Luận án tiến sĩ về dịch tễ học phân tử của porcine circovirus type 2 ở lợn tại Việt Nam

Nghiên cứu dịch tễ học phân tử virus circovirus type 2 ở lợn tại Việt Nam, cung cấp thông tin quan trọng về sự lây lan và ảnh hưởng của virus.

• Tác giả: Phạm Hồng Quân
• Người hướng dẫn: PGS. Huỳnh Thị Mỹ Lệ
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y
• Đề tài: Nghiên Cứu Sự Lưu Hành Và Đặc Điểm Dịch Tễ Học Phân Tử Của Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Ở Lợn Nuôi Tại Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận án
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Lời cam đoan
• 1.2. Mục lục
• 1.3. Danh mục chữ viết tắt
• 1.4. Danh mục bảng
• 1.5. Danh mục hình
• 1.6. Trích yếu luận án
• 1.7. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.8. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
• 1.9. Phạm vi nghiên cứu
• 1.10. Những đóng góp mới của đề tài
• 1.11. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.11.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.11.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 1.12. Tổng quan tài liệu
• 1.12.1. Tình hình chăn nuôi lợn tại Việt Nam
• 1.12.2. Giới thiệu về PCV2 và bệnh do PCV2 gây ra ở lợn nuôi
• 1.12.2.1. Giới thiệu về PCV2
• 1.12.2.2. Dịch tễ học của bệnh do PCV2
• 1.12.2.3. Cơ chế sinh bệnh
• 1.12.2.4. Triệu chứng và bệnh tích ở lợn mắc PCV2
• 1.12.2.5. Một số hội chứng ở lợn có liên quan đến sự nhiễm PCV2
• 1.12.2.6. Phòng bệnh
• 1.12.2.7. Hiện tượng đồng nhiễm do PCV2 gây ra
• 1.12.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về PCV2
• 1.12.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.12.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 1.13. Nội dung – Vật liệu - Phương pháp nghiên cứu
• 1.13.1. Địa điểm nghiên cứu
• 1.13.2. Thời gian nghiên cứu
• 1.13.3. Vật liệu nghiên cứu
• 1.13.4. Nội dung nghiên cứu
• 1.13.5. Phương pháp nghiên cứu
• 1.13.5.1. Phương pháp tính toán dung lượng mẫu
• 1.13.5.2. Phương pháp điều tra hồi cứu
• 1.13.5.3. Phương pháp thu thập mẫu
• 1.13.5.4. Phương pháp chiết tách ADN/ARN
• 1.13.5.5. Phương pháp Realtime PCR
• 1.13.5.6. Phương pháp PCR
• 1.13.5.7. Phương pháp giải trình tự và hoàn thiện trình tự gen
• 1.13.5.8. Phương pháp phân tích trình tự gen. Xây dựng cây phát sinh chủng loại
• 1.13.5.9. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử theo không gian - thời gian
• 1.13.5.10. Phương pháp đo lường tính đa dạng về di truyền
• 1.13.5.11. Phương pháp xử lý số liệu
• 1.14. Kết quả nghiên cứu và thảo luận
• 1.14.1. Sự lưu hành PCV2 ở lợn nuôi tại Việt Nam
• 1.14.1.1. Kết quả nghiên cứu sự lưu hành PCV2 theo địa phương
• 1.14.1.2. Kết quả xác định sự lưu hành PCV2 theo quy mô chăn nuôi
• 1.14.1.3. Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 ở đàn lợn thuộc các lứa tuổi
• 1.14.2. Kết quả nghiên cứu sự lưu hành của bệnh do PCV2 gây ra
• 1.14.3. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2
• 1.14.3.1. Kết quả giải trình tự bộ gen của PCV2
• 1.14.3.2. Phân loại genotype PCV2 lưu hành ở Việt Nam
• 1.14.3.3. Tính đa dạng di truyền của PCV2 lưu hành ở Việt Nam
• 1.14.3.4. Sự lưu hành của các genotype PCV2 theo không gian và thời gian
• 1.14.3.5. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của genotype PCV2b lưu hành ở Việt Nam
• 1.14.3.6. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của genotype PCV2d lưu hành ở Việt Nam
• 1.14.4. Hiện tượng đồng nhiễm PCV2 với một số virus
• 1.14.4.1. Kết quả xác định sự có mặt của một số virus đồng nhiễm
• 1.14.4.2. Kết quả nghiên cứu hiện tượng đồng nhiễm PCV2 với một số virus
• 1.14.4.3. Đặc điểm sinh học phân tử của loài virus mới đồng nhiễm với PCV2
• 2. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tính cấp thiết của đề tài

Nghiên cứu dịch tễ học phân tử của virus circovirus type 2 (PCV2) ở lợn tại Việt Nam là một vấn đề cấp thiết trong bối cảnh ngành chăn nuôi lợn đang phát triển mạnh mẽ. Theo số liệu từ Cục Chăn nuôi (2017), tổng đàn lợn đạt trên 27,4 triệu con. Tuy nhiên, dịch bệnh, đặc biệt là hội chứng do PCV2 gây ra, đang gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi. Thiệt hại hàng năm do PCV2 ước tính lên tới hàng triệu euro ở các nước phát triển. Tại Việt Nam, sự xuất hiện của hội chứng còi cọc ở lợn con từ năm 2000 đã gây ra nhiều ảnh hưởng tiêu cực. Các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào một số vùng, miền, do đó, việc nghiên cứu sự lưu hành và đặc điểm dịch tễ học của PCV2 trên toàn quốc là cần thiết để có cái nhìn tổng quan và chính xác hơn về tình hình dịch bệnh này.

II. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là xác định tỷ lệ lưu hành và đặc điểm dịch tễ học phân tử của virus circovirus type 2 ở lợn nuôi tại Việt Nam. Nghiên cứu sẽ thực hiện việc thu thập mẫu từ 14 tỉnh đại diện cho ba miền Bắc – Trung – Nam, nhằm đảm bảo tính đại diện và độ chính xác của dữ liệu. Đồng thời, nghiên cứu cũng sẽ xác định sự đồng nhiễm của PCV2 với một số ADN/ARN virus khác, từ đó cung cấp thông tin quan trọng cho việc xây dựng các biện pháp phòng chống hiệu quả. Việc tìm hiểu sự lưu hành của virus trong các đàn lợn có quy mô khác nhau và ở các nhóm tuổi khác nhau cũng sẽ được thực hiện để có cái nhìn rõ ràng hơn về tình hình dịch bệnh.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên đơn giản nhiều giai đoạn kết hợp với các thuật toán thống kê để đảm bảo tính chính xác và đáng tin cậy của kết quả. Các mẫu sẽ được phân tích bằng phương pháp Realtime PCR để xác định sự hiện diện của virus circovirus type 2. Phân tích trình tự gen sẽ được thực hiện bằng phần mềm Bioedit và MEGA để xây dựng cây phát sinh chủng loại, từ đó xác định các genotype lưu hành. Phương pháp Principal Coordinate Analysis (PCoA) sẽ được áp dụng để đánh giá sự đa dạng di truyền của các chủng virus. Việc sử dụng các phần mềm như Quantum GIS và BEAST sẽ giúp mô tả mức độ và sự phân bố của virus theo không gian và thời gian, cung cấp cái nhìn sâu sắc về đặc điểm dịch tễ học phân tử của virus trong điều kiện thực tế tại Việt Nam.

IV. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ lưu hành virus circovirus type 2 (PCV2) ở Việt Nam đạt 41,14%, với sự dao động từ 16% đến 88% ở các tỉnh khác nhau. Các đàn lợn có quy mô lớn (>500 con) có tỷ lệ dương tính cao nhất (47,5%), trong khi các đàn nhỏ hơn (100-300 con) có tỷ lệ thấp nhất (27,42%). Đáng chú ý, lợn thịt có tỷ lệ lưu hành cao nhất (45,16%). Nghiên cứu cũng xác định sự đồng nhiễm của PCV2 với các virus khác như PPV, TTV, PRRS, trong đó đồng nhiễm với PPV chiếm tỷ lệ cao nhất (35,42%). Những phát hiện này không chỉ góp phần làm rõ bức tranh dịch tễ học của PCV2 tại Việt Nam mà còn cung cấp cơ sở khoa học quan trọng cho việc nâng cao hiệu quả phòng chống dịch bệnh trong ngành chăn nuôi lợn.

V. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của virus circovirus type 2 (PCV2) không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn mang lại giá trị thực tiễn cao cho ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam. Những kết quả thu được từ nghiên cứu sẽ giúp các nhà quản lý, nhà khoa học và nông dân có cái nhìn tổng quan về tình hình dịch bệnh, từ đó đưa ra các biện pháp phòng chống hiệu quả. Việc xác định các genotype lưu hành và sự đồng nhiễm với các virus khác sẽ hỗ trợ trong việc phát triển các loại vắc xin phù hợp, nhằm giảm thiểu thiệt hại kinh tế do dịch bệnh gây ra. Hơn nữa, nghiên cứu còn tạo điều kiện cho các nghiên cứu tiếp theo, mở ra hướng đi mới trong việc nghiên cứu dịch tễ học virus ở động vật nuôi tại Việt Nam.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Bối cảnh dịch tễ thú y toàn cầu và tại Việt Nam trong hai thập kỷ qua ghi nhận sự bùng phát nghiêm trọng của các hội chứng bệnh do Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) gây ra, được gọi chung là Hội chứng bệnh liên quan đến PCV2 (Porcine Circovirus-Associated Disease - PCVAD), điển hình là Hội chứng còi cọc ở lợn sau cai sữa (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome - PMWS). Tổn thất kinh tế do PCV2 gây ra đạt mức từ 562 đến 900 triệu euro mỗi năm tại Liên minh Châu Âu (Armstrong and Bishop, 2004) và ước tính thiệt hại từ 3 đến 20 USD/đầu lợn tại Hoa Kỳ (Gillespie et al., 2009). Tại Việt Nam, kể từ khi ca bệnh PMWS đầu tiên được ghi nhận vào năm 2000 (Nguyễn Thị Thu Hồng và cs., 2006), dịch bệnh đã lan rộng trên quy mô toàn quốc. Tuy nhiên, các công trình trước đây chỉ dừng lại ở phạm vi nghiên cứu cục bộ theo từng vùng địa lý nhỏ lẻ hoặc chỉ khảo sát huyết thanh học đơn thuần mà thiếu vắng một nghiên cứu dịch tễ học phân tử bao quát trên cả ba miền Bắc – Trung – Nam.

Research gap cốt lõi mà công trình của NCS. Phạm Hồng Quân (Học viện Nông nghiệp Việt Nam, 2019) giải quyết là: (1) Sự thiếu hụt dữ liệu dịch tễ học phân tử hệ thống về sự lưu hành, biến đổi di truyền và động lực phát tán không gian - thời gian (spatio-temporal dynamics) của các genotype PCV2 trên quy mô toàn quốc; (2) Bản chất tương tác đồng nhiễm (co-infection) giữa PCV2 với các tác nhân virus đường hô hấp, sinh sản và tiêu hóa (PRRSV, PPV, TTV); và (3) Sự hiện diện của loài virus mới nổi Porcine Circovirus Type 3 (PCV3) tại Việt Nam.

Luận án thiết lập hệ thống câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết khoa học cụ thể:

1. Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Tỷ lệ lưu hành PCV2 tại các cơ sở chăn nuôi lợn ở Việt Nam phân bố như thế nào theo vùng địa lý, quy mô đàn và nhóm lứa tuổi?
   • Giả thuyết 1 (H1): PCV2 lưu hành phổ biến ở tất cả các vùng sinh thái chăn nuôi với tỷ lệ nhiễm phụ thuộc chặt chẽ vào quy mô cơ sở chăn nuôi và giai đoạn sinh trưởng của lợn.
2. Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Cơ cấu genotype của PCV2 tại Việt Nam gồm những nhóm di truyền nào, và con đường phát tán phát sinh chủng loại theo không gian - thời gian diễn ra ra sao?
   • Giả thuyết 2 (H2): Có sự chuyển dịch di truyền (genotypic shift) từ PCV2b sang PCV2d, bắt nguồn từ các dòng virus nhập nội trong khu vực và hình thành các nhánh tái tổ hợp nội địa.
3. Câu hỏi nghiên cứu 3 (RQ3): Tỷ lệ và đặc điểm đồng nhiễm giữa PCV2 với các ADN/ARN virus khác diễn ra như thế nào, và liệu có sự xuất hiện của mầm bệnh mới nổi PCV3 hay không?
   • Giả thuyết 3 (H3): PCV2 chủ yếu tồn tại ở trạng thái đa nhiễm với PPV, TTV, PRRSV, và loài virus mới PCV3 đã âm thầm lưu hành trong quần thể lợn nuôi tại Việt Nam.

Khung lý thuyết (theoretical framework) của luận án dựa trên Lý thuyết Tiến hóa và Dịch tễ học phân tử quần thể virus (Molecular Population Genetics & Viral Phylodynamics), kết hợp Cơ chế suy giảm miễn dịch lympho do Circovirus (Circovirus-induced Immunopathology) của Segalés et al. (2008) và Opriessnig et al. (2007). Phạm vi nghiên cứu được thực hiện trên 14 tỉnh đại diện cho ba miền Bắc – Trung – Nam (Thái Nguyên, Hà Nội, Hòa Bình, Bắc Ninh, Hưng Yên, Hải Phòng, Hải Dương, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Bình Dương, Tiền Giang, Vĩnh Long) trong khung thời gian từ tháng 6/2015 đến tháng 3/2019, kết hợp phân tích hồi cứu mẫu sinh học từ năm 2004 đến 2017. Nghiên cứu mang tính đột phá khi lần đầu tiên giải mã bức tranh dịch tễ học phát tán của PCV2d và phát hiện thành công sự lưu hành của PCV3 genotype 3a tại Việt Nam.

Literature Review và Positioning

Tổng quan y văn quốc tế cho thấy sự tiến hóa của PCV2 là một quá trình liên tục biến đổi di truyền học. Trước năm 2003, PCV2a là genotype chiếm ưu thế trên thế giới, nhưng sau đó đã xảy ra sự thay thế toàn cầu bởi PCV2b (Allan et al., 2007; Cortey et al., 2011; Dupont et al., 2008). Đến giai đoạn sau năm 2010, các công trình của Guo et al. (2010) tại Trung Quốc và Xiao et al. (2015, 2016) tại Hoa Kỳ đã xác nhận sự xuất hiện và thống trị của genotype mới PCV2d trên phạm vi toàn cầu. Song song đó, có hai luồng quan điểm trái ngược trong y văn về độc lực giữa các genotype: Một nhóm nghiên cứu (Constans et al., 2015; Huang et al., 2011) cho rằng sự thay thế genotype đi kèm với sự gia tăng độc lực và mức độ trầm trọng của tổn thương mô bào lâm sàng; ngược lại, nhóm nghiên cứu của Opriessnig et al. (2007) và Lager et al. (2007) khi gây nhiễm thực nghiệm lại kết luận không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về khả năng gây bệnh giữa PCV2a và PCV2b nếu không có tác nhân đồng nhiễm kích hoạt.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu trước đây của Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cs. (2012, 2015) ở miền Bắc và Lê Thị Thu Phương và cs. (2018), Nguyễn Ngọc Hải và cs. (2013) ở miền Nam đã ghi nhận sự có mặt của PCV2a, PCV2b, nhóm tái tổ hợp (circulating recombinant forms - CRF) và PCV2d. Tuy nhiên, các nghiên cứu này mang tính phân mảnh, thiếu sự tích hợp mô hình dịch tễ học không gian - thời gian (spatio-temporal Bayesian phylogeography). Luận án của Phạm Hồng Quân định vị chính xác khoảng trống này bằng cách tiến hành giải trình tự gen ORF2 và phân tích toàn diện 64 chủng PCV2 thu thập xuyên suốt từ 2004 đến 2017 trên cả ba miền đất nước.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, phát hiện của luận án hoàn toàn tương đồng với xu hướng dịch tễ tại Hàn Quốc (Kwon et al., 2017) và Trung Quốc (Wang et al., 2009; Bao et al., 2017), xác nhận PCV2d đã xâm lấn và thay thế dần PCV2b. Đồng thời, nghiên cứu giải quyết triệt để vấn đề đồng nhiễm khi chứng minh PCV2 đóng vai trò "điều kiện cần", còn các virus kế phát như Porcine Parvovirus (PPV) hay Torque Teno Virus (TTV) đóng vai trò "điều kiện đủ" để kích hoạt thể bệnh PMWS toàn phát, phù hợp với mô hình bệnh lý của Krakowka et al. (2000) và Lee et al. (2010).

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và làm sâu sắc thêm Lý thuyết Dịch tễ học phân tử và Động lực học tiến hóa virus (Viral Phylodynamics Theory) của Grenfell et al. (2004) và Lemey et al. (2009) khi áp dụng trực tiếp vào cấu trúc quần thể virus ADN sợi đơn vòng (ssDNA). Nghiên cứu thách thức giả định truyền thống cho rằng virus ADN có tốc độ đột biến thấp và cấu trúc kháng nguyên tương đối ổn định. Bằng việc phân tích cấu trúc gen ORF2 mã hóa protein Capsid (Cap - 27,8 kDa, từ nucleotide 1734/1735 đến 1030/1033/1034), luận án chỉ ra áp lực chọn lọc miễn dịch từ vắc xin thương mại (vốn chủ yếu sản xuất từ chủng PCV2a cổ điển) đã thúc đẩy sự tiến hóa phân kỳ mạnh mẽ, hình thành các biến chủng PCV2b nhánh 1A/1B, nhóm tái tổ hợp CRF và sự trỗi dậy của PCV2d.

                   [Áp lực chọn lọc vắc-xin PCV2a]
                                  │
                                  ▼
[Quần thể PCV2 nguyên thủy] ──► [Đột biến & Tái tổ hợp ORF2] ──► [Sự thống trị của PCV2d]
                                  │                                      │
                                  ▼                                      ▼
                      [Đồng nhiễm PPV/TTV/PRRSV] ──────────► [Bùng phát hội chứng PMWS/PCVAD]

Mô hình lý thuyết đề xuất xác lập 3 mệnh đề khoa học (Propositions):

• Mệnh đề 1 (P1): Tốc độ tiến hóa phân tử của gen ORF2 ở PCV2 tại Việt Nam chịu tác động mạnh bởi hiện tượng tái tổ hợp di truyền nội dòng (intra-genotypic recombination), tạo ra các motif axit amin đặc trưng tại vùng epitope bề mặt capsid.
• Mệnh đề 2 (P2): Sự di chuyển của các phân nhóm di truyền PCV2 giữa các vùng địa lý nội địa tuân theo mạng lưới vận chuyển động vật thương mại, trong đó các chủng PCV2b và PCV2d có nguồn gốc khởi phát từ Trung Quốc và Hàn Quốc.
• Mệnh đề 3 (P3): Độc lực lâm sàng của hội chứng PCVAD trong điều kiện chăn nuôi thực địa là kết quả của cơ chế cộng hưởng ức chế miễn dịch đa căn nguyên giữa PCV2 với PPV, TTV và virus mới PCV3.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp ba trụ cột phương pháp luận: (1) Dịch tễ học mô tả cắt ngang đa tầng; (2) Phân tích tọa độ chính (Principal Coordinate Analysis - PCoA); và (3) Mô hình phát sinh chủng loại Bayes không gian - thời gian (Bayesian Spatio-temporal Phylogeography).

Cách tiếp cận này cho phép định lượng mức độ tương đồng di truyền, xác định ranh giới phân loại genotype dựa trên khoảng cách di truyền p-distance của gen ORF2, đồng thời tái dựng trực quan các luồng xâm nhập và phát tán virus qua biên giới và nội địa thông qua tính toán hệ số Bayes Factor (BF). Điều kiện biên (boundary conditions) của khung phân tích được xác định rõ: áp dụng cho quần thể lợn nuôi tại các vùng sinh thái nông nghiệp của Việt Nam, với dữ liệu chuỗi nucleotide gen ORF2 hoàn chỉnh và bán hoàn chỉnh trong ngân hàng gen quốc tế và phân lập thực địa.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế theo trường phái thực chứng (positivism) với phương pháp tiếp cận định lượng dịch tễ học phân tử nghiêm ngặt. Thiết kế mẫu sử dụng kỹ thuật lấy mẫu ngẫu nhiên đơn giản nhiều giai đoạn (multistage simple random sampling), bảo đảm tính đại diện cao cho tổng đàn lợn hơn 27,4 triệu con của Việt Nam tại 14 tỉnh thành thuộc 3 miền.

Hệ thống phân tầng lấy mẫu được thực hiện theo:

• Cấp độ 1 (Vùng sinh thái & Địa phương): 14 tỉnh đại diện miền Bắc (7 tỉnh), miền Trung (4 tỉnh), miền Nam (3 tỉnh).
• Cấp độ 2 (Quy mô đàn chăn nuôi): Chia làm 3 mức quy mô rõ rệt: Quy mô lớn (>500 con), quy mô vừa (100 - 300 con), và quy mô nông hộ/nhỏ (<100 con).
• Cấp độ 3 (Lứa tuổi lợn): Lợn con theo mẹ, lợn thịt (nuôi vỗ béo), và lợn nái sinh sản.
• Cấp độ 4 (Tình trạng lâm sàng): Thu thập song song ở cả lợn có triệu chứng điển hình của PMWS/PCVAD và lợn khỏe mạnh bình thường.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thu thập, xử lý và phân tích mẫu sinh học tuân thủ tiêu chuẩn chẩn đoán quốc tế nghiêm ngặt:

• Xử lý mẫu và tách chiết axit nucleic: Sử dụng bộ kit tách chiết tự động Taco™ DNA/RNA Extraction Kit để thu nhận ADN và ARN tổng số từ bệnh phẩm phủ tạng (hạch bẹn, hạch màng treo ruột, phổi, lách, gan, thận) và huyết thanh.
• Chẩn đoán phân tử Real-time PCR và PCR: Sử dụng hóa chất Hot Start PCR Kit (i-StarMaster, iNtRON Biotechnology, Hàn Quốc). Chẩn đoán phát hiện PCV2 bằng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn 353 bp (PCV2-F: 5'-AAGGGCTGGGTTATGGTATG-3' và PCV2-R: 5'-CGCTGGAGAAGGAAAAATGG-3'). Sử dụng các cặp mồi chuyên biệt khuếch đại gen của PPV1-PPV4, TTV1-TTV2, PRRSV và PCV3 (cặp mồi giải trình tự toàn bộ genome PCV3 gồm đoạn 1257 bp và 1075 bp theo Ku et al., 2017).
• Giải trình tự gen: Sử dụng các cặp mồi CV1/CV2 (989 bp) và CV3/CV4 (1092 bp) theo Fenaux et al. (2000) để khuếch đại và giải trình tự gen mã hóa toàn bộ vỏ capsid ORF2 tại Công ty 1st BASE, Singapore.
• Kiểm soát chất lượng và độ tin cậy: Quy trình sử dụng mẫu đối chứng âm (nước cất khử ion) và đối chứng dương chuẩn quốc tế trong từng mẻ phản ứng PCR nhằm loại trừ hoàn toàn nguy cơ dương tính giả do nhiễm chéo sản phẩm khuếch đại (amplicon).

Data và phân tích

Hệ thống phần mềm tin sinh học và thống kê chuyên sâu được vận hành đồng bộ:

• BioEdit v7.0 (Hall, 1999) để căn chỉnh (alignment) và hiệu chỉnh trình tự nucleotide.
• MEGA 7 (Tamura et al., 2013) để xây dựng cây phát sinh loài theo phương pháp Neighbor-Joining và Maximum Likelihood với 1.000 lần lặp bootstrap để đánh giá độ tin cậy các nhánh tiến hóa.
• Principal Coordinate Analysis (PCoA) thực hiện trên 64 chuỗi gen ORF2 của các chủng PCV2 phân lập tại Việt Nam giai đoạn 2004 - 2017 nhằm chiếu ma trận khoảng cách di truyền đa chiều lên hệ tọa độ 2 chiều phẳng.
• Quantum GIS (QGIS) để mô hình hóa bản đồ không gian dịch tễ học và mật độ lưu hành phân bố của virus.
• BEAST v1.8.4 (Drummond et al., 2012) áp dụng mô hình phân tử đồng hồ lỏng lẻo (uncorrelated lognormal relaxed clock model) kết hợp quá trình ngẫu nhiên cây Coalescent Bayesian để tái dựng con đường phát tán không gian - thời gian (dispersal pathways) của các genotype PCV2d và PCV2b dựa trên các tham số của Lemey et al. (2009).
• SpreaD3 (Bielejec et al., 2016) để ước tính hệ số Bayes Factor (BF), phân cấp mức độ tin cậy của các luồng phát tán: BF > 150 (độ tin cậy rất cao/dứt khoát), 3 < BF < 150 (có căn cứ vững chắc), và 1 < BF < 3 (chưa đủ căn cứ) theo chuẩn phân loại Kass and Raftery (1995).
• Xử lý thống kê: Sử dụng phép kiểm Chi-square ($\chi^2$) trên phần mềm Minitab 14.0 và kiểm định chính xác của Fisher (Fisher's Exact Test) trên SAS 9.x để so sánh sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$) giữa các tỷ lệ lưu hành theo vùng, lứa tuổi và quy mô đàn.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Công trình nghiên cứu mang lại 5 phát hiện mang tính đột phá cho ngành dịch tễ học thú y Việt Nam:

1. Tỷ lệ lưu hành PCV2 cao trên diện rộng: Tỷ lệ dương tính trung bình với PCV2 trên toàn quốc đạt 41,14%. Tỷ lệ này biến động rất lớn giữa 14 tỉnh nghiên cứu, dao động từ 16,00% đến 88,00%, phản ánh sự phân bố dịch tễ phức tạp và mức độ an toàn sinh học không đồng đều giữa các vùng sinh thái.

Nhóm chỉ tiêu	Phân loại cụ thể	Tỷ lệ dương tính (%)	Mức độ ý nghĩa ($p$-value)
Quy mô đàn	Trang trại lớn (>500 con)	47,50%	$p < 0,05$
	Trang trại vừa (100 - 300 con)	27,42%
Lứa tuổi lợn	Lợn thịt (vỗ béo)	45,16%	$p < 0,05$
	Lợn con theo mẹ	39,58%
	Lợn nái	32,35%
Đồng nhiễm virus	PCV2 + PPV (Porcine Parvovirus)	35,42%	Cao nhất trong các cặp đồng nhiễm
	PCV2 + TTV (Torque Teno Virus)	13,19%	Tác nhân phụ trợ gây tổn thương
	PCV2 + PRRSV (Tai xanh)	7,64%	Hội chứng phức hợp hô hấp
	PCV3 (Loài virus mới)	4,17%	Phát hiện mới đột phá (100% PCV3a)

2. Sự thống trị và đồng lưu hành phức tạp của các genotype PCV2: Tại Việt Nam hoàn toàn không tìm thấy sự hiện diện của genotype cổ điển PCV2a trong giai đoạn nghiên cứu gần đây, mà chỉ ghi nhận sự lưu hành của genotype PCV2b (gồm nhánh 1A/1B và nhóm tái tổ hợp CRF) và genotype PCV2d. Đáng chú ý, ở cả 3 miền Bắc - Trung - Nam, hiện tượng đồng lưu hành nhiều nhóm di truyền khác nhau của PCV2 xảy ra đồng thời trong cùng một địa phương tại cùng một thời điểm.

3. Giải mã nguồn gốc và động lực phát tán xuyên quốc gia: Phân tích phát sinh loài Bayes (BEAST và SpreaD3) chứng minh:

   • Các chủng PCV2b phân lập tại Việt Nam có nguồn gốc xâm nhập trực tiếp từ Trung Quốc và Hàn Quốc.
   • Các chủng PCV2d lưu hành từ 2004 đến 2017 có nguồn gốc phát tán ban đầu từ Trung Quốc, phân nhánh thành các cụm tiến hóa độc lập tại Việt Nam với chỉ số Bayes Factor $BF > 150$.

4. Bức tranh đồng nhiễm đa căn nguyên phức tạp: Tỷ lệ lợn mắc bệnh đơn nhiễm PCV2 chiếm tỷ lệ rất thấp; đa số biểu hiện thể bệnh PMWS khi đồng nhiễm với các virus khác, trong đó tỷ lệ đồng nhiễm PCV2 + PPV dẫn đầu với 35,42%, tiếp theo là PCV2 + TTV (13,19%) và PCV2 + PRRSV (7,64%).

5. Phát hiện lần đầu tiên loài virus mới nổi PCV3 tại Việt Nam: Luận án là công trình tiên phong xác định sự hiện diện của Porcine Circovirus Type 3 (PCV3) tại Việt Nam với tỷ lệ nhiễm 4,17%. Toàn bộ 5 chủng PCV3 phân lập và giải trình tự gen ORF2 đều thuộc nhóm di truyền PCV3a, mở ra một hướng nghiên cứu bệnh học hoàn toàn mới cho ngành thú y.

                    [Căn nguyên PCV2 (41,14%)]
                                │
        ┌───────────────────────┼───────────────────────┐
        ▼                       ▼                       ▼
  [PCV2 + PPV]            [PCV2 + TTV]            [PCV2 + PRRSV]
    (35,42%)                (13,19%)                 (7,64%)
        │                       │                       │
        └───────────────────────┼───────────────────────┘
                                ▼
         [Hội chứng suy giảm miễn dịch & Còi cọc PMWS]
                                ▲
                                │
                     [Đồng phát hiện PCV3a]
                            (4,17%)

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết: Kết quả nghiên cứu cung cấp bằng chứng thực địa củng cố giả thuyết trôi dạt kháng nguyên (antigenic drift) và chọn lọc tiến hóa dưới áp lực vắc xin của Circovirus, khẳng định sự cần thiết phải cập nhật cấu trúc phân loại genotype virus học thú y quốc tế.
• Về phương pháp luận: Ứng dụng thành công chuỗi công cụ tích hợp PCoA, BEAST và SpreaD3 mở ra quy chuẩn phương pháp luận chuẩn xác cho các nghiên cứu dịch tễ học phân tử không gian - thời gian đối với các dịch bệnh truyền nhiễm nguy hiểm khác trên vật nuôi tại các nước đang phát triển.
• Về thực tiễn chăn nuôi và thú y: Cảnh báo khẩn cấp về việc rà soát hiệu lực bảo hộ chéo của các loại vắc xin thương mại hiện hành (đa số dựa trên kháng nguyên PCV2a cổ điển) trước sự thống trị của các chủng thực địa PCV2b và PCV2d. Đồng thời, chỉ ra sự cần thiết phải kiểm soát triệt để các mầm bệnh đồng nhiễm (đặc biệt là Parvovirus qua tiêm phòng đàn nái) để triệt tiêu điều kiện phát tác của hội chứng PMWS.
• Về chính sách quản lý nhà nước: Cung cấp cơ sở khoa học định lượng để Cục Thú y và Bộ Nông nghiệp & PTNT siết chặt quy trình kiểm dịch vận chuyển lợn giống qua biên giới phía Bắc, đồng thời xây dựng quy chuẩn giám sát quốc gia đối với mầm bệnh mới nổi PCV3.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả đột phá, luận án thẳng thắn thừa nhận một số giới hạn nghiên cứu:

1. Giới hạn về thiết kế lấy mẫu cắt ngang: Dữ liệu thu thập phản ánh lát cắt thời gian từ 2015-2019 kết hợp mẫu hồi cứu, chưa thiết lập được mô hình theo dõi thuần tập dọc (longitudinal cohort study) liên tục theo thời gian thực trên từng trang trại khép kín để xác định chính xác thời điểm chuyển đổi huyết thanh và động lực bài thải virus qua các giai đoạn nuôi.
2. Thiếu mô hình gây nhiễm thực nghiệm PCV3: Do hạn chế về điều kiện phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp cao (BSL-3) và nguồn lợn sạch mầm bệnh (Specific Pathogen Free - SPF), nghiên cứu chưa thực hiện được bước gây nhiễm thực nghiệm chủng PCV3a phân lập được để đánh giá độc lực đơn lẻ và cơ chế sinh bệnh học phối hợp giữa PCV2 và PCV3 in vivo.
3. Độ bao phủ trình tự toàn bộ bộ gen (Whole Genome Sequencing): Phân tích phát sinh loài chủ yếu tập trung vào khung đọc mở ORF2 (mã hóa Capsid protein) - vùng gen biến dị cao nhất phục vụ phân loại genotype, chưa giải trình tự toàn bộ 11 khung đọc mở của toàn bộ các chủng phân lập để phân tích sâu các đột biến trên vùng gen ORF1 (Rep) và ORF3 (Apoptosis).

Chương trình nghiên cứu tương lai (Future Research Agenda) cần tập trung vào:

• Hướng 1: Giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Deep Sequencing) trên quy mô lớn các chủng PCV2d và PCV3a nhằm lập bản đồ biểu sinh và các điểm nóng tái tổ hợp (recombination hotspots).
• Hướng 2: Thiết lập mô hình động vật SPF gây nhiễm thực nghiệm để làm sáng tỏ bệnh sinh học của PCV3 và tương tác cộng hưởng giữa PCV2d + PCV3a + PRRSV.
• Hướng 3: Đánh giá hiệu lực bảo hộ miễn dịch chéo (cross-protection efficacy) của các vắc xin thương mại thế hệ cũ đối với các chủng PCV2d thực địa tại Việt Nam.
• Hướng 4: Nghiên cứu phát triển ứng dụng vắc xin đa giá (multivalent vaccine) hoặc vắc xin tiểu đơn vị tái tổ hợp chứa đồng thời kháng nguyên capsid của PCV2d, PCV2b và PCV3a đặc thù cho dịch tễ Việt Nam.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật: Luận án cung cấp bộ dữ liệu 64 chuỗi nucleotide ORF2 chuẩn hóa của các chủng virus lưu hành tại Việt Nam đăng ký lên Ngân hàng Gen Quốc tế (GenBank), tạo nguồn tài nguyên tham chiếu vô giá cho cộng đồng nghiên cứu virus học và dịch tễ học thú y trong nước và quốc tế.
• Chuyển đổi ngành công nghiệp chăn nuôi: Giúp các tập đoàn chăn nuôi quy mô công nghiệp (CP, Japfa, Dabaco, CJ...) điều chỉnh chiến lược an toàn sinh học và tối ưu hóa phác đồ tiêm phòng vắc xin PCV2, giúp giảm thiểu tỷ lệ hao hụt do PMWS từ mức 20-30% xuống dưới ngưỡng kiểm soát kinh tế.
• Hoạch định chính sách thú y quốc gia: Kết quả nghiên cứu là tài liệu căn bản phục vụ công tác xây dựng Thông tư, Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về chẩn đoán, giám sát dịch bệnh do Circovirus ở lợn của Cục Thú y.
• Ý nghĩa quốc tế: Làm đầy đủ thêm mảnh ghép dịch tễ học PCV2 và PCV3 khu vực Đông Nam Á trong bức tranh toàn cầu, hỗ trợ Tổ chức Thú y Thế giới (WOAH/OIE) và FAO trong việc theo dõi các luồng phát tán xuyên biên giới của mầm bệnh động vật.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giới học thuật Thú y: Tiếp cận khung phân tích phương pháp luận dịch tễ học phân tử Bayes tiên tiến (BEAST, SpreaD3, PCoA), mở ra các đề tài nghiên cứu chuyên sâu về tiến hóa mầm bệnh.
• Các nhà khoa học R&D Vắc xin và Sinh phẩm: Nhận diện chính xác cấu trúc kháng nguyên và genotype PCV2d, PCV3a thực địa để định hướng dòng tế bào và chủng virus hạt nhân trong sản xuất vắc xin nội địa và bộ kit chẩn đoán multiplex Real-time PCR.
• Bác sĩ Thú y thực hành và Chủ trang trại: Hiểu rõ bản chất phức hợp của PMWS để không chỉ phụ thuộc vào vắc xin mà phải kiểm soát triệt để các bệnh đồng nhiễm (PPV, PRRSV, TTV) và cải thiện mật độ nuôi.
• Cơ quan Quản lý Thú y các cấp: Có căn cứ khoa học vững chắc để chỉ đạo công tác phòng chống dịch bệnh động vật có trọng tâm, trọng điểm theo vùng sinh thái và quy mô chăn nuôi.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và mở rộng lý thuyết nào? Trả lời: Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất là việc mở rộng Lý thuyết Động lực học tiến hóa phân tử quần thể virus (Viral Phylodynamics) trên đối tượng Circovirus sợi đơn vòng tại vùng nhiệt đới gió mùa. Luận án chứng minh rằng dưới áp lực chọn lọc của việc sử dụng vắc xin thế hệ 1 (PCV2a), quần thể virus tại Việt Nam đã trải qua sự chuyển dịch cấu trúc di truyền triệt để (genotypic shift), đưa genotype PCV2d và các dòng tái tổ hợp PCV2b lên vị trí thống trị tuyệt đối, đồng thời xác lập quy luật đồng lưu hành đa genotype trong cùng một không gian địa lý hẹp.

2. Phương pháp nghiên cứu có điểm gì cải tiến đột phá so với các nghiên cứu trước đây? Trả lời: So với các công trình trước đây tại Việt Nam như Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cs. (2012) hay Lê Thị Thu Phương và cs. (2018) vốn chỉ dừng lại ở cây phát sinh loài cơ bản (Neighbor-Joining/Maximum Likelihood) và thống kê tần suất mô tả, luận án của Phạm Hồng Quân đã tạo bước đột phá phương pháp luận khi tích hợp đồng thời: (1) Kỹ thuật PCoA phân tích tương quan di truyền đa chiều của 64 chủng ORF2; (2) Mô hình tiến hóa Coalescent Bayes kết hợp đồng hồ phân tử lỏng lẻo trong BEAST; và (3) Định lượng hóa mức độ tin cậy của các luồng phát tán không gian - thời gian xuyên quốc gia bằng hệ số Bayes Factor ($BF > 150$) thông qua SpreaD3.

3. Phát hiện nào gây bất ngờ nhất về mặt số liệu dịch tễ học thực địa? Trả lời: Phát hiện bất ngờ nhất là sự lưu hành âm thầm của loài virus mới nổi Porcine Circovirus Type 3 (PCV3) với tỷ lệ 4,17% (toàn bộ 5 chủng giải trình tự đều thuộc phân nhóm PCV3a) và tỷ lệ đồng nhiễm PCV2 + PPV (Porcine Parvovirus) lên tới 35,42% - vượt xa tỷ lệ đồng nhiễm giữa PCV2 và PRRSV (7,64%). Điều này bác bỏ định kiến phổ biến trước đó cho rằng PRRSV luôn là tác nhân đồng nhiễm chính yếu nhất kích hoạt hội chứng PMWS tại các trang trại Việt Nam.

4. Nghiên cứu có cung cấp giao thức lặp lại chuẩn xác (Replication Protocol) không? Trả lời: Luận án cung cấp giao thức thực nghiệm chi tiết, chuẩn hóa toàn diện từ quy trình lấy mẫu đa tầng tại 14 tỉnh, điều kiện ly trích ADN/ARN bằng bộ kit Taco™, danh mục trình tự các cặp mồi chuẩn (mồi phát hiện PCV2 khuếch đại 353 bp; mồi giải trình tự ORF2 CV1-CV4 của Fenaux et al., 2000; mồi PCV3 toàn phần của Ku et al., 2017), chu trình nhiệt phản ứng Hot Start PCR, đến các tham số mô hình hóa tiến hóa trong BEAST (mô hình GTR+G+I, Bayesian Skyline Plot, chuỗi MCMC 50.000.000 bước), bảo đảm khả năng tái lập và kiểm chứng độc lập 100%.

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm tới (10-year Research Agenda) được định hình ra sao? Trả lời: Chương trình 10 năm tới tập trung vào 3 trục chính: (1) Giám sát biến động bộ gen toàn phần (Whole Genome Surveillance) của PCV2d và PCV3 trên quy mô toàn quốc; (2) Khảo sát miễn dịch học thực nghiệm xác định cơ chế ức chế lympho T của PCV3 và độc lực tương hỗ khi bội nhiễm PCV2+PCV3; (3) Nghiên cứu công nghệ sinh học sản xuất vắc xin thế hệ mới (vắc xin virus-like particle - VLP hoặc vắc xin nhược độc tái tổ hợp đa giá PCV2b+PCV2d+PCV3a) phục vụ chiến lược kiểm soát dịch bệnh bền vững.

Kết luận

1. Công trình đã thiết lập một bức tranh toàn diện và có hệ thống đầu tiên về tỷ lệ lưu hành PCV2 tại Việt Nam với tỷ lệ nhiễm trung bình 41,14% (dao động 16% - 88% tại 14 tỉnh thành), trong đó các trang trại quy mô lớn (>500 con) và lứa tuổi lợn thịt có tỷ lệ lưu hành cao nhất (tương ứng 47,50% và 45,16%).
2. Xác định cấu trúc quần thể PCV2 tại Việt Nam chỉ bao gồm genotype PCV2b (nhánh 1A/1B, nhóm tái tổ hợp CRF) và genotype PCV2d, hoàn toàn vắng bóng genotype PCV2a trong các mẫu thực địa giai đoạn nghiên cứu; chứng minh hiện tượng đồng lưu hành nhiều nhóm di truyền trong cùng một không gian và thời gian.
3. Ứng dụng thành công phân tích phát sinh loài không gian - thời gian (BEAST/SpreaD3), chứng minh các chủng PCV2b tại Việt Nam bắt nguồn từ Trung Quốc và Hàn Quốc, trong khi các chủng PCV2d bắt nguồn từ Trung Quốc với mức độ tin cậy Bayes Factor tuyệt đối ($BF > 150$).
4. Làm sáng tỏ bản chất đa nhiễm của hội chứng PMWS, ghi nhận tỷ lệ đồng nhiễm vượt trội của PCV2 + PPV (35,42%), tiếp theo là PCV2 + TTV (13,19%) và PCV2 + PRRSV (7,64%).
5. Đạt đột phá khoa học khi lần đầu tiên phát hiện, định danh và giải trình tự thành công loài virus mới nổi Porcine Circovirus Type 3 (PCV3) thuộc phân nhóm PCV3a với tỷ lệ 4,17% trên đàn lợn nuôi tại Việt Nam.
6. Mở ra 3 hướng nghiên cứu khoa học then chốt: Dịch tễ học phân tử toàn bộ hệ gen Circovirus, cơ chế bệnh học tương tác đa căn nguyên in vivo, và phát triển công nghệ vắc xin đa giá thế hệ mới phù hợp với đặc thù chủng lưu hành nội địa.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM HỒNG QUÂN NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH VÀ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 (PCV2) Ở LỢN NUÔI TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2019 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM HỒNG QUÂN NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH VÀ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 (PCV2) Ở LỢN NUÔI TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y Mã số: 9 64 01 08 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Huỳnh Thị Mỹ Lệ PGS. Phạm Công Hoạt HÀ NỘI - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận án Phạm Hồng Quân i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS. Huỳnh Thị Mỹ Lệ, PGS. Phạm Công Hoạt đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo, cán bộ Cục Thú y, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung Ương và Ban quản lý dự án CDC đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Nghiên cứu sinh Phạm Hồng Quân ii MỤC LỤC Lời cam đoan.

ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt. vi Danh mục bảng. vii Danh mục hình.

viii Trích yếu luận án. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài. Phạm vi nghiên cứu.

Những đóng góp mới của đề tài. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài. Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn.

Tổng quan tài liệu. Tình hình chăn nuôi lợn tại Việt Nam. Giới thiệu về PCV2 và bệnh do PCV2 gây ra ở lợn nuôi. Giới thiệu về PCV2.

Dịch tễ học của bệnh do PCV2. Cơ chế sinh bệnh. Triệu chứng và bệnh tích ở lợn mắc PCV2. Một số hội chứng ở lợn có liên quan đến sự nhiễm PCV2.

Phòng bệnh. Hiện tượng đồng nhiễm do PCV2 gây ra. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về PCV2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.

Tình hình nghiên cứu trong nước. Nội dung – Vật liệu - Phương pháp nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu.

Vật liệu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp tính toán dung lượng mẫu.

Phương pháp điều tra hồi cứu. Phương pháp thu thập mẫu. Phương pháp chiết tách ADN/ARN. Phương pháp Realtime PCR.

Phương pháp PCR. Phương pháp giải trình tự và hoàn thiện trình tự gen. Phương pháp phân tích trình tự gen. Xây dựng cây phát sinh chủng loại.

Phương pháp nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử theo không gian - thời gian. Phương pháp đo lường tính đa dạng về di truyền. Phương pháp xử lý số liệu. Kết quả nghiên cứu và thảo luận.

Sự lưu hành PCV2 ở lợn nuôi tại Việt Nam. Kết quả nghiên cứu sự lưu hành PCV2 theo địa phương. Kết quả xác định sự lưu hành PCV2 theo quy mô chăn nuôi. Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 ở đàn lợn thuộc các lứa tuổi.

Kết quả nghiên cứu sự lưu hành của bệnh do PCV2 gây ra. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2. Kết quả giải trình tự bộ gen của PCV2. Phân loại genotype PCV2 lưu hành ở Việt Nam.

Tính đa dạng di truyền của PCV2 lưu hành ở Việt Nam. Sự lưu hành của các genotype PCV2 theo không gian và thời gian. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của genotype PCV2b lưu hành ở Việt Nam. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của genotype PCV2d lưu hành ở Việt Nam.

Hiện tượng đồng nhiễm PCV2 với một số virus. Kết quả xác định sự có mặt của một số virus đồng nhiễm. Kết quả nghiên cứu hiện tượng đồng nhiễm PCV2 với một số virus. Đặc điểm sinh học phân tử của loài virus mới đồng nhiễm với PCV2.

Kết luận và đề nghị. 92 Những công trình của tác giả công bố có liên quan đến luận án. 93 Tài liệu tham khảo. 112 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ ADN Axit Deoxyribonucleic ARN Axit ribonucleic CI Confidence Interval CS Cộng sự CSFV Classical Swine Fever Virus ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay IPMA Immunoperoxidase monolayer assay NaCl Natri clorua ORF Open Reading Frame PBS Phosphate – Buffered - Saline PCR Polymerase chain reaction PCV Porcine circovirus PCV1 Porcine circovirus type 1 PCV2 Porcine circovirus type 2 PCV3 Porcine circovirus type 3 PCVAD Porcine circovirus type 2-associated disease PDNS Porcine dermatitis and nephropathy syndrome PK15 Pig Kidney 15 PMWS Postweaning multisystemic wasting syndrome PPV Porcine parvovirus PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome TTV Torque teno virus vi DANH MỤC BẢNG Số bảng Tên bảng Trang 2.

Một số loại vắc xin phòng bệnh do PCV2 gây ra được phép nhập khẩu, lưu hành tại Việt Nam hiện nay. Mồi sử dụng để phát hiện các virus nghiên cứu. Trình tự mồi dùng chẩn đoán và giải trình tự gen PCV2. Trình tự mồi dùng giải trình tự gen PCV3.

Tổng hợp tình hình lấy mẫu nghiên cứu. Tóm tắt thông tin trình tự gen ORF2 của các chủng PCV2d dùng phân tích đặc điểm dịch tễ học theo không gian - thời gian. Tóm tắt thông tin trình tự gen ORF2 của các chủng PCV2b dùng phân tích đặc điểm dịch tễ học theo không gian - thời gian. Kết quả xác định sự có mặt của PCV2 từ các địa phương.

Tỷ lệ lưu hành PCV2 ở đàn lợn theo các quy mô khác nhau trên địa bàn nghiên cứu. Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 ở các lứa tuổi lợn. Trình tự gen được đưa trên Genbank. Motif đặc trưng genotype của PCV2 lưu hành ở Việt Nam.

Kết quả xác định sự có mặt của virus đồng nhiễm. Kết quả xác định sự đồng nhiễm virus trong mẫu bệnh phẩm. 83 vii DANH MỤC HÌNH Số hình Tên hình Trang 2. Phân bố tổng số lợn nuôi theo địa phương năm 2017.

Cây phát sinh loài của PCV2. Cấu trúc PCV2. Khả năng bài tiết PCV2 ở lợn bị nhiễm. Phát triển của nhiễm PCV2 biểu hiện thành PCVAD.

Một số triệu chứng lâm sàng điển hình ở lợn nghi mắc PMWS. Một số triệu chứng bệnh tích điển hình ở lợn nghi mắc PMWS. Sự phân bố PCV2 trên thế giới. Phân loại genotype của PCV2 ở Việt Nam.

Kết quả so sánh về phạm vi lấy mẫu phát hiện PCV2. Tỷ lệ dương tính với PCV2 tại các địa phương thu mẫu. Một số triệu chứng điển hình ở lợn mắc PMWS. Một số bệnh tích điển hình ở lợn mắc PMWS.

Sơ đồ đính kèm đánh dấu 20 tỉnh có trình tự được phân tích. Cây phát sinh chủng loại của các chủng PCV2 phân lập ở Việt Nam. Hệ tọa độ 2 chiều biểu diễn mối quan hệ gen giữa các chủng PCV2 phân lập ở Việt Nam. Phân bố các nhóm di truyền của PCV2 ở Việt Nam theo không gian và thời gian.

Kết quả phân tích sự phát tán theo không gian và thời gian của genotype PCV2b giữa các nước. Sự phát tán theo không gian và thời gian của chủng PCV2b nhánh 1 xâm nhập vào Việt Nam. Sự phát tán theo không gian và thời gian của chủng PCV2b nhánh 2 xâm nhập vào Việt Nam. Sự phát tán theo không gian và thời gian của genotype PCV2d.

Nguồn gốc, sự phát tán theo không gian và thời gian của genotype PCV2d lưu hành ở Việt Nam. Kết quả PCR xác định sự có mặt của virus đồng nhiễm. Các tỉnh có mẫu dương tính với các virus đồng nhiễm. Sự phân bố theo không gian của virus đồng nhiễm PCV2.

Trình tự gen ORF2 của 5 chủng PCV3 phân lập tại Việt Nam. Khoảng cách di truyền giữa các chủng PCV3 của Việt Nam và thế giới. Cây phát sinh chủng loại của PCV3 lưu hành ở Việt Nam. Quan hệ di truyền giữa PCV2 và PCV3 lưu hành ở Việt Nam.

91 ix TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Phạm Hồng Quân Tên luận án: Nghiên cứu sự lưu hành và đặc điểm dịch tễ học phân tử của porcine circovirus type 2 (PCV2) ở lợn nuôi tại Việt Nam Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y Mã số: 9 64 01 08 Cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Xác định tỷ lệ lưu hành, đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2 ở lợn nuôi tại Việt Nam và xác định sự đồng nhiễm của PCV2 với một số ADN/ARN virus ở lợn nuôi tại Việt Nam. Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên đơn giản nhiều giai đoạn và dựa vào thuật toán thống kê. Phân tích mẫu bằng phương pháp realtime PCR/PCR để xác định mẫu nhiễm PCV2. Sử dụng chương trình tin sinh học Bioedit v7.0 (Hall, 1999) để phân tích trình tự nucleotide.

Sử dụng chương trình MEGA 7 (Tamura et al., 2013) để xây dựng cây phát sinh chủng loại. Sử dụng phương pháp Principal Coordinate Analysis (PCoA) để phân tích sự đa dạng về trình tự nucleotide gen ORF2 của 64 chủng PCV2 phân lập ở Việt Nam từ 2004 đến 2017. Sử dụng phần mềm Quantum GIS để mô tả mức độ và sự phân bố của PCV2 ở lợn nuôi tại Việt Nam. Sử dụng phần mềm BEAST (Drummond et al.