Khuếch đại gen nấm Candida albicans bằng cặp mồi đặc hiệu

Tài liệu nghiên cứu Khuếch đại gen của nấm candida albicans bằng cặp mồi đặc hiệu, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên sâu về .

• Tác giả: Nguyễn Thủy Đương
• Người hướng dẫn: ThS. Đồ Thị Thanh Huyền
• Trường học: Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Kỹ thuật Y học
• Đề tài: Tối ưu hóa khuếch đại gen nấm Candida albicans bằng kỹ thuật PCR
• Loại tài liệu: khóa luận
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CÁM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Nấm Candida albicans
• 1.2. Lịch sử, nguồn gốc về nấm Candida và Candida albicans
• 1.3. Đặc điểm của nấm Candida albicans
• 1.4. Bộ gen của Candida albicans
• 1.5. Gen ACC1 của nấm Candida albicans
• 1.6. Dịch tễ học nhiễm nấm Candida và Candida albicans
• 1.7. Các yếu tố độc lực Candida albicans
• 1.8. Cơ chế gây bệnh Candida albicans
• 1.9. Các bệnh gây ra bởi nấm Candida albicans
• 1.10. Các kỹ thuật phát hiện nấm Candida albicans
• 1.10.1. Polymerase Chain Reaction (PCR)
• 1.10.2. Các thành phần phản ứng
• 1.10.3. Nguyên tắc của PCR
• 1.10.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình PCR
• 1.10.5. Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi trong PCR
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Thiết kế nghiên cứu
• 2.5. Quy trình thực hiện
• 2.6. Đạo đức trong nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Kết quả tách DNA
• 3.2. Kết quả tách DNA từ mẫu nấm Candida albicans
• 3.3. Kết quả tách chiết DNA từ mẫu môi trường nuôi cấy nến
• 3.4. Kết quả chuẩn hóa mồi Candida albicans
• 3.5. Kết quả tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi
• 3.6. Kết quả khảo sát điều kiện tối ưu hóa nhiệt độ trên mẫu môi trường nuôi cấy nến
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Kết quả tách chiết DNA
• 4.2. Trình tự mồi sử dụng
• 4.3. Kết quả chuẩn hóa cặp mồi của nấm Candida albicans
• 4.4. Kết quả tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi
• 4.5. Khảo sát điều kiện tối ưu hóa nhiệt độ trên mẫu môi trường nuôi cấy nến
• 4.6. Tình hình nghiên cứu nấm Candida albicans
• 4.7. Nghiên cứu trên thế giới
• 4.8. Nghiên cứu tại Việt Nam
• 4.9. Ưu nhược điểm của kỹ thuật PCR
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về tối ưu hóa khuếch đại gen nấm Candida albicans

Nấm Candida albicans là một trong những tác nhân gây bệnh phổ biến nhất trong cộng đồng. Việc tối ưu hóa kỹ thuật khuếch đại gen nấm Candida albicans bằng phương pháp PCR là rất cần thiết để phát hiện và điều trị kịp thời các nhiễm trùng do nấm này. Kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại DNA, giúp xác định sự hiện diện của nấm trong mẫu bệnh phẩm một cách nhanh chóng và chính xác. Nghiên cứu này sẽ tập trung vào các phương pháp tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi trong PCR để đạt được hiệu quả cao nhất trong việc khuếch đại gen của nấm.

1.1. Lịch sử và nguồn gốc của nấm Candida albicans

Nấm Candida albicans đã được phát hiện từ thời cổ đại và được biết đến như một tác nhân gây bệnh. Nấm này thường cư trú trong cơ thể người và có thể gây ra các bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng khi hệ miễn dịch suy yếu. Việc hiểu rõ về nguồn gốc và lịch sử của nấm này giúp nâng cao nhận thức về các bệnh do nó gây ra.

1.2. Đặc điểm sinh học của nấm Candida albicans

Nấm Candida albicans có khả năng tồn tại dưới dạng nấm men hoặc sợi tùy thuộc vào điều kiện môi trường. Đặc điểm này cho phép nấm thích nghi và phát triển trong nhiều điều kiện khác nhau, từ đó gây ra các bệnh nhiễm trùng. Sự thay đổi hình thái này là một yếu tố quan trọng trong khả năng gây bệnh của nấm.

II. Thách thức trong việc phát hiện nấm Candida albicans

Việc phát hiện nấm Candida albicans gặp nhiều thách thức do sự đa dạng về hình thái và khả năng kháng thuốc của nó. Các phương pháp truyền thống như nuôi cấy có thể mất nhiều thời gian và không luôn cho kết quả chính xác. Do đó, việc áp dụng kỹ thuật PCR để phát hiện nấm là một giải pháp hiệu quả, nhưng cũng cần tối ưu hóa để đạt được độ nhạy và độ đặc hiệu cao.

2.1. Những khó khăn trong chẩn đoán nấm Candida

Chẩn đoán nấm Candida albicans thường gặp khó khăn do sự tương đồng với các loài nấm khác. Điều này có thể dẫn đến việc chẩn đoán sai và điều trị không hiệu quả. Việc sử dụng PCR giúp giảm thiểu những sai sót này.

2.2. Tác động của kháng thuốc đến việc điều trị

Kháng thuốc là một vấn đề lớn trong điều trị nhiễm nấm Candida albicans. Sự xuất hiện của các chủng kháng thuốc làm cho việc điều trị trở nên phức tạp hơn. Do đó, việc phát hiện sớm và chính xác là rất quan trọng.

III. Phương pháp tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi trong PCR

Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi là một bước quan trọng trong quy trình PCR để đảm bảo sự khuếch đại hiệu quả của DNA. Nghiên cứu này sẽ trình bày các phương pháp tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi cho nấm Candida albicans, từ đó nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR.

3.1. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR dựa trên nguyên tắc khuếch đại DNA thông qua các chu kỳ nhiệt độ khác nhau. Mỗi chu kỳ bao gồm ba bước: gắn mồi, kéo dài và tái tạo. Việc tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi là rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất.

3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình PCR

Nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến quá trình PCR, bao gồm nồng độ mồi, nồng độ DNA mẫu và nhiệt độ gắn mồi. Việc điều chỉnh các yếu tố này sẽ giúp tối ưu hóa quy trình và nâng cao hiệu quả khuếch đại.

IV. Ứng dụng thực tiễn của kỹ thuật PCR trong nghiên cứu nấm

Kỹ thuật PCR đã được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chẩn đoán nấm Candida albicans. Việc tối ưu hóa quy trình PCR không chỉ giúp phát hiện nấm nhanh chóng mà còn hỗ trợ trong việc nghiên cứu các đặc điểm di truyền của nấm. Kết quả nghiên cứu cho thấy kỹ thuật này có thể cải thiện đáng kể khả năng phát hiện nấm trong các mẫu bệnh phẩm.

4.1. Kết quả nghiên cứu về khuếch đại gen nấm

Nghiên cứu cho thấy việc tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi giúp tăng cường khả năng khuếch đại gen của nấm Candida albicans. Kết quả này mở ra hướng đi mới trong việc phát hiện và điều trị các bệnh nhiễm trùng do nấm.

4.2. Ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng

Kỹ thuật PCR đã được áp dụng trong chẩn đoán lâm sàng để phát hiện nấm Candida albicans trong các mẫu bệnh phẩm. Điều này giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị kịp thời và chính xác hơn.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu nấm Candida albicans

Nghiên cứu về nấm Candida albicans và kỹ thuật PCR đang mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát hiện và điều trị các bệnh nhiễm trùng. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại những tiến bộ đáng kể trong lĩnh vực y học, đặc biệt là trong việc phát hiện sớm và điều trị hiệu quả các bệnh do nấm gây ra.

5.1. Tương lai của kỹ thuật PCR trong nghiên cứu nấm

Kỹ thuật PCR sẽ tiếp tục được cải tiến để nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu trong việc phát hiện nấm Candida albicans. Các nghiên cứu mới sẽ tập trung vào việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác hơn.

5.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu nấm trong y học

Nghiên cứu về nấm Candida albicans không chỉ giúp nâng cao hiểu biết về bệnh lý mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I TONG QUAN 1. Nẩrn Candida albicans 1.Ịch sứ, nguồn gốc về nấm Candida và Candida albicans: Lịch sứ phát hiện và đật tên cho Candida kéo dài từ thời Hy Lạp cố dại cho dền các nhả nghiên cứu hiện đại. Nhận thức về Candida dà phát triển từ khi xuất hiện loại nấm này trong dịch tiết cùa con người thành một tác nhân truyền nhiễm. Trong tác phẩm “Of the Epidemics” Hippocrates dà mô ta bệnh nấm miệng (khoáng năm 400 trước Công nguyên) là “miệng bị loét áp-tơ”.

Đen nâm 1665 Pepys Diary dà báo cáo phát hiện "Một bệnh nhân bị sốt. hay có cơn đau vã bị nấc”, duy tri quan diêm cho rang bệnh tưa miệng bat nguồn từ vật chú. Năm 1839, Langcnbcck dược công nhận là người dầu tiên nhận ra một loại mun ờ bệnh nhãn mac bệnh thương hãn. tuy nhiên ông gán thực thè nãy cho vi khuân thương hàn chứ không phai nấm.

Bennett dã quan sát thấy một loại nắm tương tự trong đờm. phối cua một bệnh nhân bị trân khí màng phối và chi trích kct luận cùa Langenbach. Năm 1847, nhà nấm học nôi tiếng người Pháp Charles Philippe Robin, dà phân loại nấm này là Oidium albicans dè dật tên cho loại nấm gày bệnh lưa miệng. Hiện nay chi Candida dã được xác định có lum 200 loài khác nhau.

Trong đỏ Candida albicans là loài thường dược phân lập và gây bệnh nhiễm trùng. Candida albicans xuất phát tử chừ latin “candeõ” (candidus) áo choàng cỏn “albicỡ” nghía là dần trơ thảnh máu trắng. Thuật ngừ nãy do nhã sinh học Pháp Charles-Philippe Robin và nhà Nấm hục Christine Marie Berkhout dặt tên. Đặc điểm của nấm Candida albicans: Candida albicans Giuộc lóp Saccharomyces ngành Ascomycota.

là một phần hệ vi khuẩn binh thưởng ớ màng nhảy đường hò hấp. đường tiêu hóa và bộ phận sinh dục. Nấm thuộc dạng vi nấm. kích thước rất nho 3-5 pm.

cỏ cấu tạo dơn bão. cấu tạo bời Giành te bào. mãng tể bào. nguyên sinh chất và nhân.

• Thành tế bão được cấu tạo bời hai lớp. Lóp trong có vai trò duy trì và giừ vững hình dạng thảnh te bào. được tạo nén bời killing 0-gIucans -chitin. Lóp ngoài gồm các manoproteins.

giúp bao phu lóp trong cua thành tế bào.s • Màng tể bão tương tự máng nguyên sinh chất cua vi khuân về cấu tạo vã chức nâng. màng nấm men còn có kha nâng hoạt hóa ty thế. • Nguyên sinh chắt chứa ty the. ribosome và không bào.

• Nhàn cua tế bào nắm men lá nhãn thật, hình tròn hoặc hĩnh bầu dục. Nhân cõ sự phân hóa với kết cấu hoãn chinh. có mãng nhân và mang hệ thống thòng tin di truyền. albicans xuất hiện ơ một sổ dạng hình thãi: bão tứ nấm (blastospores) gia sợi mun (pseudohyphae) vã sợi nấm (hyphae).

Bào tư nấm phân chia vô tinh bang cách nay chồi dẫn den sự hình Giành cãc tế bào nấm men (còn được gọi là phôi bão tư hoặc phôi bào). Sự hình thành gia sợi mun xay ra do sự phán chia tế bào phân cực khi cãc tế bão nấm men phát triẩi bàng cách này chồi đà kéo dâi ra mà không tách ra khôi các tế bão lân cận. Sau khi giai đoạn tâng trướng kết thúc, cãc tế bào phán chia, theo dó tế bào con tách khói tế bào mẹ bang cách tạo ra một vách ngân.^H «4 ugc V Hl 5 Hình 1. Sự chuyến dồi hình thái Cua nẩni Candida albicans trong quá n inh lây nhiễm Khi nuôi cầy trong phòng thi nghiệm c.

albicans phát triên dưới dạng tế bào “nấm men" hình trứng. Tuy nhiên nhùng thay dối nhỏ về nhiệt độ. chất dinh dưỡng và độ pH dẫn đền sự thay dỏi hình tliái sang dạng sợi. Bộ gen của c albicans: Candida albicans là một trong nhũng nguồn nắm gày bệnh thưởng gập nhắt ở người và dược chọn dê giái trinh tự bộ gen.

albicans có thê gây nhiẻm trùng da. niêm mục ờ nliừng người khóe mạnh, thậm chi gãy nhiễm trùng đc dọa tính mạng ờ nhùng người cỏ chức nâng miền dịch bị suy giam. Trinh tự bộ gen c. albicans trẽn 8 cặp nhiêm sấc thế (trước dây được đặt tên từ 1-7 vã R) tạo thành bộ gen đơn bội có kích thước 14.419 khung dọc mơ (ORF) dài him 100 codon.

Codon CUG dược c. albicans dịch thành serine chứ không phai leucine được tim tháy it nhất một lần trong khoang hai phần ba ORF.^H «4 ugc V Hl 6 Chung SC5314 chứa 8 cặp nhiễm sắc tile. 7 trong số dó có kích think không dõi và một trong số dó là da hinli (R). với kích thước dao dộng từ 3,2 den 1,0 Mb.

Sự hiện diện cua các gcn sầp xắp song song dổi với các RNA ribosome giài thích cho sự thay dôi kích thước nãy. Kích thước bộ gen cùa chung nãy xấp XI 16 Mb. Sự sắp xếp lại số lượng vã cấu trúc nhiễm sắc thê tạo ra sự da dạng di truyền, dược gọi lả da hình chiều dài nhiễm sấc thê (co/mờ rộng các lần lụp lại), chuyển đoạn tương hồ. mắt nhiễm sẳc the vã thê ba nhiem sẩc thê.

Những thay đối này dẫn đến những thay đối về kiểu hình, đày là một cách thích nghi của loại nấm này.11 Vũng internal transcribed spacer (ITS) cua nấm MTS 1 rOWAftw* I NTS I I NTS 0 Ọ 58S I 5« 0102 0vt>2 R«90n Ỉfilth J. 2: cắu núc vùng DNA cua nắm (NTS: đoạn đệm không dược phiên nưl ETS: doụn dệm được phiên mà bèn ngoài. ITS: doạn dệrn dược phiên mờ bèn n ong) Mỗi cụm ribosome của nắm chứa đoạn đệm 5' phiên mà ngoài (5' ETS), gen 18S rRNA, ITS ì, gen 5.SS rRNA, ITS2. 28S rRNA vá cuối củng là 3' ETS.

Trong quá trinh trường thành cua rRNA. các manh ETS vã ITS dược cảt bo. là san phàm phụ không có chức năng cùa quá trinh trưởng thành này. chúng nhanh chóng bị suy thoái.*- Vùng ITS là một doạn DNA đệm không có chức nâng nằm giừa các gen rRNA.

ơ vi khuân, chi có một vùng ITS duy nhất. Nhưng ờ sinh vật nhàn chuân. có hai lừng ITS: ITSI vã 1TS2. Vũng ITSI là DNA đệm nẳm giừa cãc gen rRNA 18S và 5.8S: sự thay đôi độ dài cua 1TS1 là khoảng (200- «4 ugc V Hl 7 300bp).

ITSI đà dưực chúng minh hiệu qua cùa chúng trong việc lãm sáng tó mối quan hộ phát sinh gen giừa các loài khác nhau. Hơn nữa DNA đệm ITS1 it được bão tồn hem DNA đệm ITS2. Các cầu trúc ITS1 chi được bao tồn trong các dơn vị phân loại nho hơn nhiều. Vùng ITS2 lá một DNA đệm năm giừa các gen rRNA 5.

vùng 1TS2 có độ đài ngằn lum vùng ITS1. sự thay dời độ dài cùa ITS2 là khoảng (180-240bp). Gen ACC1 cũa nấm Ca It(tifta albicans: ACCasc lá một enzyme sinh tông hợp axit béo. cần thiết cho sự phát Iriẽn và kha nàng tồn lại cua nấm.

Gen ACCase (gen ACC1) là gen nội chuẩn cùa Candida albicans.14 Các gen nội chuẩn luôn dược biêu hiện trong các tề bão. mà hỏa cho các protein tham gia vào các quá trinh cơ biui cua tế bão.1- Trình tự nucleotide cua gen đa dạng, thích hợp cho việc phân biệt giừa các dòng và các chung. Gen ACC1 mã hóa acetyl CoA cacboxylase. trình tự DNA mà hóa gen ACC1 cua Candida albicans có 6810 nucleotide, trinh tự protein tương úng 2270 acid amin.

Dịch tễ học nhicm nấm Candida và c. Trên thếgiởi: Nghiên cứu tại Trung Tâm Ung thư Dại Học Tôn Trung Sơn từ tháng 6 nám 2011 đến tháng 5 năm 2022 trên 606 bệnh nhàn ung thư vòm họng dà trai qua xạ trị. cỏ 62 bệnh nhân (10.2%) nhiễm nấm Candida hầu họng và 544 bệnh nhân không bị nhiễm nấm Candida hầu họng.1 Từ tháng 1 nám 1998 đến tháng 12 nám 1999 phát hiên 191 truởng hụp nấm màu ớ miền trung Thụy Dien, với tý lệ 0.32/1000 ca nhập viện. Trong đó cỏ 128 trường họp (67%) do c.

30 trường họp (15.7%) gây ra bơi Candida glabrata vã 14 trường hợp (7.™ Tại nghiên cứu giám sát tại bệnh viện cua Liên đoàn bệnh lý y tế châu Ảu trong 28 tháng.089 trường hợp được ghi nhận bới bày cãc -c .^H «4 ugc V Hl s nước châu Âu (106 lố chức tại Pháp. Tây Ban Nha. Thụy Diên và Vương quốc Anh). Tý lệ nhiễm nấm máu dao dộng từ 0.000 ca nhập viện dà được báo cáo.

Candida albicans được xác định trong 56% trường hợp. Ở Việt Nam: Nghiên cứu ờ phụ nừ trên 18 tuôi cỏ triệu chứng viêm ảm dạo đen khám tại bệnh viện Đại học Y Dược thành phố Hổ Chí Minh co sờ 2 từ ngày 01/10/2019 đen 30/4/2020. Kết quà cho thấy, trong 333 trường hợp nghiên cứu cho ty lệ viêm âm dạo do vi nắm Candida là chiếm 26.7% vã 89 trường họp nhiễm nấm Candida dà phát hiện Candida albicans là 68.20 Nghiên cứu cua Nguyễn Ngọc Hóa. Nguyễn Thị Hồng Diệp tại Khoa khám bệnh.

Bệnh viện trường Đại học Y khoa Vinh từ 01/2021 den 04/2021 trẽn 42 bệnh nhân dưới 15 tuồi nhiêm nấm. Kết quá cho thầy, tý lệ nlũcm nắm c. albicans ờ tre em (88.1%) chu yếu nhiễm ớ miệng.21 Nghiên cứu mô ta cắt ngang trên 102 bệnh nhân thư máy tại Khoa hồi sức tích cực Bệnh viện Nguyền Trãi từ tháng 3/2022 den tháng 9/2022. Tỳ lộ nhiễm vi nấm Candida lên tói 82.8% và chú yếu là Candida albicans (44.

Các yểu tố dộc lực Candida albicans: Candida albicans có kha nâng xâm lẩn. gãy nhiễm trùng và lây lan nhiễm trùng nhờ vào cãc yell tố dộc lực cua chúng. Sự thay đồi hình thái là một dấu hiệu cho quâ ti inh chuyên từ trạng thãi hội sinh sang gãy bệnh cua nấm Candida albicans. Chúng dược the hiện qua sự chuyên từ bão tư nấm (blastospores) sang gia sợi nấm (pseudohyphae) vã sau dỏ là sợi nấm (hypliae).

Ớ dạng sợi nấm. các tề bào xâm nhập vào mỏ cua vật chu bang cách chu dộng và gãy cảm ứng nhập bào. Một dộc tó dậc hiệu cua sợi nấm c. albicans là candidalysin.

Candidalysin là một peptide gồm 31 -c .^H «4 ugc V Hl 9 axit amin. có vai trờ quan trọng trụng phá huý các tế bão vật chu. gãy nhiễm trùng hệ thống vã đần tới tứ vong. Candidalysin cõ kha năng gây tôn thương trực tiếp lên máng biền mô bang each xen kẻ.

thẩm và tạo lồ xốp lãm cho các thành phẩn tế bào chắt yếu đi. yếu tố góp phần vào kha năng gây bệnh cua c. albicans là sự biêu hiện cua các protein quan trọng trong quá trinh dinh vã xâm nhập. Quá trinh dinh bị anh hương bỡi rất nhiều yếu tồ như loại protein cùa vách te bào; dặc diêm vật lý.

hoã học cùa bề mặt màng tế bào. albicans dinh vào tế bào vật chù bằng cách nhận ra các protein, fibrinogens, fibronectins và gắn với chúng thòng qua Als3 và Hwpl. Đây là các protein dược biêu hiện chu yếu trong giai đoạn tạo sợi mun.