Khuếch đại gen nấm Candida albicans bằng cặp mồi đặc hiệu

Nấm Candida albicans là một trong những tác nhân gây bệnh phổ biến nhất trong cộng đồng. 59 trang · Đại học Y Hà Nội · 2023.

• Tác giả: Nguyễn Thủy Đương
• Người hướng dẫn: ThS. Đồ Thị Thanh Huyền
• Trường học: Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Kỹ thuật Y học
• Đề tài: Tối ưu hóa khuếch đại gen nấm Candida albicans bằng kỹ thuật PCR
• Loại tài liệu: khóa luận
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CÁM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Nấm Candida albicans
• 1.2. Lịch sử, nguồn gốc về nấm Candida và Candida albicans
• 1.3. Đặc điểm của nấm Candida albicans
• 1.4. Bộ gen của Candida albicans
• 1.5. Gen ACC1 của nấm Candida albicans
• 1.6. Dịch tễ học nhiễm nấm Candida và Candida albicans
• 1.7. Các yếu tố độc lực Candida albicans
• 1.8. Cơ chế gây bệnh Candida albicans
• 1.9. Các bệnh gây ra bởi nấm Candida albicans
• 1.10. Các kỹ thuật phát hiện nấm Candida albicans
• 1.10.1. Polymerase Chain Reaction (PCR)
• 1.10.2. Các thành phần phản ứng
• 1.10.3. Nguyên tắc của PCR
• 1.10.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình PCR
• 1.10.5. Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi trong PCR
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Thiết kế nghiên cứu
• 2.5. Quy trình thực hiện
• 2.6. Đạo đức trong nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Kết quả tách DNA
• 3.2. Kết quả tách DNA từ mẫu nấm Candida albicans
• 3.3. Kết quả tách chiết DNA từ mẫu môi trường nuôi cấy nến
• 3.4. Kết quả chuẩn hóa mồi Candida albicans
• 3.5. Kết quả tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi
• 3.6. Kết quả khảo sát điều kiện tối ưu hóa nhiệt độ trên mẫu môi trường nuôi cấy nến
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Kết quả tách chiết DNA
• 4.2. Trình tự mồi sử dụng
• 4.3. Kết quả chuẩn hóa cặp mồi của nấm Candida albicans
• 4.4. Kết quả tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi
• 4.5. Khảo sát điều kiện tối ưu hóa nhiệt độ trên mẫu môi trường nuôi cấy nến
• 4.6. Tình hình nghiên cứu nấm Candida albicans
• 4.7. Nghiên cứu trên thế giới
• 4.8. Nghiên cứu tại Việt Nam
• 4.9. Ưu nhược điểm của kỹ thuật PCR
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về tối ưu hóa khuếch đại gen nấm Candida albicans

Nấm Candida albicans là một trong những tác nhân gây bệnh phổ biến nhất trong cộng đồng. Việc tối ưu hóa kỹ thuật khuếch đại gen nấm Candida albicans bằng phương pháp PCR là rất cần thiết để phát hiện và điều trị kịp thời các nhiễm trùng do nấm này. Kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại DNA, giúp xác định sự hiện diện của nấm trong mẫu bệnh phẩm một cách nhanh chóng và chính xác. Nghiên cứu này sẽ tập trung vào các phương pháp tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi trong PCR để đạt được hiệu quả cao nhất trong việc khuếch đại gen của nấm.

1.1. Lịch sử và nguồn gốc của nấm Candida albicans

Nấm Candida albicans đã được phát hiện từ thời cổ đại và được biết đến như một tác nhân gây bệnh. Nấm này thường cư trú trong cơ thể người và có thể gây ra các bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng khi hệ miễn dịch suy yếu. Việc hiểu rõ về nguồn gốc và lịch sử của nấm này giúp nâng cao nhận thức về các bệnh do nó gây ra.

1.2. Đặc điểm sinh học của nấm Candida albicans

Nấm Candida albicans có khả năng tồn tại dưới dạng nấm men hoặc sợi tùy thuộc vào điều kiện môi trường. Đặc điểm này cho phép nấm thích nghi và phát triển trong nhiều điều kiện khác nhau, từ đó gây ra các bệnh nhiễm trùng. Sự thay đổi hình thái này là một yếu tố quan trọng trong khả năng gây bệnh của nấm.

II. Thách thức trong việc phát hiện nấm Candida albicans

Việc phát hiện nấm Candida albicans gặp nhiều thách thức do sự đa dạng về hình thái và khả năng kháng thuốc của nó. Các phương pháp truyền thống như nuôi cấy có thể mất nhiều thời gian và không luôn cho kết quả chính xác. Do đó, việc áp dụng kỹ thuật PCR để phát hiện nấm là một giải pháp hiệu quả, nhưng cũng cần tối ưu hóa để đạt được độ nhạy và độ đặc hiệu cao.

2.1. Những khó khăn trong chẩn đoán nấm Candida

Chẩn đoán nấm Candida albicans thường gặp khó khăn do sự tương đồng với các loài nấm khác. Điều này có thể dẫn đến việc chẩn đoán sai và điều trị không hiệu quả. Việc sử dụng PCR giúp giảm thiểu những sai sót này.

2.2. Tác động của kháng thuốc đến việc điều trị

Kháng thuốc là một vấn đề lớn trong điều trị nhiễm nấm Candida albicans. Sự xuất hiện của các chủng kháng thuốc làm cho việc điều trị trở nên phức tạp hơn. Do đó, việc phát hiện sớm và chính xác là rất quan trọng.

III. Phương pháp tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi trong PCR

Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi là một bước quan trọng trong quy trình PCR để đảm bảo sự khuếch đại hiệu quả của DNA. Nghiên cứu này sẽ trình bày các phương pháp tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi cho nấm Candida albicans, từ đó nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR.

3.1. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR dựa trên nguyên tắc khuếch đại DNA thông qua các chu kỳ nhiệt độ khác nhau. Mỗi chu kỳ bao gồm ba bước: gắn mồi, kéo dài và tái tạo. Việc tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi là rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất.

3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình PCR

Nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến quá trình PCR, bao gồm nồng độ mồi, nồng độ DNA mẫu và nhiệt độ gắn mồi. Việc điều chỉnh các yếu tố này sẽ giúp tối ưu hóa quy trình và nâng cao hiệu quả khuếch đại.

IV. Ứng dụng thực tiễn của kỹ thuật PCR trong nghiên cứu nấm

Kỹ thuật PCR đã được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chẩn đoán nấm Candida albicans. Việc tối ưu hóa quy trình PCR không chỉ giúp phát hiện nấm nhanh chóng mà còn hỗ trợ trong việc nghiên cứu các đặc điểm di truyền của nấm. Kết quả nghiên cứu cho thấy kỹ thuật này có thể cải thiện đáng kể khả năng phát hiện nấm trong các mẫu bệnh phẩm.

4.1. Kết quả nghiên cứu về khuếch đại gen nấm

Nghiên cứu cho thấy việc tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi giúp tăng cường khả năng khuếch đại gen của nấm Candida albicans. Kết quả này mở ra hướng đi mới trong việc phát hiện và điều trị các bệnh nhiễm trùng do nấm.

4.2. Ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng

Kỹ thuật PCR đã được áp dụng trong chẩn đoán lâm sàng để phát hiện nấm Candida albicans trong các mẫu bệnh phẩm. Điều này giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị kịp thời và chính xác hơn.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu nấm Candida albicans

Nghiên cứu về nấm Candida albicans và kỹ thuật PCR đang mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát hiện và điều trị các bệnh nhiễm trùng. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại những tiến bộ đáng kể trong lĩnh vực y học, đặc biệt là trong việc phát hiện sớm và điều trị hiệu quả các bệnh do nấm gây ra.

5.1. Tương lai của kỹ thuật PCR trong nghiên cứu nấm

Kỹ thuật PCR sẽ tiếp tục được cải tiến để nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu trong việc phát hiện nấm Candida albicans. Các nghiên cứu mới sẽ tập trung vào việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác hơn.

5.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu nấm trong y học

Nghiên cứu về nấm Candida albicans không chỉ giúp nâng cao hiểu biết về bệnh lý mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Candida albicans là loài nấm thuộc lớp Saccharomyces, tồn tại bình thường trên màng nhầy đường hô hấp, đường tiêu hóa và bộ phận sinh dục người. Khi hệ vi sinh vật hoặc hệ miễn dịch của vật chủ bị rối loạn, loài nấm này có thể phát triển và gây bệnh từ nhiễm trùng niêm mạc đến nhiễm trùng xâm lấn toàn thân. Trên thế giới, nhiễm nấm Candida xâm lấn (IC) ảnh hưởng đến hơn 25.000 người mỗi năm, trong đó hơn 90% ca IC do C. albicans gây ra. Tại Hoa Kỳ, Candida là một trong năm tác nhân gây nhiễm trùng máu bệnh viện (BSIs) hàng đầu, chiếm 8%–10% các ca BSIs, với tỉ lệ tử vong do IC xấp xỉ 0,4 trường hợp trên 100.000 dân kể từ năm 1997. Việc trì hoãn điều trị kháng nấm mỗi 12–24 giờ có thể khiến tỉ lệ tử vong tăng lên đến 100%.

Bối cảnh đó đặt ra yêu cầu cấp thiết về một phương pháp chẩn đoán nhanh, nhạy và đặc hiệu. Kỹ thuật PCR có độ nhạy 92% và độ đặc hiệu 95%, cho kết quả trong 2–4 giờ, được đánh giá là một trong những phương pháp phát hiện đáng tin cậy hiện nay. Tuy nhiên, để PCR hoạt động chính xác, điều kiện phản ứng — đặc biệt là nhiệt độ gắn mồi (Ta) — phải được tối ưu hóa. Đây là xuất phát điểm của khóa luận "Khuếch đại gen của nấm Candida albicans bằng cặp mồi đặc hiệu".

Mục tiêu nghiên cứu:

1. Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi của phản ứng PCR để xác định nấm Candida albicans với trình tự mồi đặc hiệu.
2. Khảo sát điều kiện nhiệt độ đã tối ưu trên mẫu mô đúc nến.

Đối tượng và phạm vi:

• Đối tượng: Mẫu nấm Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis nuôi cấy phân lập tại Bệnh viện Da liễu Trung ương; 24 mẫu mô đúc nến từ bệnh phẩm vòm họng.
• Thời gian: Tháng 9/2022 – tháng 5/2023.
• Địa điểm: Trung tâm Nghiên cứu Gen–Protein, Trường Đại học Y Hà Nội.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và khái niệm

Khóa luận dựa trên các kiến thức nền về sinh học phân tử và vi nấm học lâm sàng, bao gồm:

• Đặc điểm sinh học của Candida albicans: Thuộc ngành Ascomycota, có khả năng chuyển đổi hình thái giữa bào tử nấm (blastospores), giả sợi nấm (pseudohyphae) và sợi nấm (hyphae) — cơ chế trung tâm của quá trình gây bệnh.
• Gen ACC1 (gen nội chuẩn): Mã hóa enzyme acetyl CoA carboxylase (ACCase), cần thiết cho sinh tổng hợp axit béo và sự tồn tại của nấm. Trình tự DNA mã hóa gen ACC1 có 6.810 nucleotide, protein tương ứng gồm 2.270 axit amin. Vùng locus gen ACC1 có sự khác biệt tương đối cao so với vùng tương ứng của Saccharomyces cerevisiae, tạo cơ sở cho thiết kế mồi đặc hiệu.
• Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer): Vùng DNA đệm giữa các gen rRNA, gồm ITS1 (200–300 bp) và ITS2 (180–240 bp), được sử dụng rộng rãi trong phân loại và nhận diện nấm.
• Bộ gen C. albicans: Gồm 8 cặp nhiễm sắc thể, kích thước bộ gen xấp xỉ 16 Mb, 14.419 khung đọc mở (ORF) dài hơn 100 codon; đặc điểm codon CUG được dịch thành serine.
• Nguyên lý PCR: Dựa trên tính chất biến tính – hồi tính của DNA và hoạt tính tổng hợp của enzyme DNA polymerase qua ba giai đoạn lặp lại: biến tính (94–95°C), gắn mồi (55–70°C), kéo dài (72°C).

Phương pháp nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu là nghiên cứu khảo sát thực nghiệm trên mẫu mô đúc nến. Quy trình kỹ thuật gồm các bước:

1. Tách chiết DNA: Sử dụng kit QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (code 56401) cho cả mẫu nấm nuôi cấy và mẫu mô đúc nến. Quy trình mô đúc nến gồm 11 bước: khử paraffin bằng xylene, rửa bằng ethanol 100%, phá vỡ tế bào mô, biến tính DNA ở 90°C/1 giờ, sau đó tinh chế qua cột.
2. Kiểm tra chất lượng DNA: Đo mật độ quang trên máy Nanodrop 2000c, đánh giá tỉ lệ A260/280 và A260/230.
3. Chuẩn hóa cặp mồi: Chạy PCR với DNA của 3 loài nấm (C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis) để kiểm tra tính đặc hiệu.
4. Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi: Sử dụng phương pháp gradient nhiệt với 6 mức nhiệt độ (56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C), 40 chu kỳ PCR.
5. Khảo sát trên mẫu mô đúc nến: Chạy PCR với nhiệt độ tối ưu đã xác định trên 24 mẫu DNA mô vòm họng đúc nến.
6. Điện di: Trên gel agarose 1,5% trong đệm TBE, hiệu điện thế 120V, sử dụng marker 100 bp; nhuộm Ethidium bromide và đọc kết quả dưới ánh sáng UV.

Nguồn dữ liệu

Dữ liệu thực nghiệm: kết quả đo quang Nanodrop 2000c, ảnh điện di gel agarose. Cặp mồi tham khảo từ nghiên cứu của tác giả MF Mushi và cộng sự ("Đa dạng về kiểu trình tự lưỡng bội của các chủng Candida albicans phân lập lâm sàng từ một bệnh viện chăm sóc hạng 3 ở Mwanza, Tanzania"); tính đặc hiệu mồi được xác nhận bởi nghiên cứu của M. Morand ("Tính hữu ích của nhập trình tự đa điểm mô tả đặc điểm của chủng nấm Candida albicans lâm sàng").

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương này trình bày hệ thống kiến thức nền về Candida albicans, bao gồm lịch sử phát hiện từ thời Hippocrates (khoảng năm 400 trước Công nguyên) qua Langenback (1839) đến phân loại chính thức của Charles Philippe Robin (1847). Hiện nay chi Candida đã được xác định có hơn 200 loài.

Tổng quan mô tả chi tiết đặc điểm hình thái (kích thước 3–5 µm, cấu tạo đơn bào), các dạng hình thái (blastospores, pseudohyphae, hyphae) và cơ chế gây bệnh thông qua các yếu tố độc lực: candidalysin (peptide 31 axit amin phá hủy màng tế bào vật chủ), protein bám dính Als3 và Hwp1, màng sinh học (biofilm) và các enzyme hydrolase (protease, phospholipase, lipase). Chương cũng hệ thống hóa dữ liệu dịch tễ học từ nhiều nghiên cứu quốc tế và trong nước:

Nghiên cứu	Địa điểm / Đối tượng	Kết quả liên quan đến C. albicans
Trung tâm Ung thư ĐH Tôn Trung Sơn (2011–2022)	606 bệnh nhân ung thư vòm họng sau xạ trị	62 ca (10,2%) nhiễm Candida hầu họng
Miền trung Thụy Điển (1998–1999)	191 trường hợp nấm máu	128 ca (67%) do C. albicans
Liên đoàn bệnh lý y tế châu Âu (28 tháng, 7 nước)	Giám sát bệnh viện	C. albicans chiếm 56% ca nhiễm nấm máu
BV ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh CS2 (10/2019–4/2020)	333 phụ nữ viêm âm đạo	26,7% do vi nấm Candida; trong số đó C. albicans chiếm 68,2%
BV Nguyễn Trãi (3/2022–9/2022)	102 bệnh nhân thở máy tại ICU	Nhiễm vi nấm Candida 82,8%, chủ yếu là C. albicans (44%)
Bệnh viện ĐH Y khoa Vinh (01–04/2021)	42 bệnh nhân dưới 15 tuổi	C. albicans chiếm 88,1%, chủ yếu nhiễm ở miệng

Phần cuối chương so sánh các kỹ thuật phát hiện (nuôi cấy, huyết thanh học, LAMP, PCR) và lý giải lý do chọn PCR làm phương pháp trọng tâm, đồng thời trình bày chi tiết các thành phần phản ứng PCR, nguyên tắc, các yếu tố ảnh hưởng và phương pháp tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi (gradient nhiệt, touchdown PCR).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương mô tả đầy đủ tiêu chuẩn lựa chọn mẫu (mô nến cần đủ 5–8 mảnh cắt, độ dày 5–10 µm) và tiêu chuẩn loại trừ (mảnh cắt không trúng bệnh phẩm, không đủ số lượng, mẫu nến bị tơi). Danh mục trang thiết bị được liệt kê cụ thể: máy ly tâm Eppendorf Centrifuge 5424R, máy vortex Eppendorf Mix Mate, máy đo quang Nanodrop 2000c (Thermo), máy lắc nhiệt Eppendorf Thermomixer 437.

Quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô đúc nến gồm 11 bước chi tiết với các thông số kỹ thuật cụ thể (tốc độ ly tâm, nhiệt độ ủ, thể tích hóa chất). Thành phần phản ứng PCR (tổng thể tích 10 µl) được trình bày rõ: Mastermix 2X (5 µl), mồi xuôi 5 pmol/µl (0,5 µl), mồi ngược 5 pmol/µl (0,5 µl), nước cất 2 lần (2 µl), DNA (2 µl). Chu trình nhiệt: biến tính đầu 95°C/5 phút → 40 chu kỳ (95°C/35s – Ta/45s – 72°C/35s) → kéo dài cuối 72°C/5 phút → bảo quản 15°C.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương trình bày tuần tự ba nhóm kết quả thực nghiệm.

Tách chiết DNA: Mẫu DNA nấm C. albicans đạt nồng độ 105,8 ng/µl, tỉ lệ A260/280 = 1,8–2,0 (không lẫn protein), tỉ lệ A260/230 = 2,2 (không lẫn tạp chất/carbohydrate). 24 mẫu mô đúc nến (KV18–KV42) có nồng độ dao động từ 3,6 ng/µl, tỉ lệ A260/280 trong khoảng 1,8–2,0 (trừ mẫu KV33 có A260/280 = 2,1 cho thấy lẫn ít tạp chất protein); một số mẫu có tỉ lệ A260/230 ngoài khoảng tiêu chuẩn 2–2,2 do còn lẫn carbohydrate từ mô đúc nến.

Chuẩn hóa cặp mồi: Kết quả điện di trên gel agarose cho thấy giếng số 1 (DNA C. albicans) xuất hiện 1 vạch rõ nét, kích thước 519 bp, không có vạch phụ. Giếng số 2 (C. glabrata) và giếng số 3 (C. parapsilosis) không xuất hiện vạch. Chứng âm không có sản phẩm khuếch đại. Kết quả xác nhận cặp mồi có tính đặc hiệu hoàn toàn với C. albicans, không bắt cặp vùng gen của C. glabrata và C. parapsilosis.

Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi: Khảo sát gradient 6 mức nhiệt độ (56°C–61°C) cho thấy vạch khuếch đại đậm nhất ở 56°C, độ sáng giảm dần khi tăng nhiệt độ, không xuất hiện vạch ở 60°C và 61°C. Nhiệt độ gắn mồi tối ưu được xác định là 56°C.

Khảo sát trên 24 mẫu mô đúc nến: Kết quả cho thấy mẫu KV24 dương tính với vạch điện di có kích thước 519 bp bằng với chứng dương. Các mẫu còn lại âm tính. Một số mẫu (KV19, KV33) xuất hiện sản phẩm không đặc hiệu; mẫu KV30 xuất hiện smear.

Chương 4: Bàn luận

Chương phân tích nguyên nhân các kết quả thu được và đặt trong bối cảnh nghiên cứu tổng thể. Về chất lượng DNA mô đúc nến: quá trình cố định bằng formalin hình thành liên kết DNA–formalin, DNA–protein; formalin bị oxy hóa thành acid formic gây khử purin DNA dẫn đến đứt gãy chuỗi. Paraffin không được khử hoàn toàn cũng là chất ức chế PCR. Điều này giải thích tại sao tỉ lệ A260/230 của một số mẫu nằm ngoài khoảng tiêu chuẩn và lý do xuất hiện sản phẩm không đặc hiệu. Về cặp mồi: tác giả phân tích chi tiết các thông số theo nguyên tắc thiết kế mồi — chiều dài (mồi xuôi 23 nt, mồi ngược 21 nt đạt yêu cầu), hàm lượng GC (mồi xuôi 26,1%, mồi ngược 38,5% — thấp hơn ngưỡng 40–60%, tiềm ẩn nguy cơ liên kết không đặc hiệu), nhiệt độ nóng chảy Tm (mồi xuôi 58,8°C, mồi ngược 61,5°C, cách nhau 3°C — đáp ứng yêu cầu). Chương cũng so sánh với các nghiên cứu trong nước và quốc tế về tình hình nghiên cứu C. albicans và ưu/nhược điểm của kỹ thuật PCR.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

• Tách chiết thành công DNA nấm Candida albicans đạt tiêu chuẩn PCR: nồng độ 105,8 ng/µl, A260/280 = 1,8–2,0, A260/230 = 2,2.
• Xác nhận tính đặc hiệu của cặp mồi: khuếch đại đoạn DNA 519 bp đặc hiệu cho C. albicans, không phản ứng chéo với C. glabrata và C. parapsilosis.
• Xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 56°C qua phương pháp gradient nhiệt (khảo sát 6 mức 56°C–61°C, 40 chu kỳ).
• Khảo sát thành công trên 24 mẫu mô đúc nến vòm họng: mẫu KV24 dương tính với kích thước sản phẩm 519 bp tương ứng chứng dương; 23 mẫu còn lại âm tính.

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

Tác giả nêu cần thực hiện thêm các bước: lấy lại mẫu, tinh sạch mẫu, tối ưu nồng độ mồi và nồng độ DNA để nâng cao độ chính xác kết quả. Việc bổ sung chứng nội chuẩn được khuyến nghị để loại trừ khả năng âm tính giả.

Đóng góp so với nghiên cứu trước

Khóa luận thiết lập được quy trình PCR với cặp mồi đặc hiệu bắt cặp vùng gen ACC1 của C. albicans chủng SC5314 và xác định điều kiện nhiệt độ gắn mồi tối ưu (56°C) phù hợp với điều kiện thiết bị tại Trung tâm Nghiên cứu Gen–Protein, Trường Đại học Y Hà Nội. Đây là bước đầu kiểm chứng khả năng ứng dụng PCR trên nguồn mẫu mô đúc nến — loại mẫu lưu trữ phổ biến, sẵn có và chi phí bảo quản thấp — trong việc phát hiện hồi cứu nấm C. albicans.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Tác giả tự nhận định các hạn chế cụ thể trong phần bàn luận:

• Thiếu chứng nội chuẩn: Chưa thực hiện được chứng nội chuẩn để loại trừ âm tính giả, đây là điểm hạn chế được nêu rõ.
• Quy mô mẫu nhỏ: Cỡ mẫu 24 mẫu mô đúc nến chưa đủ để kết luận có tính đại diện cao; một số mẫu bị nhiễu do chất lượng DNA thấp (KV19, KV33 có sản phẩm không đặc hiệu; KV30 có smear).
• Hóa chất và thiết bị còn hạn chế: Chưa thể thực hiện bước lấy lại mẫu, tinh sạch mẫu, tối ưu nồng độ mồi và nồng độ DNA.
• Hướng mở: Mở rộng cỡ mẫu, bổ sung chứng nội chuẩn, so sánh song song với phương pháp nuôi cấy hoặc LAMP; khảo sát trên các loại bệnh phẩm khác (máu, gạc âm đạo) để đánh giá toàn diện hơn khả năng ứng dụng lâm sàng của quy trình.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận có giá trị tham khảo chủ yếu cho các đối tượng sau:

• Sinh viên ngành Kỹ thuật Y học, Y sinh học, Vi sinh học đang thực hiện khóa luận liên quan đến kỹ thuật PCR, tối ưu hóa điều kiện phản ứng phân tử sinh học, hoặc phát hiện tác nhân nấm gây bệnh.
• Sinh viên y khoa và dược học nghiên cứu về bệnh nhiễm nấm Candida và các phương pháp chẩn đoán.
• Kỹ thuật viên phòng xét nghiệm muốn tìm hiểu quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô đúc nến bằng kit QIAamp DNA FFPE Tissue Kit và các thông số kỹ thuật điện di gel agarose.

Phần đáng tham khảo nhất: Chương 1 (tổng hợp dịch tễ học và so sánh các kỹ thuật phát hiện), Chương 2 (quy trình tách chiết DNA mô đúc nến 11 bước và thành phần phản ứng PCR), Chương 3 và 4 (phân tích kết quả gradient nhiệt và lý giải nguyên nhân các vạch không đặc hiệu trên mẫu mô đúc nến).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nhiệt độ gắn mồi tối ưu được chọn là 56°C, trong khi nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi dự đoán cho Ta trong khoảng 53–57°C?

Tác giả muốn tăng độ đặc hiệu của phản ứng nên không chọn nhiệt độ thấp trong khoảng dự đoán mà thực hiện gradient từ 56°C đến 61°C. Kết quả điện di cho thấy vạch khuếch đại đậm nhất ở 56°C, độ sáng giảm dần khi tăng nhiệt độ và không xuất hiện vạch ở 60°C và 61°C, do đó 56°C được xác nhận là tối ưu.

2. Cặp mồi trong nghiên cứu này bắt cặp vào vùng gen nào của C. albicans và kích thước sản phẩm khuếch đại là bao nhiêu?

Cặp mồi bắt cặp vào vùng gen ACC1 (gen nội chuẩn mã hóa acetyl CoA carboxylase) của C. albicans chủng SC5314: mồi xuôi bắt cặp từ vị trí nucleotide 3184 đến 3206, mồi ngược bắt cặp từ vị trí 3682 đến 3700. Sản phẩm khuếch đại có kích thước 519 bp.

3. Tại sao một số mẫu mô đúc nến (KV19, KV30, KV33) cho kết quả không rõ ràng hoặc có vạch không đặc hiệu?

Tác giả giải thích do đặc điểm của mẫu mô đúc nến: quá trình cố định bằng formalin tạo liên kết DNA–formalin và DNA–protein, formalin bị oxy hóa thành acid formic gây đứt gãy chuỗi DNA; paraffin nếu không khử hoàn toàn sẽ ức chế PCR. Cụ thể KV19, KV33 có sản phẩm không đặc hiệu do DNA bị đứt gãy; KV30 xuất hiện smear do mẫu chứa chất ức chế hoặc DNA bị đứt gãy.

4. Tính đặc hiệu của cặp mồi được kiểm chứng như thế nào trong nghiên cứu này?

Tác giả chạy PCR với cùng một cặp mồi trên DNA của ba loài nấm cùng chi Candida: C. albicans (giếng 1), C. glabrata (giếng 2), C. parapsilosis (giếng 3), kèm chứng âm (giếng 4). Kết quả: chỉ giếng 1 xuất hiện vạch rõ nét 519 bp, giếng 2 và 3 không có vạch, chứng âm không có sản phẩm khuếch đại, xác nhận cặp mồi đặc hiệu cho C. albicans.

5. Tại sao vạch điện di của mẫu KV24 mờ hơn so với chứng dương dù được kết luận là dương tính?

Tác giả nhận định nguyên nhân có thể do nồng độ DNA của nấm C. albicans trong mẫu bệnh phẩm ít, hoặc chất lượng DNA bị thoái hóa và đứt gãy trong quá trình lưu trữ mô đúc nến dài hạn, làm giảm hiệu quả khuếch đại. Việc chưa có chứng nội chuẩn cũng là yếu tố hạn chế khả năng loại trừ âm tính giả cho các mẫu còn lại.

---

Kết luận

Khóa luận của sinh viên Nguyễn Thủy Dương (Lớp Y4XN, Khoa Kỹ thuật Y học, Trường Đại học Y Hà Nội, 2023) đã thiết lập và kiểm chứng quy trình PCR với cặp mồi đặc hiệu bắt cặp vùng gen ACC1 để phát hiện nấm Candida albicans, xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 56°C qua phương pháp gradient nhiệt. Nghiên cứu còn bước đầu khảo sát khả năng ứng dụng quy trình này trên nguồn mẫu mô đúc nến — loại bệnh phẩm lưu trữ sẵn có trong thực hành lâm sàng — và ghi nhận một mẫu dương tính trong số 24 mẫu vòm họng được kiểm tra. Các hạn chế về cỡ mẫu, thiếu chứng nội chuẩn và ảnh hưởng của quá trình xử lý mô đúc nến đến chất lượng DNA được tác giả nhận diện rõ, tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo ở quy mô lớn hơn và điều kiện kỹ thuật hoàn thiện hơn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I TONG QUAN 1. Nẩrn Candida albicans 1.Ịch sứ, nguồn gốc về nấm Candida và Candida albicans: Lịch sứ phát hiện và đật tên cho Candida kéo dài từ thời Hy Lạp cố dại cho dền các nhả nghiên cứu hiện đại. Nhận thức về Candida dà phát triển từ khi xuất hiện loại nấm này trong dịch tiết cùa con người thành một tác nhân truyền nhiễm. Trong tác phẩm “Of the Epidemics” Hippocrates dà mô ta bệnh nấm miệng (khoáng năm 400 trước Công nguyên) là “miệng bị loét áp-tơ”.

Đen nâm 1665 Pepys Diary dà báo cáo phát hiện "Một bệnh nhân bị sốt. hay có cơn đau vã bị nấc”, duy tri quan diêm cho rang bệnh tưa miệng bat nguồn từ vật chú. Năm 1839, Langcnbcck dược công nhận là người dầu tiên nhận ra một loại mun ờ bệnh nhãn mac bệnh thương hãn. tuy nhiên ông gán thực thè nãy cho vi khuân thương hàn chứ không phai nấm.

Bennett dã quan sát thấy một loại nắm tương tự trong đờm. phối cua một bệnh nhân bị trân khí màng phối và chi trích kct luận cùa Langenbach. Năm 1847, nhà nấm học nôi tiếng người Pháp Charles Philippe Robin, dà phân loại nấm này là Oidium albicans dè dật tên cho loại nấm gày bệnh lưa miệng. Hiện nay chi Candida dã được xác định có lum 200 loài khác nhau.

Trong đỏ Candida albicans là loài thường dược phân lập và gây bệnh nhiễm trùng. Candida albicans xuất phát tử chừ latin “candeõ” (candidus) áo choàng cỏn “albicỡ” nghía là dần trơ thảnh máu trắng. Thuật ngừ nãy do nhã sinh học Pháp Charles-Philippe Robin và nhà Nấm hục Christine Marie Berkhout dặt tên. Đặc điểm của nấm Candida albicans: Candida albicans Giuộc lóp Saccharomyces ngành Ascomycota.

là một phần hệ vi khuẩn binh thưởng ớ màng nhảy đường hò hấp. đường tiêu hóa và bộ phận sinh dục. Nấm thuộc dạng vi nấm. kích thước rất nho 3-5 pm.

cỏ cấu tạo dơn bão. cấu tạo bời Giành te bào. mãng tể bào. nguyên sinh chất và nhân.

• Thành tế bão được cấu tạo bời hai lớp. Lóp trong có vai trò duy trì và giừ vững hình dạng thảnh te bào. được tạo nén bời killing 0-gIucans -chitin. Lóp ngoài gồm các manoproteins.

giúp bao phu lóp trong cua thành tế bào.s • Màng tể bão tương tự máng nguyên sinh chất cua vi khuân về cấu tạo vã chức nâng. màng nấm men còn có kha nâng hoạt hóa ty thế. • Nguyên sinh chắt chứa ty the. ribosome và không bào.

• Nhàn cua tế bào nắm men lá nhãn thật, hình tròn hoặc hĩnh bầu dục. Nhân cõ sự phân hóa với kết cấu hoãn chinh. có mãng nhân và mang hệ thống thòng tin di truyền. albicans xuất hiện ơ một sổ dạng hình thãi: bão tứ nấm (blastospores) gia sợi mun (pseudohyphae) vã sợi nấm (hyphae).

Bào tư nấm phân chia vô tinh bang cách nay chồi dẫn den sự hình Giành cãc tế bào nấm men (còn được gọi là phôi bão tư hoặc phôi bào). Sự hình thành gia sợi mun xay ra do sự phán chia tế bào phân cực khi cãc tế bão nấm men phát triẩi bàng cách này chồi đà kéo dâi ra mà không tách ra khôi các tế bão lân cận. Sau khi giai đoạn tâng trướng kết thúc, cãc tế bào phán chia, theo dó tế bào con tách khói tế bào mẹ bang cách tạo ra một vách ngân.^H «4 ugc V Hl 5 Hình 1. Sự chuyến dồi hình thái Cua nẩni Candida albicans trong quá n inh lây nhiễm Khi nuôi cầy trong phòng thi nghiệm c.

albicans phát triên dưới dạng tế bào “nấm men" hình trứng. Tuy nhiên nhùng thay dối nhỏ về nhiệt độ. chất dinh dưỡng và độ pH dẫn đền sự thay dỏi hình tliái sang dạng sợi. Bộ gen của c albicans: Candida albicans là một trong nhũng nguồn nắm gày bệnh thưởng gập nhắt ở người và dược chọn dê giái trinh tự bộ gen.

albicans có thê gây nhiẻm trùng da. niêm mục ờ nliừng người khóe mạnh, thậm chi gãy nhiễm trùng đc dọa tính mạng ờ nhùng người cỏ chức nâng miền dịch bị suy giam. Trinh tự bộ gen c. albicans trẽn 8 cặp nhiêm sấc thế (trước dây được đặt tên từ 1-7 vã R) tạo thành bộ gen đơn bội có kích thước 14.419 khung dọc mơ (ORF) dài him 100 codon.

Codon CUG dược c. albicans dịch thành serine chứ không phai leucine được tim tháy it nhất một lần trong khoang hai phần ba ORF.^H «4 ugc V Hl 6 Chung SC5314 chứa 8 cặp nhiễm sắc tile. 7 trong số dó có kích think không dõi và một trong số dó là da hinli (R). với kích thước dao dộng từ 3,2 den 1,0 Mb.

Sự hiện diện cua các gcn sầp xắp song song dổi với các RNA ribosome giài thích cho sự thay dôi kích thước nãy. Kích thước bộ gen cùa chung nãy xấp XI 16 Mb. Sự sắp xếp lại số lượng vã cấu trúc nhiễm sắc thê tạo ra sự da dạng di truyền, dược gọi lả da hình chiều dài nhiễm sấc thê (co/mờ rộng các lần lụp lại), chuyển đoạn tương hồ. mắt nhiễm sẳc the vã thê ba nhiem sẩc thê.

Những thay đối này dẫn đến những thay đối về kiểu hình, đày là một cách thích nghi của loại nấm này.11 Vũng internal transcribed spacer (ITS) cua nấm MTS 1 rOWAftw* I NTS I I NTS 0 Ọ 58S I 5« 0102 0vt>2 R«90n Ỉfilth J. 2: cắu núc vùng DNA cua nắm (NTS: đoạn đệm không dược phiên nưl ETS: doụn dệm được phiên mà bèn ngoài. ITS: doạn dệrn dược phiên mờ bèn n ong) Mỗi cụm ribosome của nắm chứa đoạn đệm 5' phiên mà ngoài (5' ETS), gen 18S rRNA, ITS ì, gen 5.SS rRNA, ITS2. 28S rRNA vá cuối củng là 3' ETS.

Trong quá trinh trường thành cua rRNA. các manh ETS vã ITS dược cảt bo. là san phàm phụ không có chức năng cùa quá trinh trưởng thành này. chúng nhanh chóng bị suy thoái.*- Vùng ITS là một doạn DNA đệm không có chức nâng nằm giừa các gen rRNA.

ơ vi khuân, chi có một vùng ITS duy nhất. Nhưng ờ sinh vật nhàn chuân. có hai lừng ITS: ITSI vã 1TS2. Vũng ITSI là DNA đệm nẳm giừa cãc gen rRNA 18S và 5.8S: sự thay đôi độ dài cua 1TS1 là khoảng (200- «4 ugc V Hl 7 300bp).

ITSI đà dưực chúng minh hiệu qua cùa chúng trong việc lãm sáng tó mối quan hộ phát sinh gen giừa các loài khác nhau. Hơn nữa DNA đệm ITS1 it được bão tồn hem DNA đệm ITS2. Các cầu trúc ITS1 chi được bao tồn trong các dơn vị phân loại nho hơn nhiều. Vùng ITS2 lá một DNA đệm năm giừa các gen rRNA 5.

vùng 1TS2 có độ đài ngằn lum vùng ITS1. sự thay dời độ dài cùa ITS2 là khoảng (180-240bp). Gen ACC1 cũa nấm Ca It(tifta albicans: ACCasc lá một enzyme sinh tông hợp axit béo. cần thiết cho sự phát Iriẽn và kha nàng tồn lại cua nấm.

Gen ACCase (gen ACC1) là gen nội chuẩn cùa Candida albicans.14 Các gen nội chuẩn luôn dược biêu hiện trong các tề bão. mà hỏa cho các protein tham gia vào các quá trinh cơ biui cua tế bão.1- Trình tự nucleotide cua gen đa dạng, thích hợp cho việc phân biệt giừa các dòng và các chung. Gen ACC1 mã hóa acetyl CoA cacboxylase. trình tự DNA mà hóa gen ACC1 cua Candida albicans có 6810 nucleotide, trinh tự protein tương úng 2270 acid amin.

Dịch tễ học nhicm nấm Candida và c. Trên thếgiởi: Nghiên cứu tại Trung Tâm Ung thư Dại Học Tôn Trung Sơn từ tháng 6 nám 2011 đến tháng 5 năm 2022 trên 606 bệnh nhàn ung thư vòm họng dà trai qua xạ trị. cỏ 62 bệnh nhân (10.2%) nhiễm nấm Candida hầu họng và 544 bệnh nhân không bị nhiễm nấm Candida hầu họng.1 Từ tháng 1 nám 1998 đến tháng 12 nám 1999 phát hiên 191 truởng hụp nấm màu ớ miền trung Thụy Dien, với tý lệ 0.32/1000 ca nhập viện. Trong đó cỏ 128 trường họp (67%) do c.

30 trường họp (15.7%) gây ra bơi Candida glabrata vã 14 trường hợp (7.™ Tại nghiên cứu giám sát tại bệnh viện cua Liên đoàn bệnh lý y tế châu Ảu trong 28 tháng.089 trường hợp được ghi nhận bới bày cãc -c .^H «4 ugc V Hl s nước châu Âu (106 lố chức tại Pháp. Tây Ban Nha. Thụy Diên và Vương quốc Anh). Tý lệ nhiễm nấm máu dao dộng từ 0.000 ca nhập viện dà được báo cáo.

Candida albicans được xác định trong 56% trường hợp. Ở Việt Nam: Nghiên cứu ờ phụ nừ trên 18 tuôi cỏ triệu chứng viêm ảm dạo đen khám tại bệnh viện Đại học Y Dược thành phố Hổ Chí Minh co sờ 2 từ ngày 01/10/2019 đen 30/4/2020. Kết quà cho thấy, trong 333 trường hợp nghiên cứu cho ty lệ viêm âm dạo do vi nắm Candida là chiếm 26.7% vã 89 trường họp nhiễm nấm Candida dà phát hiện Candida albicans là 68.20 Nghiên cứu cua Nguyễn Ngọc Hóa. Nguyễn Thị Hồng Diệp tại Khoa khám bệnh.

Bệnh viện trường Đại học Y khoa Vinh từ 01/2021 den 04/2021 trẽn 42 bệnh nhân dưới 15 tuồi nhiêm nấm. Kết quá cho thầy, tý lệ nlũcm nắm c. albicans ờ tre em (88.1%) chu yếu nhiễm ớ miệng.21 Nghiên cứu mô ta cắt ngang trên 102 bệnh nhân thư máy tại Khoa hồi sức tích cực Bệnh viện Nguyền Trãi từ tháng 3/2022 den tháng 9/2022. Tỳ lộ nhiễm vi nấm Candida lên tói 82.8% và chú yếu là Candida albicans (44.

Các yểu tố dộc lực Candida albicans: Candida albicans có kha nâng xâm lẩn. gãy nhiễm trùng và lây lan nhiễm trùng nhờ vào cãc yell tố dộc lực cua chúng. Sự thay đồi hình thái là một dấu hiệu cho quâ ti inh chuyên từ trạng thãi hội sinh sang gãy bệnh cua nấm Candida albicans. Chúng dược the hiện qua sự chuyên từ bão tư nấm (blastospores) sang gia sợi nấm (pseudohyphae) vã sau dỏ là sợi nấm (hypliae).

Ớ dạng sợi nấm. các tề bào xâm nhập vào mỏ cua vật chu bang cách chu dộng và gãy cảm ứng nhập bào. Một dộc tó dậc hiệu cua sợi nấm c. albicans là candidalysin.

Candidalysin là một peptide gồm 31 -c .^H «4 ugc V Hl 9 axit amin. có vai trờ quan trọng trụng phá huý các tế bão vật chu. gãy nhiễm trùng hệ thống vã đần tới tứ vong. Candidalysin cõ kha năng gây tôn thương trực tiếp lên máng biền mô bang each xen kẻ.

thẩm và tạo lồ xốp lãm cho các thành phẩn tế bào chắt yếu đi. yếu tố góp phần vào kha năng gây bệnh cua c. albicans là sự biêu hiện cua các protein quan trọng trong quá trinh dinh vã xâm nhập. Quá trinh dinh bị anh hương bỡi rất nhiều yếu tồ như loại protein cùa vách te bào; dặc diêm vật lý.

hoã học cùa bề mặt màng tế bào. albicans dinh vào tế bào vật chù bằng cách nhận ra các protein, fibrinogens, fibronectins và gắn với chúng thòng qua Als3 và Hwpl. Đây là các protein dược biêu hiện chu yếu trong giai đoạn tạo sợi mun.