Luận án tiến sĩ nghiên cứu biến đổi gen ở người bệnh mắc bệnh xirô niệu rối loạn chu trình chuyển hóa urê và bệnh loạn dưỡng cơ ở việt nam bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới

Luận án tiến sĩ nghiên cứu biến đổi gen ở bệnh nhân xirô niệu, rối loạn chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ tại Việt Nam bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Hường
• Người hướng dẫn: GS. Nguyễn Huy Hoàng
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu biến đổi gen ở người bệnh mắc bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và bệnh loạn dưỡng cơ ở Việt Nam bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới
• Loại tài liệu: luận án tiến sỹ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Bệnh xirô niệu (MSUD)
• 1.1.1. Cơ chế bệnh sinh
• 1.1.2. Di truyền phân tử
• 1.1.3. Triệu chứng lâm sàng và chẩn đoán
• 1.1.4. Tình hình nghiên cứu bệnh xirô niệu trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.2. Bệnh rối loạn chu trình chuyển hóa urê
• 1.2.1. Cơ chế bệnh sinh
• 1.2.2. Di truyền phân tử
• 1.2.3. Tình hình nghiên cứu bệnh rối loạn chu trình chuyển hóa urê trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.3. Bệnh loạn dưỡng cơ
• 1.3.1. Phân loại bệnh
• 1.3.2. Tình hình nghiên cứu bệnh loạn dưỡng cơ trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.4. Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (NGS)
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ người bệnh
• 2.1.1.1. Bệnh xirô niệu
• 2.1.1.2. Bệnh rối loạn chu trình chuyển hóa urê
• 2.1.1.3. Bệnh loạn dưỡng cơ
• 2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.1.2.1. Thời gian nghiên cứu
• 2.1.2.2. Địa điểm nghiên cứu
• 2.1.3. Đạo đức trong nghiên cứu
• 2.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Tách chiết DNA tổng số
• 2.3.2. Giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa bằng hệ thống Illumina
• 2.3.3. Sàng lọc các biến thể trên các gen chứa biến thể liên quan
• 2.3.4. Kiểm chứng biến thể có tiềm năng gây bệnh
• 2.3.5. Đánh giá ảnh hưởng của các biến thể bằng một số công cụ tin sinh
• 2.3.6. Phân loại khả năng gây bệnh của các biến thể có tiềm năng theo tiêu chí của Hiệp hội Bệnh học Phân tử và Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG)
• 2.3.7. Cơ sở dữ liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Bệnh xirô niệu (MUSD)
• 3.1.1. Kết quả lâm sàng
• 3.1.2. Tách chiết DNA tổng số
• 3.1.3. Kết quả giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa
• 3.1.4. Kiểm chứng biến thể
• 3.1.5. Đánh giá ảnh hưởng của các biến thể bằng một số công cụ tin sinh
• 3.1.6. Phân loại khả năng gây bệnh của các biến thể có tiềm năng theo tiêu chí của Hiệp hội Bệnh học Phân tử và Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG)
• 3.2. Bệnh rối loạn chu trình chuyển hóa urê (UCD)
• 3.2.1. Kết quả lâm sàng
• 3.2.2. Tách chiết DNA tổng số
• 3.2.3. Kết quả giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa
• 3.2.4. Kiểm chứng biến thể
• 3.2.5. Đánh giá ảnh hưởng của các biến thể bằng một số công cụ tin sinh
• 3.2.6. Phân loại khả năng gây bệnh của các biến thể có tiềm năng theo tiêu chí của Hiệp hội Bệnh học Phân tử và Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG)
• 3.3. Bệnh loạn dưỡng cơ (MD)
• 3.3.1. Kết quả lâm sàng
• 3.3.2. Tách chiết DNA tổng số
• 3.3.3. Kết quả giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa
• 3.3.4. Kiểm chứng biến thể
• 3.3.5. Đánh giá ảnh hưởng của các biến thể bằng một số công cụ tin sinh
• 3.3.6. Phân loại khả năng gây bệnh của các biến thể có tiềm năng theo tiêu chí của Hiệp hội Bệnh học Phân tử và Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG)
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Bệnh xirô niệu (MUSD)
• 4.2. Bệnh rối loạn chu trình chuyển hóa urê (UCD)
• 4.3. Bệnh loạn dưỡng cơ
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Biến đổi gen và bệnh nhân xirô niệu

Biến đổi gen là yếu tố chính gây ra bệnh nhân xirô niệu, một rối loạn chuyển hóa hiếm gặp. Bệnh này liên quan đến sự tích tụ các amino acid mạch nhánh (BCAA) như leucine, isoleucine và valine trong cơ thể. Các biến đổi gen trên các gen BCKDHA, BCKDHB, DBT và DLD làm suy giảm chức năng của phức hợp enzyme BCKD, dẫn đến sự tích tụ các chất này. Nghiên cứu sử dụng giải trình tự gen thế hệ mới để xác định các biến đổi gen này ở bệnh nhân Việt Nam, từ đó hỗ trợ chẩn đoán và điều trị.

1.1. Cơ chế bệnh sinh

Bệnh nhân xirô niệu gây ra do sự tích tụ các amino acid mạch nhánh (BCAA) trong máu và nước tiểu. Các biến đổi gen trên các gen BCKDHA, BCKDHB, DBT và DLD làm suy giảm hoặc mất chức năng của phức hợp enzyme BCKD. Điều này dẫn đến sự tích tụ các BCAA và các α-ketoacid mạch nhánh, gây tổn thương hệ thần kinh và các biến chứng nghiêm trọng khác.

1.2. Di truyền phân tử

Các biến đổi gen trên các gen BCKDHA, BCKDHB, DBT và DLD là nguyên nhân di truyền của bệnh nhân xirô niệu. Các gen này mã hóa các tiểu đơn vị của phức hợp enzyme BCKD, đóng vai trò quan trọng trong quá trình dị hóa các amino acid mạch nhánh. Sự suy giảm chức năng của phức hợp này do biến đổi gen dẫn đến sự tích tụ các chất độc hại trong cơ thể.

II. Rối loạn chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ

Rối loạn chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ là hai bệnh lý di truyền hiếm gặp khác được nghiên cứu trong tài liệu này. Rối loạn chuyển hóa urê liên quan đến sự tích tụ amoniac trong máu do sự suy giảm chức năng của chu trình urê. Loạn dưỡng cơ là một nhóm bệnh gây suy yếu cơ bắp do các biến đổi gen trên các gen liên quan đến cấu trúc và chức năng của cơ. Nghiên cứu sử dụng giải trình tự gen thế hệ mới để xác định các biến đổi gen gây ra các bệnh này.

2.1. Rối loạn chuyển hóa urê

Rối loạn chuyển hóa urê là một nhóm bệnh di truyền liên quan đến sự tích tụ amoniac trong máu. Các biến đổi gen trên các gen CPS1, OTC, ASS1, ASL và ARG1 làm suy giảm chức năng của chu trình urê, dẫn đến sự tích tụ amoniac và các chất độc hại khác. Nghiên cứu sử dụng giải trình tự gen thế hệ mới để xác định các biến đổi gen này ở bệnh nhân Việt Nam.

2.2. Loạn dưỡng cơ

Loạn dưỡng cơ là một nhóm bệnh gây suy yếu cơ bắp do các biến đổi gen trên các gen liên quan đến cấu trúc và chức năng của cơ. Các gen như LAMA2, DMD và FKRP thường bị ảnh hưởng. Nghiên cứu sử dụng giải trình tự gen thế hệ mới để xác định các biến đổi gen gây ra loạn dưỡng cơ ở bệnh nhân Việt Nam.

III. Giải trình tự gen thế hệ mới và ứng dụng

Giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) là công nghệ tiên tiến được sử dụng trong nghiên cứu này để xác định các biến đổi gen gây ra bệnh nhân xirô niệu, rối loạn chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ. NGS cho phép phân tích đồng thời nhiều gen, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí so với các phương pháp truyền thống. Nghiên cứu này đã xác định được các biến đổi gen quan trọng, hỗ trợ chẩn đoán và điều trị các bệnh hiếm gặp này.

3.1. Phương pháp giải trình tự

Nghiên cứu sử dụng giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) để phân tích toàn bộ vùng mã hóa của gen (WES) ở các bệnh nhân mắc bệnh nhân xirô niệu, rối loạn chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ. Phương pháp này cho phép xác định các biến đổi gen một cách nhanh chóng và chính xác, hỗ trợ chẩn đoán và điều trị.

3.2. Ứng dụng trong y học phân tử

Kết quả nghiên cứu từ giải trình tự gen thế hệ mới có thể được ứng dụng trong y học phân tử để phát triển các liệu pháp điều trị cá nhân hóa cho các bệnh nhân mắc bệnh nhân xirô niệu, rối loạn chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ. Điều này giúp cải thiện chất lượng cuộc sống và giảm thiểu các biến chứng nghiêm trọng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Bệnh hiếm là nhóm bệnh lý phức tạp với tỷ lệ mắc thấp trong cộng đồng nhưng để lại hệ quả nghiêm trọng đối với sức khỏe và tính mạng của người bệnh. Tại Việt Nam, theo thống kê của Bộ Y tế, có khoảng 6 triệu người đang sống chung với các căn bệnh hiếm, trong đó hơn 50% trường hợp phát hiện ở trẻ em và khoảng 30% trẻ mang bệnh tử vong trước 5 tuổi, trở thành nguyên nhân gây tử vong sơ sinh đứng hàng thứ hai. Khoảng 80% các hội chứng hiếm gặp xuất phát từ nguyên nhân di truyền và người bệnh phải mang bệnh suốt đời.

Bệnh xirô niệu (Maple syrup urine disorder - MSUD), rối loạn chu trình chuyển hóa urê (Urea cycle disorder - UCD) và bệnh loạn dưỡng cơ (Muscular dystrophy - MD) là ba nhóm bệnh di truyền hiếm gặp điển hình ở trẻ nhỏ. Các bệnh lý này có phổ biểu hiện lâm sàng rộng, mức độ nghiêm trọng thay đổi tùy thuộc vào mức độ suy giảm hoạt tính enzyme hoặc cấu trúc protein, dễ gây nhầm lẫn với các bệnh lý khác và gây khó khăn cho việc chẩn đoán lâm sàng. Phương pháp giải trình tự Sanger truyền thống khi áp dụng đơn lẻ trên từng gen tốn nhiều thời gian và chi phí do số lượng gen liên quan lớn. Trong bối cảnh đó, phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa (Whole Exome Sequencing - WES) dựa trên công nghệ giải trình tự thế hệ mới (Next Generation Sequencing - NGS) là giải pháp phân tích đồng thời nhiều gen, giúp xác định chính xác các biến thể gây bệnh thuộc vùng mã hóa (nơi chứa tới 85% biến thể gây bệnh di truyền đơn gen Mendel dù chỉ chiếm 1% kích thước hệ gen). Việc ứng dụng WES để phát hiện biến thể gen gây bệnh ở người bệnh MSUD, UCD và MD tại Việt Nam đáp ứng yêu cầu cấp thiết về mặt chẩn đoán phân tử, hỗ trợ định hướng điều trị và tư vấn di truyền gia đình.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa ở người bệnh mắc xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ tại Việt Nam.
2. Xác định được các biến thể mang tính di truyền theo phả hệ trong gia đình của người bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ tại Việt Nam.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu:
  • Nhóm người bệnh mắc bệnh xirô niệu (R01, R02, R03, R04) và các thành viên trong gia đình.
  • Nhóm người bệnh mắc rối loạn chu trình chuyển hóa urê (R05, R06, R07) và các thành viên trong gia đình.
  • Nhóm người bệnh mắc loạn dưỡng cơ (R08, R09) cùng bố và mẹ.
• Phạm vi không gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phối hợp thu thập mẫu và phân tích lâm sàng với Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung ương.
• Phạm vi thời gian: Đề tài nằm trong khuôn khổ chương trình phát triển khoa học cơ bản giai đoạn 2017–2025 của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, luận án bảo vệ năm 2022.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trên thế giới

Tác giả đã tổng thuật chi tiết lịch sử nghiên cứu và thực trạng chẩn đoán phân tử của ba nhóm bệnh lý:

• Bệnh xirô niệu (MSUD): Kể từ phát hiện đầu tiên của Menkes và cộng sự (1954), nguyên nhân sai hỏng khử carboxyl oxy hóa amino acid mạch nhánh (BCAA) được làm rõ vào năm 1960. Nellis và Danner (2001) xác định tần suất biến thể trên các gen mã hóa tiểu đơn vị E1α (BCKDHA), E1β (BCKDHB), E2 (DBT) lần lượt là 33%, 38% và 19%. Các nghiên cứu của Morton (2002), Quental (2010), Su và cộng sự (2017), Strauss và cộng sự (2020) đã phát hiện hàng trăm biến thể gen liên quan. Ứng dụng NGS/WES trong MSUD được triển khai qua các công trình của Liu và cộng sự (2018) phát hiện biến thể c.391G>A (p.G131R) và mất đoạn lớn trên BCKDHB, cùng các nghiên cứu phát hiện biến thể trên BCKDHA, BCKDHB, DBT ở Trung Quốc, Mexico và nhiều quốc gia khác.
• Rối loạn chu trình chuyển hóa urê (UCD): Gồm các khiếm khuyết trên 6 enzyme và 2 protein vận chuyển (CPS1, NAGS, ASS1, SLC25A13, ASL, ARG1, SLC25A15, OTC). Nghiên cứu của Amstutz và cộng sự (2011), Fan và cộng sự (2020), Qin và cộng sự (2016), Olga và cộng sự (2021), Kenneson và Singh (2020), Xu và cộng sự (2018) đã ứng dụng NGS để phát hiện các biến thể điểm, biến thể dịch khung và biến thể vị trí cắt nối (splicing) trên các gen OTC, CPS1, ASS1, SLC25A13. Trong đó, đột biến gen OTC liên kết nhiễm sắc thể X chiếm khoảng 50% tổng số các ca UCD.
• Bệnh loạn dưỡng cơ (MD): Được Batten mô tả từ 1903–1904; Theadom và cộng sự (2014) tổng hợp tỷ lệ mắc chung từ 19,8 đến 25,1/100.000 người. Có 69 gen liên quan đến loạn dưỡng cơ và loạn dưỡng cơ bẩm sinh (CMD). Các nghiên cứu WES của Luce và cộng sự (2018), Ding và cộng sự (2019), Vigliano và cộng sự (2009) tập trung làm rõ các biến thể trên gen DMD, LAMA2, CAPN3, COL6A1, TTN.

Các nghiên cứu tại Việt Nam và khoảng trống nghiên cứu

• Tại Việt Nam, kỹ thuật khối phổ song song sàng lọc sơ sinh phát hiện MSUD từ năm 2012 ghi nhận 14 ca trong 3 năm đầu với tỷ lệ tử vong sơ sinh rất cao (11/12 ca tử vong) (Vũ Chí Dũng và CS). Giai đoạn 2011–2016, Bệnh viện Nhi Trung ương chẩn đoán 26 ca MSUD qua phân tích acid hữu cơ và định lượng amino acid.
• Đối với bệnh loạn dưỡng cơ, các nghiên cứu trong nước trước đây của Trần Vân Khánh và cộng sự (2003, 2013), Tạ Minh Hiền và cộng sự (2003), Nguyễn Thị Mai Hương (2015), Lê Thị Phương và cộng sự (2019) chủ yếu sử dụng kỹ thuật PCR đa mồi, MLPA hoặc phân tích microsatellite tập trung vào các đột biến mất/lặp exon trên gen DMD.
• Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết: Thiếu các nghiên cứu giải trình tự quy mô toàn bộ vùng mã hóa (WES) kết hợp phân tích di truyền phả hệ để xác định chính xác các biến thể điểm, biến thể ghép nối và biến thể hiếm gặp trên các gen gây bệnh MSUD, UCD và loạn dưỡng cơ bẩm sinh (liên quan LAMA2) ở người bệnh Việt Nam.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và cơ chế bệnh sinh

1. Bệnh xirô niệu (MSUD): Di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường (AR). Cơ chế do thiếu hụt hoạt tính phức hợp enzyme ty thể branched-chain α-ketoacid dehydrogenase (BCKD) gồm 3 tiểu phần xúc tác E1 (BCKDHA, BCKDHB), E2 (DBT), E3 (DLD). Quá trình dị hóa BCAA (leucine, isoleucine, valine) bị ngưng trệ, làm tích tụ BCAA và các acid α-keto tương ứng trong máu và nước tiểu, gây ngộ độc hệ thần kinh trung ương.
2. Bệnh rối loạn chu trình chuyển hóa urê (UCD): Sai hỏng chu trình biến đổi amoniac ($NH_3$) thành urê qua 5 phản ứng enzyme ty thể và tế bào chất. Điển hình là thiếu hụt enzyme Ornithine transcarbamylase (OTC, di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể X) và Carbamoyl phosphate synthetase 1 (CPS1, di truyền lặn NST thường), dẫn đến tăng amoniac máu cấp tính, gây tổn thương não và tử vong sơ sinh.
3. Bệnh loạn dưỡng cơ bẩm sinh type 1A (MDC1A): Di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường do biến thể gen LAMA2 (6q22.33, 65 exon, mã hóa chuỗi laminin α-2 dài 3.122 amino acid). Sự thiếu hụt laminin α-2 làm mất ổn định phức hợp laminin-211/221 tại màng đáy sợi cơ, dẫn đến teo cơ, thoái hóa sợi cơ, tăng creatine kinase (CK) và biến đổi chất trắng não trên MRI.

+-----------------------------------------------------------------------------------+
|                        QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU PHÂN TỬ VÀ WES                        |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
| 1. Thu thập mẫu máu ngoại vi & Phân tích hồ sơ lâm sàng / hóa sinh                |
|    - Người bệnh MSUD (R01 - R04), UCD (R05 - R07), MD (R08 - R09) & gia đình     |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
                                          |
                                          v
+-----------------------------------------------------------------------------------+
| 2. Tách chiết DNA tổng số & Đánh giá chất lượng DNA (Điện di gel Agarose 1%)     |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
                                          |
                                          v
+-----------------------------------------------------------------------------------+
| 3. Giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa (WES) trên hệ thống Illumina             |
|    - Bắt giữ exome, xây dựng thư viện, giải trình tự song song dung lượng cao     |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
                                          |
                                          v
+-----------------------------------------------------------------------------------+
| 4. Phân tích tin sinh học & Chú giải biến thể                                    |
|    - Gióng hàng hệ gen chuẩn hg19, gọi biến thể bằng GATK                         |
|    - Lọc biến thể theo tần số alen (ExAC, 1000 Genomes) & vùng mã hóa             |
|    - Dự đoán tác động in silico: SIFT, PolyPhen-2, MaxEntScan::score5ss, Prosite  |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
                                          |
                                          v
+-----------------------------------------------------------------------------------+
| 5. Kiểm chứng biến thể & Phân tích phả hệ gia đình bằng giải trình tự Sanger      |
|    - Thiết kế mồi đặc hiệu, khuếch đại PCR, giải trình tự Sanger                  |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
                                          |
                                          v
+-----------------------------------------------------------------------------------+
| 6. Phân loại biến thể theo tiêu chuẩn ACMG                                        |
|    - Đánh giá mức độ gây bệnh: PVS, PS, PM, PP -> Gây bệnh / Có thể gây bệnh      |
+-----------------------------------------------------------------------------------+

Phương pháp nghiên cứu thực tế

• Thu thập mẫu và tách chiết DNA: Lấy mẫu máu ngoại vi từ người bệnh và người thân; tách chiết DNA tổng số; kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ bằng đo quang phổ và điện di trên gel agarose 1%.
• Giải trình tự WES: Sử dụng hệ thống giải trình tự thế hệ mới Illumina, bắt giữ toàn bộ vùng exon của hệ gen người.
• Xử lý dữ liệu tin sinh học: Gióng hàng trình tự đọc với hệ gen tham chiếu người (Human genome assembly 19 - hg19), sử dụng công cụ GATK (Genome Analysis Toolkit) để phát hiện đa hình đơn nucleotide (SNP) và các biến thể chèn/mất đoạn nhỏ (InDel).
• Sàng lọc và phân tích in silico: Lọc biến thể dựa trên tần số alen hiếm (MAF), kiểm tra biến thể trên các gen đích liên quan đến từng nhóm bệnh; sử dụng các phần mềm dự đoán chức năng gồm SIFT, PolyPhen-2, phần mềm phân tích vị trí ghép nối MaxEntScan::score5ss, công cụ ScanProsite dự đoán cầu disulfide và mô hình hóa cấu trúc không gian 3D của protein.
• Kiểm chứng biến thể: Thiết kế cặp mồi đặc hiệu khuếch đại vùng gen chứa biến thể bằng phản ứng PCR, kiểm chứng bằng phương pháp giải trình tự Sanger trên người bệnh và các thành viên gia đình để xác định nguồn gốc di truyền theo phả hệ.
• Phân loại biến thể: Phân loại theo hướng dẫn chuẩn của Hiệp hội Bệnh học Phân tử và Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG) dựa trên các tiêu chí: PVS (rất mạnh), PS (mạnh), PM (trung bình), PP (hỗ trợ).

---

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Chương Mở đầu trình bày bối cảnh thực tế về gánh nặng bệnh hiếm tại Việt Nam và trên thế giới. Tác giả làm rõ cơ sở phân tử, các dạng phân loại lâm sàng và tổng quan các gen liên quan của ba bệnh:

• Bệnh xirô niệu (MSUD) gồm 5 thể lâm sàng: thể cổ điển (hoạt tính BCKD < 2%), thể trung gian (hoạt tính BCKD 3–30%), thể không liên tục, thể đáp ứng thiamine và thể thiếu E3; liên quan 4 gen BCKDHA (19q13.1), BCKDHB (6q14.1), DBT (1p21) và DLD (7q31).
• Bệnh rối loạn chu trình chuyển hóa urê (UCD) liên quan 8 gen (CPS1, NAGS, ASS1, SLC25A13, ASL, ARG1, SLC25A15, OTC), trong đó tập trung phân tích sâu cơ chế di truyền của gen OTC trên nhiễm sắc thể Xp21.1.
• Bệnh loạn dưỡng cơ (MD) với các phân nhóm: DMD/BMD (DMD), LGMD, FSHD, DM1/DM2 (DMPK, ZNF9), DD và nhóm loạn dưỡng cơ bẩm sinh MDC1A (LAMA2 trên nhiễm sắc thể 6q22.33).

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ người bệnh cho từng nhóm bệnh lý; quy trình thu thập mẫu tuân thủ đạo đức nghiên cứu y sinh học. Tác giả trình bày danh mục hóa chất, thiết bị, quy trình tách chiết DNA, thông số chu trình nhiệt PCR khuếch đại, hệ thống bắt giữ exon và nền tảng giải trình tự Illumina. Các thuật toán tin sinh học, cơ sở dữ liệu đối chiếu (ClinVar, ExAC, dbSNP, OMIM) và quy tắc kết hợp tiêu chuẩn phân loại biến thể theo ACMG được hệ thống hóa rõ ràng.

Kết quả nghiên cứu

Chương Kết quả nghiên cứu được cấu trúc thành ba phần tương ứng với ba nhóm bệnh lý nghiên cứu:

+------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------+
|                                TỔNG HỢP CÁC BIẾN THỂ GEN GÂY BỆNH ĐƯỢC XÁC ĐỊNH TRONG LUẬN ÁN                         |
+-------------------+----------------+-----------+----------------------+--------------------+---------------------------+
| Nhóm bệnh         | Mã người bệnh  | Gen       | Biến thể DNA         | Biến đổi protein   | Trạng thái di truyền      |
+-------------------+----------------+-----------+----------------------+--------------------+---------------------------+
| Bệnh xirô niệu    | R01            | BCKDHB    | Biến thể exon 10     | Biến đổi acid amin | Đồng hợp tử / Dị hợp tử   |
| (MSUD)            | R02            | BCKDHB    | Biến thể exon 9      | Biến đổi acid amin | Di truyền từ bố mẹ        |
|                   | R03            | BCKDHB    | Biến thể exon 1      | Biến đổi acid amin | Di truyền từ bố mẹ        |
|                   | R04            | DBT       | Đột biến gen DBT     | Đột biến tiểu phần | Di truyền phả hệ          |
+-------------------+----------------+-----------+----------------------+--------------------+---------------------------+
| Rối loạn chu trình| R05            | OTC       | IVS7+1G>A            | Sai hỏng ghép nối  | Bán hợp tử (nam) / Phả hệ |
| chuyển hóa urê    | R06            | OTC       | c.E122V (exon 4)     | p.Glu122Val        | Bán hợp tử (nam) / Dị hợp |
| (UCD)             | R07            | OTC       | Biến thể gen OTC     | Biến đổi acid amin | Di truyền liên kết NST X  |
+-------------------+----------------+-----------+----------------------+--------------------+---------------------------+
| Loạn dưỡng cơ     | R08            | LAMA2     | c.2987G>A (c.C996Y)  | p.Cys996Tyr        | Dị hợp tử tử bố mẹ        |
| (MD - MDC1A)      | R09            | LAMA2     | c.2987G>A (c.C996Y)  | p.Cys996Tyr        | Đồng hợp tử tử phả hệ     |
+-------------------+----------------+-----------+----------------------+--------------------+---------------------------+

1. Kết quả nghiên cứu bệnh xirô niệu (MSUD):

   • Phân tích lâm sàng và hóa sinh của 4 người bệnh R01, R02, R03, R04 ghi nhận các triệu chứng điển hình: tăng nồng độ leucine, isoleucine, valine trong máu, nước tiểu có mùi xirô, bú kém, hôn mê sơ sinh.
   • Kết quả WES kết hợp kiểm chứng Sanger xác định: người bệnh R01, R02, R03 mang các biến thể trên gen BCKDHB (tại các exon 1, 9, 10), người bệnh R04 mang biến thể trên gen DBT.
   • Phân tích in silico cho thấy các biến thể làm thay đổi acid amin tại các vị trí bảo tồn cao giữa các loài, làm thay đổi cấu trúc không gian 3D của phức hợp BCKD, dẫn đến mất ổn định và suy giảm chức năng enzyme. Phân loại theo ACMG xác nhận các biến thể thuộc nhóm gây bệnh hoặc có tiềm năng gây bệnh.

2. Kết quả nghiên cứu bệnh rối loạn chu trình chuyển hóa urê (UCD):

   • Ba người bệnh R05, R06, R07 có biểu hiện tăng amoniac máu nghiêm trọng, bệnh não cấp tính.
   • Kết quả giải trình tự xác định các biến thể gây bệnh nằm trên gen OTC (liên kết NST X):
     • Người bệnh R05 mang biến thể vị trí cắt nối tại intron 7 (IVS7+1G>A). Phần mềm MaxEntScan::score5ss dự đoán biến thể này phá hủy vị trí nhận biết cắt nối tự nhiên của intron 7, làm sai hỏng quá trình xử lý tiền mRNA.
     • Người bệnh R06 mang biến thể thay thế nucleotide tại exon 4 dẫn đến đột biến sai nghĩa c.E122V (p.Glu122Val). Công cụ tin sinh học dự đoán acid amin glutamic acid tại vị trí 122 được bảo tồn cao, đột biến làm gián đoạn liên kết và hoạt tính xúc tác của enzyme Ornithine transcarbamylase.
     • Phân tích phả hệ xác nhận người bệnh nam mang biến thể ở trạng thái bán hợp tử nhận alen đột biến từ mẹ mang gen dị hợp tử.

3. Kết quả nghiên cứu bệnh loạn dưỡng cơ (MD):

   • Hai người bệnh R08 và R09 (trong cùng một gia đình) có triệu chứng giảm trương lực cơ sơ sinh, chậm phát triển vận động, nồng độ creatine kinase (CK) trong huyết thanh tăng cao và hình ảnh MRI cho thấy bất thường tín hiệu chất trắng lan tỏa.
   • Dữ liệu WES và Sanger phát hiện biến thể thay thế nucleotide trên gen LAMA2: đột biến p.C996Y (thay thế Cysteine bằng Tyrosine tại vị trí amino acid 996).
   • Phân tích bằng công cụ ScanProsite xác nhận vị trí Cysteine 996 tham gia trực tiếp vào việc hình thành cầu nối disulfide nội phân tử trong chuỗi polypeptide laminin α-2. Đột biến làm mất cầu disulfide, phá vỡ cấu trúc không gian của miền protein laminin EGF-like, dẫn đến mất chức năng protein và gây bệnh loạn dưỡng cơ bẩm sinh MDC1A. Phân tích di truyền phả hệ xác nhận biến thể di truyền lặn từ bố và mẹ mang gen dị hợp tử.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn

• Ứng dụng quy trình chẩn đoán WES: Luận án đã xây dựng và áp dụng thành công quy trình giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa (WES) kết hợp kiểm chứng Sanger và phân tích tin sinh học để xác định chính xác các biến thể gây bệnh đơn gen hiếm gặp ở người bệnh Việt Nam.
• Bổ sung dữ liệu di truyền cho các bệnh hiếm tại Việt Nam:
  • Xác định phổ biến thể trên gen BCKDHB và DBT ở người bệnh xirô niệu (MSUD).
  • Xác định các biến thể điểm và biến thể vị trí ghép nối trên gen OTC (IVS7+1G>A, c.E122V) ở người bệnh rối loạn chu trình chuyển hóa urê.
  • Xác định cơ chế gây bệnh của biến thể p.C996Y trên gen LAMA2 phá vỡ cầu liên kết disulfide, khẳng định chẩn đoán phân tử bệnh loạn dưỡng cơ bẩm sinh thiếu hụt merosin (MDC1A) mà không cần thực hiện sinh thiết cơ xâm lấn.
• Giá trị tư vấn di truyền: Cung cấp bằng chứng di truyền học phả hệ chính xác, giúp phát hiện người lành mang gen trong gia đình, hỗ trợ sàng lọc trước sinh và phòng ngừa nguy cơ sinh con mắc bệnh ở các thai kỳ tiếp theo.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Mở rộng ứng dụng công nghệ giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa (WES) trong chẩn đoán sớm các bệnh chuyển hóa bẩm sinh và bệnh thoái hóa thần kinh - cơ tại các cơ sở y tế chuyên khoa nhi.
• Kết hợp dữ liệu phân tích biến thể di truyền với chương trình sàng lọc sơ sinh mở rộng để can thiệp dinh dưỡng sớm cho người bệnh MSUD và UCD, hạn chế tử vong sơ sinh và tổn thương thần kinh không phục hồi.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Quy mô mẫu nghiên cứu còn giới hạn ở một số lượng nhỏ gia đình người bệnh (4 ca MSUD, 3 ca UCD, 2 ca MD) do tính chất hiếm gặp của bệnh lý trong cộng đồng. Phương pháp WES chủ yếu tập trung vào vùng mã hóa exon, chưa phân tích toàn diện các biến thể cấu trúc lớn phức tạp nằm sâu trong vùng intron hoặc vùng điều hòa phiên mã ngoài gen.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Mở rộng cỡ mẫu người bệnh trên phạm vi toàn quốc để xây dựng cơ sở dữ liệu đầy đủ về phổ đột biến bệnh hiếm ở quần thể người Việt Nam.
  • Ứng dụng giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing - WGS) và các thử nghiệm chức năng in vitro/in vivo để đánh giá sâu hơn mức độ biểu hiện và hoạt tính của protein đột biến.

---

Giá trị tham khảo

• Đối với nghiên cứu sinh và học viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Di truyền học: Luận án là tài liệu tham khảo chuẩn mực về quy trình phân tích dữ liệu WES, kỹ thuật xử lý dữ liệu tin sinh học (GATK, SIFT, PolyPhen-2, ScanProsite) và quy tắc phân loại biến thể theo tiêu chuẩn quốc tế ACMG.
• Đối với bác sĩ lâm sàng, chuyên gia Di truyền Y học và Nhi khoa: Cung cấp các dẫn liệu lâm sàng - sinh hóa đối chiếu với biến thể gen cụ thể của ba nhóm bệnh hiếm (MSUD, UCD, MDC1A), giúp nâng cao năng lực chẩn đoán phân biệt, hạn chế sinh thiết cơ xâm lấn và xây dựng phác đồ tư vấn di truyền trước sinh.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án nghiên cứu những nhóm bệnh di truyền nào và sử dụng phương pháp phân tử chủ đạo nào?
Luận án nghiên cứu ba nhóm bệnh di truyền hiếm gặp ở trẻ em Việt Nam gồm: Bệnh xirô niệu (MSUD), Rối loạn chu trình chuyển hóa urê (UCD) và Bệnh loạn dưỡng cơ (MD). Phương pháp chủ đạo là giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa (Whole Exome Sequencing - WES) trên hệ thống NGS Illumina, kết hợp kiểm chứng bằng giải trình tự Sanger và phân tích tin sinh học.

2. Các gen nào được xác định có biến thể gây bệnh ở nhóm người bệnh xirô niệu (MSUD)?
Nghiên cứu xác định các biến thể gây bệnh nằm trên gen BCKDHB (mã hóa tiểu đơn vị E1β của phức hợp BCKD, tại các exon 1, 9, 10) ở ba người bệnh R01, R02, R03 và biến thể trên gen DBT (mã hóa tiểu đơn vị E2) ở người bệnh R04.

3. Đột biến trên gen OTC ở người bệnh rối loạn chu trình chuyển hóa urê (UCD) có đặc điểm di truyền gì?
Gen OTC nằm trên nhiễm sắc thể giới tính X (Xp21.1), quy định kiểu di truyền lặn liên kết NST X. Luận án phát hiện biến thể vị trí cắt nối IVS7+1G>A và biến thể sai nghĩa c.E122V (p.Glu122Val) ở trạng thái bán hợp tử trên các bé trai mắc bệnh (R05, R06), di truyền từ mẹ mang gen dị hợp tử.

4. Biến thể p.C996Y trên gen LAMA2 gây bệnh loạn dưỡng cơ bẩm sinh theo cơ chế phân tử nào?
Biến thể p.C996Y dẫn đến sự thay thế amino acid Cysteine bằng Tyrosine tại vị trí 996 của chuỗi laminin α-2. Phân tích qua công cụ ScanProsite chứng minh đột biến này làm mất cầu nối disulfide nội phân tử thiết yếu, phá vỡ cấu trúc bậc ba của miền protein laminin EGF-like, làm suy giảm cấu trúc màng đáy sợi cơ và dẫn đến bệnh loạn dưỡng cơ bẩm sinh MDC1A.

---

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thu Hường đã ứng dụng thành công công nghệ giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa (WES) để xác định căn nguyên di truyền ở người bệnh mắc xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ tại Việt Nam. Công trình đã làm sáng tỏ các biến thể gây bệnh trên các gen BCKDHB, DBT, OTC và LAMA2, đồng thời phân tích cơ chế phân tử và sự di truyền biến thể theo phả hệ gia đình. Kết quả đạt được đóng góp nguồn dữ liệu khoa học tin cậy cho di truyền học người ở Việt Nam, nâng cao hiệu quả chẩn đoán bệnh hiếm và phục vụ đắc lực cho công tác tư vấn di truyền tiền sản.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Tại Việt Nam, cho đến nay vẫn chưa có một cuộc điều tra hay thống kê chính thức về các bệnh hiếm gặp. Hiện nay, Việt Nam có duy nhất một câu lạc bộ dành cho các người bệnh mắc bệnh hiếm tại Bệnh viện Nhi Trung ương, được thành lập vào ngày 11/11/2014. Ngày 16/5/2019, Bộ Y tế tổ chức phiên họp đầu tiên của Hội đồng tư vấn về quản lý bệnh hiếm. Theo số liệu của Bộ Y tế, Việt Nam có khoảng 6 triệu người đang sống chung với các căn bệnh hiếm.

Trong đó, hơn 50% trường hợp phát hiện bệnh hiếm là ở trẻ em, có tới 30% trẻ mang bệnh tử vong trước 5 tuổi và được xếp hàng thứ hai trong các nguyên nhân gây tử vong sơ sinh tại Việt Nam. Thêm vào đó, 80% các hội chứng hiếm gặp có nguyên nhân di truyền và trẻ sẽ mắc bệnh suốt đời. Bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và bệnh loạn dưỡng cơ là ba trong những bệnh hiếm gặp ở trẻ nhỏ. Giai đoạn khởi phát bệnh các bệnh này phụ thuộc vào mức độ nghiêm trọng khác nhau của bệnh.

Do đó, việc chẩn đoán sớm và chính xác nguyên nhân gây bệnh là cơ sở để đưa ra các liệu pháp điều trị phù hợp, hạn chế được những biến chứng nghiêm trọng. Tuy nhiên, mức độ nghiêm trọng và phổ lâm sàng rộng cùng với số lượng người bệnh hạn chế là các lý do gây khó khăn cho các bác sĩ và chuyên gia y tế trong việc đưa ra các chẩn đoán chính xác. Giải trình tự Sanger là phương pháp thường được sử dụng trong chẩn đoán các bệnh di truyền nói chung và bệnh hiếm gặp nói riêng. Công việc này cần được thực hiện trên tất cả các gen liên quan đến bệnh, do đó tiêu tốn nhiều thời gian và cần đến chi phí lớn.

Năm 2005, sự phát triển của kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) cho phép phân tích đồng thời nhiều hoặc thậm chí tất cả các gen, nhờ đó có thể khắc phục được nhược điểm nêu trên. Trong đó, phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa (WES), một trong những ứng dụng của NGS, đã được chứng minh là một công cụ hiệu quả trong việc xác định gen gây bệnh theo di truyền Mendel do vùng gen mã hóa chỉ chiếm 1% hệ gen nhưng số lượng bệnh do biến thể nằm trong vùng này lên tới 85%. Thực tế đã chứng minh, hàng chục nghìn biến thể gen đã được xác định trong vùng gen mã hóa ở nhiều người mắc bệnh phức tạp như: tim mạch, thần kinh, chuyển hóa…. Trên cơ sở đó, phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa (WES) được sử dụng để xác định nguyên nhân di truyền ở các người mắc bệnh xirô niệu, rối 2 loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ ở Việt Nam.

Kết quả thu được có thể là cơ sở hỗ trợ các bác sĩ đưa ra liệu pháp điều trị thích hợp cho người bệnh và đề xuất các phương án tư vấn di truyền cho gia đình người bệnh. Xuất phát từ những lý do nêu trên nghiên cứu sinh đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu biến đổi gen ở người bệnh mắc bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và bệnh loạn dưỡng cơ ở Việt Nam bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới”. Mục tiêu nghiên cứu - Giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa ở người bệnh mắc xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ tại Việt Nam; - Xác định được các biến thể mang tính di truyền theo phả hệ trong gia đình của người bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ tại Việt Nam. Nội dung nghiên cứu 1.

Thu thập mẫu máu và tách DNA tổng số từ mẫu máu một số người bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê, loạn dưỡng cơ và các thành viên trong gia đình. Giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa của một số người bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ. Phân tích số liệu, phát hiện các đột biến di truyền trên các gen liên quan đến bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ. Phân tích in silico dự đoán ảnh hưởng của các đột biến đến chức năng protein tương ứng.

Bệnh xirô niệu (MSUD) 1. Khái niệm Bệnh xirô niệu (MSUD) là một rối loạn chuyển hóa hiếm gặp, di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường. Cơ thể của người bệnh không thể chuyển hóa được các amino acid mạch nhánh (BCAA) bao gồm leucine, isoleucine và valine. Sự tích tụ của các amino acid này trong nước tiểu tạo ra mùi đặc trưng và là nguồn gốc tên của bệnh.

Nếu không được điều trị kịp thời, bệnh có thể tiến triển đến co giật, hôn mê và thậm chí tử vong sớm, thường trước 3 tháng tuổi. Xirô niệu là bệnh hiếm gặp với tỷ lệ mắc ước tính khoảng 1/185.000 trên toàn thế giới [1]. Tuy nhiên, ở các quốc gia có tỷ lệ hôn nhân cận huyết cao, con số này có thể lớn hơn [2]. Đến nay, tỷ lệ mắc bệnh xirô niệu ở Việt Nam chưa được thống kê đầy đủ và chính thức.

Cơ chế bệnh sinh Bệnh xirô niệu gây ra do biến thể xuất hiện trên gen BCKDHA, BCKDHB, DBT và DLD, mã hóa tương ứng cho các tiểu đơn vị E1α, E1β, E2, E3 của phức hợp α-ketoacid dehydrogenase mạch nhánh (BCKD). Phức hợp BCKD xúc tác quá trình khử carboxyl hóa các α-ketoacid mạch nhánh, bước thứ hai trong quá trình phân giải các amino acid mạch nhánh. Biến thể trên các gen mã hóa làm suy giảm hoặc mất chức năng của phức hợp, từ đó dẫn đến sự tích tụ các amino acid mạch nhánh như leucine, isoleucine, valine trong máu và các α-ketoacid mạch nhánh trong máu và nước tiểu [3]. Sự tích lũy các chất này có thể gây tổn thương hệ thần kinh thông qua việc ngăn cản quá trình tổng hợp các chất dẫn truyền thần kinh quan trọng và quá trình myelin hóa xảy ra ở các tế bào thần kinh [3].

Leucine, isoleucine, valine là 03 amino acid thiết yếu, không thể tự tổng hợp ở động vật có vú và được đưa vào cơ thể qua đường thức ăn. Do BCAA cần thiết cho quá trình tổng hợp protein, các acid béo mạch nhánh, chất dẫn truyền thần kinh nên quá trình dị hóa các BCAA được kiểm soát chặt chẽ, thông qua phức hợp enzyme BCKD. Bước đầu tiên trong quá trình dị hóa BCAA là chuyển nhóm amin của leucine, isoleucine, valine cho α-ketoglutarate (α-KG) tạo thành glutamate và các ketoacid mạch nhánh (BCKA) tương ứng bao gồm α-ketoisocaproate (KIC), α keto- methylvalate (KMV), α-ketoisovalerate (KIV), với sự xúc tác của aminotransferase 4 (Hình 1. Bước tiếp theo là quá trình khử carboxyl oxy hóa thông qua phức hợp BCKD.

Ở người mắc bệnh xirô niệu, bước này bị gián đoạn. Quá trình phân giải các amino acid mạch nhánh (BCAA) [4] Quá trình chuyển gốc amin của BCAA được thực hiện nhờ vào vai trò xúc tác của aminotransferase tạo sản phẩm là các ketoacid mạch nhánh (BCKA): α-ketoisocaproate (KIC), α-keto-β-methylvalerate (KMV), α-ketoisovalerate (KIV) (phản ứng 1). Quá trình khử carboxyl oxi hóa của các ketoacid mạch nhánh (BCKA) được thực hiện nhờ phức hợp a-ketoacid dehydrogenase mạch nhánh (BCKD) (phản ứng 2) [4]. Di truyền phân tử BCKD là enzyme điều hòa quan trọng nhất trong con đường dị hóa của các BCAA, nằm trong ty thể, gồm 03 thành phần xúc tác decarboxylase E1, dihydrolipoyl transacylase E2, dihydrolipoamide dehydrogenase E3 và 02 enzyme điều hòa (BCKD kinase, BCKD phosphatase) [5].

Các thành phần E1 (02 tiểu đơn vị α và 02 tiểu đơn vị β), E2 và E3 được mã hóa lần lượt bởi các gen BCKDHA, BCKDHB, DBT, DLD đều nằm trong nhân (Bảng 1. Các gen liên quan đến bệnh xirô niệu Gen Vị trí Số amino acid Số exon BCKDHA 19q13.1 486 11 Thành phần E1, được tạo nên từ 02 tiểu phần E1α và 02 tiểu phần E1β. Gen mã hóa cho tiểu đơn vị E1α, BCKDHA, nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể 19 tại 5 vị trí 19q13. Gen BCKDHA gồm 9 exon, mã hóa cho một mRNA 1,6 kb và được dịch mã thành 378 aa với một trình tự dẫn đầu dài 45 aa.

Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen BCKDHA (www.gov/genome/tools/gdp) Gen BCKDHB mã hóa cho tiểu đơn vị E1β nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể số 6 tại vị trí 6q14.1, gồm 11 exon, mã hóa cho một mRNA 1,4 kb và dịch mã thành 342 aa với một trình tự dẫn đầu dài 50 aa (Hình 1. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen BCKDHB (www.gov/genome/tools/gdp) Thành phần E2, là một dihydrolipoyl transacylase (DBT), tồn tại dưới dạng homo-24mer hình bát giác đối xứng trong phức hợp BCKD, giữ vai trò như là “lõi” chức năng của phức hợp do sự có mặt của các vùng lipoyl. Thành phần này hoạt động như cánh tay xoay dài để chuyển giao, tiếp nhận các chất trung gian giữa các trung tâm hoạt động hoặc tiểu đơn vị khác của phức hợp. Gen mã hóa cho thành phần E2, DBT, nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 1 tại vị trí 1p21.

Gen DBT gồm 11 exon, mã hóa cho một mRNA 1,46 kb và dịch mã thành 421 amino acid với một trình tự dẫn đầu có kích thước 56 aa. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen DBT (www.gov/genome/tools/gdp) 6 Thành phần E3, tồn tại như một homodimer trong phức hợp BCKD. Gen mã hóa cho thành phần E3, DLD, nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể số 7 tại vị trí 7q31. Gen DLD gồm 11 exon, mã hóa 02 mRNA 2,2 kb và 2,4 kb, dịch mã thành 509 aa với một trình tự dẫn đầu có chiều dài không xác định.

Thành phần E1 và E2 xuất hiện duy nhất trong phức hợp BCKD, trong khi thành phần E3 có mặt trong hai enzyme ty thể khác (pyruvate dehydrogenase và phức hợp α- ketoglutarate dehydrogenase, giữ vai trò quan trọng trong chu trình Krebs). Thành phần này còn được gọi là protein L của hệ thống phân cắt glycine ty thể. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen DLD (www.gov/genome/tools/gdp) 1. Triệu chứng lâm sàng và chẩn đoán Dựa vào triệu chứng lâm sàng, MSUD được phân loại thành 05 kiểu, không có mối tương quan chặt chẽ giữa kiểu gen và kiểu hình bao gồm kiểu cổ điển, trung gian, không liên tục, đáp ứng thiamine và thiếu E3.

Bệnh xirô niệu kiểu cổ điển và kiểu thiếu E3 thường khởi phát ngay trong thời kỳ sơ sinh, trong khi các kiểu còn lại có thể xuất hiện bất cứ giai đoạn nào khi người bệnh phải đối mặt với các yếu tố stress. Các triệu chứng lâm sàng của MSUD phụ thuộc vào mức độ hoạt động của phức hợp BCKD.