MỞ ĐẦU Tại Việt Nam, cho đến nay vẫn chưa có một cuộc điều tra hay thống kê chính thức về các bệnh hiếm gặp. Hiện nay, Việt Nam có duy nhất một câu lạc bộ dành cho các người bệnh mắc bệnh hiếm tại Bệnh viện Nhi Trung ương, được thành lập vào ngày 11/11/2014. Ngày 16/5/2019, Bộ Y tế tổ chức phiên họp đầu tiên của Hội đồng tư vấn về quản lý bệnh hiếm. Theo số liệu của Bộ Y tế, Việt Nam có khoảng 6 triệu người đang sống chung với các căn bệnh hiếm.
Trong đó, hơn 50% trường hợp phát hiện bệnh hiếm là ở trẻ em, có tới 30% trẻ mang bệnh tử vong trước 5 tuổi và được xếp hàng thứ hai trong các nguyên nhân gây tử vong sơ sinh tại Việt Nam. Thêm vào đó, 80% các hội chứng hiếm gặp có nguyên nhân di truyền và trẻ sẽ mắc bệnh suốt đời. Bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và bệnh loạn dưỡng cơ là ba trong những bệnh hiếm gặp ở trẻ nhỏ. Giai đoạn khởi phát bệnh các bệnh này phụ thuộc vào mức độ nghiêm trọng khác nhau của bệnh.
Do đó, việc chẩn đoán sớm và chính xác nguyên nhân gây bệnh là cơ sở để đưa ra các liệu pháp điều trị phù hợp, hạn chế được những biến chứng nghiêm trọng. Tuy nhiên, mức độ nghiêm trọng và phổ lâm sàng rộng cùng với số lượng người bệnh hạn chế là các lý do gây khó khăn cho các bác sĩ và chuyên gia y tế trong việc đưa ra các chẩn đoán chính xác. Giải trình tự Sanger là phương pháp thường được sử dụng trong chẩn đoán các bệnh di truyền nói chung và bệnh hiếm gặp nói riêng. Công việc này cần được thực hiện trên tất cả các gen liên quan đến bệnh, do đó tiêu tốn nhiều thời gian và cần đến chi phí lớn.
Năm 2005, sự phát triển của kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) cho phép phân tích đồng thời nhiều hoặc thậm chí tất cả các gen, nhờ đó có thể khắc phục được nhược điểm nêu trên. Trong đó, phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa (WES), một trong những ứng dụng của NGS, đã được chứng minh là một công cụ hiệu quả trong việc xác định gen gây bệnh theo di truyền Mendel do vùng gen mã hóa chỉ chiếm 1% hệ gen nhưng số lượng bệnh do biến thể nằm trong vùng này lên tới 85%. Thực tế đã chứng minh, hàng chục nghìn biến thể gen đã được xác định trong vùng gen mã hóa ở nhiều người mắc bệnh phức tạp như: tim mạch, thần kinh, chuyển hóa…. Trên cơ sở đó, phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa (WES) được sử dụng để xác định nguyên nhân di truyền ở các người mắc bệnh xirô niệu, rối 2 loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ ở Việt Nam.
Kết quả thu được có thể là cơ sở hỗ trợ các bác sĩ đưa ra liệu pháp điều trị thích hợp cho người bệnh và đề xuất các phương án tư vấn di truyền cho gia đình người bệnh. Xuất phát từ những lý do nêu trên nghiên cứu sinh đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu biến đổi gen ở người bệnh mắc bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và bệnh loạn dưỡng cơ ở Việt Nam bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới”. Mục tiêu nghiên cứu - Giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa ở người bệnh mắc xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ tại Việt Nam; - Xác định được các biến thể mang tính di truyền theo phả hệ trong gia đình của người bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ tại Việt Nam. Nội dung nghiên cứu 1.
Thu thập mẫu máu và tách DNA tổng số từ mẫu máu một số người bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê, loạn dưỡng cơ và các thành viên trong gia đình. Giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa của một số người bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ. Phân tích số liệu, phát hiện các đột biến di truyền trên các gen liên quan đến bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ. Phân tích in silico dự đoán ảnh hưởng của các đột biến đến chức năng protein tương ứng.
Bệnh xirô niệu (MSUD) 1. Khái niệm Bệnh xirô niệu (MSUD) là một rối loạn chuyển hóa hiếm gặp, di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường. Cơ thể của người bệnh không thể chuyển hóa được các amino acid mạch nhánh (BCAA) bao gồm leucine, isoleucine và valine. Sự tích tụ của các amino acid này trong nước tiểu tạo ra mùi đặc trưng và là nguồn gốc tên của bệnh.
Nếu không được điều trị kịp thời, bệnh có thể tiến triển đến co giật, hôn mê và thậm chí tử vong sớm, thường trước 3 tháng tuổi. Xirô niệu là bệnh hiếm gặp với tỷ lệ mắc ước tính khoảng 1/185.000 trên toàn thế giới [1]. Tuy nhiên, ở các quốc gia có tỷ lệ hôn nhân cận huyết cao, con số này có thể lớn hơn [2]. Đến nay, tỷ lệ mắc bệnh xirô niệu ở Việt Nam chưa được thống kê đầy đủ và chính thức.
Cơ chế bệnh sinh Bệnh xirô niệu gây ra do biến thể xuất hiện trên gen BCKDHA, BCKDHB, DBT và DLD, mã hóa tương ứng cho các tiểu đơn vị E1α, E1β, E2, E3 của phức hợp α-ketoacid dehydrogenase mạch nhánh (BCKD). Phức hợp BCKD xúc tác quá trình khử carboxyl hóa các α-ketoacid mạch nhánh, bước thứ hai trong quá trình phân giải các amino acid mạch nhánh. Biến thể trên các gen mã hóa làm suy giảm hoặc mất chức năng của phức hợp, từ đó dẫn đến sự tích tụ các amino acid mạch nhánh như leucine, isoleucine, valine trong máu và các α-ketoacid mạch nhánh trong máu và nước tiểu [3]. Sự tích lũy các chất này có thể gây tổn thương hệ thần kinh thông qua việc ngăn cản quá trình tổng hợp các chất dẫn truyền thần kinh quan trọng và quá trình myelin hóa xảy ra ở các tế bào thần kinh [3].
Leucine, isoleucine, valine là 03 amino acid thiết yếu, không thể tự tổng hợp ở động vật có vú và được đưa vào cơ thể qua đường thức ăn. Do BCAA cần thiết cho quá trình tổng hợp protein, các acid béo mạch nhánh, chất dẫn truyền thần kinh nên quá trình dị hóa các BCAA được kiểm soát chặt chẽ, thông qua phức hợp enzyme BCKD. Bước đầu tiên trong quá trình dị hóa BCAA là chuyển nhóm amin của leucine, isoleucine, valine cho α-ketoglutarate (α-KG) tạo thành glutamate và các ketoacid mạch nhánh (BCKA) tương ứng bao gồm α-ketoisocaproate (KIC), α keto- methylvalate (KMV), α-ketoisovalerate (KIV), với sự xúc tác của aminotransferase 4 (Hình 1. Bước tiếp theo là quá trình khử carboxyl oxy hóa thông qua phức hợp BCKD.
Ở người mắc bệnh xirô niệu, bước này bị gián đoạn. Quá trình phân giải các amino acid mạch nhánh (BCAA) [4] Quá trình chuyển gốc amin của BCAA được thực hiện nhờ vào vai trò xúc tác của aminotransferase tạo sản phẩm là các ketoacid mạch nhánh (BCKA): α-ketoisocaproate (KIC), α-keto-β-methylvalerate (KMV), α-ketoisovalerate (KIV) (phản ứng 1). Quá trình khử carboxyl oxi hóa của các ketoacid mạch nhánh (BCKA) được thực hiện nhờ phức hợp a-ketoacid dehydrogenase mạch nhánh (BCKD) (phản ứng 2) [4]. Di truyền phân tử BCKD là enzyme điều hòa quan trọng nhất trong con đường dị hóa của các BCAA, nằm trong ty thể, gồm 03 thành phần xúc tác decarboxylase E1, dihydrolipoyl transacylase E2, dihydrolipoamide dehydrogenase E3 và 02 enzyme điều hòa (BCKD kinase, BCKD phosphatase) [5].
Các thành phần E1 (02 tiểu đơn vị α và 02 tiểu đơn vị β), E2 và E3 được mã hóa lần lượt bởi các gen BCKDHA, BCKDHB, DBT, DLD đều nằm trong nhân (Bảng 1. Các gen liên quan đến bệnh xirô niệu Gen Vị trí Số amino acid Số exon BCKDHA 19q13.1 486 11 Thành phần E1, được tạo nên từ 02 tiểu phần E1α và 02 tiểu phần E1β. Gen mã hóa cho tiểu đơn vị E1α, BCKDHA, nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể 19 tại 5 vị trí 19q13. Gen BCKDHA gồm 9 exon, mã hóa cho một mRNA 1,6 kb và được dịch mã thành 378 aa với một trình tự dẫn đầu dài 45 aa.
Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen BCKDHA (www.gov/genome/tools/gdp) Gen BCKDHB mã hóa cho tiểu đơn vị E1β nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể số 6 tại vị trí 6q14.1, gồm 11 exon, mã hóa cho một mRNA 1,4 kb và dịch mã thành 342 aa với một trình tự dẫn đầu dài 50 aa (Hình 1. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen BCKDHB (www.gov/genome/tools/gdp) Thành phần E2, là một dihydrolipoyl transacylase (DBT), tồn tại dưới dạng homo-24mer hình bát giác đối xứng trong phức hợp BCKD, giữ vai trò như là “lõi” chức năng của phức hợp do sự có mặt của các vùng lipoyl. Thành phần này hoạt động như cánh tay xoay dài để chuyển giao, tiếp nhận các chất trung gian giữa các trung tâm hoạt động hoặc tiểu đơn vị khác của phức hợp. Gen mã hóa cho thành phần E2, DBT, nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 1 tại vị trí 1p21.
Gen DBT gồm 11 exon, mã hóa cho một mRNA 1,46 kb và dịch mã thành 421 amino acid với một trình tự dẫn đầu có kích thước 56 aa. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen DBT (www.gov/genome/tools/gdp) 6 Thành phần E3, tồn tại như một homodimer trong phức hợp BCKD. Gen mã hóa cho thành phần E3, DLD, nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể số 7 tại vị trí 7q31. Gen DLD gồm 11 exon, mã hóa 02 mRNA 2,2 kb và 2,4 kb, dịch mã thành 509 aa với một trình tự dẫn đầu có chiều dài không xác định.
Thành phần E1 và E2 xuất hiện duy nhất trong phức hợp BCKD, trong khi thành phần E3 có mặt trong hai enzyme ty thể khác (pyruvate dehydrogenase và phức hợp α- ketoglutarate dehydrogenase, giữ vai trò quan trọng trong chu trình Krebs). Thành phần này còn được gọi là protein L của hệ thống phân cắt glycine ty thể. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen DLD (www.gov/genome/tools/gdp) 1. Triệu chứng lâm sàng và chẩn đoán Dựa vào triệu chứng lâm sàng, MSUD được phân loại thành 05 kiểu, không có mối tương quan chặt chẽ giữa kiểu gen và kiểu hình bao gồm kiểu cổ điển, trung gian, không liên tục, đáp ứng thiamine và thiếu E3.
Bệnh xirô niệu kiểu cổ điển và kiểu thiếu E3 thường khởi phát ngay trong thời kỳ sơ sinh, trong khi các kiểu còn lại có thể xuất hiện bất cứ giai đoạn nào khi người bệnh phải đối mặt với các yếu tố stress. Các triệu chứng lâm sàng của MSUD phụ thuộc vào mức độ hoạt động của phức hợp BCKD.
