Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Và Sinh Học Phân Tử Của Virus KTY-PRRS-06 Gây Rối Loạn Hô Hấp Ở Lợn

Chuyên khảo phân tích Luận văn nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus cường độc kty prrs 06 gây, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên

• Tác giả: Hoàng Thị Thảo
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Hữu Nam
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Virus KTY-PRRS-06 Gây Hội Chứng Rối Loạn Hô Hấp Ở Lợn
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Lời cam đoan
• 1.2. Mục lục
• 1.3. Danh mục các chữ viết tắt
• 1.4. Danh mục bảng
• 1.5. Danh mục hình
• 1.6. Trích yếu luận văn
• 1.7. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.8. Mục đích nghiên cứu
• 1.9. Tổng quan tài liệu
• 1.9.1. Tình hình nghiên cứu về Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn
• 1.9.1.1. Tình hình dịch PRRS trên thế giới
• 1.9.1.2. Tình hình dịch PRRS tại Việt Nam
• 1.9.1.3. Những nghiên cứu về dịch PRRS ở nước ngoài
• 1.9.1.4. Những nghiên cứu về dịch PRRS ở Việt Nam
• 1.10. Virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV)
• 1.10.1. Hình thái, cấu tạo virus PRRS
• 1.10.2. Phân loại virus PRRS
• 1.10.3. Khả năng gây bệnh của virus PRRS
• 1.10.4. Sức đề kháng của virus PRRS
• 1.10.5. Đặc tính nuôi cấy virus PRRS
• 1.11. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản
• 1.11.1. Đặc điểm chung
• 1.11.2. Động vật cảm nhiễm
• 1.11.3. Chất chứa mầm bệnh
• 1.11.4. Cơ chế sinh bệnh và phương thức truyền lây
• 1.11.5. Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS
• 1.11.6. Bệnh tích của lợn mắc PRRS
• 1.11.7. Các phương pháp chẩn đoán PRRS
• 1.11.8. Biện pháp phòng và trị bệnh
• 1.12. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
• 1.12.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 1.12.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.12.1.2. Vật liệu nghiên cứu
• 1.12.1.3. Địa điểm nghiên cứu
• 1.12.1.4. Thời gian nghiên cứu
• 1.12.2. Nội dung nghiên cứu
• 1.12.3. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145
• 1.12.4. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145
• 1.12.5. Phương pháp nghiên cứu
• 1.12.5.1. Nuôi cấy virus KTY-PRRS-06 trên môi trường tế bào Marc-145
• 1.12.5.2. Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID50
• 1.12.5.3. Xác định đường cong sinh trưởng của virus PRRS qua các đời cấy chuyển
• 1.12.5.4. Phương pháp tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS
• 1.12.5.5. Phương pháp RT-PCR
• 1.12.5.6. Phương pháp giải trình tự Gen
• 1.12.5.7. Phương pháp đọc kết quả
• 1.13. Kết quả và thảo luận
• 1.13.1. Kết quả nghiên cứu chủng virus PRRS nghiên cứu
• 1.13.2. Kết quả lựa chọn mẫu PRRS cho nghiên cứu
• 1.13.3. Kết quả kiểm tra khả năng tạp nhiễm với các loại virus khác
• 1.13.4. Kết quả nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-06
• 1.13.5. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào qua các đời cấy chuyển
• 1.13.6. Kết quả xác định hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-06
• 1.13.7. Kết quả nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-06
• 1.13.8. Kết quả tách chiết RNA tổng số của chủng virus KTY-PRRS-06
• 1.13.9. Kết quả giải trình tự đoạn ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-06
• 1.13.10. Kết quả nghiên cứu so sánh trình tự nucleotide qua các đời cấy chuyển
• 1.13.11. Kết quả nghiên cứu so sánh trình tự axit amin của virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển
• 1.13.12. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử
• 1.14. Kết luận và kiến nghị
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Virus PRRS Hội Chứng Rối Loạn Hô Hấp Ở Lợn

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS), hay còn gọi là bệnh "Tai xanh", là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn. Bệnh do virus PRRS gây ra, thuộc họ Arteriviridae. Virus này tấn công hệ miễn dịch của lợn, đặc biệt là các tế bào đại thực bào phế nang, làm suy giảm khả năng chống lại các tác nhân gây bệnh khác. PRRS ảnh hưởng đến mọi lứa tuổi và giống lợn, gây ra các vấn đề về hô hấp, sinh sản và tăng trưởng. Theo tài liệu gốc, PRRS được xác nhận lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1987 và nhanh chóng lan rộng ra toàn thế giới. Việc nghiên cứu sâu về đặc tính sinh học virus PRRS là vô cùng quan trọng để phát triển các biện pháp phòng và kiểm soát bệnh hiệu quả.

1.1. Lịch Sử Phát Hiện và Tình Hình Dịch Tễ Bệnh PRRS

Bệnh PRRS lần đầu tiên được ghi nhận tại Mỹ vào năm 1987, sau đó lan rộng ra Canada và các nước châu Âu vào đầu những năm 1990. Do chưa xác định được nguyên nhân, bệnh được gọi bằng nhiều tên khác nhau như "Bệnh bí hiểm ở lợn" (MSD) hay "Hội chứng hô hấp và sảy thai ở lợn" (PEARS). Đến năm 1992, tên gọi chính thức "Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn" (PRRS) đã được thống nhất. Theo Cục Thú y (2008), dịch PRRS đã lưu hành ở nhiều quốc gia trên thế giới, gây tổn thất kinh tế lớn cho ngành chăn nuôi lợn.

1.2. Tác Động Kinh Tế và Ảnh Hưởng Của Virus PRRS Đến Ngành Chăn Nuôi

Virus PRRS gây ra những thiệt hại kinh tế đáng kể cho ngành chăn nuôi lợn. Bệnh làm giảm năng suất sinh sản của lợn nái, tăng tỷ lệ chết ở lợn con, giảm tăng trọng ở lợn thịt và tăng chi phí điều trị. Theo các nghiên cứu, PRRS có thể gây thiệt hại hàng trăm triệu đô la mỗi năm cho ngành chăn nuôi lợn trên toàn thế giới. Việc kiểm soát và phòng ngừa bệnh PRRS là vô cùng quan trọng để bảo vệ ngành chăn nuôi lợn.

II. Thách Thức Nghiên Cứu Virus KTY PRRS 06 Gây Bệnh Ở Lợn

Nghiên cứu về virus KTY-PRRS-06 đặt ra nhiều thách thức do sự biến đổi gen liên tục của virus PRRS. Các chủng virus PRRS khác nhau có độc lực khác nhau, gây khó khăn trong việc phát triển vaccine hiệu quả. Theo tài liệu gốc, virus PRRS có sự đột biến cao, tạo ra nhiều chủng có độc lực khác nhau, rất khó để kiểm soát dịch bệnh. Việc nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển là cần thiết để hiểu rõ hơn về sự biến đổi của virus và phát triển các biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả.

2.1. Sự Biến Đổi Gen và Độc Lực Của Các Chủng Virus PRRS

Virus PRRS có khả năng biến đổi gen cao, dẫn đến sự xuất hiện của nhiều chủng virus khác nhau với độc lực khác nhau. Một số chủng virus PRRS có độc lực cao, gây ra các triệu chứng nghiêm trọng và tỷ lệ chết cao ở lợn. Các chủng khác có thể gây ra các triệu chứng nhẹ hơn hoặc không có triệu chứng. Sự biến đổi gen của virus PRRS gây khó khăn trong việc phát triển vaccine hiệu quả, vì vaccine có thể không bảo vệ chống lại tất cả các chủng virus.

2.2. Khó Khăn Trong Việc Phát Triển Vaccine Hiệu Quả Phòng Bệnh PRRS

Việc phát triển vaccine hiệu quả chống lại virus PRRS là một thách thức lớn do sự biến đổi gen liên tục của virus. Các vaccine hiện có có thể không bảo vệ chống lại tất cả các chủng virus PRRS. Ngoài ra, một số vaccine có thể gây ra các tác dụng phụ không mong muốn ở lợn. Việc nghiên cứu và phát triển các loại vaccine mới, có khả năng bảo vệ chống lại nhiều chủng virus PRRS khác nhau, là rất cần thiết.

2.3. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Virus KTY PRRS 06

Nghiên cứu đặc tính sinh học virus KTY-PRRS-06 là rất quan trọng để hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh của virus và phát triển các biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả. Nghiên cứu này có thể giúp xác định các yếu tố quan trọng trong sự lây nhiễm và gây bệnh của virus KTY-PRRS-06, từ đó giúp phát triển các loại thuốc và vaccine hiệu quả hơn.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Virus KTY PRRS 06

Nghiên cứu đặc tính sinh học virus KTY-PRRS-06 sử dụng các phương pháp nuôi cấy virus trên môi trường tế bào Marc-145, xác định hiệu giá virus TCID50, và giải trình tự gen. Theo tài liệu gốc, các phương pháp nghiên cứu bao gồm: Nuôi cấy virus KTY-PRRS-06 trên môi trường tế bào Marc-145; xác định hiệu giá virus TCID50; xác định đường cong sinh trưởng của virus PRRS qua các đời cấy truyền; tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS; RT- PCR; phương pháp giải trình tự Gen. Các phương pháp này cho phép đánh giá sự ổn định của virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển và xác định các biến đổi gen có thể xảy ra.

3.1. Nuôi Cấy Virus KTY PRRS 06 Trên Môi Trường Tế Bào Marc 145

Việc nuôi cấy virus KTY-PRRS-06 trên môi trường tế bào Marc-145 là một bước quan trọng trong nghiên cứu. Môi trường tế bào Marc-145 cung cấp các điều kiện tối ưu cho sự nhân lên của virus PRRS. Quá trình nuôi cấy cho phép thu được một lượng lớn virus để sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.

3.2. Xác Định Hiệu Giá Virus TCID50 Để Đánh Giá Khả Năng Lây Nhiễm

Xác định hiệu giá virus TCID50 là một phương pháp quan trọng để đánh giá khả năng lây nhiễm của virus KTY-PRRS-06. TCID50 là lượng virus cần thiết để gây nhiễm cho 50% số tế bào trong môi trường nuôi cấy. Hiệu giá virus cao cho thấy virus có khả năng lây nhiễm mạnh.

3.3. Giải Trình Tự Gen Để Xác Định Các Biến Đổi Di Truyền Của Virus

Giải trình tự gen là một phương pháp quan trọng để xác định các biến đổi di truyền của virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển. Phương pháp này cho phép xác định các đột biến gen có thể ảnh hưởng đến độc lực và khả năng lây nhiễm của virus.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Phân Tử Virus PRRS

Kết quả nghiên cứu cho thấy virus KTY-PRRS-06 có khả năng gây bệnh tích tế bào ổn định qua các đời cấy chuyển. Hiệu giá virus cao và ổn định, cho thấy virus có khả năng phát triển và nhân lên tốt trên môi trường tế bào Marc-145. Theo tài liệu gốc, trình tự nucleotide và axit amin của đoạn gen ORF5 của chủng nghiên cứu qua các đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145 ổn định, mức độ tương đồng về nucleotide từ 98,15% đến 100%; về axit amin từ 96,88% đến 100%. Các kết quả này cung cấp thông tin quan trọng về sự ổn định của virus KTY-PRRS-06 và khả năng sử dụng virus này trong sản xuất vaccine.

4.1. Khả Năng Gây Bệnh Tích Tế Bào Ổn Định Của Virus KTY PRRS 06

Khả năng gây bệnh tích tế bào ổn định của virus KTY-PRRS-06 là một yếu tố quan trọng cho thấy virus có khả năng gây bệnh liên tục qua các đời cấy chuyển. Điều này cho thấy virus không bị suy yếu hoặc mất khả năng gây bệnh trong quá trình nuôi cấy.

4.2. Hiệu Giá Virus Cao Và Ổn Định Trong Quá Trình Nuôi Cấy

Hiệu giá virus cao và ổn định trong quá trình nuôi cấy cho thấy virus KTY-PRRS-06 có khả năng nhân lên tốt trên môi trường tế bào Marc-145. Điều này là quan trọng để sản xuất một lượng lớn virus cho các thí nghiệm tiếp theo và cho sản xuất vaccine.

4.3. Sự Ổn Định Của Trình Tự Gen ORF5 Qua Các Đời Cấy Chuyển

Sự ổn định của trình tự gen ORF5 qua các đời cấy chuyển cho thấy virus KTY-PRRS-06 không có sự biến đổi gen đáng kể trong quá trình nuôi cấy. Điều này là quan trọng để đảm bảo rằng virus vẫn giữ được các đặc tính mong muốn, chẳng hạn như khả năng kích thích hệ miễn dịch.

V. Ứng Dụng Nghiên Cứu Virus KTY PRRS 06 Trong Sản Xuất Vaccine

Nghiên cứu về virus KTY-PRRS-06 có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển vaccine phòng bệnh PRRS. Việc xác định các đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus giúp lựa chọn các chủng virus phù hợp để sản xuất vaccine. Theo tài liệu gốc, để chủ động đạt hiệu quả cao trong công tác phòng chống dịch PRRS, nước ta cần có vaccine chế từ các chủng phân lập được. Do đó, để tìm ra được các chủng virus có đủ tiêu chuẩn để sản xuất vaccine thì việc nghiên cứu một số đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus PRRS qua các đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145 để xác định sự biến đổi hay không biến đổi hệ gen trong cấu trúc gen của virus PRRS sau các đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145 để làm cơ sở khoa học cho việc lựa chọn các chủng virus PRRS để chế tạo các loại vaccine thế hệ mới phù hợp với PRRSV đang lưu hành góp phần vào công cuộc khống chế dịch bệnh trên đàn lợn là việc làm cần thiết.

5.1. Lựa Chọn Chủng Virus PRRS Phù Hợp Để Sản Xuất Vaccine

Việc lựa chọn chủng virus PRRS phù hợp để sản xuất vaccine là một bước quan trọng để đảm bảo hiệu quả của vaccine. Chủng virus được chọn phải có khả năng kích thích hệ miễn dịch mạnh mẽ và bảo vệ chống lại nhiều chủng virus PRRS khác nhau.

5.2. Phát Triển Vaccine Thế Hệ Mới Phòng Bệnh PRRS Hiệu Quả

Nghiên cứu về virus KTY-PRRS-06 có thể giúp phát triển các loại vaccine thế hệ mới phòng bệnh PRRS hiệu quả hơn. Các vaccine này có thể được thiết kế để bảo vệ chống lại nhiều chủng virus PRRS khác nhau và giảm thiểu các tác dụng phụ không mong muốn.

5.3. Ứng Dụng Kết Quả Nghiên Cứu Vào Thực Tiễn Chăn Nuôi Lợn

Kết quả nghiên cứu về virus KTY-PRRS-06 có thể được ứng dụng vào thực tiễn chăn nuôi lợn để cải thiện các biện pháp phòng và kiểm soát bệnh PRRS. Các biện pháp này có thể bao gồm việc sử dụng vaccine, cải thiện điều kiện vệ sinh và quản lý đàn lợn.

VI. Kết Luận Và Hướng Nghiên Cứu Về Virus Gây Bệnh PRRS Ở Lợn

Nghiên cứu về virus KTY-PRRS-06 đã cung cấp những thông tin quan trọng về đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus. Các kết quả nghiên cứu này có thể được sử dụng để phát triển các biện pháp phòng và kiểm soát bệnh PRRS hiệu quả hơn. Theo tài liệu gốc, việc nghiên cứu một số đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus PRRS qua các đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145 để xác định sự biến đổi hay không biến đổi hệ gen trong cấu trúc gen của virus PRRS sau các đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145 để làm cơ sở khoa học cho việc lựa chọn các chủng virus PRRS để chế tạo các loại vaccine thế hệ mới phù hợp với PRRSV đang lưu hành góp phần vào công cuộc khống chế dịch bệnh trên đàn lợn là việc làm cần thiết. Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc đánh giá hiệu quả của các loại vaccine mới và phát triển các phương pháp chẩn đoán bệnh PRRS nhanh chóng và chính xác.

6.1. Đánh Giá Hiệu Quả Của Các Loại Vaccine Mới Phòng Bệnh PRRS

Việc đánh giá hiệu quả của các loại vaccine mới phòng bệnh PRRS là rất quan trọng để đảm bảo rằng vaccine có khả năng bảo vệ lợn chống lại bệnh. Các nghiên cứu nên tập trung vào việc xác định khả năng kích thích hệ miễn dịch và bảo vệ chống lại các chủng virus PRRS khác nhau của vaccine.

6.2. Phát Triển Phương Pháp Chẩn Đoán Bệnh PRRS Nhanh Chóng

Phát triển các phương pháp chẩn đoán bệnh PRRS nhanh chóng và chính xác là rất quan trọng để phát hiện sớm các trường hợp bệnh và ngăn chặn sự lây lan của virus. Các phương pháp chẩn đoán mới nên có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, và có thể được sử dụng trong điều kiện thực địa.

6.3. Nghiên Cứu Về Cơ Chế Gây Bệnh Của Virus PRRS

Nghiên cứu về cơ chế gây bệnh của virus PRRS có thể giúp phát triển các biện pháp điều trị bệnh hiệu quả hơn. Các nghiên cứu nên tập trung vào việc xác định các yếu tố quan trọng trong sự lây nhiễm và gây bệnh của virus PRRS, từ đó giúp phát triển các loại thuốc và phương pháp điều trị hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS), thường gọi là bệnh tai xanh, là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi toàn cầu. Tại Việt Nam, dịch bệnh bùng phát dữ dội từ năm 2007 với 88.945 con mắc bệnh tại 21 tỉnh thành, và đạt đỉnh điểm vào năm 2010 khi khiến hơn 621.000 con lợn nhiễm bệnh cùng hơn 336.000 con phải tiêu hủy. Trong khu vực châu Á, tỷ lệ lưu hành virus PRRS luôn duy trì ở mức báo động như tại Thái Lan 97%, Malaysia 94%, Philippines 90% và Trung Quốc 80%. Vấn đề nghiên cứu cốt lõi xuất phát từ thực trạng virus PRRS có tốc độ đột biến cao, tạo ra nhiều biến chủng cường độc phức tạp khiến các loại vaccine thương mại nhập khẩu chưa đạt hiệu quả bảo hộ tối ưu trên đàn lợn nội địa.

Mục tiêu cụ thể của luận văn là đánh giá toàn diện sự ổn định về đặc tính sinh học (khả năng gây bệnh tích tế bào, động thái nhân lên, hiệu giá virus) và đặc tính sinh học phân tử (trình tự nucleotide và axit amin của khung đọc mở ORF5) của chủng virus cường độc KTY-PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển liên tục trên môi trường tế bào dòng Marc-145. Đề tài được triển khai thực hiện từ tháng 9 năm 2015 đến tháng 6 năm 2016 tại Bộ môn Bệnh lý Thú y và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, sử dụng mẫu phân lập từ ổ dịch tại Hải Phòng năm 2015. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của công trình là xác lập cơ sở dữ liệu tin cậy với độ tương đồng di truyền đạt từ 98,15% đến 100%, tạo tiền đề tuyển chọn giống virus bản địa chuẩn hóa phục vụ sản xuất vaccine thế hệ mới, hướng tới mục tiêu giảm thiểu tỷ lệ tử vong trên 70% ở lợn con và bảo vệ an toàn dịch tễ cho đàn gia súc quốc gia.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết virus học thú y hiện đại về virus PRRS thuộc chi Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales. Bộ gen của virus là sợi đơn RNA dương có kích thước 13 đến 15 kb chứa 7 khung đọc mở (ORF1 đến ORF7). Về cơ chế sinh bệnh học miễn dịch, virus có tính hướng đại thực bào phế nang (PAM), xâm nhập qua thụ thể bề mặt và tiêu hủy tới 40% quần thể đại thực bào, dẫn đến hội chứng suy giảm miễn dịch nghiêm trọng và mở đường cho các mầm bệnh kế phát nguy hiểm như Haemophilus parasuis hay Streptococcus suis.

Khung lý thuyết phân tử tập trung vào ba khái niệm then chốt: Khung đọc mở ORF5 dài 603 bp mã hóa glycoprotein vỏ GP5 (200 axit amin) mang các epitop trung hòa mầm bệnh quan trọng nhất; Bệnh tích tế bào (Cyto Pathogenic Effect - CPE) thể hiện mức độ phá hủy tế bào chủ in-vitro; Liều gây nhiễm mô nuôi cấy 50% (TCID50) biểu thị hiệu giá virus; và Tính ổn định di truyền của các đời cấy chuyển (từ P0 đến P40) trên tế bào dòng nhằm kiểm tra độc lực và mức độ biến dị di truyền.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập từ cỡ mẫu gồm 35 cá thể lợn nghi mắc bệnh tai xanh tại ổ dịch Hải Phòng năm 2015, phân bổ thành 5 nhóm sinh lý: 11 lợn con theo mẹ, 8 lợn sau cai sữa, 7 lợn choai, 4 lợn nái mang thai và 5 lợn nái nuôi con. Phương pháp chọn mẫu chủ đích được áp dụng dựa trên các chỉ dấu lâm sàng cảnh báo của Tổ chức Thú y Thế giới như tỷ lệ sảy thai trên 20% và tỷ lệ chết trước cai sữa trên 25%.

Quy trình phân tích bao gồm: Chẩn đoán mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật RT-PCR và kiểm tra loại trừ các tác nhân tạp nhiễm gồm virus Dịch tả lợn (CSFV), Lở mồm long móng (FMDV), Tiêu chảy thành dịch (PEDV) và Viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGEV); Nuôi cấy và cấy chuyển chủng virus KTY-PRRS-06 qua 40 thế hệ trên dòng tế bào thận khỉ Marc-145 với tỷ lệ đa nhiễm MOI là 0,01; Xác định hiệu giá virus theo phương pháp Behrens-Karber tại các mốc thời gian từ 24 đến 120 giờ; Tách chiết RNA tổng số bằng bộ kít QIAamp; Khuếch đại đoạn gen ORF5 kích thước 603 bp bằng One-Step RT-PCR với cặp mồi chuyên biệt; Tinh sạch và giải trình tự gen tự động trên hệ thống Beckman Coulter CEQ 8000; Xử lý dữ liệu chuỗi bằng phần mềm MEGA5 và công cụ BLAST.

Lý do lựa chọn dòng tế bào Marc-145 và phương pháp giải trình tự mao quản là vì tế bào Marc-145 cung cấp môi trường đồng nhất cao, khắc phục nhược điểm giới hạn chu kỳ sống của đại thực bào PAM sơ cấp, trong khi công nghệ giải trình tự tự động bảo đảm độ chính xác phân tử tuyệt đối trong suốt tiến trình 10 tháng thực nghiệm.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, kết quả xét nghiệm RT-PCR trên 35 mẫu lợn nghi nhiễm đã xác định 28 mẫu dương tính với virus PRRS, đạt tỷ lệ 80,00%. Trong đó, nhóm lợn nái mang thai đạt tỷ lệ dương tính tuyệt đối 100% (4 trên 4 mẫu) và nhóm lợn choai đạt 85,72% (6 trên 7 mẫu). Chủng virus KTY-PRRS-06 phân lập từ phổi lợn nái có hiệu giá ban đầu 10^2,66 TCID50/25µl và hoàn toàn âm tính với các virus tạp nhiễm CSFV, FMDV, PEDV và TGEV.

Thứ hai, khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của chủng KTY-PRRS-06 thể hiện tính ổn định vượt trội qua 40 đời cấy chuyển. Tại thời điểm 24 giờ sau gây nhiễm, tỷ lệ tế bào Marc-145 bị phá hủy đạt 15% đến 25%; tăng lên 40% đến 55% ở 36 giờ; đạt 60% đến 70% ở 48 giờ; đạt 85% đến 90% ở 60 giờ; và đạt 100% tế bào bị tổn thương hoàn toàn ở mốc 72 giờ trước khi bong tróc toàn bộ khỏi bề mặt nuôi cấy ở 84 giờ.

Thứ ba, động thái sinh trưởng của virus đạt đỉnh cực đại ở mốc 72 giờ sau gây nhiễm với giá trị trung bình Log10 TCID50/25µl đạt 4,56, tăng đáng kể so với mức 2,23 ở 24 giờ và 3,43 ở 48 giờ. Sau mốc 72 giờ, hiệu giá virus suy giảm nhanh chóng xuống 10^2,58 ở 84 giờ và chỉ còn 10^1,63 ở 120 giờ. Hiệu giá virus qua các thế hệ cấy chuyển duy trì ổn định và có xu hướng tăng nhẹ: đời P0 đạt 10^2,66; đời P10 và P20 đạt 10^2,87; đời P30 và P40 đạt 10^3,16 TCID50/25µl.

Thứ tư, phân tích sinh học phân tử đoạn gen ORF5 (kích thước 603 bp mã hóa 200 axit amin) cho thấy mức độ tương đồng nucleotide giữa các đời cấy chuyển dao động từ 98,15% đến 100%, và mức độ tương đồng về axit amin đạt từ 96,88% đến 100%.

Thảo luận kết quả

Động thái nhân lên của virus KTY-PRRS-06 đạt đỉnh ở 72 giờ phản ánh quá trình sao chép ồ ạt của hạt virus nội bào đạt đến giới hạn trước khi nguồn tế bào cảm nhiễm bị phá hủy hoàn toàn. Việc hiệu giá virus sụt giảm mạnh sau 84 giờ là hệ quả tất yếu của hiện tượng thoái hóa và bong tróc thảm tế bào Marc-145, làm mất đi môi trường dinh dưỡng duy trì hạt virus sống.

Khi so sánh với các nghiên cứu tiền nhiệm, đỉnh sinh trưởng ở 72 giờ của chủng KTY-PRRS-06 hoàn toàn tương đồng với các chủng PRRS phân lập tại vùng phụ cận Hà Nội từng ghi nhận giá trị Log10 TCID50/25µl là 4,83 tại thời điểm 72 giờ. Tuy nhiên, tốc độ nhân lên của chủng nghiên cứu nhanh hơn đáng kể so với chủng nhược độc Hanvet1.VN vốn cần từ 80 đến 96 giờ mới đạt hiệu giá tối đa, chứng minh KTY-PRRS-06 mang đặc tính của một chủng cường độc thích ứng cao.

Trong các báo cáo khoa học, dữ liệu động thái này được minh họa tối ưu qua biểu đồ đường cong sinh trưởng dạng hình chuông thể hiện tương quan giữa trục hoành (thời gian 24 đến 120 giờ) và trục tung (Log10 TCID50/25µl), kết hợp bảng ma trận đối chiếu mức độ sai khác axit amin giữa các thế hệ cấy chuyển. Sự ổn định cao về trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 khẳng định chủng virus không xảy ra đột biến tiêu cực trong quá trình cấy chuyển, đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn khoa học để làm nguồn giống sản xuất sinh phẩm y học thú y.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, thiết lập quy trình bảo tồn và chuẩn hóa ngân hàng giống virus gốc. Bộ môn Bệnh lý Thú y và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam cần duy trì lưu giữ chủng KTY-PRRS-06 trong điều kiện nhiệt độ âm sâu -80°C và nitơ lỏng, hoàn thiện hồ sơ sinh học đạt chuẩn quốc tế trong vòng 6 tháng đầu năm 2017 nhằm cung cấp nguồn giống sạch bệnh cho các viện nghiên cứu.

Thứ hai, đẩy mạnh nghiên cứu sản xuất chế phẩm vaccine phòng bệnh tai xanh thế hệ mới. Các công ty sản xuất dược và vaccine thú y phối hợp cùng các nhà khoa học triển khai quy trình làm giảm độc lực hoặc vô hoạt chủng KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển cao hơn, hướng tới mục tiêu sản xuất các lô vaccine thử nghiệm đạt hiệu giá tối thiểu 10^6 TCID50/ml trong khung thời gian 12 đến 18 tháng.

Thứ ba, chuẩn hóa và chuyển giao quy trình chẩn đoán RT-PCR phát hiện nhanh ổ dịch. Cục Thú y và các Chi cục Thú y vùng cần phổ biến quy trình RT-PCR khuếch đại gen ORF5 kích thước 603 bp tới 100% các trung tâm chẩn đoán thú y tuyến tỉnh, bảo đảm rút ngắn thời gian phát hiện virus xuống dưới 24 giờ kể từ quý 3 năm 2017.

Thứ tư, tăng cường công tác giám sát dịch tễ phân tử tại các cơ sở chăn nuôi quy mô trang trại. Hiệp hội chăn nuôi và các chủ trang trại cần định kỳ lấy mẫu huyết thanh và hạch phổi để tầm soát biến chủng PRRSV lưu hành, đặt mục tiêu khống chế tỷ lệ nhiễm bệnh dưới mức 5% và loại trừ nguy cơ bùng phát dịch cục bộ trong giai đoạn 2017 đến 2020.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nhóm chuyên gia và nhà nghiên cứu công nghệ sinh học thú y có thể khai thác chi tiết quy trình nuôi cấy, phân lập virus trên tế bào Marc-145 và phương pháp giải trình tự gen tự động để chuẩn hóa kỹ thuật đánh giá tính ổn định di truyền của các chủng vi sinh vật gây bệnh.

Nhóm doanh nghiệp sản xuất vaccine và chế phẩm sinh học thú y tìm thấy trong luận văn nguồn dữ liệu thực nghiệm giá trị về thời điểm thu hoạch virus tối ưu ở mốc 72 giờ và độ ổn định di truyền trên 98,15%, phục vụ công tác thiết kế quy trình sản xuất vaccine nhược độc hoặc vô hoạt quy mô công nghiệp.

Nhóm bác sĩ thú y và cán bộ quản lý dịch tễ tại các địa phương có thể sử dụng bộ triệu chứng lâm sàng đặc thù trên 5 nhóm lợn cùng kỹ thuật chẩn đoán phân tử RT-PCR để nâng cao độ chính xác trong công tác điều tra ổ dịch và khoanh vùng dập dịch tai xanh tại thực địa.

Nhóm giảng viên, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Thú y, Chăn nuôi và Công nghệ sinh học có thể sử dụng luận văn như một tài liệu tham khảo học thuật chuẩn mực về phương pháp luận nghiên cứu virus học, từ thiết kế thí nghiệm in-vitro đến phân tích tiến hóa phân tử bằng phần mềm chuyên dụng MEGA5.

Câu hỏi thường gặp

Chủng virus KTY-PRRS-06 có nguồn gốc từ đâu và mang những đặc tính nổi bật nào? Chủng KTY-PRRS-06 được phân lập từ mẫu phổi của lợn nái mắc bệnh tại ổ dịch Hải Phòng năm 2015 với hiệu giá ban đầu 10^2,66 TCID50/25µl. Đây là chủng cường độc thuần khiết, hoàn toàn âm tính với 4 loại mầm bệnh tạp nhiễm phổ biến gồm virus dịch tả lợn, lở mồm long móng, tiêu chảy thành dịch và viêm dạ dày ruột truyền nhiễm.

Tại sao dòng tế bào Marc-145 được ưu tiên lựa chọn để cấy chuyển virus PRRS? Dòng tế bào thận khỉ Marc-145 có khả năng phân chia vô hạn, độ đồng nhất cơ chất cao và tạo bệnh tích tế bào rất rõ rệt khi virus nhân lên. Kết quả nghiên cứu chứng minh tế bào này hỗ trợ virus phát triển mạnh mẽ và đạt 100% bệnh tích ở mốc 72 giờ, vượt trội hơn đại thực bào phế nang sơ cấp vốn khó chuẩn bị và giới hạn chu kỳ sống.

Thời điểm nào thích hợp nhất để thu hoạch virus PRRS đạt hiệu giá cao trên tế bào nuôi? Thời điểm thu hoạch tối ưu nhất là 72 giờ sau khi gây nhiễm, khi toàn bộ 100% tế bào Marc-145 đã biểu hiện bệnh tích tế bào và hiệu giá virus đạt đỉnh cực đại trung bình là 10^4,56 TCID50/25µl. Thu hoạch sau mốc 72 giờ sẽ làm giảm sút hàm lượng virus do tế bào chủ đã hoại tử hoàn toàn.

Tính ổn định di truyền của đoạn gen ORF5 qua 40 đời cấy chuyển được chứng minh như thế nào? Đoạn gen ORF5 dài 603 bp mã hóa 200 axit amin của kháng nguyên GP5 được giải trình tự tự động trên hệ thống Beckman Coulter CEQ 8000. Kết quả phân tích cho thấy độ tương đồng nucleotide giữa các đời P0 đến P40 đạt từ 98,15% đến 100% và axit amin đạt từ 96,88% đến 100%, chứng minh tính ổn định di truyền vượt trội.

Kết quả của đề tài đóng góp giá trị thực tiễn gì cho công tác kiểm soát dịch bệnh tại Việt Nam? Luận văn cung cấp bằng chứng khoa học khẳng định chủng KTY-PRRS-06 có khả năng nhân lên mạnh mẽ và bảo tồn đặc tính phân tử ổn định qua nhiều thế hệ. Đây là cơ sở then chốt để phát triển các dòng vaccine nội địa phòng chống bệnh tai xanh tương thích hoàn toàn với dịch tễ học Việt Nam.

Kết luận

• Đã phân lập thành công chủng virus cường độc KTY-PRRS-06 thuần khiết từ ổ dịch lợn nái tại Hải Phòng năm 2015, xác định tỷ lệ nhiễm PRRS bằng RT-PCR đạt 80,00% trên đàn lợn nghi mắc bệnh.
• Đã xác định đặc tính gây bệnh tích tế bào của virus trên dòng Marc-145 duy trì ổn định qua 40 đời cấy chuyển, với tỷ lệ phá hủy tế bào đạt 100% ở thời điểm 72 giờ sau gây nhiễm.
• Đã xác lập đường cong sinh trưởng của virus với hiệu giá đỉnh đạt 10^4,56 TCID50/25µl tại 72 giờ, làm căn cứ định chuẩn thời điểm thu hoạch sinh khối virus phục vụ nghiên cứu và sản xuất.
• Đã chứng minh tính ổn định sinh học phân tử xuất sắc của đoạn gen ORF5 (kích thước 603 bp, mã hóa 200 axit amin) với độ tương đồng nucleotide từ 98,15% đến 100% và axit amin từ 96,88% đến 100% qua 40 thế hệ cấy chuyển.
• Đã cung cấp nguồn vật liệu di truyền và chủng giống virus bản địa chuẩn hóa, tạo nền tảng vững chắc cho công tác nghiên cứu bệnh lý học và sản xuất vaccine phòng chống hội chứng PRRS tại Việt Nam.

Đóng góp chính của luận văn là mở ra triển vọng tự chủ công nghệ sản xuất vaccine tai xanh thế hệ mới từ chủng virus thực địa. Về lộ trình tiếp theo trong giai đoạn 2017 đến 2020, các cơ quan nghiên cứu cần nhanh chóng tiến hành các thử nghiệm đánh giá mức độ giảm độc lực và kiểm tra hiệu lực bảo hộ miễn dịch trên động vật cảm nhiễm. Hãy kết nối và hợp tác cùng các cơ sở nghiên cứu đầu ngành để ứng dụng ngay những phát hiện khoa học này vào thực tiễn chăn nuôi an toàn sinh học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HOÀNG THỊ THẢO NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG VIRUS CƯỜNG ĐỘC KTY-PRRS-06 GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN Ngành : Thú y Mã số : 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học : PGS. Nguyễn Hữu Nam NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2016 Tác giả luận văn Hoàng Thị Thảo i LỜI CẢM ƠN Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các Thầy, Cô giáo - những người đã tận tình dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi học tập tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam cũng như trong thời gian tôi thực hiện luận văn này.

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến PGS. Nguyễn Hữu Nam, người hướng dẫn khoa học, về sự giúp đỡ nhiệt tình và có trách nhiệm đối với tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Lời cảm ơn của tôi cũng xin gửi tới Bộ môn Bệnh lý - Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, các anh, chị, em phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y - Khoa Thú y nơi tôi thực hiện đề tài đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành đề tài tốt nhất. Cuối cùng tôi xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này.

Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2016 Tác giả luận văn Hoàng Thị Thảo ii MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh mục các chữ viết tắt. vi Danh mục bảng .viii Danh mục hình.

ix Trích yếu luận văn. Tính cấp thiết của đề tài. Mục đích nghiên cứu. Tổng quan tài liệu.

Tình hình nghiên cứu về Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn. Tình hình dịch PRRS trên thế giới. Tình hình dịch PRRS tại Việt Nam. Những nghiên cứu về dịch PRRS ở nước ngoài.

Những nghiên cứu về dịch PRRS ở Việt Nam. Virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV). Hình thái, cấu tạo virus PRRS. Phân loại virus PRRS.

Khả năng gây bệnh của virus PRRS. Sức đề kháng của virus PRRS. Đặc tính nuôi cấy virus PRRS. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản.

Đặc điểm chung. Động vật cảm nhiễm. Chất chứa mầm bệnh. Cơ chế sinh bệnh và phương thức truyền lây.

Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS. Bệnh tích của lợn mắc PRRS. Các phương pháp chẩn đoán PRRS. Biện pháp phòng và trị bệnh.

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu.

Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145.

Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY- PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145. Phương pháp nghiên cứu. Nuôi cấy virus KTY-PRRS-06 trên môi trường tế bào Marc-145. Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID50.

Xác định đường cong sinh trưởng của virus PRRS qua các đời cấy chuyển. Phương pháp tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS. Phương pháp RT- PCR. Phương pháp giải trình tự Gen.

Phương pháp đọc kết quả. Kết quả và thảo luận. Kết quả nghiên cứu chủng virus prrs nghiên cứu. Kết quả lựa chọn mẫu PRRS cho nghiên cứu.

Kết quả kiểm tra khả năng tạp nhiễm với các loại virus khác. Kết quả nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY- PRRS-06. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào qua các đời cấy chuyển. Kết quả xác định hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-06.

Kết quả nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-06. Kết quả tách chiết RNA tổng số của chủng virus KTY-PRRS-06. Kết quả giải trình tự đoạn ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-06. Kết quả nghiên cứu so sánh trình tự nucleotide qua các đời cấy chuyển.

Kết quả nghiên cứu so sánh trình tự axit amin của virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử. Kết luận và kiến nghị. 52 Tài liệu tham khảo.

53 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Chữ viết đầy đủ BED Blue Ear disease BLAST Basic Local Alignment Search Tool Bp Base pair CNSH Công nghệ sinh học CPE Cyto Pathogenic Effect DMEM Dulbecco,s Modified Eagle’s Medium DMSO Dimethylsulfoxide DNA Deoxynucleotide Acid dNTP Deoxynucleotide triphotphat EAV Equine Arteritis virus EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acide ELISA Enzyme Linked Immunosortbent Assay FBS Fetal Bovine Serum FCS Fetal Calf Serum GP Glycoprotein IFA Indirect Immunofluoresence Assay kDa Kilodalton LDHV Lactate Dehydlogenase – elevating virus Log Logarit (cơ số 10) MEGA5 Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 5.10 MOI Multiplicity Of Infection mRNA Acid Ribonucleic thông tin vi MSD Mistery Swine Disease OIE Tổ chức thú y thế giới ORF Open Reading Frame (khung đọc mở) PAM Pulmnary Alveolar Macrophage PBS Phosphate Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction PEARS Porcine Endemic Abortion and Respiratory Syndrome PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus RNA Ribonucleic Acid RT- PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction SHFV Simian Hemorrhaghic Fever Virus TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 VNT Virus Neutralization Test vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Protein cấu trúc của PRRSV. Sức đề kháng của virus với điều kiện ngoại cảnh. Thành phần và thể tích cho phản ứng RT- PCR.

Các cặp mồi cho phản ứng RT- PCR. Chu kỳ nhiệt độ cho phản ứng RT- PCR. Mẫu lợn nghi mắc PRRS thu thập được. Kết quả chẩn đoán RT- PCR các lợn nghi mắc PRRS.

Hồ sơ giống virus PRRS lựa chọn nghiên cứu. Kết quả xác định sự có mặt của virus PRRS, CSF, FMD, FED, TGE. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng virus KTY- PRRS-06 qua các đời cấy chuyển. Hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-06 tại thời điểm thu hoạch.

Hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển. Sai khác về vị trí nucleotide ở các đời của chủng KTY-PRRS-06. So sánh sự tương đồng về nucleotide của virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển. Sai khác về vị trí axit amin ở các đời của chủng KTY-PRRS-06.

So sánh sự tương đồng về axit amin của virus KTY-PRRS-06 ở các đời cấy chuyển. 49 viii DANH MỤC HÌNH Hình 2. Bản đồ lịch sử xuất hiện PRRS trên thế giới. Cấu trúc hạt của PRRS virus.

Cấu trúc hệ gen của virus PRRS. Virus PRRS xâm nhập và phá hủy tế bào đại thực bào. Tế bào Marc-145 chưa gây nhiễm virus. Bệnh tích tế bào sau 36 giờ gây nhiễm.

Bệnh tích tế bào sau 48 giờ gây nhiễm. Bệnh tích tế bào sau 60 giờ gây nhiễm. Bệnh tích tế bào sau 72 giờ gây nhiễm. Đường cong sinh trưởng của virus KTY-PRRS-06.

Log10 hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-06. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số. Kết quả phản ứng RT- PCR với mồi ORF5. Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide đoạn gen ORF5 của chủng KTY-PRRS-06 ở đời cấy chuyển thứ 10.

So sánh trình tự nucleotide của chủng KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển. So sánh trình tự axit amin của chủng KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển. Cây sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-06. 51 ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Hoàng Thị Thảo Tên luận văn: “ Nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus cường độc KTY-PRRS-06 gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn” Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Đề tài nhằm mục đích đánh giá được sự ổn định một số đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus cường độc KTY-PRRS-06 gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, qua các đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145 Phương pháp nghiên cứu Bằng các phương pháp nghiên cứu: Nuôi cấy virus KTY-PRRS-06 trên môi trường tế bào Marc-145; xác định hiệu giá virus TCID50; xác định đường cong sinh trưởng của virus PRRS qua các đời cấy truyền; tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS; RT- PCR; phương pháp giải trình tự Gen.

Kết quả chính và kết luận 1. Đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-06: Khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng virus nghiên cứu có tính ổn định cao qua các đời cấy chuyển trên môi trường Marc-145. Chủng virus PRRS có hiệu giá cao và ổn định, có khả năng phát triển và nhân lên tốt trên môi trường tế bào Marc-145. Hiệu giá virus thu được cao nhất tại thời điểm 72 giờ sau gây nhiễm.

Đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-06: Xác định được trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 của chủng virus sau các đời cấy chuyển liên tục. Đoạn gen ORF5 quy định kháng nguyên GP5 của chủng virus KTY-PRRS-06 có kích thước 603 bp mã hóa cho 200 axit amin của protein kháng nguyên GP5. Trình tự nucleotide và axit amin của trong đoạn gen ORF5 của chủng nghiên cứu qua các đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145 ổn định, mức độ tương đồng về nucleotide từ 98,15% đến 100%; về axit amin từ 96,88% đến 100%. x THESIS ABSTRACT Master candidate: Hoang Thi Thao Thesis title: "Research biology and molecular biology of the virulent strain KTY- PRRS-06 cause Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome".

Major: Veterinary Medicine Code: 60 64 01 01 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives Topic purpose assess the stability of some biological characteristics and molecular biology of the virulent strain KTY-PRRS-06 cause reproductive disorders and respiratory in pigs, over the lifetime subcultures environment on Marc-145 cells. Materials and Methods KTY-PRRS-06 virus cultured on environmental Marc-145 cells; TCID50 virus titre determined; determine the growth curve over the lifetime of PRRSV inoculation; Total RNA extraction of PRRS virus genome; RT- PCR; Gen. Main findings and conclusions 1. Biological characteristics of KTY-PRRS-06 virus strain: Ability to cause cell lesions of viral strains studied high stability over the lifetime subcultures on Marc-145 environment.