MỞ ĐẦU Vi nấm là những sinh vật sinh bào tử nhân chuẩn đƣợc tìm thấy ở hầu hết mọi môi trƣờng sống. Để tồn tại và sinh sản, chúng cạnh tranh với các sinh vật khác. Vi nấm tạo ra rất nhiều chất chuyển hóa thứ cấp. Các chất chuyển hóa thứ cấp khác nhau có tác dụng gây hại nhƣ độc tố nấm mốc, tuy nhiên, một số trong số chúng có thể tăng cƣờng sức khỏe và tuổi thọ.
Các đặc tính y học của nấm đã đƣợc khám phá và sử dụng trong điều trị bệnh, tăng cƣờng sức khỏe của con ngƣời. Một số chất chuyển hóa thứ cấp của nấm nhƣ penicillin, cyclosporin, statin và acid mycophenolic đƣợc biết đến với ứng dụng trong việc kéo dài tuổi thọ của con ngƣời. Hiện nay, ngày càng có nhiều nghiên cứu về các chất chuyển hóa thứ cấp của nấm để tìm ra các loại thuốc mới. Một số vai trò có lợi của nấm đối với loài ngƣời bao gồm kháng sinh, enzyme, chất tạo màu thực phẩm và thực phẩm bổ dƣỡng.
Nhiều ngành công nghiệp khác nhau sử dụng các sản phẩm từ nấm nhƣ enzyme, chất màu thực phẩm và dƣợc phẩm. Hoạt tính sinh học của các chất chuyển hóa thứ cấp của nấm bao gồm : chống viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, kháng virus và chống ung thƣ. Các loài nấm khác nhau tạo ra các chất chuyển hóa thứ cấp quan trọng về mặt dƣợc lý nhƣ Aspergillus niger, Aspergillus parasiticus, Beauveria bassiana, Cephalosporium acremonium, Micromonospora purpurea, Monascus purpureus, Penicillium griseofulvum, Penicillium notatum, Streptomyces griseusadium và Tolya. Trong những thập kỷ gần đây, các hợp chất thứ cấp từ vi nấm đã tạo ra một cuộc cách mạng trong nhiều lĩnh vực.
Kể từ khi phát hiện ra penicillin, kháng sinh nhóm β- lactam đầu tiên, vi nấm đã cung cấp cho y học hiện đại những loại kháng sinh và dƣợc liệu quan trọng. Các loại thuốc hoặc sản phẩm dùng trong nông nghiệp có nguồn gốc từ vi nấm bao gồm statin, echinocandin và strobilurins. Sử dụng vi nấm để sản xuất công nghiệp các hormone steroid là một trong những thành công quan trọng của công nghệ sinh học. Do tính đa dạng sinh học của nấm cũng nhƣ các hợp chất có hoạt tính sinh học cao, vi nấm hứa hẹn nhiều tiềm năng ứng dụng trong dƣợc phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệp và nhiều lĩnh vực khác [1].
Aspergillus niger là một loại nấm phổ biến có mặt ở hầu hết mọi nơi. Do đặc tính phát triển nhanh, phân bố trên nhiều loại cơ chất tự nhiên, ít gây bệnh cho con ngƣời, có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme, chủng nấm này đƣợc sử dụng rộng rãi để sản xuất các enzyme công nghiệp nhƣ glucoamylase, pectinase, alpha- galactosidase, glucose oxidase và nhiều hợp chất khác, ứng dụng trong công nghiệp Luan van 2 chế biến thực phẩm và dƣợc phẩm. niger cũng đã đƣợc chứng minh là một nguồn giàu các chất chuyển hóa thứ cấp, bao gồm diketopiperazine, alkaloid, pyrones, bicoumarins, malformins, trong đó một số hợp chất đƣợc chứng minh là có tác dụng điều hòa miễn dịch và có các phản ứng gây độc tế bào. Việt Nam là một đất nƣớc có khí hậu nóng ẩm, với đa dạng các loại lƣơng thực và nông sản có giá thành rẻ, là điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển.
Aspergillus niger xuất hiện ở rất nhiều nơi nhƣ trên đất, trên bề mặt hầu hết các loại nông sản nếu không đƣợc xử lý đúng cách. Hiện nay, chƣa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của các chủng nấm mốc, trong đó có A. niger trên bề mặt hạt lạc. Do đó, xác định đƣợc các thành phần hóa học cũng nhƣ hoạt tính của các hợp chất thứ cấp sản sinh bởi chủng A.
niger từ hạt lạc đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện các hợp chất mới, các độc tố cũng nhƣ các hoạt chất tốt, góp phần trong nghiên cứu các dƣợc phẩm điều trị bệnh, đảm bảo an toàn thực phẩm, nâng cao sức khỏe và tuổi thọ của con ngƣời. Hiện nay ở Việt Nam có một số nghiên cứu sử dụng A. niger trong sinh tổng hợp pectinase, cellulase để sản xuất công nghiệp. Tuy nhiên chƣa có nhiều nghiên cứu hóa học về chủng nấm này trên hạt lạc.
Việc xác định thành phần hóa học của chủng nấm A. niger từ hạt lạc, qua đó phát hiện các hợp chất có hoạt tính tốt, cũng nhƣ phát hiện các hợp chất mới, chƣa đƣợc biết đến đóng vai trò rất quan trọng trong kiểm soát an toàn thực phẩm, đặc biệt là sản xuất dƣợc phẩm, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị các bệnh nhiễm khuẩn và ung thƣ. Trên cơ sở đó, chúng tôi đã lựa chọn đề tài : « Nghiên cứu phân lập một số hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ và kháng khuẩn từ chủng vi nấm Aspergillus niger IMBC-NMTP01». Mục tiêu của luận văn : Xác định đƣợc thành phần và cấu trúc của một số hợp chất có mặt trong chủng nấm Aspergillus niger IMBC-NMTP01 có nguồn gốc từ hạt lạc, đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ và kháng khuẩn của các hợp chất đó, làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu y sinh, dƣợc lý sau này.
Nội dung luận văn bao gồm : 1. Phân lập, lên men sinh khối lƣợng lớn, tạo cao chiết tổng của chủng nấm A. niger IMBC-NMTP01 2. Phân lập các hợp chất từ cao chiết tổng của chủng A.
niger IMBC-NMTP01 bằng các phƣơng pháp sắc ký kết hợp Luan van 3 3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc bằng các phƣơng pháp vật lý, hóa học 4. Phân tích hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ và hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất phân lập đƣợc Luan van 4 CHƢƠNG 1. Vi nấm và tầm quan trọng của nghiên cứu các hợp chất tự nhiên từ vi nấm 1.
Giới thiệu chung về vi nấm Giới Nấm (tên khoa học: Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn dị dƣỡng có thành tế bào bằng kitin (chitin). Phần lớn nấm phát triển dƣới dạng các sợi đa bào đƣợc gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên thể sợi (mycelium), một số nấm khác lại phát triển dƣới dạng đơn bào. Quá trình sinh sản (hữu tính hoặc vô tính) của nấm thƣờng là qua bào tử, đƣợc tạo ra trên những cấu trúc đặc biệt hay thể quả. Một số loài mất khả năng tạo nên những cấu trúc sinh sản đặc biệt và nhân lên qua hình thức sinh sản sinh dƣỡng.
Vi nấm là các sinh vật nhân chuẩn thuộc giới Nấm, có cấu tạo đa bào, tế bào không có diệp lục, sống dị dƣỡng, vách tế bào cấu tạo chủ yếu bởi chitin, có hoặc không có cellulose, sinh trƣởng bằng cách kéo dài sợi. Cấu tạo của vi nấm thƣờng gồm những sợi kéo dài, gọi là sợi nấm (hyphae), lan ra trên bề mặt mà chúng bám vào. Thể sợi tạo ra các bào tử, đƣợc phát tán và lây lan nấm ra các bề mặt, sinh vật khác. Vi nấm phân bố ở hầu khắp các vùng khí hậu, từ nóng đến lạnh, nhiệt đới hay ôn đới, chúng sống phần lớn ở trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc ký sinh trên cơ thể động, thực vật và nấm khác.
Vi nấm đóng một vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các vật chất hữu cơ và không thể thiếu đƣợc trong chu trình chuyển hóa và trao đổi vật chất. Nhiều loại vi nấm là có lợi, chẳng hạn nhƣ làm sinh vật phân giải trong đất, phần lớn không thể nhìn thấy bằng mắt thƣờng. Hàng ngàn loài vi nấm đƣợc tìm thấy trong địa y, một dạng cộng sinh giữa nấm và tảo. Tuy nhiên cũng có một số loài nấm có chứa các độc tố, chẳng hạn nhƣ Penicillium, Aspergillus và Neurospora đƣợc phát hiện là những loại nấm mốc làm hỏng trái cây và bánh mì, gây ảnh hƣởng đến quá trình bảo quản thực phẩm.
Một số loài vi nấm còn có giá trị thƣơng mại. Vi nấm còn đƣợc dùng để sản xuất chất kháng sinh, dƣợc phẩm trong y học và nhiều loại enzyme, ngày nay nhiều loại nấm đƣợc biết đến và sử dụng trong phòng chống nhiều loại bệnh hiểm nghèo nhƣ viêm gan, mỡ máu, đột quỵ, ung thƣ. Tuy vậy, nhiều loại nấm lại có chứa các chất hoạt động sinh học đƣợc gọi là mycotoxin, nhƣ ankaloid và polyketide - là những chất độc đối với động vật lẫn con ngƣời. Một số loại nấm có thể gây ra các chứng bệnh cho con ngƣời và động vật, cũng nhƣ bệnh dịch cho cây trồng, mùa màng và có thể gây tác động lớn lên an ninh lƣơng thực và kinh tế.
Luan van 5 Hình 1. Một số loài vi nấm phổ biến [1] 1. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu các hợp chất từ vi nấm Vi nấm đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣ công nghiệp chế biến thực phẩm dùng để sản xuất tƣơng, chao, xì dầu…, các loại axit hữu cơ nhƣ citric acid, oxalic acid, các enzyme thực phẩm nhƣ protease, pectinase, amylase. Trong y học, nấm mốc đƣợc dùng để sản xuất các loại kháng sinh nhƣ penicillin, cephalosporin, griseofulvin, các vitamin nhóm B và các dƣợc phẩm khác.
Trong nông nghiệp, vi nấm đƣợc ứng dụng trong sản xuất các chất kích thích tăng trƣởng kéo dài ngọn, lá, rễ cho cây trồng nhƣ gibberellin, auxin, các chế phẩm phân bón hữu cơ, phân vi sinh giúp tăng độ màu mỡ, cải tạo đất hoặc là thiên địch chống lại côn trùng. Tầm quan trọng của việc khai thác các hợp chất tự nhiên từ vi nấm lần đầu tiên đƣợc ghi nhận vào năm 1928, khi kháng sinh penicillin đƣợc tìm ra bởi Alexander Fleming từ chủng nấm Penicillium notatum. Kể từ đó, việc phát hiện ra các sản phẩm tự nhiên từ vi nấm đã thu hút đƣợc sự quan tâm của các nhà khoa học trong sản xuất và phát triển thuốc. Trong những thập kỷ gần đây, các hợp chất trao đổi thứ cấp từ vi nấm đang ngày càng đƣợc quan tâm nghiên cứu, nhiều hợp chất có cấu trúc độc đáo, thể hiện nhiều hoạt tính sinh học và tác dụng dƣợc học nhƣ ức chế khối u, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng enzyme và ức chế ung thƣ [2, 3].
Các lớp chất chủ yếu sản sinh bởi vi nấm là các polyketide, alkaloid, terpene, peptide, lipid, các hợp chất chứa nitro và các chất sinh tổng hợp hỗn hợp khác [4]. Luan van 6 Nhiều công bố đã cho thấy tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của nguồn vi nấm và khả năng phát triển các hợp chất tự nhiên thành các thuốc kháng sinh mới ứng dụng trong điều trị [5]. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng hầu hết các hợp chất kháng sinh mới đƣợc phát hiện chủ yếu từ các loài vi nấm thuộc chi Aspergillus và Penicillium.