CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ E. COLI GÂY BỆNH Ở LỢN 1.
Tình hình nghiên cứu ở trong nước Ở Việt Nam, vai trò gây bệnh tiêu chảy do E. coli ở lợn đã xuất hiện đã được khẳng định trong nghiên cứu của Đào Trọng Đạt và cs (1995). Một số yếu tố độc lực chính của vi khuẩn E. coli đã được nhiều tác giả nghiên cứu như Lý Thị Liên Khai (2001), Lê Văn Dương và cs, (2010).
Đỗ Ngọc Thúy và cs, (2004) cho biết vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy thường mang kháng nguyên F4, F18, độc tố đường ruột STb là chủ yếu và thuộc các nhóm O149, O139, O138, O141, O1, O86, O111, O55, O26, O8, O64. Các yếu tố gây bệnh thường gặp là F4/STb/LT, F4/STa/STb, F4/Sta/STb/LT, F18/Sta/STb/LT, F18/Sta/STb, F18/Sta/LT. Nghiên cứu của Hồ Soái và Đinh Thị Bích Lân (2005), cho thấy kết quả kiểm tra độc lực 5 chủng E.
coli từ phân lợn bị tiêu chảy ở Quảng Trị cho thấy 4 chủng gây chết 100% chuột, chiếm tỷ lệ 80% và 1 chủng gây chết 50% chuột, chiếm tỷ lệ 20%. Cùng thời gian đó, tác giả Trương Quang (2005), khi tiến hành kiểm tra độc lực của 30 chủng E. coli phân lập được từ phân của lợn 1 đến 60 ngày tuổi bị tiêu chảy cho kết quả như sau: 27 chủng E. coli (chiếm 90%) giết chết 100% số chuột thí nghiệm và 3 chủng (chiếm 10%) giết chết 50% số chuột thí nghiệm sau thời gian từ 24-72 giờ.
Một nghiên cứu khác của Vũ Khắc Hùng và cs, (2015) đã tiến hành nghiên cứu chế tạo thành công vắc xin tái tổ hợp phòng hai bệnh phù đầu và và phó thương hàn lợn. Kết quả nghiên cứu lợn sau khi tiêm vắc xin với thành phần kháng nguyên Salmonella và E. coli đều có tác dụng bảo hộ tốt, đạt tiêu chuẩn cơ sở. Bằng phương pháp PCR, Vũ Khắc Hùng và cs, (2005) xác định được tỷ lệ sinh độc tố STa, LT và VT2a lần lượt là 24%, 20%, 4,5% từ 216 chủng lợn con sau cai sữa.
Phần lớn các chủng sinh độc tố đều mang yếu tố bám dính. Đỗ Ngọc Thúy và cs, (2002) đã xác định đặc tính kháng nguyên và vai trò gây bệnh của E. coli gây tiêu chảy ở lợn cho thấy, trong tổng số 170 chủng được kiểm tra, các chủng có mang tổ hợp các yếu tố gây bệnh F4/STa/STb/LT và thuộc serotype kháng nguyên O149, K91 là phổ biến nhất. Các chủng đại diện cho tổ hợp Luan van PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.com to remove the waterma 4 các yếu tố gây bệnh và serotype kháng nguyên O đều biểu hiện đặc tính gây bệnh invitro và invivo điển hình.
Theo Lý Thị Liên Khai (2001) khi phân lập E. coli từ phân lợn con bị tiêu chảy và phân lợn con khỏe mạnh đã cho biết các chủng E. coli mang K88, K99 và 987P là nguyên nhân chính gây tiêu chảy cho lợn con từ 1 đến 2 tuần tuổi. coli thường xuyên cư trú trong ruột lợn và chúng chỉ gây bệnh khi gặp điều kiện thuận lợi như: Tác động stress làm giảm sức đề kháng của lợn, làm tăng số lượng vi khuẩn và sinh độc tố.
Tạ Thị Vịnh và cs, (1996) đã chiết xuất thành công chế phẩm gamma globulin từ huyết thanh ngựa để điều trị dự phòng cho lợn con tiêu chảy. Cũng trên cơ sở nghiên cứu căn cứ vào nguyên nhân và quá trình diễn biến của bệnh đặc biệt tập trung vào quá trình nhiễm khuẩn bội nhiễm, các tác giả đã đưa ra hàng loạt các giải pháp gồm nhiều sinh phẩm khác nhau nhằm mục đích phòng bệnh tiêu chảy. Nguyễn Thị Nội (1986) nghiên cứu sử dụng vắc xin E. coli tiêm phòng cho nái chửa, đã dựa vào kết quả xác định tần xuất của các serotype O trong số chủng E.
coli gây bệnh phân lập được, từ đó chọn một số serotype có tần số xuất hiện cao nhất để chế vắc xin. Dùng các loại vắc xin tiêm phòng cho lợn mẹ 2 lần vào lúc 6 và 12 tuần tuổi trước khi đẻ để tạo kháng thể truyền qua sữa đầu, bảo vệ lợn con trong một vài tuần lễ đầu sau khi sinh. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn E. Các kết quả nghiên cứu đã khẳng định được vai trò vi khuẩn E.
coli trong hội chứng tiêu chảy ở lợn con (Gyles và Fairbrother, 2010). Hiện nay các nghiên cứu tập trung xác định cấu trúc phân tử và các đặc tính sinh học của yếu tố bám dính, độc tố (Smeds và cs, 2001; Zhang và cs, 2007), sử dụng kháng nguyên bám dính và độc tố để sản xuất vắc xin phòng bệnh (Tiels và cs, 2008; Verdonck và cs, 2004). Fairbrother (1992) khi nghiên cứu về các yếu gây bệnh của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập từ các thể bệnh khác nhau, tác giả đã đặt tên các chủng vi khuẩn E.
coli theo những yếu tố gây bệnh mà chúng có khả năng sinh ra như: Enterotoxngeneic E. coli (VTEC), Adhesive Enteropathogeneic E. Từ Luan van PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.com to remove the waterma 5 đó sắp xếp các serotype cùng mang các yếu tố gây bệnh vào các nhóm gây nên những thể bệnh đặc trưng cho từng lứa tuổi khác nhau ở lợn. Ở Đan Mạch, kết quả nghiên cứu của Frydendahl (2002) cho thấy trên 44% số chủng vi khuẩn E.
Ở Cộng hoà Slovakia, Vũ Khắc Hùng và Pilipcinec (2003) đã tìm thấy trong 218 mẫu phân lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy có chứa kháng nguyên bám dính F4, F5+F41, F6 của E. coli với tỷ lệ lần lượt 37,7%, 0,46%, 3,2%. Một nghiên cứu gần đây của Chae và cs, (2012) trên 105 chủng vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn con tiêu chảy từ 1-6 tuần tại Hàn Quốc tìm thấy kháng nguyên bám dính F4, F6 hiện diện với tỷ lệ lần lượt là 27,62%, 31,43% và không tìm thấy chủng nào mang kháng nguyên bám dính F5.
VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI Vi khuẩn Escherichia coli thuộc họ Enterobacteriaceae, nhóm Escherichae, loài Escherchia. Trong các vi khuẩn đường ruột, loài Escherchia là loài phổ biến nhất. coli xuất hiện và sinh sống trong động vật chỉ vài giờ sau khi con non sinh ra và tồn tại cho đến khi con vật chết. Ở điều kiện bình thường các chủng E.
coli không gây bệnh, khi các điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng kém, vệ sinh thú y không đảm bảo dẫn đến sức chống chịu bệnh tật của con vật suy giảm thì vi khuẩn E. coli hoạt động mạnh, trở nên cường độc và có khả năng gây bệnh. Đặc điểm hình thái E. coli là trực khuẩn đường ruột, Gram âm, là những vi khuẩn hình que, 2 đầu tròn, kích thước dài ngắn tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy, đường kính khoảng 1 µm.
Không hình thành bào tử, tạo giáp mô mỏng, có lông quanh cơ thể, một số có lông bám (pili). Khuẩn lạc trên môi trường đặc phát triển hoàn toàn sau 1 ngày nuôi cấy. Khuẩn lạc có bìa tròn, hoặc nhăn nheo hoặc nhầy. Một vài chủng có khả năng gây dung huyết (Fairbrother và Gyles, 2006).
Đặc tính sinh hóa Vi khuẩn E. coli lên men sinh hơi glucose, lactose, mannitol, maltose, mannose, xylose, fructose. Có thể lên men hoặc không lên men các đường saccharose, raffinose, salicin, esculin, dunxit, glycerol. Ngược lại, vi khuẩn E.
coli Luan van PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.com to remove the waterma 6 không lên men các đường dextrin, emidon, glycogene, inositol, cellobiose, Metylglycosit (Quinn và cs, 2004). Cũng theo Quinn và cs, (2004) vi khuẩn E. coli được định danh bằng phản ứng sinh hóa qua các môi trường như: môi trường Kligler Iron Agar (KIA), môi trường kiểm tra indole, môi trường Methyl Red (MR), môi trường Voges. coli sinh indole, phản ứng MR dương tính, VP âm tính, hoàn nguyên nitrate thành nitrite, không sử dụng ure.
Trên môi trường KIA: E. coli lên men đường glucose và lactose, phần thạch nghiêng và thạch đứng đều chuyển sang màu vàng, làm nứt thạch, ngoài ra không sinh H2S, không cho kết tủa đen. Kết quả xét nghiệm IMViC của vi khuẩn E. coli như sau : Indole: trong môi trường có tryptophane, E.
coli nhờ có enzyme tryptophanase sẽ phân giải tryptophane trong môi trường tạo thành indole. Để nhận diện indole người ta nhỏ vào vài giọt thuốc thử Kovac’s, indole kết hợp với paradimethylamino-benzaldehyde trong thuốc thử tạo thành hợp chất rosindole có màu đỏ : indole dương tính. Methyl Red (MR): trong môi trường có glucose, E. coli tạo nồng độ H+ cao (pH < 4,5) cho thuốc thử Methyl Red vào môi trường có màu đỏ: MR dương tính.
Voges – Proskauer (VP): tùy loại enzyme vi khuẩn có được mà quá trình lên men glucose sẽ cho sản phẩm cuối cùng khác nhau. Một trong số đó là aceton, sẽ tạo phức hợp màu đỏ với thuốc thử α- naphthol và KOH E. coli có VP âm tính (không có màu đỏ). coli không sử dụng được nguồn cacbon duy nhất là citrate có trong môi trường Simmon’s citrate, do đó không làm tăng pH của môi trường, không làm thay đổi màu xanh lục của môi trường có chứa chất chỉ thị màu xanh bromothymol.
coli không mọc và không làm thay đổi màu xanh lá cây của môi trường. Đặc tính nuôi cấy E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản nên chúng được chọn làm mẫu để nghiên cứu về sinh vật học. coli thuộc loại trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện.
Nhiệt độ thích hợp cho chúng phát triển là 37 0C, tuy nhiên có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 15-40 0C, pH Luan van PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.com to remove the waterma 7 thích hợp là 7,2-7,4. Chúng mọc dễ dàng trong MacConkey (MC), Eosin Methylene Blue (EMB), có khả năng sản sinh dung huyết α và β. Trên môi trường EMB, khuẩn lạc E. coli to, tròn, hơi lồi, trơn bóng, có màu tím ánh kim, đường kính khuẩn lạc khoảng 1-2 mm.
Trên môi trường MC, vi khuẩn E. coli lên men đường Lactose hình thành khuẩn lạc màu hồng sáng, to, tròn đều, mặt khuẩn lạc hơi lồi, trơn bóng, đường kính khuẩn lạc khoảng 1-2 mm (Quinn và cs, 2004). Sức đề kháng Cũng như các loại vi khuẩn không sinh nha bào khác, E. coli không chịu được nhiệt độ, đun 500C trong 1 giờ, 600C trong 30 phút, và 1000C vi khuẩn chết ngay.
Các chất sát trùng thông thường: axít phenic, biclorua thuỷ ngân, formol (0,2%) diệt vi khuẩn sau 5 phút. Ở môi trường bên ngoài các chủng E. coli độc tố có thể tồn tại đến 4 tháng. coli có khả năng đề kháng với sự sấy khô và hun khói (Đào Trọng Đạt và cs, 1995).
Trong đất và nước E. coli sống được khoảng vài tháng.