MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của luận án Tiêu chảy cấp ở lợn hay tiêu chảy thành dịch (Porcine Epidemic Diarrhea, PED) là một bệnh nguy hiểm và có khả năng lây lan trên lợn ở tất cả các độ tuổi. Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV), một loại virus thuộc họ Coronaviridae, là tác nhân gây ra bệnh PED. Tỷ lệ tử vong ở lợn cao, lên đến 80–100% sau khi mắc bệnh PED, đặc biệt ở lợn con mới sinh dưới 7 ngày tuổi [1]. Dịch PED đã bùng phát và gây ra tổn thất kinh tế nghiêm trọng ở nhiều nước trên thế giới đặc biệt là Châu Á và Châu Mỹ [2].
Tại Việt Nam, dịch PED đã có mặt ở nhiều tỉnh thành khắp cả nước [3]. Các chủng PEDV được phát hiện tại ba miền Bắc, Trung, Nam từ năm 2015 đến năm 2016 thuộc về nhóm gen G1b, G2a và G2b [4]. Các chủng PEDV G2 đã gây ảnh hưởng đến kinh tế nghiêm trọng, làm giảm năng suất đàn lợn nái và lợn giống ở nhiều tỉnh thành [5]. Hiện nay, hầu hết các vacxin phòng PEDV được sử dụng ở Việt Nam là vacxin truyền thống có nguồn gốc ngoại nhập hoặc sử dụng các chủng nhập khẩu thuộc nhóm G1a cổ điển để sản xuất vacxin.
Sự khác biệt trong trình tự bộ gen của các chủng PEDV mới bùng phát và các chủng PEDV trong vacxin, đặc biệt là ở các thụ thể trung hòa, dẫn đến vacxin hiện tại có hiệu quả bảo hộ thấp chống lại các chủng PEDV trên thực địa [3]. Vì vậy, để đảm bảo an toàn cho ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam, cần có những nghiên cứu phát triển vacxin phòng PEDV, đặc biệt là các chủng virus thuộc nhóm G2 gây bệnh thực địa. Vacxin tiểu đơn vị được tạo ra nhờ sử dụng hệ thống thực vật có nhiều lợi thế bao gồm mức đầu tư sản xuất thấp, dễ dàng nhân rộng, độ ổn định cao và thời hạn sử dụng lâu dài [6]. Phương pháp biểu hiện tạm thời dựa trên agro-infiltration có lợi thế trong việc sản xuất các protein tái tổ hợp nhanh chóng với số lượng lớn, điều này cho phép phản ứng kịp thời khi xảy ra các dịch bệnh [7].
Protein S của PEDV tồn tại ở dạng homotrimer. Protein S là nhân tố không thể thiếu trong tương tác của virus với các thụ thể tế bào [8] và được xem là mục tiêu chính để phát triển vacxin [9]. Vùng CO-26K equivalent (COE) (aa 499–638) là một vùng quyết định kháng nguyên trên protein S của PEDV phản ứng với kháng thể trung hòa [8] và được nhận diện bởi kháng thể đơn dòng 2C10 ở đầu C của protein S [10]. Kháng nguyên COE được xem là mục tiêu chính để sản xuất vacxin tiểu đơn vị phòng PEDV [11].
Vùng COE đã được nghiên cứu biểu hiện trên hệ thống thực vật trong nhiều công bố trước đây [12, 13]. Protein COE tái tổ hợp ở dạng monomer có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch trên chuột. Dạng cấu trúc pentamer của COE đã được biểu hiện thành công nhưng chưa có các đánh giá về khả năng gây miễn dịch [12]. 33a8d66 6e7d7dc9e13 dd1 05b1 1d31 bb1a 3455 1df2b0 cb9 7186 bc6 d16a 369ee5 b ee72a4a6 c95e 8b44 261 c11b4da31 9ff705 b88da 47d8 4df733 b53a c07db5dfacc 1510e98 0f4 50b60aa5d5a6890 d04 084e1 69f91b0a 0746aa f8db6ad4b36 3cb2aa f7241 c66a 32f777 f8d7 cb0bb287 f89ee b3cc87 25aa013 8eb5 ef5 3e30 c2eaa3 b4 e02a5a6fa 70b0 7f7 fcd90 ba65b61b8 f12 3f1 9667 d8f652fe56 cf4 b7e8a dcc6c3 2 27fc8c5 9ff18a6 cc5 b550e f27 2207e 2890 e7004 6d87 71b5cc78 c4cc78 b7b5 3ed 7c671 77c6ed c0d9 cb4e3df6 d9b4 f27 9f2 4b01 e9147a 384db32 2798e 50c0f8e b6 be2c8 01b1fb0070 8e12 c6de 961 c5f1c0 06855 d27 b368 f5d3200 457bf86 82875 8 7da9aa76 fc2 ed63 f83 0eaf0 c38 74ebfb6 7e9c8ed f16 f6dc82 6b51 078e7 60f49c 65a914d4973 444e2 d79a7 58d43b2e 6adbb6da 6d7 cb1 d692 8950 8de5 27b9 8e614 08e5183 8cb468 07e5 f69d5b5 f32e 0b59 dd6 d94 9422a0 b5 cc7e 452e d3c3d3a4 8f c8c0 747 d2d9 988b26a4d181 f8d1ae03e7 8f6a 3d5a4 0036 f14 74f03bfa68a33 1f 24180d1943 19c5b53 60e51 00c27f5c0 6601 be5b55b9 1eb2 908e5 cb1a159e 6e2b bd19 f0b1a72 c4971 21fb1e8 ee703 c88 1d05 b4f370 b27a4 cb9a 76d3 8fc7fa3 9f9 6e4c1 25a430 5bfc91 dc8 7d41 6036 0fb00fca063 6038aae 4774 0cfd0a7 b33ab4d c075 cc2 f31a 7f7 245 c7a5fca8 f749 3b20 d1be27aa69 d40 c7a2 f7f36b3f0ae f35 e190ac1c9 6f6 f10 748 f84c4d3a 7aaad61 9ff8ef2 9806 c05 43c99b8a 20c9a1df4 b83b8 d125 48d1f8 da85e1 7f2 45c47e48 f5 cf18c4a38b4fb6219a 69980 133a2 49 Ngoài vùng COE thuộc protein S của PEDV, vùng S1D (aa 636–789) có 2 vùng được nhận biết bởi thụ thể tế bào lympho B là SS2 (aa 748–755) và vùng SS6 (aa 764–771) cũng là các vùng kháng nguyên quan trọng tương tác với các kháng thể có khả năng trung hòa [14].
Thêm vào đó, tiểu phần S2 có chứa các vùng kháng nguyên tương tác với các kháng thể có khả năng trung hòa virus bao gồm các aa 744–759, các aa 747–774, các aa 756–771 và các aa 1371–1377 [15]. Tiểu phần S2 đã được biểu hiện dưới dạng từng phần hoặc đầy đủ trong E. Chuột được tiêm tiểu phần S2 có sự hiện diện của các kháng thể có khả năng trung hòa PEDV [16]. Protein S đã được phát hiện có sự biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá Nicotiana benthamiana ở mức độ thấp [18] hoặc không biểu hiện [19].
Với mục đích tạo protein S1 tái tổ hợp dạng trimer, toàn bộ protein S1 dung hợp motif GCN4pII (pII) được biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá N. benthamiana, tuy nhiên, mức độ biểu hiện của protein S1-pII chỉ đạt 0,005% protein hòa tan tổng số (TSP) [20]. Trong nghiên cứu này, với mục đích tạo ra các protein S tái tổ hợp có cấu trúc tương tự protein S dạng trimer tự nhiên hoặc dạng oligomer, các vùng COE (aa 499–638), COE–S1D (aa 499–789) hoặc S2 (aa 730–1324) thuộc protein S được dung hợp motif GCN4pII hoặc dung hợp motif GCN4pII-tp. Tính đến nay, chưa có công bố nào ở trong và ngoài nước nghiên cứu về việc biểu hiện các protein tái tổ hợp này trên hệ thống cây thuốc lá N.
benthamiana cũng như chứng minh được tính sinh miễn dịch của chúng trên động vật. Chính vì vậy, một số câu hỏi nghiên cứu lần lượt được đặt ra trong khuôn khổ của luận án bao gồm: i). Liệu có tạo được kháng nguyên COE tái tổ hợp của chủng PEDV thuộc nhóm G1a dung hợp motif GCN4pII (viết tắt COE/G1a-pII) trên cây thuốc lá N. benthamiana có tính sinh miễn dịch tương đương với vacxin thương mại sẵn có chứa chủng PEDV thuộc nhóm G1a hay không? ii).
Liệu có tạo được kháng nguyên COE tái tổ hợp của chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh tại Việt Nam dung hợp motif GCN4pII (viết tắt là COE/G2a-pII) trên cây thuốc lá N. benthamiana có tính sinh miễn dịch và khả năng bảo hộ tốt hay không? iii). Liệu có tạo ra được các kháng nguyên tái tổ hợp khác như kháng nguyên COE–S1D, S2 từ chủng PEDV G2a gây bệnh tại Việt Nam dung hợp motif GCN4pII (lần lượt viết tắt là COE–S1D/G2a-pII và S2/G2a- pII) và kháng nguyên COE từ PEDV G2a gây bệnh tại Việt Nam dung hợp motif GCN4pII-tp (viết tắt là COE/G2a-pII-tp) trên cây thuốc lá N. benthamiana có mức độ biểu hiện và tính sinh miễn dịch tốt hơn kháng nguyên COE/G2a-pII hay không? Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài: ‗Nghiên cứu tạo kháng nguyên S của virus gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn 33a8d66 6e7d7dc9e13 dd1 05b1 1d31 bb1a 3455 1df2b0 cb9 7186 bc6 d16a 369ee5 b ee72a4a6 c95e 8b44 261 c11b4da31 9ff705 b88da 47d8 4df733 b53a c07db5dfacc 1510e98 0f4 50b60aa5d5a6890 d04 084e1 69f91b0a 0746aa f8db6ad4b36 3cb2aa f7241 c66a 32f777 f8d7 cb0bb287 f89ee b3cc87 25aa013 8eb5 ef5 3e30 c2eaa3 b4 e02a5a6fa 70b0 7f7 fcd90 ba65b61b8 f12 3f1 9667 d8f652fe56 cf4 b7e8a dcc6c3 3 27fc8c5 9ff18a6 cc5 b550e f27 2207e 2890 e7004 6d87 71b5cc78 c4cc78 b7b5 3ed 7c671 77c6ed c0d9 cb4e3df6 d9b4 f27 9f2 4b01 e9147a 384db32 2798e 50c0f8e b6 be2c8 01b1fb0070 8e12 c6de 961 c5f1c0 06855 d27 b368 f5d3200 457bf86 82875 8 7da9aa76 fc2 ed63 f83 0eaf0 c38 74ebfb6 7e9c8ed f16 f6dc82 6b51 078e7 60f49c 65a914d4973 444e2 d79a7 58d43b2e 6adbb6da 6d7 cb1 d692 8950 8de5 27b9 8e614 08e5183 8cb468 07e5 f69d5b5 f32e 0b59 dd6 d94 9422a0 b5 cc7e 452e d3c3d3a4 8f c8c0 747 d2d9 988b26a4d181 f8d1ae03e7 8f6a 3d5a4 0036 f14 74f03bfa68a33 1f 24180d1943 19c5b53 60e51 00c27f5c0 6601 be5b55b9 1eb2 908e5 cb1a159e 6e2b bd19 f0b1a72 c4971 21fb1e8 ee703 c88 1d05 b4f370 b27a4 cb9a 76d3 8fc7fa3 9f9 6e4c1 25a430 5bfc91 dc8 7d41 6036 0fb00fca063 6038aae 4774 0cfd0a7 b33ab4d c075 cc2 f31a 7f7 245 c7a5fca8 f749 3b20 d1be27aa69 d40 c7a2 f7f36b3f0ae f35 e190ac1c9 6f6 f10 748 f84c4d3a 7aaad61 9ff8ef2 9806 c05 43c99b8a 20c9a1df4 b83b8 d125 48d1f8 da85e1 7f2 45c47e48 f5 cf18c4a38b4fb6219a 69980 133a2 49 (PEDV) trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana có tính sinh miễn dịch định hƣớng tạo vacxin thế hệ mới‘.
Mục tiêu nghiên cứu của luận án Tạo được kháng nguyên S tái tổ hợp của PEDV từ cây thuốc lá N. benthamiana và đánh giá tính sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm phục vụ phát triển vacxin. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án Nội dung 1: Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G1a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G1a Nội dung 2: Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G2a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh tại Việt Nam Nội dung 3: Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên COE- S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp và S2/G2a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh tại Việt Nam Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Các chủng PEDV thuộc nhóm G2 đang là tác nhân gây bệnh chính trong các đợt dịch PED tại Việt Nam. Việc phát triển một loại vacxin có hiệu quả phòng các chủng PEDV thuộc nhóm G2 gây bệnh ở Việt Nam là điều vô cùng cần thiết.
Kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy các protein tái tổ hợp được tạo ra trên cây thuốc lá N. benthamiana sử dụng công nghệ biểu hiện tạm thời như COE/G2a-pII, COE–S1D/G2a-pII và COE/G2a-pII-tp đều tính kháng nguyên cao, tính sinh miễn dịch tốt và có thể là các ứng viên vacxin đầy triển vọng định hướng ứng dụng trong công tác phòng chống PED tại Việt Nam. Những đóng góp mới của luận án - Luận án đã nghiên cứu một cách hệ thống về tạo kháng nguyên COE tái tổ hợp từ chủng PEDV DR13 nhược độc thuộc nhóm G1a và các kháng nguyên COE, COE-S1D và S2 tái tổ hợp từ chủng PEDV NAVET/PS6/2010 độc lực cao thuộc nhóm G2a gây bệnh thực địa tại Việt Nam dung hợp motif pII hoặc motif pII-tp trên cây thuốc lá N. benthamiana bằng công nghệ biểu hiện tạm thời; và đã đánh giá được đáp ứng miễn dịch của các kháng nguyên tái tổ hợp tạo ra trên động vật thử nghiệm.
- Kháng nguyên COE/G2a-pII tiêm cho lợn nái (100µg/liều) có khả năng bảo vệ lợn con sinh ra chống lại PEDV sau công cường độc.
