Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Bệnh đái tháo đường típ 2 Đái tháo đường (ĐTĐ) típ 2 là bệnh hình thành do tác động qua lại của các yếu tố di truyền và yếu tố môi trường (mắc phải). Vai trò của yếu tố di truyền đã được chứng minh trên nghiên cứu các trường hợp sinh đôi. Vai trò của yếu tố môi trường cũng đã được chứng minh trong rất nhiều nghiên cứu gần đây.
Yếu tố di truyền và mắc phải có vai trò quyết định gây ra bệnh ĐTĐ típ 2 thông qua cơ chế gây kháng insulin ở tổ chức mỡ và cơ vân, sản xuất glucose quá mức ở gan và sự khiếm khuyết tế bào β. Mặc dù nguyên nhân gây bệnh chưa được biết một cách rõ ràng, nhưng có nhiều yếu tố nguy cơ của bệnh đã được ghi nhận, bao gồm: béo phì, chế độ ăn, uống thừa năng lượng, lối sống tĩnh tại, tuổi cao, tiền sử bệnh THA-ĐTĐ của gia đình liên quan đến ĐTĐ, dân tộc, tăng đường huyết trong thời kỳ mang thai [18]. Ngược với ĐTĐ típ 1, đa phần các bệnh nhân ĐTĐ típ 2 có thể đạt mức nồng độ đường huyết theo khuyến cáo thông qua việc điều chỉnh chế độ ăn, uống, tăng cường hoạt động thể lực và sử dụng thuốc uống hạ đường huyết. Khi không thể duy trì đường huyết như mong muốn bằng các biện pháp trên, insulin sẽ được bổ sung vào chế độ điều trị.
Các chỉ số theo dõi nồng độ đường huyết 1. Glucose huyết tương lúc đói Chỉ số glucose huyết tương lúc đói phản ánh chính xác nồng độ đường huyết tại thời điểm lấy máu làm xét nghiệm. Bệnh nhân cần nhịn đói trước khi lấy máu xét nghiệm ít nhất 8-10 giờ, thời điểm lấy máu thường vào buổi sáng khi bệnh nhân đã nhịn đói qua đêm. Định lượng glucose huyết tương lúc đói 4 là xét nghiệm phổ biến nhất và sớm nhất được sử dụng trong chẩn đoán và theo dõi điều trị bệnh đái tháo đường [47].
Xét nghiệm glucose được thực hiện bằng 2 phương pháp như hóa học và enzym. Tuy nhiên hiện nay phương pháp hóa học gần như không nơi nào thực hiện do không đặc hiệu và mất nhiều thời gian. Phương pháp phổ biến hiện nay là dùng enzym. Phương pháp enzym có độ đặc hiệu cao và thời gian nhanh nên rất hiệu quả.
Ba loại emzym phổ biến hiện nay thường dùng để định lượng glucose trong máu là hexokinase, glucose oxydase và glucose dehydrogenase. Phương pháp glucose oxidase [47]: Đây là phương pháp phổ biến với các hóa chất cho máy hóa sinh bán tự động và một số máy hóa sinh tự động. Phương pháp này kết hợp sử dụng enzym glucose oxydase và enzym peroxydase. Nguyên lý của phương pháp như sau: GOD (glucose oxydase) Glucose + H2O ------------------------------------> Acid gluconic + H2O2 POD (Peroxydase) 2H2O2 + Phenol + 4 amino-Antipyrin -------------------> Quinonemin + 4H2O Phương pháp trải qua 2 bước.
Đầu tiên glucose trong mẫu được oxy hóa bởi enzym glucose oxydase để tạo H2O2. Tuy nhiên glucose oxydase có đặc hiệu cao với β-glucose trong khi trong huyết thanh còn có cả α-glucose với tỉ lệ 2/3 β-glucose, 1/3 α-glucose, do vậy một số hóa chất còn có thêm cả mutarotase để chuyển α-glucose thành β-glucose. H2O2 được tạo ra tỉ lệ thuận với nồng độ glucose. Sau đó H2O2 tiếp tục tham gia phản ứng với phenol và 4 amino-antipyrin để tạo ra quinonemin.
Quinonemin có màu hồng cánh sen, đậm độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ glucose. Quinonemin được đo ở bước sóng 540nm. Phương pháp hexokinase [47]: 5 Đây là phương pháp phổ biến hiện nay trên các hệ thống máy tự động. Phương pháp này là phương pháp chính xác nhất hiện nay.
Bằng việc sử dụng enzym hexokinase nên rất đặc hiệu với glucose mà không bị nhiễu bởi các carbonhydrat khác. Phương pháp trải qua 2 gian đoạn theo sơ đồ sau: Hexokinase Glucose + ATP -------------------------------------> Glucose-6-Phosphat + ADP G6PD Glucose-6-Phosphat + NADP+ ---------> 6-Phosphogluconat + NADPH + H+ Giai đoạn 1: Hexokinase sẽ xúc tác phản ứng phosphoryl hóa glucose tạo Glucose-6-Phosphat. Giai đoạn 2: G6PD sẽ xúc tác phản ứng oxy hóa Glucose-6-Phosphat để tạo NADPH. Mật độ quang của NADPH tăng lên tỉ lệ thuận với nồng độ Glucose và được đo ở bước sóng 340 nm.
Cần lưu ý ở đây là hexokinase xúc tác phản ứng phosphoryl cả fructose và mannose, tuy nhiên nồng độ các loại đường này trong máu là quá nhỏ và không đủ để gây nhiễu cho phản ứng. Một lưu ý nữa là huyết thanh (huyết tương) vỡ hồng cầu có thể ảnh hưởng đến phương pháp này do trong hồng cầu có enzym G6PD và enzym 6- phosphogluconat dehydrogenase mà cả 2 enzym này cũng sử dụng NADP+ làm cơ chất. Do vậy ngày nay để giảm sự ảnh hưởng này người ta thường sử dụng G6PD của vi khuẩn (thay vì của nấm) vì G6PD của vi khuẩn sẽ sử dụng NAD+ thay thế NADP+. Đồng thời thay vì đo sự thay đổi mật độ quang của NADPH, hiện nay một số hóa chất sử dụng thêm một chất chỉ thị như phenazin methosulphat (PMS) hoặc idonitrotetrazolium (INT) để tham gia phản ứng với NADPH tạo sản phẩm màu đo được ở bước sóng 520nm.
Ưu điểm của phương pháp này là có độ đặc hiệu cao. Kết quả ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác. Nhưng nhược điểm là giá thành hóa chất còn cao. 6 Phương pháp glucose dehydrogenase (GDH) [47]: Đây là phương pháp được sử dụng nhiều trên các máy đo đường huyết cá nhân.
Phương pháp chỉ xảy ra qua 1 phản ứng: GDH β-D-Glucose + NAD+ -------------------->D-Glucono-∆-lacton + NADH + H+ NADH tạo ra được đo ở bước sóng 340 nm dưới dạng động học hoặc điểm cuối. Ngoài ra người ta còn cho thêm mutarotase để chuyển các α- glucose sang β-glucose giúp kết quả được chính xác hơn. Tuy nhiên men GDH lại cũng phản ứng với các đường khác như maltose, galactose hay xylose. Vì vậy nếu vì một lý do nào đó bệnh nhân có sử dụng các đường này trong điều trị sẽ làm kết quả tăng giả tạo.
Để tránh sai số này ngày nay người ta sử dụng loại GDH được phân lập từ chủng vi khuẩn Bacillus cereus rất đặc hiệu với glucose nên sẽ cho kết quả chính xác hơn và tương đương với phương pháp hexokinase. Fructosamin huyết tương - Danh pháp: Fructosamin là tên gọi thông thường của 1-amino 1-deoxy fructose, cũng được gọi là isoglucosamine, fructosamin là một ketoamin, sản phẩm của phản ứng không cần enzym giữa đường (chủ yếu là glucose) và protein (chủ yếu là albumin). - Quá trình đường hóa: Trong cơ thể quá trình đường hóa diễn ra như sau: nhóm carbonyl của glucose kết hợp với nhóm amino của protein tạo thành aldimine (Schiff base), những chất này tiến triển thành ketoamin bền vững, chính là fructosamin. Phản ứng này chỉ diễn ra theo một chiều và không cần có sự tham gia của chất 7 xúc tác [36].
Hàm lượng fructosamin ở người bình thường dưới 285 µmol/L, tăng cao ở bệnh nhân ĐTĐ mà glucose máu không được kiểm soát tốt [16]. - Các phương pháp định lượng fructosamin: Phenylhydrazine: Ghiggeri G. và cộng sự đã làm sạch “glycated albumin” từ huyết thanh của bệnh nhân đái tháo đường và phát hiện chất này phản ứng với phenylhydrazine để tạo thành sản phẩm phenylhydrazone hấp thụ bước sóng 350 nm [39]. Tuy nhiên, phương pháp này không được triển khai ở các phòng xét nghiệm lâm sàng.
Furosine: Fructosamin bị thủy phân trong thời gian 18 giờ trong môi trường HCl 6 mmol/l ở 950C tạo thành 50% lysine, 30% furosine, 10% pyridosine và các sản phẩm khác. Furosine được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng (liquid chromatography). Mặc dù phương pháp này được khuyến cáo bởi độ đặc hiệu cao nhưng bước thủy phân kéo dài 18 giờ là một trở ngại lớn trong việc triển khai tại các phòng xét nghiệm [36]. Affinity chromatography: Acid phenylboric trong dung dịch kiềm tạo phức hợp với nhóm cis-diol của đường.
Huyết thanh của bệnh nhân đái tháo đường được trộn với dung dịch N-3-aminobenzene boric acid. Hỗn hợp này được khuấy lên ở bước sóng 330 nm ở 20 độ C chất fluorescence tỏa ra đo được ở bước sóng 490 nm.Từ đó tính được nồng độ fructosamin. Phương pháp này không được sử dụng rộng rãi trên lâm sàng [36]. 2-Thiobarbituric acid (TBA): Đây là phương pháp đo màu TBA.
Xử lý fructosamin với acid tạo ra 5- hydroxymethylfurfuraldehyde (HMF). HMF được ước tính bằng cách đo sự hấp phụ ở bước sóng 284 nm. 8 Nitroblue tetrazolium (NBT): Phương pháp NBT dựa trên khả năng khử của fructosamin trong môi trường kiềm. Mẫu huyết thanh của bệnh nhân được cho thêm chất đệm carbonate (pH 10,8 và 37 độ C có chứa NBT, chất này sau đó bị khử và hấp thụ bước sóng 530 nm).
Phương pháp này có ưu điểm là nhanh, độ đặc hiệu cao, rẻ tiền và dễ tự động hóa [36]. Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay): Ngày nay, ELISA là phương pháp phổ biến để định lượng fructosamin vì độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Nguyên lý của phương pháp này dựa trên kỹ thuật miễn dịch enzyme gắn cạnh tranh. Kháng thể sử dụng trong phương pháp ELISA là kháng thể đơn dòng thu hoạch từ chuột được miễn dịch với albumin glycosyl hóa tinh khiết.
Kháng thể này chỉ nhận diện và gắn với các epitope trên phân tử albumin glycosyl hóa mà không gắn với các protein khác cũng như albumin không glycosyl hóa. - Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả định lượng fructosamin: + Hàm lượng albumin máu thấp ảnh hưởng trực tiếp đến giá trị của xét nghiệm fructosamin, lúc này hàm lượng fructosamin không phản ánh đúng hàm lượng đường huyết trung bình của bệnh nhân. Theo tác giả Van- DieijenVisser MP và cộng sự (2017), nồng độ albumin ở mức cao hơn hay thấp hơn 30 g/L sẽ ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm fructosamin [49]. + Trong phương pháp nitro tetrazolium (NBT) có một số yếu tố ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm fructosamin đã được chứng minh: superoxide dismutase (SOD) làm giảm quá trình khử của thuốc thử NBT.
Một số chất khi có mặt ở nồng độ cao sẽ gây ảnh hưởng không nhỏ đến kết quả như heparin, EDTA, bilirubin, triglyceride, acid ascorbic, acid uric và glutathione. Các yếu 9 tố trên làm kết quả fructosamin tăng giả tạo. Trong đó heparin, EDTA, Bilirubin phải đạt đến nồng độ rất cao trong mẫu máu mới có thể gây sai số rõ rệt. Điều này ít gặp trên lâm sàng.
Riêng acid uric ở nồng độ 0,93 µmol/l đã gây sai số [32]. Do đó, thuốc thử NBT dùng để định lượng fructosamin ngày nay đều được bổ sung uricase enzym thủy phân acid uric, loại bỏ ảnh hưởng của acid uric đến kết quả xét nghiệm. HbA1c - Hemoglobin và quá trình tạo thành HbA1c: Hemoglobin (Hb) là một protein màu (chromoprotein), gồm một phân tử globin gắn với bốn nhân hem. Sự tổng hợp Hb bắt đầu từ giai đoạn tiền nguyên hồng cầu đến giai đoạn hồng cầu lưới ở trong tủy xương.
Quá trình tạo thành Hb gồm có tổng hợp hem và tổng hợp globin.