Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư và kháng khuẩn của hợp chất từ Aspergillus niger

• Tác giả: Lê Ngọc Anh
• Người hướng dẫn: TS. Trần Hồng Quang
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư và kháng khuẩn từ hợp chất vi nấm Aspergillus niger
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Giới thiệu về vi nấm và tầm quan trọng của nghiên cứu các hợp chất tự nhiên từ vi nấm

Vi nấm là những sinh vật nhân chuẩn, có khả năng sinh sản và phát triển trong nhiều môi trường khác nhau. Chúng tạo ra nhiều chất chuyển hóa thứ cấp, trong đó có những chất có tác dụng gây hại như độc tố nấm mốc, nhưng cũng có những chất có lợi cho sức khỏe con người. Vi nấm như Aspergillus niger đã được chứng minh là nguồn cung cấp nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, bao gồm kháng sinh và các chất điều hòa miễn dịch. Việc nghiên cứu các hợp chất từ vi nấm không chỉ giúp phát hiện ra các loại thuốc mới mà còn có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như dược phẩm, nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm.

1.1. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu các hợp chất từ vi nấm

Nghiên cứu về vi nấm đã mở ra nhiều cơ hội trong việc phát triển các sản phẩm dược phẩm. Các hợp chất như penicillin và cephalosporin đã được phát hiện từ vi nấm, cho thấy tiềm năng lớn trong việc điều trị bệnh. Các hợp chất này không chỉ có tác dụng kháng khuẩn mà còn có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Việc khai thác các hợp chất tự nhiên từ vi nấm như Aspergillus niger có thể dẫn đến việc phát hiện ra các loại thuốc mới, giúp nâng cao hiệu quả điều trị và đảm bảo an toàn thực phẩm.

II. Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư và kháng khuẩn

Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và xác định các hợp chất từ chủng vi nấm Aspergillus niger IMBC-NMTP01. Các hợp chất này được đánh giá về hoạt tính gây độc tế bào ung thư và khả năng kháng khuẩn. Kết quả cho thấy một số hợp chất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, đồng thời cũng có tác dụng kháng khuẩn mạnh mẽ. Việc xác định hoạt tính của các hợp chất này không chỉ có ý nghĩa trong nghiên cứu khoa học mà còn có thể ứng dụng trong phát triển các loại thuốc mới.

2.1. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất

Quá trình phân lập các hợp chất từ Aspergillus niger được thực hiện thông qua các phương pháp sắc ký hiện đại. Các hợp chất được phân lập đã được xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp như NMR và MS. Kết quả cho thấy sự hiện diện của nhiều hợp chất mới có hoạt tính sinh học cao. Việc xác định cấu trúc hóa học là bước quan trọng để hiểu rõ hơn về cơ chế tác động của các hợp chất này đối với tế bào ung thư và vi khuẩn.

2.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất được đánh giá thông qua các thử nghiệm in vitro. Kết quả cho thấy một số hợp chất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, đặc biệt là tế bào ung thư gan và ung thư vú. Điều này mở ra triển vọng cho việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới từ các hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ vi nấm.

III. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào ung thư và kháng khuẩn từ hợp chất vi nấm Aspergillus niger IMBC-NMTP01 đã chỉ ra tiềm năng lớn của các hợp chất tự nhiên trong việc phát triển thuốc mới. Các hợp chất này không chỉ có khả năng ức chế tế bào ung thư mà còn có tác dụng kháng khuẩn mạnh. Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động và khả năng ứng dụng thực tiễn của các hợp chất này trong y học.

3.1. Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

Cần thực hiện các nghiên cứu lâm sàng để đánh giá hiệu quả và độ an toàn của các hợp chất đã phân lập. Ngoài ra, việc nghiên cứu các hợp chất khác từ Aspergillus niger cũng cần được thực hiện để khám phá thêm nhiều tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh.

Tổng quan nghiên cứu

Vi nấm là sinh vật nhân chuẩn đa bào, phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có khả năng sản sinh nhiều hợp chất chuyển hóa thứ cấp với hoạt tính sinh học đa dạng. Trong đó, chi Aspergillus, đặc biệt là Aspergillus niger, được biết đến như một nguồn dồi dào các enzyme công nghiệp và hợp chất có tiềm năng dược lý như kháng khuẩn, kháng ung thư. Ở Việt Nam, khí hậu nóng ẩm tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm mốc trên các loại nông sản như hạt lạc, tuy nhiên nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các chủng A. niger từ nguồn này còn hạn chế. Luận văn tập trung nghiên cứu chủng vi nấm Aspergillus niger IMBC-NMTP01 phân lập từ hạt lạc, nhằm phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất thứ cấp và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư cũng như kháng khuẩn của các hợp chất này. Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn 2020-2021 tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả nghiên cứu góp phần mở rộng hiểu biết về nguồn hợp chất sinh học có giá trị từ vi nấm, đồng thời làm cơ sở khoa học cho phát triển dược phẩm mới, nâng cao an toàn thực phẩm và sức khỏe cộng đồng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết về sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp của vi nấm, đặc biệt là các cụm gen sinh tổng hợp (Biosynthetic Gene Clusters - BGC) trong Aspergillus niger, bao gồm các nhóm polyketide synthase (PKS), nonribosomal peptide synthetase (NRPS) và các đoạn lai. Các hợp chất thứ cấp như pyranones, alkaloids, cyclopeptides, polyketides và sterols được xem là các nhóm chính có hoạt tính sinh học đa dạng. Mô hình nghiên cứu tập trung vào quá trình phân lập, tinh chế hợp chất từ dịch chiết nấm mốc, xác định cấu trúc bằng phổ NMR, MS, ECD và đánh giá hoạt tính sinh học qua các phương pháp in vitro như thử độc tế bào ung thư, ức chế sản sinh nitric oxide (NO) và hoạt tính kháng khuẩn.

Ba khái niệm chính được áp dụng gồm:

• Chất chuyển hóa thứ cấp của vi nấm và vai trò trong dược lý
• Phân tích cấu trúc hóa học bằng phổ học đa chiều
• Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro trên các dòng tế bào ung thư và vi sinh vật kiểm định

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là chủng vi nấm Aspergillus niger IMBC-NMTP01 được lưu giữ tại Viện Hóa sinh biển, Việt Nam. Sinh khối nấm được nuôi cấy nhân sinh khối lớn trên môi trường PDA trong 25 ngày, thu được 5.2 g cao chiết tổng từ dung môi ethyl acetate. Các hợp chất được phân lập bằng sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột (CC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các pha tĩnh silica gel, pha đảo C18, Sephadex LH-20. Cấu trúc hóa học được xác định bằng phổ NMR 1D, 2D (1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC), phổ khối lượng (HRESITOFMS), phổ lưỡng sắc tròn (ECD) và tính toán phổ ECD bằng Gaussian 16W.

Hoạt tính sinh học được đánh giá qua:

• Thử độc tế bào ung thư trên 6 dòng tế bào người (HepG2, KB, HL-60, MCF7, SK-Mel-2, LNCaP) bằng phương pháp Sulforhodamine B (SRB) đo IC50
• Đánh giá ức chế sản sinh nitric oxide (NO) trên tế bào RAW 264.7 kích thích bằng LPS, xác định IC50 bằng phương pháp Griess
• Thử hoạt tính kháng khuẩn trên 6 chủng vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm men Candida albicans bằng phương pháp pha loãng đa nồng độ xác định MIC

Cỡ mẫu gồm 14 hợp chất phân lập từ cao chiết tổng, mỗi thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần để đảm bảo độ tin cậy. Phân tích dữ liệu sử dụng phần mềm TableCurve 2Dv4 và các công cụ phổ học chuyên dụng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập và xác định cấu trúc 14 hợp chất thứ cấp từ chủng A. niger IMBC-NMTP01, trong đó có 2 hợp chất mới là epi-Aspergillusol (A1) và Aspernigin (A3), cùng 12 hợp chất đã biết như Pyrophen (A2), 2-(Hydroxyimino)-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid (A4), Aspergillusol A (A5), Rubrofusarin B (A6), Nigerasperone A (A7), Fonsecin (A8), TMC-256C1 (A9), Pyranonigrin A (A10), Orlandin (A11), Nigerasperone C (A12), Asperpyrone A (A13), 5-(Hydroxymethyl)-2-furancarboxylic acid (A14).

2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư: Một số hợp chất thể hiện khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư với giá trị IC50 dao động trong khoảng 10-50 µM, trong đó hợp chất A1 và A3 có hoạt tính nổi bật trên các dòng tế bào HepG2 và MCF7, với mức ức chế trên 60% ở nồng độ 20 µM.

3. Hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO): Các hợp chất A1, A3, A6 và A8 cho thấy khả năng ức chế NO hiệu quả trên tế bào RAW 264.7 kích thích LPS, với IC50 lần lượt khoảng 15-30 µM, cho thấy tiềm năng chống viêm.

4. Hoạt tính kháng khuẩn: Một số hợp chất như Rubrofusarin B (A6) và Nigerasperone A (A7) có khả năng ức chế vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus và Bacillus cereus với MIC từ 12.5 đến 25 µM, đồng thời thể hiện hoạt tính kháng nấm Candida albicans với MIC khoảng 25 µM.

Thảo luận kết quả

Kết quả phân lập 14 hợp chất, trong đó có 2 hợp chất mới, khẳng định tiềm năng đa dạng hóa nguồn hợp chất sinh học từ chủng A. niger IMBC-NMTP01. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phù hợp với các nghiên cứu trước đây về các dẫn xuất pyranone và alkaloid từ Aspergillus, cho thấy khả năng ứng dụng trong phát triển thuốc chống ung thư. Hoạt tính ức chế NO và kháng khuẩn cũng đồng nhất với các báo cáo về tác dụng chống viêm và kháng khuẩn của các hợp chất polyketide và sterol từ vi nấm.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ cột so sánh IC50 của các hợp chất trên từng dòng tế bào ung thư, biểu đồ đường thể hiện % ức chế NO theo nồng độ, và bảng tổng hợp giá trị MIC kháng khuẩn. So sánh với các hợp chất chuẩn như Ellipticine (đối chứng dương) và Streptomycin, các hợp chất phân lập cho thấy hiệu quả tương đối, mở ra hướng nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động và tối ưu hóa cấu trúc hóa học.

Kết quả cũng nhấn mạnh tầm quan trọng của việc khai thác nguồn vi nấm từ nông sản địa phương, góp phần phát triển dược liệu bản địa và nâng cao giá trị kinh tế nông sản.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tăng cường nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất mới từ các chủng A. niger phân lập từ đa dạng nguồn nguyên liệu nông sản trong nước, nhằm mở rộng thư viện hợp chất sinh học có giá trị. Thời gian thực hiện: 2-3 năm, chủ thể: các viện nghiên cứu sinh học và dược liệu.

2. Phát triển quy trình lên men và tinh chế hợp chất quy mô bán công nghiệp để cung cấp nguyên liệu cho nghiên cứu dược lý và thử nghiệm tiền lâm sàng, tập trung tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và chiết xuất. Thời gian: 1-2 năm, chủ thể: các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học.

3. Nghiên cứu cơ chế tác động sinh học của các hợp chất có hoạt tính cao trên tế bào ung thư và vi khuẩn, bao gồm đánh giá độc tính chọn lọc và tương tác phân tử, nhằm phát triển thuốc điều trị mới. Thời gian: 3-4 năm, chủ thể: các trung tâm nghiên cứu y sinh và dược lý.

4. Xây dựng mô hình hợp tác liên ngành giữa viện nghiên cứu, trường đại học và doanh nghiệp để thúc đẩy ứng dụng các hợp chất từ vi nấm trong sản xuất dược phẩm và bảo vệ thực phẩm, đồng thời nâng cao nhận thức về an toàn thực phẩm. Thời gian: liên tục, chủ thể: các tổ chức khoa học và doanh nghiệp.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu sinh học và dược liệu: Có thể sử dụng kết quả phân lập và xác định cấu trúc hợp chất làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học và phát triển thuốc mới.

2. Chuyên gia công nghệ sinh học và công nghiệp enzyme: Tham khảo quy trình nuôi cấy, lên men và chiết xuất hợp chất từ vi nấm để ứng dụng trong sản xuất enzyme và dược liệu.

3. Bác sĩ và chuyên gia y học: Nắm bắt thông tin về các hợp chất tự nhiên có tiềm năng điều trị ung thư và kháng khuẩn, hỗ trợ nghiên cứu lâm sàng và phát triển liệu pháp mới.

4. Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng: Áp dụng kết quả nghiên cứu để phát triển sản phẩm mới từ nguồn vi nấm bản địa, nâng cao giá trị sản phẩm và đảm bảo an toàn thực phẩm.

Câu hỏi thường gặp

1. Aspergillus niger có vai trò gì trong công nghiệp?
   A. niger là nguồn enzyme công nghiệp quan trọng như pectinase, glucoamylase, được sử dụng trong chế biến thực phẩm và dược phẩm, đồng thời là nguồn hợp chất sinh học có hoạt tính kháng khuẩn và kháng ung thư.

2. Phương pháp nào được sử dụng để xác định cấu trúc hợp chất trong nghiên cứu?
   Phổ NMR 1D, 2D, phổ khối lượng HRESITOFMS, phổ lưỡng sắc tròn (ECD) và tính toán phổ ECD bằng phần mềm Gaussian 16W là các phương pháp chính để xác định cấu trúc và cấu hình tuyệt đối của hợp chất.

3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư được đánh giá như thế nào?
   Sử dụng phương pháp Sulforhodamine B (SRB) đo mật độ quang học protein tế bào, xác định IC50 trên các dòng tế bào ung thư người như HepG2, MCF7, SK-Mel-2, cho phép đánh giá khả năng ức chế sự phát triển tế bào.

4. Các hợp chất từ A. niger có thể ứng dụng trong điều trị bệnh gì?
   Các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế sản sinh NO và gây độc tế bào ung thư, do đó có tiềm năng ứng dụng trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, viêm và ung thư.

5. Tại sao nghiên cứu A. niger từ hạt lạc lại quan trọng?
   Hạt lạc là nguồn nguyên liệu phổ biến ở Việt Nam, dễ bị nhiễm nấm mốc. Nghiên cứu giúp phát hiện các hợp chất độc tố và hợp chất có lợi, góp phần kiểm soát an toàn thực phẩm và phát triển dược liệu từ nguồn bản địa.

Kết luận

• Phân lập thành công 14 hợp chất thứ cấp từ chủng Aspergillus niger IMBC-NMTP01, trong đó có 2 hợp chất mới với cấu trúc được xác định rõ ràng.
• Một số hợp chất thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư, ức chế sản sinh nitric oxide và kháng khuẩn hiệu quả trên các dòng tế bào và vi sinh vật kiểm định.
• Nghiên cứu khẳng định tiềm năng của vi nấm A. niger từ nguồn nông sản bản địa trong phát triển dược phẩm và bảo vệ thực phẩm.
• Cần tiếp tục nghiên cứu cơ chế tác động và phát triển quy trình sản xuất quy mô lớn để ứng dụng thực tiễn.
• Khuyến khích hợp tác liên ngành để thúc đẩy ứng dụng kết quả nghiên cứu vào sản xuất và y học.

Hành động tiếp theo: Khởi động các dự án nghiên cứu mở rộng về phân lập hợp chất mới, thử nghiệm tiền lâm sàng và phát triển sản phẩm dược liệu từ vi nấm bản địa. Đăng ký hợp tác nghiên cứu và tìm kiếm nguồn tài trợ để nâng cao hiệu quả nghiên cứu.