hơi, chảy dịch mũi lẫn bọt máu. Sốt, ho, khó thở, da vùng bụng và tai chuyển màu đỏ tím. Sốt cao, co giật, triệu chứng thần kinh, liệt vận động, sưng đau các khớp.
Bệnh tích đại thể ở phổi Viêm phổi - màng phổi dính sườn, fibrin bao phủ, xuất huyết hoại tử thùy hoành. Viêm phổi thùy (thùy đỉnh, thùy tim), gan hóa phổi, dịch bao tim. Viêm phế quản - phổi, xung huyết lan tỏa, dịch rỉ viêm nhiều trong phế nang.
Bệnh tích ngoài phổi Bọt khí lẫn máu đầy khí phế quản. Xuất huyết nội tạng, tụ máu niêm mạc xoang bao tim. Viêm màng não mủ, viêm khớp tích mủ, tích dịch bao khớp.

2. Kết quả đánh giá tính ổn định đặc tính sinh học của bộ giống sản xuất vacxin

  • Bộ giống vi khuẩn A. pleuropneumoniae (các chủng ký hiệu A1, A2, A3), P. multocida (chủng P4 thuộc serotype A, chủng P5 thuộc serotype D) và S. suis (chủng St) qua nhiều đời cấy truyền vẫn giữ nguyên vẹn các đặc tính sinh vật hóa học đặc trưng, độ thuần khiết $100%$ và không bị tạp nhiễm.
  • Kết quả kiểm tra sinh học phân tử bằng PCR:
    • Chủng A1 chứa các gen apxIICA, apxIIICA, apxIBD, apxIIIBD.
    • Chủng A2 chứa các gen apxICA, apxIICA, apxIBD.
    • Chủng A3 chứa các gen apxIIICA, apxIBD, apxIIIBD.
    • Chủng P4 dương tính với gen kmt1 và hyaD-hyaC (serotype A); chủng P5 dương tính với gen kmt1 và dcbF (serotype D).
    • Chủng St xác định là S. suis serotype 2 mang đầy đủ 3 gen độc lực quan trọng: sly, mrp và arcA.
  • Độc lực trên chuột nhắt trắng: Các chủng giống duy trì $LD_{50}$ và $LD_{100}$ ổn định, gây chết chuột thí nghiệm trong vòng 24 - 48 giờ sau khi tiêm truyền.

3. Kết quả xây dựng quy trình sản xuất và đánh giá chất lượng vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu

  • Nuôi cấy lên men sục khí: Đã tối ưu hóa thông số lên men (nhiệt độ $37^\circ\text{C}$, tốc độ khuấy, lưu lượng sục khí và kiểm soát pH) giúp mật độ vi khuẩn đơn giá đạt cao: A. pleuropneumoniae đạt $\ge 10^{10}\text{ CFU/ml}$, P. multocida đạt $\ge 10^{10}\text{ CFU/ml}$, S. suis đạt $\ge 10^{10}\text{ CFU/ml}$.
  • Phối chế vacxin: Hỗn hợp kháng nguyên vô hoạt của 3 loài vi khuẩn được phối trộn đồng nhất với chất bổ trợ Montanide IMS 1313 VG N theo tỷ lệ $1:1$ ($50%$ pha nước kháng nguyên và $50%$ pha tá dược nhũ dầu).
  • Kiểm nghiệm chất lượng:
    • Vô trùng và thuần khiết: Không phát hiện vi khuẩn, nấm mốc hay tạp khuẩn trên các môi trường nuôi cấy kiểm định.
    • An toàn: Vacxin an toàn tuyệt đối trên chuột nhắt trắng và lợn thí nghiệm (không gây phản ứng sốt bất thường, không hình thành u hạt hoại tử hay áp xe tại vị trí tiêm).
    • Hiệu lực bảo hộ: Thử thách công cường độc trên chuột nhắt trắng đạt tỷ lệ bảo hộ $\ge 80%$; trên lợn thí nghiệm đạt khả năng bảo hộ chống lại sự tấn công của chủng cường độc.
  • So sánh đáp ứng miễn dịch giữa vacxin bổ trợ nhũ dầu và vacxin bổ trợ keo phèn:
    • Kỹ thuật ELISA và các phản ứng ngưng kết huyết thanh học cho thấy: Lợn tiêm vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu Montanide IMS 1313 VG N sản sinh hàm lượng kháng thể đặc hiệu kháng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis cao hơn rõ rệt so với lợn tiêm vacxin bổ trợ keo phèn ở tất cả các thời điểm kiểm tra sau 21 ngày.
    • Thời gian duy trì hiệu giá kháng thể bảo hộ của vacxin nhũ dầu kéo dài liên tục trên 6 tháng ($> 180$ ngày), vượt trội so với vacxin keo phèn (hiệu giá kháng thể suy giảm mạnh sau 90 - 120 ngày).
  • Xác định liều tiêm và độ ổn định bảo quản:
    • Liều tiêm tối ưu được xác định là 2,0 ml/con qua đường tiêm bắp.
    • Vacxin bảo quản ở nhiệt độ mát ($4 - 8^\circ\text{C}$) duy trì hiệu lực và tính ổn định ít nhất 12 - 24 tháng; ở nhiệt độ phòng ($18 - 25^\circ\text{C}$) vacxin vẫn giữ được hiệu lực trong thời gian ngắn cho phép.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt học thuật và thực tiễn

  1. Về khoa học học thuật:
    • Cung cấp dữ liệu bệnh lý học thực nghiệm có tính hệ thống về các biến đổi lâm sàng và bệnh tích đại thể chi tiết trên lợn do 3 loài vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida, S. suis gây ra trong điều kiện gây nhiễm thực nghiệm tại Việt Nam.
    • Xác định được cấu trúc gen độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập tại Việt Nam dùng làm giống sản xuất vacxin (hệ gen apx ở A. pleuropneumoniae, các gen hyaD, dcbF ở P. multocida, và các gen sly, mrp, arcA ở S. suis serotype 2).
  2. Về công nghệ và thực tiễn:
    • Đã chế tạo thành công vacxin đa giá vô hoạt phòng bệnh viêm phổi ở lợn kết hợp cả ba loài vi khuẩn A. pleuropneumoniae (serotype 2, 5a, 5b), P. multocida (serotype A, D) và S. suis (serotype 2) sử dụng chất bổ trợ vi nhũ dầu Montanide IMS 1313 VG N ở quy mô phòng thí nghiệm.
    • Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất vacxin viêm phổi lợn vô hoạt đa giá có bổ trợ nhũ dầu, chứng minh được ưu thế miễn dịch vượt trội (hiệu giá kháng thể cao hơn, đáp ứng kéo dài trên 6 tháng) so với vacxin bổ trợ keo phèn truyền thống.
    • Xây dựng hoàn chỉnh quy trình sử dụng vacxin phòng bệnh trên đàn lợn nuôi thực địa.

Bảng tóm tắt quy trình sử dụng vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu

Đối tượng lợn Liều lượng và đường tiêm Phác đồ tiêm phòng chi tiết
Lợn con sau cai sữa 2,0 ml/con, tiêm bắp Tiêm 1 mũi duy nhất vào giai đoạn từ 21 đến 28 ngày tuổi (sau cai sữa).
Lợn nái chửa 2,0 ml/con/mũi, tiêm bắp Định kỳ 1 năm tiêm 2 lần. Mỗi lần tiêm gồm 2 mũi:
- Mũi 1: Tiêm trước khi đẻ 1 tháng.
- Mũi 2: Tiêm nhắc lại sau mũi 1 từ 7 đến 10 ngày.
Lợn đực giống 2,0 ml/con/mũi, tiêm bắp Định kỳ 1 năm tiêm 2 lần. Mỗi lần tiêm gồm 2 mũi:
- Mũi 1: Tiêm 2,0 ml.
- Mũi 2: Tiêm nhắc lại sau mũi 1 từ 7 đến 10 ngày.

Kiến nghị của tác giả

  • Tiếp tục mở rộng thử nghiệm sản xuất vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ nhũ dầu trên dây chuyền công nghiệp đạt chuẩn GMP-WHO của Công ty Marphavet.
  • Mở rộng khảo nghiệm trên diện rộng tại các vùng sinh thái chăn nuôi khác nhau trên toàn quốc để sớm đưa chế phẩm vào lưu hành thương mại, thay thế nguồn vacxin nhập ngoại đắt tiền.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

  • Quy trình chế tạo vacxin mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô bán công nghiệp thử nghiệm, chưa đánh giá chi tiết sự biến động chỉ tiêu kỹ thuật ở các mẻ sản xuất quy mô công nghiệp hàng vạn liều liên tục.
  • Phạm vi khảo sát dịch tễ và thu thập chủng vi khuẩn chủ yếu tập trung vào các chủng giống gốc đại diện tại các tỉnh phía Bắc, chưa bao phủ toàn bộ các biến thể serotype hiếm gặp có thể xuất hiện tại các vùng sinh thái miền Trung và miền Nam.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Hoàn thiện hồ sơ tiêu chuẩn cơ sở để đăng ký cấp phép khảo nghiệm và lưu hành thương mại sản phẩm vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu trên toàn quốc.
  • Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng công nghệ vacxin tiểu phần (subunit vaccine) tái tổ hợp biểu hiện các protein độc tố Apx và kháng nguyên OMP nhằm nâng cao hơn nữa tính bảo hộ chéo giữa các serotype khác nhau của A. pleuropneumoniae.

Giá trị tham khảo

  • Đối với nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Thú y, Bệnh lý học động vật, Vi sinh vật học: Cung cấp tài liệu tham khảo chuẩn xác về phương pháp phân lập, định danh sinh học phân tử bằng kỹ thuật PCR các gen độc tố vi khuẩn đường hô hấp, phương pháp gây bệnh thực nghiệm và đánh giá đáp ứng miễn dịch động vật.
  • Đối với các nhà khoa học và kỹ sư công nghệ sinh học dược thú y: Cung cấp thông số kỹ thuật chi tiết về công thức phối chế vacxin đa giá vô hoạt với chất bổ trợ nhũ dầu Montanide IMS 1313 VG N, quy trình kiểm nghiệm an toàn, hiệu lực theo tiêu chuẩn quốc gia.
  • Đối với bác sĩ thú y thực hành và các cơ sở chăn nuôi lợn: Là cơ sở khoa học để chẩn đoán phân biệt triệu chứng bệnh tích đại thể của ba bệnh hô hấp truyền nhiễm nguy hiểm, đồng thời cung cấp phác đồ tiêm phòng vacxin hiệu quả cho từng đối tượng lợn (lợn con cai sữa, lợn nái chửa, lợn đực giống).

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao đề tài lại lựa chọn bổ trợ Montanide IMS 1313 VG N thay thế cho keo phèn truyền thống?

Chất bổ trợ keo phèn (nhôm hydroxit) có nhược điểm là thời gian đáp ứng miễn dịch ngắn (thường giảm mạnh sau 3-4 tháng), khả năng kích thích miễn dịch dịch thể ở mức độ vừa phải và có thể gây u hạt, áp xe tại vị trí tiêm. Montanide IMS 1313 VG N là chất bổ trợ vi nhũ dầu pha nước (water-dispersible nano-emulsion), dễ dàng phối chế ở nhiệt độ phòng, kích thích đáp ứng miễn dịch nhanh, mạnh, kéo dài thời gian bảo hộ trên 6 tháng và có độ an toàn mô học cao, không gây tổn thương cục bộ tại vị trí tiêm sau khi giết mổ.

2. Bộ giống vi khuẩn dùng để sản xuất vacxin trong luận án gồm những chủng nào và có đặc điểm gì?

Bộ giống gốc (Master seed) gồm 3 loài vi khuẩn với 6 chủng huyết thanh đặc hiệu đại diện cho thực địa Việt Nam:

  • Actinobacillus pleuropneumoniae: Gồm 3 chủng thuộc serotype 2, 5a và 5b (mang các gen độc tố apxIICA, apxIIICA, apxIBD, apxIIIBD, apxICA).
  • Pasteurella multocida: Gồm 2 ch