Luận văn nghiên cứu đặc điểm phân tử gen meq của virus gây bệnh marek trên gà tại một số tỉnh miền bắc việt nam

Nghiên cứu đặc điểm phân tử gen meq của virus gây bệnh Marek trên gà tại miền Bắc Việt Nam, cung cấp thông tin quan trọng cho ngành chăn nuôi.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Hiền
• Người hướng dẫn: TS. Đoàn Thị Thanh Hương
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Điểm Gen Meq Của Virus Gây Bệnh Marek Trên Gà Tại Miền Bắc Việt Nam
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• Tính cấp thiết của đề tài
• Mục đích nghiên cứu
• Nội dung nghiên cứu
• Ý nghĩa của đề tài
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 1.1. Tổng quan về bệnh Marek
• 1.1.1. Phân loại virus gây bệnh
• 1.1.2. Hình thái, cấu trúc của virus MDV
• 1.1.3. Tuổi mắc bệnh, tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong
• 1.1.4. Cơ chế sinh bệnh
• 1.1.5. Triệu chứng, bệnh tích
• 1.1.6. Phương pháp chẩn đoán
• 1.1.7. Phòng bệnh
• 1.2. Gen gây ung thư của MDV
• 1.2.1. Gen Marek’s EcoRI-Q
• 1.3. Tình hình nghiên cứu MDV trên thế giới và Việt Nam
• 1.3.1. Tình hình nghiên cứu MDV trên thế giới
• 1.3.2. Tình hình nghiên cứu MDV ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, vật liệu và phạm vi và thời gian nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
• 2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
• 2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.2. Cơ sở vật chất và trang thiết bị nghiên cứu
• 2.2.1. Các dụng cụ và thiết bị
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp thu thập mẫu bệnh phẩm
• 2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
• 2.3.3. Phương pháp thiết kế mồi
• 2.3.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
• 2.3.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
• 2.3.6. Phương pháp giải trình tự Sanger
• 2.3.7. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thu nhận và giải trình tự gen Meq từ mẫu bệnh phẩm
• 3.1.1. Sàng lọc mẫu có chứa virus Marek
• 3.1.2. Kết quả thu nhận trình tự nucleotide toàn bộ gen Meq
• 3.2. Kết quả phân tích đặc điểm phân tử gen Meq
• 3.2.1. Một số đặc điểm phân tử gen Meq
• 3.2.2. Kết quả so sánh tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide và amino acid giữa các chủng GaHV2 nghiên cứu với trình tự gen tương ứng trên thế giới
• 3.3. Kết quả phân tích phả hệ nguồn gốc
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Gen Meq Virus Marek Trên Gà

Nghiên cứu về Gen Meq của Virus Marek trên gà tại Miền Bắc Việt Nam là một lĩnh vực quan trọng, đặc biệt trong bối cảnh bệnh Marek gây ra những thiệt hại kinh tế đáng kể cho ngành chăn nuôi gia cầm. Bệnh Marek là một bệnh truyền nhiễm do virus thuộc họ Herpesviridae gây ra, đặc trưng bởi sự tăng sinh tế bào lympho và hình thành khối u ở các cơ quan nội tạng. Việc nghiên cứu đặc điểm di truyền của virus gây bệnh là rất cần thiết để hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh, sự biến đổi của virus và từ đó đưa ra các biện pháp phòng bệnh hiệu quả. Theo thống kê của Tổ chức dịch tễ Thú y thế giới (OIE), bệnh Marek đã xuất hiện ở nhiều quốc gia trên thế giới, bao gồm cả các nước phát triển mạnh về chăn nuôi. Do đó, việc nghiên cứu sâu về đặc điểm di truyền của virus Marek là vô cùng cấp thiết.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Gen Meq Trong Bệnh Marek

Gen Meq đóng vai trò quan trọng trong việc xác định độc lực của virus Marek. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng số lượng motif PPPP và các đột biến điểm trong vùng gen Meq có liên quan đến độc lực của virus. Việc phân tích gen Meq giúp chúng ta hiểu rõ hơn về sự biến đổi của virus và khả năng gây bệnh của nó. Theo [8, 9], số lượng motif PPPP và các đa hình trong gen Meq có tương quan với độc lực của virus. Điều này làm nổi bật tầm quan trọng của việc nghiên cứu gen Meq trong việc kiểm soát bệnh Marek.

1.2. Bối Cảnh Dịch Tễ Học Bệnh Marek Tại Miền Bắc Việt Nam

Tại Việt Nam, bệnh Marek đã được báo cáo từ năm 1978. Đến năm 1980, bệnh bùng phát mạnh tại miền Bắc, gây thiệt hại lớn cho các trang trại gà giống. Các chủng virus gây bệnh tại các ổ dịch đã được xác định là chủng có độc lực cao. Thực tế này cho thấy sự xuất hiện của nhiều biến chủng virus Marek mới mà các chủng vaccine hiện tại không còn phù hợp. Nghiên cứu về dịch tễ học bệnh Marek và biến chủng virus Marek là rất quan trọng để đưa ra các biện pháp phòng bệnh hiệu quả.

II. Thách Thức Trong Kiểm Soát Bệnh Marek Trên Gà Hiện Nay

Mặc dù vaccine phòng bệnh Marek đã được sử dụng rộng rãi, nhưng bệnh vẫn tiếp tục bùng phát ở nhiều nơi trên thế giới, kể cả trên các đàn gà đã được tiêm phòng. Điều này cho thấy sự xuất hiện của các biến chủng virus Marek có khả năng vượt qua các đáp ứng miễn dịch do vaccine tạo ra. Việc nghiên cứu các biến chủng virus Marek và cơ chế kháng vaccine của chúng là một thách thức lớn trong công tác phòng chống bệnh. Theo Lachheb et al., 2020, bệnh Marek liên tục bùng phát ngay cả trên các đàn gà đã được phòng bệnh bằng vaccine, cho thấy MDV đã xuất hiện nhiều biến chủng và có khả năng vượt qua các đáp ứng miễn dịch do vaccine gây ra [15].

2.1. Sự Xuất Hiện Của Các Biến Chủng Virus Marek Độc Lực Cao

Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng độc lực của các chủng virus Marek đã tăng lên trong những thập kỷ gần đây. Một số chủng phân lập dễ gây bệnh cho gà hơn các chủng cũ. Điều này có thể là do việc sử dụng vaccine đã tạo áp lực chọn lọc, dẫn đến sự phát triển của các chủng virus có độc lực cao hơn. Việc giám sát sự xuất hiện của các biến chủng virus Marek độc lực cao là rất quan trọng để điều chỉnh các biện pháp phòng bệnh kịp thời.

2.2. Hiệu Quả Hạn Chế Của Vaccine Marek Hiện Tại

Vaccine Marek hiện tại, chủ yếu là chủng virus GaHV-2 nhược độc CVI988 (Rispens), vẫn được sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên, hiệu quả của vaccine này đang bị đe dọa bởi sự xuất hiện của các biến chủng virus có khả năng vượt qua miễn dịch do vaccine tạo ra. Việc nghiên cứu và phát triển các loại vaccine Marek mới có khả năng bảo vệ chống lại các biến chủng virus là rất cần thiết. Theo [21], những nỗ lực đã được thực hiện để xác định các patho type mới xuất hiện để đảm bảo sự bảo vệ của vaccine.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Đặc Điểm Gen Meq Virus Marek Hiệu Quả

Nghiên cứu đặc điểm gen Meq của virus Marek đòi hỏi việc áp dụng các phương pháp sinh học phân tử hiện đại. Các phương pháp này bao gồm thu thập mẫu bệnh phẩm, tách chiết DNA tổng số, thiết kế mồi, PCR, giải trình tự Sanger và phân tích phylogenetic. Việc kết hợp các phương pháp này giúp chúng ta xác định chính xác trình tự nucleotide của gen Meq, phân tích các đột biến và xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng virus khác nhau. Các phương pháp này được sử dụng để phân tích phát sinh loài và dự đoán xu hướng tiến hóa của virus.

3.1. Quy Trình Thu Thập Mẫu Bệnh Phẩm Và Tách Chiết DNA

Việc thu thập mẫu bệnh phẩm đúng cách là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng của DNA được tách chiết. Mẫu bệnh phẩm thường được thu thập từ các cơ quan nội tạng của gà bị bệnh, như lách, gan và thận. DNA tổng số sau đó được tách chiết bằng các bộ kit thương mại hoặc các phương pháp truyền thống. Việc kiểm tra chất lượng và số lượng DNA là cần thiết trước khi tiến hành các bước tiếp theo. Phương pháp tách chiết DNA tổng số được thực hiện theo quy trình chuẩn để đảm bảo DNA có chất lượng tốt cho các phân tích tiếp theo.

3.2. Kỹ Thuật PCR Và Giải Trình Tự Sanger Trong Phân Tích Gen Meq

PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật khuếch đại DNA được sử dụng để tạo ra nhiều bản sao của gen Meq. Mồi được thiết kế đặc hiệu cho vùng gen Meq để đảm bảo chỉ có vùng gen này được khuếch đại. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và giải trình tự bằng phương pháp Sanger. Trình tự nucleotide thu được được sử dụng để phân tích các đột biến và so sánh với các chủng virus khác. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được sử dụng để khuếch đại gen Meq từ mẫu DNA đã tách chiết.

3.3. Phân Tích Phylogenetic Xác Định Nguồn Gốc Virus Marek

Phân tích phylogenetic là một phương pháp sử dụng trình tự nucleotide của gen Meq để xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng virus Marek khác nhau. Cây phả hệ được xây dựng dựa trên các thuật toán thống kê để hiển thị mối quan hệ tiến hóa giữa các chủng virus. Phân tích phylogenetic giúp chúng ta xác định nguồn gốc của các chủng virus đang lưu hành tại Việt Nam và so sánh chúng với các chủng virus trên thế giới. Phân tích phylogenetic giúp xác định mối quan hệ nguồn gốc của các chủng GaHV - 2 dựa trên trình tự amino acid của toàn bộ gen Meq.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Đặc Điểm Phân Tử Gen Meq Virus Marek

Nghiên cứu về đặc điểm phân tử gen Meq của virus Marek tại Miền Bắc Việt Nam đã thu được những kết quả quan trọng. Các kết quả này bao gồm trình tự nucleotide của gen Meq từ các chủng virus khác nhau, phân tích các đột biến và xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng virus. Các kết quả này cung cấp thông tin quan trọng về sự biến đổi của virus Marek và giúp chúng ta hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh của nó. Các báo cáo trước đây cho thấy số lượng motif PPPP và các đa ình và đột biến điểm khác nhau trong vùng gen Meq có tương quan với độc lực của virus [8 , 9 ].

4.1. Trình Tự Nucleotide Gen Meq Của Các Chủng Virus Marek

Trình tự nucleotide của gen Meq đã được xác định từ các chủng virus Marek phân lập tại Miền Bắc Việt Nam. Các trình tự này được so sánh với các trình tự gen Meq của các chủng virus khác trên thế giới để xác định các đột biến và sự khác biệt di truyền. Các đột biến này có thể ảnh hưởng đến độc lực của virus và khả năng đáp ứng miễn dịch của gà. Kết quả thu nhận trình tự nucleotide toàn bộ gen Meq từ mẫu bệnh phẩm.

4.2. Phân Tích Đột Biến Và Đa Hình Trong Gen Meq

Phân tích các đột biến và đa hình trong gen Meq giúp chúng ta hiểu rõ hơn về sự biến đổi của virus Marek và khả năng thích nghi của nó với môi trường. Các đột biến có thể ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của protein Meq, từ đó ảnh hưởng đến độc lực của virus. Việc xác định các đột biến quan trọng có thể giúp chúng ta phát triển các biện pháp phòng bệnh hiệu quả hơn. Kết quả phân tích đặc điểm phân tử gen Meq cho thấy một số đặc điểm phân tử gen Meq.

4.3. Mối Quan Hệ Di Truyền Giữa Các Chủng Virus Marek

Phân tích phylogenetic giúp chúng ta xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng virus Marek khác nhau. Các chủng virus có nguồn gốc gần nhau thường có trình tự gen Meq tương đồng hơn. Việc xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng virus giúp chúng ta hiểu rõ hơn về sự lây lan của bệnh và nguồn gốc của các chủng virus đang lưu hành. Kết quả phân tích phả hệ nguồn gốc cho thấy mối quan hệ di truyền giữa các chủng GaHV - 2 nghiên cứu.

V. Ứng Dụng Kết Quả Nghiên Cứu Gen Meq Trong Phòng Bệnh Marek

Kết quả nghiên cứu về đặc điểm gen Meq của virus Marek có thể được ứng dụng trong việc phát triển các biện pháp phòng bệnh hiệu quả hơn. Các ứng dụng này bao gồm lựa chọn vaccine phù hợp, phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác, và giám sát sự biến đổi của virus. Việc áp dụng các kết quả nghiên cứu vào thực tiễn sẽ giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh Marek gây ra cho ngành chăn nuôi gia cầm. Dữ liệu thu được trong quá trình thực hiện đề tài góp phần cung cấp nguồn gen và thông tin cho những nghiên cứu tiếp theo giúp cho việc chẩn đoán, theo dõi, đánh giá mức độ gây bệnh của MDV từ đó có thể lựa chọn các chủng vaccine phù hợp và có hiệu quả hơn trong công tác phòng bệnh.

5.1. Lựa Chọn Vaccine Marek Phù Hợp Với Biến Chủng Virus

Việc lựa chọn vaccine phù hợp với các biến chủng virus Marek đang lưu hành là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả phòng bệnh. Các vaccine hiện tại có thể không bảo vệ chống lại tất cả các biến chủng virus. Việc nghiên cứu đặc điểm gen Meq của các biến chủng virus giúp chúng ta xác định các kháng nguyên quan trọng và lựa chọn vaccine có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch chống lại các kháng nguyên này. Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học để có thể lựa chọn vaccine phòng bệnh Marek đạt hiệu quả nhất.

5.2. Phát Triển Phương Pháp Chẩn Đoán Nhanh Bệnh Marek

Các phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác là rất cần thiết để phát hiện sớm bệnh Marek và ngăn chặn sự lây lan của bệnh. Các phương pháp chẩn đoán dựa trên PCR và giải trình tự gen Meq có thể giúp chúng ta xác định chính xác chủng virus gây bệnh và phân biệt chúng với các chủng virus khác. Việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác sẽ giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh Marek gây ra.

VI. Kết Luận Và Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Gen Meq Marek

Nghiên cứu về đặc điểm gen Meq của virus Marek tại Miền Bắc Việt Nam đã cung cấp những thông tin quan trọng về sự biến đổi của virus và cơ chế gây bệnh của nó. Các kết quả nghiên cứu này có thể được ứng dụng trong việc phát triển các biện pháp phòng bệnh hiệu quả hơn. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều câu hỏi chưa được giải đáp và cần được nghiên cứu tiếp. Cung cấp dữ liệu khoa học về gen kháng nguyên Meq , đặc điểm phân tử và phả hệ nguồn gốc của virus MDV gây bệnh Marek trên gà.

6.1. Tổng Kết Các Kết Quả Nghiên Cứu Về Gen Meq Virus Marek

Nghiên cứu đã xác định trình tự nucleotide của gen Meq từ các chủng virus Marek phân lập tại Miền Bắc Việt Nam, phân tích các đột biến và đa hình trong gen Meq, và xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng virus. Các kết quả này cung cấp thông tin quan trọng về sự biến đổi của virus Marek và giúp chúng ta hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh của nó.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Gen Meq Và Bệnh Marek

Các hướng nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc xác định các yếu tố di truyền khác ảnh hưởng đến độc lực của virus Marek, nghiên cứu cơ chế kháng vaccine của các biến chủng virus, và phát triển các loại vaccine mới có khả năng bảo vệ chống lại các biến chủng virus. Việc tiếp tục nghiên cứu về gen Meq và bệnh Marek sẽ giúp chúng ta kiểm soát bệnh hiệu quả hơn và giảm thiểu thiệt hại cho ngành chăn nuôi gia cầm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh Marek (Marek’s Disease - MD) là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm hàng đầu trên gia cầm, được mệnh danh là căn bệnh thế kỷ XX gây thiệt hại kinh tế ước tính hàng tỷ USD mỗi năm cho ngành chăn nuôi toàn cầu. Theo dữ liệu dịch tễ từ Tổ chức Thú y Thế giới, bệnh đã được ghi nhận xuất hiện tại 93 quốc gia và vùng lãnh thổ, với tỷ lệ tử vong ở các đàn gia cầm dao động phổ biến từ 25% đến 30%, cá biệt có những ổ dịch bùng phát làm tỷ lệ chết lên tới 68,97%. Bệnh do virus thuộc chi Mardivirus, họ Herpesviridae gây ra, trong đó loài Gallid alphaherpesvirus 2 (GaHV-2, thuộc serotype 1) là tác nhân độc lực chính chịu trách nhiệm hình thành các khối u lympho ác tính trên nội tạng, da và dây thần kinh của gà.

Tại Việt Nam, dịch bệnh Marek diễn biến hết sức phức tạp kể từ khi ghi nhận lần đầu vào năm 1978. Đáng báo động, nhiều đợt dịch nghiêm trọng vẫn bùng phát mạnh mẽ ngay trên những đàn gà đã được tiêm phòng đầy đủ các dòng vaccine tiêu chuẩn như CVI988 hay HVT, điển hình như ổ dịch làm chết gần 40.000 cá thể gà tại khu vực phía Nam. Thực trạng này đặt ra vấn đề nghiên cứu cấp bách: các chủng virus thực địa đang lưu hành tại Việt Nam đã biến đổi di truyền và tăng cường độc lực, khiến vaccine thương mại hiện hành suy giảm hiệu quả bảo hộ.

Nhằm giải quyết bài toán trên, luận văn tập trung vào mục tiêu thu nhận, giải trình tự toàn bộ vùng gen kháng nguyên gây ung thư Meq (kích thước 1020 bp) của các chủng virus Marek lưu hành tại các tỉnh miền Bắc, từ đó phân tích đặc điểm phân tử, xác định độc lực và lập cây phả hệ tiến hóa di truyền. Nghiên cứu được triển khai trên 7 mẫu bệnh phẩm thu thập từ 5 địa bàn trọng điểm (Hà Nội, Bắc Giang, Quảng Ninh, Hải Dương, Bắc Ninh) và 1 mẫu vaccine tham chiếu, thực hiện trong khung thời gian từ tháng 3/2022 đến tháng 11/2022. Kết quả mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc, cung cấp dữ liệu phân tử chuẩn xác với độ tương đồng di truyền trên 99% so với các chủng quốc tế, hỗ trợ trực tiếp cho công tác giám sát dịch tễ và định hướng phát triển vaccine phòng bệnh phù hợp tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên lý thuyết bệnh sinh học ung thư tế bào do Herpesvirus theo mô hình Cornell 4 giai đoạn: giai đoạn ly giải tế bào sớm (2 đến 7 ngày sau nhiễm, tấn công chủ yếu vào tế bào lympho B tại lách và tuyến ức), giai đoạn tiềm ẩn kéo dài (7 đến 10 ngày, virus ẩn cư dai dẳng trong tế bào lympho T hoạt hóa), giai đoạn ly giải tế bào muộn kèm ức chế miễn dịch (sau 18 ngày, virus nhân lên hoàn chỉnh tại biểu mô nang lông) và giai đoạn tăng sinh lympho ác tính (sau 28 ngày, hình thành các khối u đa cơ quan).

Bên cạnh đó, nghiên cứu ứng dụng lý thuyết độc lực phân tử của oncoprotein Meq (Marek’s EcoRI Q fragment). Meq là protein gồm 339 amino acid mang cấu trúc bZIP (basic leucine zipper) liên kết linh hoạt với DNA và các protein điều hòa nội bào như p53, đóng vai trò công tắc kích hoạt chuyển dạng tế bào và ức chế quá trình chết tự nhiên (apoptosis). Thuyết tiến hóa độc lực chỉ ra rằng sự thay đổi số lượng các đoạn lặp giàu proline (motif PPPP) và các đột biến điểm trên gen Meq là chỉ thị phân tử cốt lõi quyết định độc lực của virus: các chủng nhược độc (attMDV) sở hữu 8 motif PPPP, chủng độc lực vừa (mMDV) mang 7 motif PPPP, trong khi các chủng độc lực cao (vvMDV) và độc lực cực cao (vv+MDV) lần lượt chỉ còn 3 và 2 motif PPPP. Ngoài ra, nghiên cứu tiếp cận các khái niệm then chốt gồm: Gallid alphaherpesvirus 2 (GaHV-2), phân loại pathotype độc lực, gen ung thư Meq và cơ chế đột biến chèn đoạn (insertion mutation).

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu của nghiên cứu bao gồm 7 mẫu bệnh phẩm gan gà nghi mắc bệnh Marek thu thập từ các trang trại chăn nuôi tại 5 tỉnh miền Bắc (Hà Nội, Bắc Giang, Quảng Ninh, Hải Dương, Bắc Ninh) và 1 mẫu vaccine sống thương mại Prevexxion RN phân phối tại Việt Nam. Cỡ mẫu 7 mẫu thực địa được lựa chọn theo phương pháp chọn mẫu chủ đích dựa trên các tiêu chí bệnh tích lâm sàng điển hình: gan sưng to từ 2 đến 3 lần, xuất hiện khối u màu trắng xám nổi rõ trên bề mặt, lách xuất huyết và mống mắt biến đổi màu sắc. Phương pháp này đảm bảo tối ưu hóa khả năng thu nhận DNA virus có hoạt tính cao từ các tổn thương mô đặc hiệu.

DNA tổng số được tách chiết bằng bộ sinh phẩm GeneJET Genomic DNA Purification Kit theo quy trình phá vỡ màng tế bào bằng Proteinase K kết hợp cột lọc silica. Toàn bộ mẫu được sàng lọc sơ bộ bằng phản ứng PCR chẩn đoán xác định GaHV-2 thông qua cặp mồi Marek-F/R (kích thước sản phẩm 0,7 kb). Tiếp đó, vùng gen Meq toàn phần được khuếch đại bằng cặp mồi đặc hiệu GaHV2-MeqF và GaHV2-MeqR với sản phẩm PCR đạt kích thước 1,6 kb. Lý do lựa chọn cặp mồi này là do vị trí bám mồi nằm ngoài vùng mã hóa của gen Meq (nằm trên gen pp14 phía trước và gen vIL-8 phía sau), cho phép thu nhận trọn vẹn 100% chiều dài gen Meq mà không làm mất đoạn cấu trúc đầu 5' hay 3'. Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được giải trình tự trực tiếp hai chiều theo nguyên lý Sanger trên hệ thống ABI 3500. Dữ liệu trình tự được đối chiếu qua BLAST NCBI, phân tích căn gióng bằng phần mềm GeneDoc 2.7 và xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA 7 theo mô hình thay thế nucleotide Kimura-2 parameter với 1000 lần lặp kiểm định Bootstrap. Toàn bộ quy trình thực nghiệm được triển khai từ tháng 3/2022 đến tháng 11/2022 tại Phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình phân tích thực nghiệm sinh học phân tử đã mang lại bốn phát hiện khoa học mang tính đột phá:

Thứ nhất, 100% (7/7) mẫu bệnh phẩm gan gà thu thập từ thực địa miền Bắc đều dương tính với virus Marek serotype 1 (GaHV-2). Trình tự toàn bộ gen Meq của 7 chủng thực địa này đều có kích thước chuẩn xác là 1020 nucleotide, mã hóa cho chuỗi polypeptide gồm 339 amino acid.

Thứ hai, phát hiện sự khác biệt cấu trúc sâu sắc giữa các chủng thực địa và chủng vaccine thương mại. Gen Meq của chủng vaccine sống (MRVX) có kích thước 1197 nucleotide (mã hóa 398 amino acid), do mang một đoạn chèn dài 177 nucleotide (tương ứng 59 amino acid) tại vị trí từ nucleotide thứ 573 đến 750. Toàn bộ 7 chủng thực địa miền Bắc đều không có đoạn chèn này, một đặc trưng điển hình của các chủng virus cường độc.

Thứ ba, phân tích đặc tính phân tử protein Meq cho thấy cả 7 chủng thực địa đều chứa đúng 3 motif PPPP lặp lại, với hàm lượng proline dao động ở mức thấp từ 20,59% đến 21,18%. Ngược lại, chủng vaccine MRVX sở hữu tới 7 motif PPPP và tỷ lệ proline đạt 23,88%.

Thứ tư, xác định được tập hợp các đột biến điểm đặc trưng tạo nên biến đổi amino acid tại 9 vị trí trọng yếu gồm: 66, 71, 77, 80, 115, 139, 176, 217 và 326 khi so sánh với chủng vaccine chuẩn CVI988. Đặc biệt, sự xuất hiện đồng thời của hai đột biến thay thế serine thành alanine tại vị trí 71 (S71A) và glutamate thành lysine tại vị trí 77 (E77K) khẳng định các chủng lưu hành tại miền Bắc thuộc nhóm pathotype độc lực cao (vvMDV).

Thảo luận kết quả

Các kết quả thu nhận được phản ánh rõ nét quy luật tiến hóa phân tử dưới áp lực chọn lọc miễn dịch. Việc tỷ lệ proline trong protein Meq ở các chủng thực địa giảm xuống mức 20,59% - 21,18% cùng sự gián đoạn của các đoạn lặp PPPP (chỉ còn 3 motif so với 7 motif ở chủng vaccine) làm tăng đáng kể khả năng hoạt hóa phiên mã và giảm tính ức chế của protein Meq. Điều này giải thích nguyên nhân các chủng GaHV-2 thực địa có tốc độ nhân lên mạnh mẽ, khả năng ức chế miễn dịch cao và gây khối u ác tính sớm hơn ở gà con.

Khi đối chiếu với cơ sở dữ liệu quốc tế, 7 chủng virus miền Bắc thể hiện sự tương đồng nucleotide rất cao (từ 99,8% đến 99,9%) và cùng nhánh tiến hóa với các chủng độc lực cao tại Trung Quốc như GX070079, YA và LTS, nhưng lại phân tách thành nhánh độc lập so với các chủng vaccine nguồn gốc phương Tây như CVI988 hay CU-2. Sự khác biệt kháng nguyên do 9 vị trí đột biến acid amin then chốt gây ra là nguyên nhân trực tiếp làm suy giảm hiệu lực bảo vệ của các chương trình vaccine truyền thống tại các trang trại Việt Nam.

Dữ liệu nghiên cứu này có thể được mô hình hóa trực quan rất hiệu quả thông qua hai dạng biểu đồ và bảng:

• Bảng ma trận so sánh đa chuỗi amino acid: Giúp thể hiện trực quan vị trí mất đoạn 59 amino acid của các chủng thực địa so với chủng vaccine, đồng thời làm nổi bật các đột biến điểm S71A và E77K.
• Cây phả hệ phát sinh loài (Phylogenetic Tree): Minh họa rõ ràng sự phân cụm di truyền, chỉ ra mối quan hệ nguồn gốc gần gũi giữa các chủng virus thực địa Việt Nam với các chủng vvMDV châu Á, cách biệt hoàn toàn với nhóm chủng nhược độc (attMDV).

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các bằng chứng khoa học phân tử đã xác lập, luận văn đề xuất 4 nhóm giải pháp chiến lược nhằm kiểm soát hiệu quả bệnh Marek:

Thứ nhất, thiết lập hệ thống giám sát dịch tễ học phân tử định kỳ đối với virus GaHV-2. Cục Thú y phối hợp cùng các Chi cục Chăn nuôi và Thú y địa phương cần tiến hành lấy mẫu và giải trình tự gen Meq ngẫu nhiên tại ít nhất 70% các trang trại gà giống quy mô trên 5.000 con tại các tỉnh trọng điểm miền Bắc. Hoạt động này cần thực hiện định kỳ 6 tháng một lần từ năm 2023 đến năm 2026 nhằm kịp thời phát hiện sự xuất hiện của các biến chủng độc lực cực cao (vv+MDV).

Thứ hai, nghiên cứu và sản xuất vaccine tái tổ hợp thế hệ mới tương đồng kháng nguyên bản địa. Các viện nghiên cứu công nghệ sinh học và doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm thú y cần sử dụng khung gen Meq của các chủng vvMDV thực địa tại miền Bắc để phát triển dòng vaccine nhược độc hoặc vaccine vector tái tổ hợp. Mục tiêu đến năm 2027 đưa vào khảo nghiệm diện rộng dòng vaccine có khả năng nâng tỷ lệ bảo hộ thực địa lên trên 90% trước các biến chủng virus lưu hành.

Thứ ba, chuẩn hóa quy trình chẩn đoán nhanh phân biệt virus thực địa và virus vaccine bằng kỹ thuật multiplex PCR. Các phòng xét nghiệm chẩn đoán thú y cần áp dụng quy trình khuếch đại đoạn gen Meq 1,6 kb để phát hiện sớm mầm bệnh và phân biệt chính xác chủng cường độc (1020 bp) với chủng vaccine (1197 bp) trong vòng 4 đến 6 giờ, đạt độ nhạy và độ đặc hiệu trên 98%.

Thứ tư, siết chặt các biện pháp an toàn sinh học và tối ưu hóa lịch tiêm phòng tại cơ sở chăn nuôi. Các chủ trang trại và kỹ sư thú y phải thực hiện nghiêm ngặt quy trình khử trùng chuồng nuôi bằng Formalin kết hợp thuốc tím, xử lý triệt để 100% chất độn chuồng và biểu mô nang lông sau mỗi lứa nuôi. Đảm bảo tiêm phòng vaccine Marek cho 100% gà con ở giai đoạn phôi 18 ngày tuổi hoặc tiêm dưới da cổ trong vòng 24 giờ đầu sau khi nở để tạo hàng rào miễn dịch sớm trước khi gà tiếp xúc với mầm bệnh môi trường.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và dữ liệu thực nghiệm của luận văn là tài liệu tham khảo giá trị cho 4 nhóm đối tượng chuyên môn:

Nhóm 1: Các nhà khoa học, giảng viên và nghiên cứu sinh chuyên ngành Vi sinh vật học, Sinh học phân tử và Thú y học. Nguồn tài liệu cung cấp quy trình chuẩn từ thiết kế mồi ngoại vi khuếch đại trọn vẹn gen Meq (1,6 kb), quy trình PCR tối ưu hóa đến phương pháp xử lý dữ liệu tin sinh học bằng MEGA 7 và GeneDoc. Use case thực tế: Ứng dụng khung nghiên cứu này để triển khai các đề tài giải trình tự và phân tích tiến hóa cho các đối tượng virus DNA kích thước lớn khác.

Nhóm 2: Chuyên viên xét nghiệm và cán bộ kỹ thuật tại các Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương và Chi cục Thú y vùng. Luận văn cung cấp phương pháp chẩn đoán phân tử có độ chính xác cao giúp phân định rành mạch giữa cá thể gà bị nhiễm virus thực địa cường độc và cá thể mang virus vaccine sống. Use case thực tế: Xây dựng quy trình vận hành tiêu chuẩn (SOP) phục vụ xét nghiệm xác minh ổ dịch Marek tại các cơ sở chăn nuôi.

Nhóm 3: Các doanh nghiệp sản xuất, nhập khẩu và phân phối vaccine thú y. Tài liệu chỉ rõ nguyên nhân di truyền học phân tử dẫn đến sự sụt giảm hiệu lực bảo hộ của các dòng vaccine ngoại nhập (chứa chủng CVI988 hoặc HVT) trước các biến chủng vvMDV tại miền Bắc. Use case thực tế: Định hướng chiến lược nghiên cứu phát triển sản phẩm sinh phẩm mới phù hợp với dịch tễ học phân tử của Việt Nam.

Nhóm 4: Bác sĩ thú y, kỹ sư chăn nuôi và chủ trang trại gia cầm quy mô công nghiệp. Luận văn giúp người làm thực tế hiểu rõ cơ chế bệnh sinh 4 giai đoạn, các dạng bệnh tích điển hình ở gan, lách, mắt và tầm quan trọng sống còn của việc tiêm vaccine đúng thời điểm 1 ngày tuổi kết hợp kiểm soát an toàn sinh học. Use case thực tế: Thiết lập quy trình quản lý rủi ro sinh học và lịch phòng tễ nghiêm ngặt tại trang trại.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao đàn gà đã được tiêm phòng vaccine Marek đầy đủ nhưng dịch bệnh vẫn bùng phát? Nguyên nhân chủ yếu do các chủng virus GaHV-2 thực địa lưu hành tại các trang trại đã biến đổi độc lực lên mức rất độc (vvMDV), mang các đột biến điểm đặc trưng như S71A và E77K trên gen Meq. Những biến đổi phân tử này tạo ra sự khác biệt kháng nguyên lớn so với các chủng vaccine cổ điển như CVI988 hay HVT, khiến hiệu lực bảo hộ sụt giảm mạnh trong điều kiện thực địa.

Gen Meq đóng vai trò then chốt như thế nào trong cơ chế gây ung thư của virus Marek? Gen Meq (kích thước 1020 bp) mã hóa protein bZIP gồm 339 amino acid, là oncoprotein chính của virus GaHV-2. Protein này liên kết với p53 và các yếu tố điều hòa phiên mã nội bào nhằm ức chế quá trình apoptosis và thúc đẩy tế bào lympho T chuyển dạng ác tính, dẫn đến sự tăng sinh không kiểm soát và hình thành các khối u lympho ở gan, lách sau 28 ngày nhiễm.

Làm thế nào để phân biệt chủng virus Marek thực địa và chủng virus vaccine qua xét nghiệm PCR? Phân biệt dựa vào chiều dài sản phẩm khuếch đại gen Meq: các chủng thực địa cường độc không có đoạn chèn nên gen Meq dài 1020 bp (339 amino acid), trong khi chủng vaccine sống mang đoạn chèn dài 177 bp nâng kích thước gen lên 1197 bp (398 amino acid). Khi điện di sản phẩm PCR với cặp mồi GaHV2-MeqF/R, vạch DNA của chủng vaccine sẽ di chuyển chậm hơn và nằm ở vị trí cao hơn rõ rệt so với chủng thực địa.

Các chỉ số phân tử nào được sử dụng để xác định pathotype độc lực của một chủng GaHV-2 mới? Độc lực của GaHV-2 tỷ lệ nghịch với số lượng motif PPPP và tỷ lệ phần trăm proline trong protein Meq. Chủng độc lực cao (vvMDV) chỉ chứa 3 motif PPPP và tỷ lệ proline thấp khoảng 20,59% - 21,18%. Ngược lại, các chủng nhược độc và độc lực vừa sở hữu từ 7 đến 8 motif PPPP cùng tỷ lệ proline cao trên 23,88%.

Đâu là thời điểm vàng để tiêm vaccine phòng bệnh Marek đạt hiệu quả bảo hộ cao nhất cho đàn gà? Thời điểm tối ưu nhất là tiêm in ovo vào phôi gà 18 ngày tuổi hoặc tiêm dưới da cổ cho gà con 1 ngày tuổi ngay tại trạm ấp trước khi xuất bán. Gà con 1 ngày tuổi có độ mẫn cảm với virus Marek cao gấp 1.000 lần so với gà 14-26 ngày tuổi, do đó việc tạo đáp ứng miễn dịch sớm trước khi gà tiếp xúc với môi trường chuồng nuôi là yếu tố quyết định sự thành bại.

Kết luận

• Luận văn đã xác định 100% mẫu bệnh phẩm gan gà thu thập tại 5 tỉnh miền Bắc (Hà Nội, Bắc Giang, Quảng Ninh, Hải Dương, Bắc Ninh) đều dương tính với virus gây bệnh Marek serotype 1 (GaHV-2).
• Thu nhận và giải trình tự thành công toàn bộ gen Meq của 7 chủng thực địa (kích thước 1020 bp, mã hóa 339 amino acid) và 1 chủng vaccine thương mại (kích thước 1197 bp, mã hóa 398 amino acid mang đoạn chèn 177 bp).
• Xác lập bằng chứng phân tử chứng minh 7 chủng virus thực địa thuộc pathotype độc lực cao (vvMDV), mang 3 motif PPPP, tỷ lệ proline từ 20,59% đến 21,18% và sở hữu hai đột biến điểm chỉ thị S71A, E77K.
• Phân tích phả hệ tiến hóa chỉ ra các chủng virus miền Bắc có độ tương đồng di truyền trên 99,8% với các chủng vvMDV tại Trung Quốc và phân tách độc lập với các chủng vaccine phương Tây.
• Cung cấp nguồn dữ liệu phân tử chuẩn xác và quy trình PCR đặc hiệu 1,6 kb phục vụ công tác chẩn đoán phân biệt, giám sát dịch tễ học và định hướng phát triển vaccine phòng bệnh Marek tại Việt Nam.

Kế hoạch tiếp theo cần tập trung mở rộng quy mô giải trình tự trên phạm vi toàn quốc và khởi động các chương trình thử nghiệm tiền lâm sàng đối với vaccine tái tổ hợp từ năm 2024 đến năm 2026. Các nhà quản lý thú y, viện nghiên cứu và chủ cơ sở chăn nuôi gia cầm cần chủ động ứng dụng kỹ thuật chẩn đoán phân tử gen Meq và nâng cấp hàng rào an toàn sinh học nhằm bảo vệ bền vững ngành chăn nuôi gia cầm Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU. Tính cấp thiết của đề tài. Mục đích nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.

Ý nghĩa của đề tài. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU. Tổng quan về bệnh Marek.1 Phân loại virus gây bệnh. Hình thái, cấu trúc của virus MDV.

Tuổi mắc bệnh, tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong. Cơ chế sinh bệnh. Triệu chứng, bệnh tích. Phương pháp chẩn đoán.

Phòng bệnh. Gen gây ung thư của MDV. Gen Marek’s EcoRI-Q. Tình hình nghiên cứu MDV trên thế giới và Việt Nam.

Tình hình nghiên cứu MDV trên thế giới. Tình hình nghiên cứu MDV ở Việt Nam. 21 CHƯƠNG: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng, vật liệu và phạm vi và thời gian nghiên cứu.

Đối tượng và vật liệu nghiên cứu. Phạm vi nghiên cứu. Địa điểm và thời gian nghiên cứu. Cơ sở vật chất và trang thiết bị nghiên cứu.

Các dụng cụ và thiết bị. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp thu thập mẫu bệnh phẩm. Phương pháp tách chiết DNA tổng số.

Phương pháp thiết kế mồi. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction). Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR. Phương pháp giải trình tự Sanger.

Phương pháp phân tích và xử lý số liệu. 31 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN. Thu nhận và giải trình tự gen Meq từ mẫu bệnh phẩm. Sàng lọc mẫu có chứa virus Marek.

Kết quả thu nhận trình tự nucleotide toàn bộ gen Meq. Kết quả phân tích đặc điểm phân tử gen Meq. Một số đặc điểm phân tử gen Meq. Kết quả so sánh tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide và amino acid giữa các chủng GaHV2 nghiên cứu với trình tự gen tương ứng trên thế giới.

Kết quả phân tích phả hệ nguồn gốc. 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 61 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt MDV Marek’s Disease Virus Vi rút gây bệnh Marek bp Base pair Cặp base DNA Deoxyribonucleic acid Phân tử DNA GaHV-2 Gallid anphaherpesvirus-2 Vi rút Marek serotype 1 GaHV-3 Gallid anphaherpesvirus-3 Vi rút Marek serotype 2 MeHV1 Meleagrid herpesvius-1 Vi rút Marek serotype 3 Meq Marek’s disease virus EcoRI Gen Meq fragmet Q att Attenuated Nhược độc m Mild Độc lực yếu v Virulent Độc lực vv Very virulent Độc lực cao vv+ Very virulent plus Độc lực cực cao pp38 Phosphoprotein 38 Protein pp38 US Unique Short Vùng ngắn duy nhất UL Unique Long Vùng dài duy nhất TRL Terminal repeat long Vùng lặp lại giới hạn dài IRL Internal repeat long Vùng lặp lại nội bộ dài TRS Terminal repeat short Vùng lặp lại giới hạn ngắn IRS Internal repeat short Vùng lặp lại nội bộ ngắn BR1 Basic region 1 Vùng có tính bazơ 1 BR2 Basic region 2 Vùng có tính bazơ 2 PCR Polymesase Chain Reaction Phản ứng tạo chuỗi do polymerase TAE Tris-acetate-EDTA Dung dịch đệm TAE dNTPs Deoxynucleotide triphosphate MEGA Molecular Evolutionary Chương trình MEGA Genetics Analysis Epp: Eppendorf Ống Eppendorf NCBI National Centre for Trung tâm thông tin CNSH Biotechology Information vi DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.

Đặc điểm phân biệt bệnh Marek và bệnh Leuko. Danh sách các mẫu sử dụng trong nghiên cứu. Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu. Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng PCR thu nhận gen Meq.

Danh sách các chủng MDV của Việt Nam và thế giới sử dụng trong nghiên cứu. Phân tích đặc tính phân tử protein Meq của các chủng GaHV-2. Các vị trí sai khác amino acid trong gen Meq giữa các chủng GaHV-2 nghiên cứu so với các chủng trên thế giới. Tỷ lệ (%) đồng nhất về thành phần nucleotide và amino acid toàn bộ gen Meq của 08 chủng GaHV-2 (Việt Nam) với các chủng đại diện trên thế giới.

54 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cấu tạo virus MDV. Cấu trúc bộ gen MDV ở dạng thẳng và dạng vòng [30].3: Sơ đồ giải mã bộ gen chủng Md5 của GaHV-2 [4].4: Mắt gà khi nhiễm Marek .5: Khối u hình thành trên da .6: Lách xuất huyết .7: Gan sưng, hình thành khối u .8: Vị trí của gen Meq nằm trong bộ gen [57] .2: Kết quả BLAST trình tự mồi GaHV2 - MeqF trên NCBI. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR bằng cặp mồi Marek-F – Marek-R. Kết quả truy cập Ngân hàng gen của các chủng nghiên cứu .3: Sản phẩm PCR được khuếch đại bằng cặp mồi GaHV2- MeqF/GaHV2-MeqR.

Phân tích sản phẩm trên gel aragose 1%.4: Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen Meq của 8 chủng GaHV-2 nghiên cứu.5: Sự sai khác về vị trí amino acid của các chủng trong nghiên cứu .6: Sự gián đoạn motif PPPP của các chủng nghiên cứu .7: Cây phả hệ xác định mối quan hệ nguồn gốc của các chủng GaHV-2 dựa trên trình tự amino acid của toàn bộ gen Meq. Tính cấp thiết của đề tài Marek là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, gây thiệt hại lớn về kinh tế cho ngành chăn nuôi gia cầm trên toàn thế giới và được gọi là căn bệnh của thế kỷ XX [1]. Bệnh Marek (Marek’s disease – MD) do nhà khoa học Hungary phát hiện lần đầu tiên năm 1907, sau đó được phát hiện ở nhiều nước trên thế giới. Theo thống kê của Tổ chức dịch tễ Thú y thế giới (Office International des Epizooties – OIE), tính từ năm 2005 đến năm 2016 bệnh Marek đã xuất hiện ở 93 quốc gia trên thế giới, bao gồm các nước phát triển mạnh về chăn nuôi như: Mỹ, Anh, Canada, Hà Lan ….

Virus gây bệnh Marek (Marek’s disease virus – MDV) là virus DNA, thuộc họ Herpesviridae, chi Mardivirus, có khả năng điều khiển làm tăng sinh tế bào gây nên các dạng khối u ở cơ quan nội tạng của gia cầm [3]. Dựa trên các đặc điểm huyết thanh học, bệnh được chia thành 3 serotype khác nhau: serotype 1 được gây ra bởi Gallid alphaherpesvirus 2 (GaHV-2) là loại virus có độc lực mạnh, gây thiệt hại về kinh tế nặng nề; serotype 3 được gây ra bởi Meleagrid herpesvirus 1 (MeHV-1 hay HVT), có độc lực yếu hơn; serotype 2 do Gallid herpesvirus 3 (GaHV-3) không có khả năng gây bệnh cho gà nên không được quan tâm nhiều [4, 5]. Trong 3 loại serotype trên, bộ gen của GaHV-2 có kích thước lớn nhất (174,046 bp), sau đó là GaHV-3 (164,270 bp) và MeHV-1 (160,673 bp) [6]. Trong hệ gen của GaHV-2, gen Meq được coi là gen kháng nguyên của virus, vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định tính độc lực của virus [7].

Các báo cáo trước đây cho thấy số lượng motif PPPP và các đa ình và đột biến điểm khác nhau trong vùng gen Meq có tương quan với độc lực của virus [8, 9]. Dựa trên tỷ lệ tử vong ở các đàn, tần suất mắc bệnh và khả năng bảo hộ của vaccine hiện có, các chủng GaHV-2 đã được chia thành 5 pathotypes là: 2 nhược độc (att), độc lực vừa (mMDV), độc lực (vMDV), độc lực cao (vvMDV), và độc lực cực cao (vv+ MDV) [10]. Ở Việt Nam, bệnh Marek lần đầu tiên được báo cáo vào năm 1978 với tên gọi “teo chân gà”, “ung thư gà”, “hội chứng khối u”… .Đến năm 1980, tại miền Bắc, bệnh bùng phát mạnh, nhiều trang trại gà giống phải tiêu hủy cả đàn mặc dù các trại gà này đã dùng chủng virus vaccine HVT hoặc CVI988/Rispens để phòng bệnh [11, 12, 13]. Chủng virus gây bệnh tại các ổ dịch đã được phân lập và xác định là chủng có độc lực cao.

Thực tế trên cho thấy đã có nhiều biến chủng virus MDV mới tại Việt Nam mà các chủng virus vaccine không còn phù hợp nữa. Cho đến khi đề tài này tiến hành, chỉ mới có một vài nghiên cứu về sinh học phân tử nhằm xác định chính xác genotype của chủng virus MDV đang gây bệnh. Nhu cầu nghiên cứu gen, đặc điểm phân tử của các chủng virus MDV đang lưu hành là rất cần thiết nhằm phục vụ nghiên cứu, ứng dụng trong chẩn đoán, phân định type, dịch tễ học và đa dạng sinh học. Xuất phát từ nhu cầu và mục tiêu trên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm phân tử gen Meq của virus gây bệnh Marek trên gà tại một số tỉnh Miền Bắc Việt Nam’’.

Mục đích nghiên cứu - Thu nhận và giải trình tự toàn bộ gen kháng nguyên Meq của các chủng virus gây bệnh Marek ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam. - Phân tích được một số đặc điểm phân tử, phả hệ nguồn gốc của virus và xác định chủng gây bệnh. Nội dung nghiên cứu - Giải trình tự toàn bộ vùng gen Meq - Phân tích phả hệ nguồn gốc của các chủng GaHV-2 Việt Nam và thế giới dựa trên dữ liệu gen Meq từ đó xác định chủng virus đang lưu hành tại Việt Nam - Phân tích đặc điểm phân tử vùng gen Meq của các chủng Việt Nam và so 3 sánh với các chủng trên thế giới. Ý nghĩa của đề tài 4.

Ý nghĩa khoa học - Cung cấp dữ liệu khoa học về gen kháng nguyên Meq, đặc điểm phân tử và phả hệ nguồn gốc của virus MDV gây bệnh Marek trên gà. - Cung cấp thêm thông tin về thành phần, đặc điểm, cấu trúc gen Meq của virus MDV nhằm phục vụ nhu cầu phát triển vaccine. Ý nghĩa thực tiễn - Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học để có thể lựa chọn vaccine phòng bệnh Marek đạt hiệu quả nhất. - Dữ liệu thu được trong quá trình thực hiện đề tài góp phần cung cấp nguồn gen và thông tin cho những nghiên cứu tiếp theo giúp cho việc chẩn đoán, theo dõi, đánh giá mức độ gây bệnh của MDV từ đó có thể lựa chọn các chủng vaccine phù hợp và có hiệu quả hơn trong công tác phòng bệnh.

TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1. Tổng quan về bệnh Marek Bệnh Marek (Marek’s disease - MD) là một bệnh truyền nhiễm ở gà do virus thuộc nhóm Herpes gây ra. Đặc trưng của bệnh là tăng sinh tế bào lympho, thâm nhiễm tế bào đơn nhân dưới hình thức khối u thần kinh ngoại biên và các cơ quan nội tạng, mống mắt và da [14]. Virus gây bệnh có tên gọi chung là Marek’s Desease Virus (MDV) thuộc họ Herpesviridae, thuộc phân họ α-Herpesvirinae; chi Mardivirus.

Hệ gen là DNA sợi đôi có kích thước xấp xỉ khoảng 175 kb, kích thước hạt virus dao động từ 100 đến 120 nm. MDV được chia thành 3 loại: Meleagrid herpesvirus 1 (MeHV-1 hay HVT), Gallid alphaherpesvirus 2 (GaHV-2), Gallid herpesvirus 3 (GaHV-3). Trong đó, GaHV-2 thuộc serotype 1 là tác nhân gây bệnh Marek, biểu hiện thành u lympho ác tính ở gà bị nhiễm bệnh. MeHV-1 thường lây bệnh trên gà tây, được phát triển và sử dụng như một vaccine Marek tiềm năng.