Tổng quan luận án

Bệnh tiêu chảy cấp ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea - PED) do virus PEDV (thuộc họ Coronaviridae) gây ra là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, lây lan trên đàn lợn ở mọi lứa tuổi và gây tỉ lệ tử vong từ 80% đến 100% ở lợn con dưới 7 ngày tuổi. Tại Việt Nam, dịch PED xuất hiện từ năm 2008 tại các tỉnh phía Nam và nhanh chóng lan rộng ra phạm vi cả nước. Các nghiên cứu phân lập giai đoạn 2015–2016 ghi nhận các chủng lưu hành thuộc các nhóm gen G1b, G2a và G2b; trong đó các chủng thuộc nhóm G2 độc lực cao là tác nhân gây thiệt hại kinh tế chủ yếu cho các cơ sở chăn nuôi lợn nái và lợn giống. Mặc dù các loại vacxin phòng PEDV truyền thống (nhược độc hoặc vô hoạt) đã được triển khai, phần lớn các chế phẩm thương mại lưu hành đều phát triển từ các chủng cổ điển thuộc nhóm gen G1a (như chủng DR13 hoặc SM98). Do sự sai khác trong cấu trúc hệ gen và các epitope trung hòa giữa chủng vacxin cổ điển và chủng thực địa biến chủng G2, hiệu quả bảo hộ thực tế của các vacxin này suy giảm rõ rệt.

Hệ thống biểu hiện tạm thời trên thực vật (Plant Molecular Farming thông qua Agrobacterium infiltration trên cây Nicotiana benthamiana) mang lại các ưu thế kỹ thuật về chi phí đầu tư, tốc độ sản xuất sinh khối protein tái tổ hợp và khả năng đáp ứng nhanh khi dịch bệnh bùng phát. Protein gai (Spike - S) của PEDV ở dạng homotrimer tự nhiên là kháng nguyên đích chủ yếu kích thích cơ thể sản sinh kháng thể trung hòa. Các vùng quyết định kháng nguyên chủ chốt bao gồm vùng COE (aa 499–638), vùng S1D (aa 636–789 chứa các epitope tế bào lympho B như SS2: aa 748–755 và SS6: aa 764–771) và tiểu phần S2 (aa 730–1383). Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng toàn bộ protein S hoặc tiểu đơn vị S1 biểu hiện trên thực vật thường đạt hàm lượng rất thấp (khoảng 0,005% protein hòa tan tổng số - TSP) hoặc không biểu hiện. Việc biểu hiện các tiểu phần kháng nguyên dạng monomer thường kém ổn định và có hiệu quả kích thích miễn dịch hạn chế. Do đó, khoảng trống nghiên cứu cốt lõi mà luận án giải quyết là thiết kế, biểu hiện và đánh giá đặc tính sinh học của các cấu trúc kháng nguyên dung hợp motif tạo trimer (GCN4-pII) và motif tạo polymer (tp của IgM) trên cây N. benthamiana, hướng đến phát triển ứng viên vacxin tiểu đơn vị thế hệ mới có tính sinh miễn dịch cao chống lại các chủng PEDV nhóm G2 lưu hành tại Việt Nam.

Mục tiêu tổng quát của luận án là tạo được các kháng nguyên S tái tổ hợp của virus PEDV trên hệ thống cây thuốc lá N. benthamiana và đánh giá tính sinh miễn dịch của chúng trên động vật thí nghiệm phục vụ phát triển vacxin.

Các câu hỏi nghiên cứu được luận án đặt ra và giải quyết bao gồm:

  1. Liệu có tạo được kháng nguyên COE tái tổ hợp của chủng PEDV thuộc nhóm G1a dung hợp motif GCN4pII (viết tắt COE/G1a-pII) trên cây thuốc lá N. benthamiana có tính sinh miễn dịch tương đương với vacxin thương mại sẵn có chứa chủng PEDV thuộc nhóm G1a hay không?
  2. Liệu có tạo được kháng nguyên COE tái tổ hợp của chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh tại Việt Nam dung hợp motif GCN4pII (viết tắt là COE/G2a-pII) trên cây thuốc lá N. benthamiana có tính sinh miễn dịch và khả năng bảo hộ tốt hay không?
  3. Liệu có tạo ra được các kháng nguyên tái tổ hợp khác như kháng nguyên COE–S1D, S2 từ chủng PEDV G2a gây bệnh tại Việt Nam dung hợp motif GCN4pII (lần lượt viết tắt là COE–S1D/G2a-pII và S2/G2a-pII) và kháng nguyên COE từ PEDV G2a gây bệnh tại Việt Nam dung hợp motif GCN4pII-tp (viết tắt là COE/G2a-pII-tp) trên cây thuốc lá N. benthamiana có mức độ biểu hiện và tính sinh miễn dịch tốt hơn kháng nguyên COE/G2a-pII hay không?

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Đoạn gen mã hóa các vùng kháng nguyên COE của chủng PEDV DR13 (nhóm G1a), vùng kháng nguyên COE, COE–S1D và tiểu phần S2 của chủng PEDV NAVET/PEDV/PS6/2010 (nhóm G2a phân lập tại Việt Nam); cây thuốc lá Nicotiana benthamiana; chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens AGL1; dòng tế bào Vero; động vật thí nghiệm bao gồm chuột nhắt trắng (Balb/c), lợn nái mang thai và lợn con.
  • Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), phối hợp cùng Công ty Cổ phần Thuốc thú y Trung ương NAVETCO, Công ty CNC, Học viện Nông nghiệp Việt Nam và Viện Nghiên cứu Di truyền Thực vật và Cây trồng Leibniz (IPK, CHLB Đức). Dữ liệu nghiên cứu, khảo sát dịch tễ và thực nghiệm được hoàn thành và bảo vệ năm 2023.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Dịch tiêu chảy cấp ở lợn được ghi nhận lần đầu tại Anh và Bỉ vào năm 1970, sau đó bùng phát tại Nhật Bản, Hàn Quốc trong thập niên 1980–1990. Tháng 4/2013, PEDV xâm nhập vào Mỹ và lây lan qua 31 tiểu bang, gây chết gần 7 triệu con lợn (khoảng 10% tổng đàn) và thiệt hại hơn 440 triệu USD. Tại Châu Âu, dịch bùng phát trở lại ở Đức (2014) với tỉ lệ chết lên tới 70%, tiếp tục xuất hiện tại Slovenia (2015), Ukraine, Áo, Pháp, Hà Lan, Bồ Đào Nha. Tại Châu Á, PED gây thiệt hại nghiêm trọng tại Trung Quốc (giai đoạn 2010–2012 làm chết hơn 50.000 lợn sơ sinh), Hàn Quốc, Nhật Bản, Philippines, Thái Lan và Việt Nam.

Tại Việt Nam, sau các đợt dịch đầu tiên năm 2008–2010 tại miền Đông Nam Bộ (tỉ lệ mắc bệnh ở lợn sơ sinh đạt 93,94%, tỉ lệ tử vong 81,67%), dịch bệnh lan ra các tỉnh phía Bắc và miền Trung giai đoạn 2013–2015 (Đồng Văn Quyền và CS, Nguyễn Bá Hiên và CS). Khảo sát của các nhóm tác giả ghi nhận tỉ lệ mẫu phân/ruột dương tính với PEDV đạt 38,51% tại Quảng Trị, Thái Bình, Thái Nguyên (2013–2014); 40,63% mẫu dương tính tại Bắc Giang (Trần Đức Hoàn và CS, 2021); và 14,56% lợn mắc bệnh với tỉ lệ chết 53,38% tại Thanh Hóa (Hoàng Văn Sơn và CS, 2020).

Về nghiên cứu phát triển vacxin thực vật phòng PEDV trên thế giới, các hướng tiếp cận chính tập trung vào biểu hiện tiểu phần COE hoặc S1:

Tác giả / Tài liệu Đối tượng thực vật Kháng nguyên biểu hiện Phương thức biểu hiện Mức độ tích lũy
Kang et al. [12] Thuốc lá COE Chuyển gen ổn định 10 mg/kg lá tươi
Kang et al. [13] Thuốc lá không nicotine COE Chuyển gen ổn định 2,1% TSP
Bae et al. [115] Khoai tây COE Chuyển gen ổn định 0,1% TSP
Oszvald et al. [118] Hạt ngô COE Chuyển gen ổn định 0,122% TSP
Jani et al. [120] Thuốc lá COE-LTB Chuyển gen ổn định 1,6% TSP
Huy et al. [11] Mô sẹo lúa COE-Co1 Chuyển gen ổn định 0,083% TSP
Park et al. [124] Ngô S1-LTB / S1-DCpep Chuyển gen ổn định 20 mg/kg
Ho et al. [125] Thuốc lá COE-PIGS (Polymer IgG-Fc) Biểu hiện tạm thời 0,74% TSP
Spencer et al. [19] Thuốc lá S-ELP / M-ELP / N-ELP / E-ELP Biểu hiện tạm thời S-ELP không biểu hiện
Chen et al. [18] Thuốc lá VLP (S+M+E) Biểu hiện tạm thời Tích lũy thấp

Các nghiên cứu trước đây chủ yếu sử dụng cây chuyển gen ổn định (thời gian thu hồi sinh khối kéo dài, hàm lượng biểu hiện thấp) hoặc biểu hiện các monomer phân tán, chưa đánh giá đầy đủ tính sinh miễn dịch bảo hộ trên lợn chống lại các chủng thực địa G2. Tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ sinh học phối hợp với Viện IPK Gatersleben (CHLB Đức) đã từng bước làm chủ công nghệ biểu hiện tạm thời trên N. benthamiana để sản xuất kháng nguyên virus cúm A/H5N1, A/H7N9 và PRRSV dung hợp motif GCN4-pII và tp (Phan Trọng Hoàng, Udo Conrad, Phùng Hồ Hải). Tuy nhiên, đối với virus PEDV, chưa có công trình nào trong nước và quốc tế nghiên cứu biểu hiện các tiểu phần COE, COE–S1D và S2 có nguồn gốc từ chủng PEDV nhóm G2a dung hợp các motif đa phân tử hóa (pII, pII-tp) trên cây thuốc lá và kiểm chứng khả năng bảo hộ trên động vật chủ (lợn nái và lợn con). Luận án của NCS Hồ Thị Thương được định vị nhằm giải quyết toàn diện khoảng trống công nghệ và thực tiễn này.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

  • Cấu trúc sinh học của Protein S và cơ chế trung hòa: Protein S của PEDV (1383 aa, 180–220 kDa) thuộc nhóm glycoprotein cấu trúc homotrimer màng loại I, chịu trách nhiệm gắn kết thụ thể tế bào chủ và hòa màng. Tiểu phần S1 (aa 1–729) chứa các epitope nhận diện bởi tế bào lympho B gồm NTD/S0 (aa 19–220), vùng trung hòa chính COE (aa 499–638) và vùng S1D (aa 636–789 chứa motif SS2 và SS6). Tiểu phần S2 (aa 730–1383) chứa vùng hòa màng và các epitope bảo tồn (aa 744–759, 747–774, 756–771, 1371–1377).
  • Cơ chế trimer hóa qua motif GCN4-pII: GCN4 là yếu tố phiên mã của nấm men. Motif nhân tạo GCN4-pII gồm chuỗi 32 amino acid (từ Arg1 đến Glu32), được thiết kế với lõi kỵ nước hoàn toàn từ các gốc phân nhánh beta (Ile, Val), có khả năng thúc đẩy quá trình hình thành cấu trúc trimer bền vững, tăng độ hòa tan và độ ổn định của các protein dung hợp.
  • Cơ chế đa phân tử hóa (polymerization) qua motif tp của IgM: Mảnh đuôi tp (tailpiece) là đoạn peptid ngắn gồm 18 amino acid (PTLYNVSLVMSDTAGTCY) nằm ở đầu C của chuỗi nặng IgM. Sự tương tác và liên kết disulfide qua gốc Cys575 kích hoạt quá trình tự lắp ráp các monomer thành dạng oligomer bậc cao (pentamer/hexamer), giúp tăng cường ái lực kháng nguyên và hiệu quả trình diện miễn dịch.
  • Khung vector biểu hiện thực vật: Sử dụng vector pCB301 (dẫn xuất từ pRTRA) mang promoter đôi CaMV 35S, trình tự tăng cường dịch mã TOL (đầu 5' không dịch mã của TMV), peptide tín hiệu định vị mạng lưới nội chất, thẻ tinh sạch His-tag, thẻ nhận diện c-myc và tín hiệu lưu giữ mạng lưới nội chất KDEL ở đầu C.
[Promoter 35S] -- [TOL] -- [Signal Peptide] -- [Kháng nguyên S (COE / COE-S1D / S2)] -- [Linker] -- [GCN4-pII / pII-tp] -- [6xHis] -- [c-myc] -- [KDEL]

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

+-----------------------------------------------------------------------------------+
|                        QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN                           |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
                                          |
  [Tách dòng gen S từ PEDV G1a (DR13) & G2a (NAVET/PS6/2010)] 
                                          |
  [Thiết kế vector biểu hiện pCB301 tái tổ hợp & Biến nạp vào A. tumefaciens AGL1]
                                          |
  [Biểu hiện tạm thời trên lá N. benthamiana (Tối ưu tuổi cây, OD600, ngày thu hoạch)]
                                          |
  [Thu hồi, tinh sạch bằng IMAC (Ni-Sepharose) & Phân tích cấu trúc (SEC, SDS-PAGE, BS3)]
                                          |
  +---------------------------------------+---------------------------------------+
  |                                       |                                       |
[Thử nghiệm trên chuột Balb/c]   [Thử nghiệm trên lợn nái chửa]    [Thử nghiệm trên lợn con]
- Đo IgG, IgA, IgM (ELISA)       - Tiêm COE/G2a-pII (100 µg)       - Tiêm COE-S1D/G2a-pII (50 µg)
- Kháng thể trung hòa (VNT)      - Đo IgG, IgA, VNT, IFN-gamma     - So sánh với vacxin thương mại
- Định lượng cytokine IFN-gamma  - Công cường độc lợn con (G2a)   - Đo IgG, IgA, VNT, IFN-gamma
  • Sinh học phân tử và di truyền: Tách chiết ARN virus, tổng hợp cDNA, khuếch đại gen bằng RT-PCR/PCR với hệ thống mồi đặc hiệu; nhân dòng trong E. coli G10; chuyển vector vào A. tumefaciens AGL1 bằng phương pháp biến nạp xung điện.
  • Kỹ thuật sinh học thực vật và biểu hiện: Nuôi trồng cây N. benthamiana bằng hệ thống thủy canh trong điều kiện kiểm soát; tiêm thấm huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens mang cấu trúc gen đích kết hợp chủng mang vector hỗ trợ pMON65305/Hc-Pro (ức chế cơ chế câm lặng gen); khảo sát tối ưu hóa các thông số: tuổi cây (4–7 tuần), mật độ tế bào vi khuẩn ($OD_{600}$ từ 0,4 đến 1,2), thời gian thu hoạch lá (4–8 ngày sau biến nạp - dpi).
  • Kỹ thuật hóa sinh và phân tích protein: Chiết xuất protein hòa tan tổng số (TSP); tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực kim loại cố định IMAC (cột Ni-Sepharose) với dải nồng độ imidazole rửa giải (10, 15, 20, 25 và 250 mM); sắc ký lọc gel (Size Exclusion Chromatography - SEC) để phân tách các phân đoạn kích thước; phản ứng liên kết chéo với chất cộng hóa trị $BS^3$ (Bis[sulfosuccinimidyl] suberate); điện di biến tính SDS-PAGE, điện di không biến tính Native-PAGE; lai Western blot sử dụng kháng thể kháng c-myc hoặc huyết thanh động vật đặc hiệu.
  • Kỹ thuật đánh giá miễn dịch học in vivo và in vitro:
    • Thí nghiệm trên chuột: Tiêm bắp các kháng nguyên tái tổ hợp (phối hợp chất bổ trợ Freund hoặc Emulsigen-D) theo phác đồ đa liều; thu huyết thanh tại các ngày quy định; đo hiệu giá IgG, IgA, IgM đặc hiệu PEDV bằng ELISA gián tiếp; định lượng cytokine IFN-$\gamma$ bằng bộ kit ELISA thương mại.
    • Thí nghiệm trung hòa virus trên tế bào (VNT): Nuôi cấy virus PEDV (chủng DR13, SM98, NAVET/PS6/2010) trên tế bào Vero; ủ huyết thanh pha loãng bậc 2 với $100\ TCID_{50}$ virus; đánh giá hiệu giá kháng thể trung hòa qua sự xuất hiện bệnh lý tế bào (CPE).
    • Thí nghiệm trên lợn nái mang thai và thử thách công cường độc trên lợn con: Tiêm bắp kháng nguyên COE/G2a-pII (100 $\mu g$/liều) cho lợn nái ở các thời điểm trước khi sinh; thu mẫu máu và sữa non; theo dõi đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào; lợn con sinh ra được công cường độc với chủng PEDV G2a độc lực cao; theo dõi điểm số phân (mức độ tiêu chảy), điểm lâm sàng, biến động khối lượng và tỉ lệ sống sót.
    • Thí nghiệm trên lợn con: Tiêm bắp kháng nguyên COE–S1D/G2a-pII (50 $\mu g$/liều) kết hợp chất bổ trợ Emulsigen-D; so sánh đối chứng với vacxin thương mại Corning (Wuhan Keqian Biology).
  • Phương pháp xử lý thống kê: Số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phần mềm phân tích thống kê, so sánh sự sai khác giữa các lô thí nghiệm bằng phân tích phương sai (ANOVA) và phép thử t-test với mức ý nghĩa $p < 0,05$.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở khoa học về dịch bệnh PED, đặc điểm sinh học phân tử của virus PEDV và các chiến lược phát triển vacxin. Chương này trình bày chi tiết về cấu trúc hệ gen 28 kb gồm 7 ORF, cơ chế chức năng của các protein cấu trúc (S, E, M, N) và phi cấu trúc (ORF1a, ORF1b, ORF3). Trọng tâm chương phân tích sâu cấu trúc protein gai S dạng homotrimer (1383 aa), phân bố các vùng epitope trung hòa trên tiểu phần S1 (đặc biệt là vùng COE aa 499–638 và S1D aa 636–789) và tiểu phần S2. Chương 1 cũng phân tích lịch sử tiến hóa và dịch tễ học phân tử của các phân nhóm gen PEDV trên thế giới và tại Việt Nam, làm rõ sự chuyển dịch từ nhóm G1 cổ điển sang nhóm G2 độc lực cao. Đồng thời, chương đánh giá toàn diện các hệ thống biểu hiện vacxin tiểu đơn vị từ thực vật, cơ chế tự lắp ráp trimer của motif xoắn GCN4-pII và cơ chế hình thành polymer bậc cao nhờ peptide tp của chuỗi nặng IgM, xác lập cơ sở lý thuyết cho các thiết kế cấu trúc tái tổ hợp trong luận án.

Chương 2. Vật liệu và phương pháp

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc chủng vi sinh vật (E. coli G10, A. tumefaciens AGL1), tế bào Vero, các chủng virus chuẩn (DR13, SM98) và chủng thực địa độc lực cao NAVET/PEDV/PS6/2010 do Công ty NAVETCO cung cấp. Chương này liệt kê danh mục mồi khuếch đại gen S và các tiểu phần, thiết kế chi tiết hệ thống vector biểu hiện pCB301 mang các cấu trúc dung hợp đích. Toàn bộ quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa: từ kỹ thuật gieo trồng và chăm sóc cây thuốc lá N. benthamiana thủy canh, phương pháp tiêm thấm vi khuẩn (agro-infiltration), tối ưu hóa điều kiện biểu hiện, quy trình chiết xuất và tinh sạch protein tái tổ hợp bằng sắc ký IMAC/SEC, đến các phản ứng hóa sinh xác định trạng thái đa phân tử (BS3 cross-linking). Phần cuối chương quy định chặt chẽ quy trình bố trí thí nghiệm miễn dịch học trên động vật (chuột Balb/c, lợn nái chửa, lợn con), quy trình công cường độc virus in vivo và các phương pháp thống kê sinh học xử lý dữ liệu.

Chương 3. Kết quả và thảo luận

1. Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G1a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G1a

Tác giả đã thiết kế thành công vector biểu hiện pCB301 mang gen mã hóa kháng nguyên COE của chủng PEDV DR13 dung hợp motif GCN4-pII. Kháng nguyên COE/G1a-pII được biểu hiện tạm thời thành công trong lá cây N. benthamiana. Phân tích dịch chiết bằng Western blot với kháng thể kháng c-myc và điện di SDS-PAGE cho thấy protein có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết. Sau khi tinh sạch qua cột Ni-Sepharose (IMAC), sản phẩm đạt độ tinh khiết cao. Thử nghiệm liên kết chéo với hóa chất $BS^3$ kết hợp điện di không biến tính (Native-PAGE) và Western blot đã chứng minh kháng nguyên COE/G1a-pII tồn tại chủ yếu ở dạng cấu trúc trimer bền vững tương tự như cấu trúc tự nhiên trên bề mặt virion. Thử nghiệm tiêm bắp trên chuột nhắt trắng Balb/c chứng minh kháng nguyên COE/G1a-pII kích thích sinh đáp ứng kháng thể IgG, IgA và IgM đặc hiệu PEDV cao trong huyết thanh (đo bằng ELISA và Western blot), đồng thời huyết thanh chuột có khả năng trung hòa virus PEDV chủng DR13 trên mô hình nuôi cấy tế bào Vero.

2. Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G2a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh tại Việt Nam

Tác giả đã tách dòng toàn bộ gen mã hóa protein S từ chủng thực địa NAVET/PEDV/PS6/2010 và thiết kế cấu trúc vector pCB301-COE/G2a-pII. Quá trình tối ưu hóa điều kiện biểu hiện trên cây thuốc lá N. benthamiana thủy canh xác định các thông số tối ưu: tuổi cây 5–6 tuần, mật độ dịch khuẩn biến nạp $OD_{600} = 0,8 - 1,0$, và thời điểm thu hoạch lá ở ngày thứ 6 sau tiêm thấm (6 dpi). Quá trình tinh sạch IMAC được tối ưu hóa với nồng độ imidazole trong đệm rửa từ 15–20 mM, giúp loại bỏ triệt để protein tạp của cây chủ trước khi rửa giải bằng imidazole 250 mM. Phân tích sắc ký lọc gel SEC và phản ứng liên kết chéo $BS^3$ xác nhận kháng nguyên COE/G2a-pII tự lắp ráp thành dạng trimer đồng nhất.

Thử nghiệm gây miễn dịch trên lợn nái mang thai (tiêm bắp 100 $\mu g$ kháng nguyên/liều) cho kết quả:

  • Lợn nái sau tiêm sản sinh hàm lượng kháng thể IgG và IgA đặc hiệu PEDV cao trong huyết thanh và sữa non.
  • Nồng độ cytokine IFN-$\gamma$ trong huyết thanh lợn nái tăng có ý nghĩa thống kê, chứng minh sự kích hoạt đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào.
  • Huyết thanh và sữa non của lợn nái tiêm chủng thể hiện hiệu giá kháng thể trung hòa cao đối với chủng PEDV G2a độc lực cao.
  • Kết quả thử thách công cường độc trên lợn con: Lợn con sinh ra từ lợn nái được tiêm COE/G2a-pII sau khi công cường độc với liều gây chết của chủng PEDV NAVET/PS6/2010 đã biểu hiện triệu chứng lâm sàng nhẹ, điểm số phân tiêu chảy giảm rõ rệt, duy trì mức tăng khối lượng cơ thể ổn định và đạt tỉ lệ sống sót cao vượt trội so với lô đối chứng không tiêm phòng.

3. Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên COE–S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp và S2/G2a-pII tái tổ hợp

Để nâng cao hiệu quả bảo hộ, tác giả tiếp tục thiết kế và biểu hiện thành công 3 cấu trúc kháng nguyên mới từ chủng PEDV G2a:

  • COE/G2a-pII-tp: Dung hợp thêm đoạn peptide tp (18 aa) ở đầu C giúp kháng nguyên chuyển đổi từ dạng trimer sang dạng oligomer bậc cao (polymer), làm tăng đáng kể độ ổn định và khả năng nhận diện miễn dịch.
  • COE–S1D/G2a-pII: Mở rộng vùng kháng nguyên từ aa 499 đến aa 789, tích hợp thêm vùng S1D chứa hai epitope nhận diện bởi tế bào B quan trọng là SS2 và SS6.
  • S2/G2a-pII: Biểu hiện tiểu phần S2 (aa 730–1324) chứa các vùng hòa màng và epitope trung hòa bảo tồn cao.

Tất cả các kháng nguyên đều biểu hiện thành công trên lá N. benthamiana và được tinh sạch bằng IMAC. Mức độ tích lũy và hiệu suất thu hồi của các kháng nguyên tái tổ hợp từ lá cây thuốc lá được tổng hợp trong bảng dưới đây:

Kháng nguyên tái tổ hợp Mức độ tích lũy (% TSP) Trọng lượng phân tử lý thuyết (kDa) Trạng thái cấu trúc đa phân tử Hiệu suất thu hồi sau IMAC ($\mu g/g$ lá tươi)
COE/G1a-pII ~1,2 – 1,5% ~23 kDa (monomer) Trimer (~69 kDa) 45 – 55
COE/G2a-pII ~1,4 – 1,8% ~23 kDa (monomer) Trimer (~69 kDa) 50 – 65
COE/G2a-pII-tp ~1,6 – 2,1% ~25 kDa (monomer) Oligomer / Polymer (>150 kDa) 60 – 75
COE–S1D/G2a-pII ~0,8 – 1,2% ~39 kDa (monomer) Trimer (~117 kDa) 35 – 48
S2/G2a-pII ~0,5 – 0,9% ~74 kDa (monomer) Trimer (~222 kDa) 20 – 32

Đánh giá tính sinh miễn dịch trên chuột và lợn con:

  • Thử nghiệm trên chuột cho thấy cả 3 cấu trúc kháng nguyên nhóm G2 đều kích thích mạnh mẽ sự sinh sản kháng thể IgG, IgA, IgM, cytokine IFN-$\gamma$ và kháng thể trung hòa PEDV. Cấu trúc COE/G2a-pII-tp cho đáp ứng miễn dịch cao hơn cấu trúc trimer COE/G2a-pII.
  • Thử nghiệm trên lợn con: Kháng nguyên COE–S1D/G2a-pII (liều 50 $\mu g$/con) phối hợp với chất bổ trợ Emulsigen-D kích thích sinh đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu PEDV mạnh hơn, đồng thời tạo hàm lượng kháng thể IgA, IFN-$\gamma$ và hiệu giá kháng thể trung hòa PEDV tương đương với vacxin thương mại Corning (Wuhan Keqian Biology).

Kết quả và những đóng góp mới

  • Đóng góp mới về mặt khoa học: Luận án là công trình đầu tiên nghiên cứu một cách hệ thống và toàn diện việc ứng dụng công nghệ biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana để sản xuất các cấu trúc kháng nguyên đa phân tử (trimer hóa qua GCN4-pII và polymer hóa qua GCN4-pII-tp) của các tiểu phần protein S (COE G1a, COE G2a, COE–S1D G2a, S2 G2a) từ virus PEDV. Nghiên cứu đã chứng minh về mặt cấu trúc sinh học rằng việc dung hợp motif GCN4-pII và peptide tp cho phép tái tạo chính xác cấu trúc trimer tự nhiên và oligomer bậc cao của protein S, khắc phục hoàn toàn hiện tượng biểu hiện kém hoặc không biểu hiện của protein S toàn phần trên thực vật.
  • Đóng góp mới về mặt thực tiễn:
    • Chứng minh kháng nguyên COE/G2a-pII (100 $\mu g$/liều) tiêm cho lợn nái mang thai có khả năng truyền kháng thể thụ động qua sữa non, bảo vệ lợn con sinh ra chống lại sự lây nhiễm và gây chết của chủng virus PEDV G2a độc lực cao lưu hành tại Việt Nam.
    • Chứng minh kháng nguyên COE–S1D/G2a-pII (50 $\mu g$/liều) kết hợp chất bổ trợ Emulsigen-D tiêm cho lợn con kích thích sinh miễn dịch dịch thể (IgG, IgA) và kháng thể trung hòa tương đương vacxin thương mại Corning (Wuhan Keqian Biology).
    • Tạo tiền đề công nghệ sinh học thực vật (Plant Molecular Farming) hoàn chỉnh, phục vụ sản xuất vacxin tiểu đơn vị thế hệ mới phòng chống dịch PED tại Việt Nam với chi phí thấp và khả năng đáp ứng nhanh.
  • Kiến nghị và đề xuất: Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất ở quy mô lớn hơn, nghiên cứu các công thức chất bổ trợ đường uống hoặc niêm mạc ruột nhằm tăng cường kháng thể sIgA cục bộ, và tiếp tục khảo sát hiệu lực bảo hộ chéo trên các biến chủng thực địa khác nhau.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của luận án: Các thử nghiệm công cường độc virus in vivo trên lợn con mới chỉ được thực hiện trên quy mô đàn nhỏ trong điều kiện kiểm soát phòng thí nghiệm; chưa tiến hành thử thách công cường độc trực tiếp trên mô hình lợn con tiêm kháng nguyên COE–S1D/G2a-pII. Quy trình tinh sạch hiện tại sử dụng sắc ký ái lực kim loại IMAC thông qua thẻ His-tag, phù hợp cho quy mô nghiên cứu nhưng cần giải pháp tinh sạch không thẻ (tag-free) hoặc tối ưu hóa sử dụng dịch chiết thực vật thô an toàn cho quy mô công nghiệp thương mại.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:
    • Nâng quy mô nuôi trồng cây thuốc lá và chiết xuất protein tái tổ hợp ở quy mô pilot/công nghiệp.
    • Đánh giá tính ổn định lý hóa, độ bền nhiệt và hạn sử dụng của các chế phẩm vacxin thực vật dạng dịch hoặc dạng đông khô.
    • Mở rộng thử nghiệm lâm sàng diện rộng trên các đàn lợn thực địa tại nhiều vùng dịch tễ khác nhau để đánh giá khả năng bảo hộ chéo giữa các phân nhóm PEDV G1 và G2.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo giá trị cho nhiều đối tượng trong lĩnh vực công nghệ sinh học và thú y:

  • Nghiên cứu sinh và học viên cao học: Tham khảo quy trình thiết kế vector biểu hiện thực vật mang các motif dung hợp tạo cấu trúc đa phân tử (GCN4-pII, IgM-tp), kỹ thuật biểu hiện tạm thời qua Agrobacterium infiltration, và phương pháp phân tích hóa sinh protein (SEC, $BS^3$ cross-linking, Native-PAGE).
  • Giảng viên và nhà nghiên cứu chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học, Thú y học: Nguồn tư liệu chuyên sâu về sinh học phân tử virus PEDV, dịch tễ học các chủng PEDV tại Việt Nam, và phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch (ELISA, VNT trên tế bào Vero, định lượng cytokine, thử thách công cường độc in vivo).
  • Các nhà sản xuất vacxin và nhà hoạch định chính sách thú y: Cung cấp cơ sở khoa học và dữ liệu thực chứng để phát triển các dây chuyền sản xuất sinh dược phẩm thú y từ thực vật, chủ động nguồn vacxin phòng chống dịch PED phù hợp với các biến chủng virus thực địa tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao luận án không biểu hiện toàn bộ protein S tự nhiên của PEDV mà lựa chọn biểu hiện các tiểu phần COE, COE–S1D và S2 dung hợp motif GCN4-pII trên cây thuốc lá? Toàn bộ protein S của PEDV có kích thước phân tử lớn (1383 aa, 180–220 kDa) và cấu trúc phức tạp với hơn 29 vị trí N-glycosyl hóa. Các công bố quốc tế trước đây đã chỉ ra rằng biểu hiện protein S toàn phần trên cây N. benthamiana thường không biểu hiện hoặc chỉ đạt mức tích lũy cực kỳ thấp (~0,005% TSP), không khả thi cho sản xuất. Việc lựa chọn các tiểu phần chứa epitope trung hòa then chốt (COE, S1D, S2) dung hợp với motif GCN4-pII giúp phân tử tự lắp ráp thành cấu trúc trimer tương tự trạng thái tự nhiên, nâng cao đáng kể mức độ biểu hiện (đạt tới 1,2–2,1% TSP), độ hòa tan và tính sinh miễn dịch.

2. Vai trò cấu trúc và chức năng của motif GCN4-pII và peptide tp của IgM trong các kháng nguyên tái tổ hợp là gì? Motif GCN4-pII (32 amino acid) sở hữu lõi kỵ nước cấu tạo từ các gốc phân nhánh beta, có vai trò kích hoạt và ổn định quá trình trimer hóa của các protein dung hợp, giúp protein tái tổ hợp bắt chước hình thái trimer của protein gai virus tự nhiên. Trong khi đó, peptide tp (18 amino acid ở đuôi chuỗi nặng IgM) chứa gốc Cys575 tạo liên kết disulfide liên phân tử, giúp định hướng các trimer tự lắp ráp thành phức hợp oligomer/polymer bậc cao (tương tự pentamer IgM), từ đó gia tăng độ bền phân tử và tăng cường ái lực tương tác với tế bào trình diện kháng nguyên.

3. Hiệu quả bảo hộ của kháng nguyên COE/G2a-pII trên lợn nái và lợn con được chứng minh qua những chỉ số thực nghiệm nào? Thử nghiệm trên lợn nái mang thai (tiêm 100 $\mu g$/liều) ghi nhận sự gia tăng vượt trội của kháng thể IgG, IgA đặc hiệu PEDV và cytokine IFN-$\gamma$ trong huyết thanh cũng như sữa non, cùng hiệu giá kháng thể trung hòa cao đối với chủng PEDV G2a. Khi lợn con sinh ra được công cường độc với chủng PEDV NAVET/PS6/2010 độc lực cao, lợn con bú sữa mẹ tiêm phòng có điểm phân tiêu chảy thấp, triệu chứng lâm sàng nhẹ, duy trì tăng trọng bình thường và đạt tỉ lệ sống sót cao vượt bậc so với lô đối chứng lợn con tử vong do tiêu chảy mất nước nghiêm trọng.

4. Kháng nguyên COE–S1D/G2a-pII biểu hiện trên cây thuốc lá khi tiêm cho lợn con có ưu thế gì so với vacxin thương mại? Kháng nguyên COE–S1D/G2a-pII (50 $\mu g$/liều) khi phối hợp chất bổ trợ Emulsigen-D tiêm bắp cho lợn con đã kích thích tạo hàm lượng kháng thể IgG đặc hiệu PEDV cao hơn có ý nghĩa thống kê so với vacxin thương mại Corning (Wuhan Keqian Biology), đồng thời tạo nồng độ kháng thể IgA, cytokine IFN-$\gamma$ và hiệu giá kháng thể trung hòa virus tương đương với vacxin thương mại. Cấu trúc này tích hợp cả vùng COE và hai epitope lympho B (SS2, SS6), giúp mở rộng phổ nhận diện kháng nguyên đặc hiệu cho các chủng PEDV G2a thực địa.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Hồ Thị Thương đã phát triển thành công quy trình công nghệ tạo các kháng nguyên S đa phân tử tái tổ hợp (COE G1a, COE G2a, COE–S1D G2a, COE-tp G2a và S2 G2a) của virus PEDV trên hệ thống thực vật Nicotiana benthamiana bằng phương pháp biểu hiện tạm thời. Việc dung hợp các motif cấu trúc GCN4-pII và peptide tp đã giải quyết thành công bài toán về độ ổn định, mức độ tích lũy và tính sinh miễn dịch của kháng nguyên gai virus. Các kết quả thử nghiệm trên chuột, lợn nái mang thai và lợn con khẳng định các protein tái tổ hợp tạo ra có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể, miễn dịch qua trung gian tế bào và bảo hộ lợn con chống lại chủng PEDV G2a độc lực cao lưu hành tại Việt Nam. Công trình là bước tiến khoa học quan trọng, cung cấp nền tảng vật liệu và công nghệ triển vọng cho việc sản xuất vacxin tiểu đơn vị thế hệ mới phòng chống dịch PED tại Việt Nam.