ĐẶT VẤN ĐỀ Theo Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization – WHO), thiếu máu cục bộ tim (Coronary Artery Disease – CAD) còn được gọi là bệnh tim mạch vành (Coronary Heart Disease - CHD) là dạng bệnh lý gây tử vong cao trên thế giới. Năm 2016, ước tính có 17,9 triệu người chết vì bệnh tim mạch, chiếm 31% tổng số ca tử vong toàn thế giới (WHO, 2016). Nguyên nhân chính dẫn tới bệnh tim mạch (CVD - Coronary Artery Disease) là do sự tăng bất thường nồng độ LDL cholesterol (LDL - C) trong máu, dẫn đến sự tích tụ mảng xơ vữa ở động mạch và động mạch chủ, tắc nghẽn mạch máu, thiếu máu cục bộ ở tim (Versmissen et al., 2008, Elis et al. Familial hypercholesterolaemia (FH) là dạng bệnh lý tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình, thuộc nhóm bệnh lý di truyền trên nhiễm sắc thể thường gây rối loạn chuyển hóa lipid thường gặp trên thế giới (Taranto et al.
Nguyên nhân dẫn đến bệnh FH là do các dạng đột biến điểm xuất hiện trên các gen có chức năng mã hóa protein tham gia chuyển hóa cholesterol, lipid trong máu, cụ thể là gen: Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR), Apolipoprotein B (ApoB) hoặc Proprotein Convertase Subtilisin–Kexin type 9 (PCSK9) (Sjouke et al. Bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình với tỷ lệ ước tính trên toàn thế giới là 1/500 (0,2%) (Austin et al. Nhiều công bố khoa học ghi nhận bênh lý tim mạch (bệnh mạch vành) thuộc nhóm bệnh lý rối loạn đa yếu tố, với sự tác động của cả hai yêu tố môi trường và di truyền (Backer et al. Tuy nhiên, bệnh lý FH (Familial hypercholesterolaemia) là nguyên nhân chính dẫn đến các bệnh lý về tim (Austin et al., 2004, Goldstein et al.
Gen ApoB (Apolipoprotein B) là gen mã hóa cho protein ApoB – 100 và ApoB – 48, giữ vai trò quan trọng trong việc hình thành phức hợp giữa Low Density Lipoprotein (LDL) và Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR) (Chen et al. 1 Những dẫn chứng nêu trên cho thấy ý nghĩa khoa học của ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định tính chất đột biến điểm liên quan đến bệnh lý tăng cholesterol có tính chất gia đình. Do đó trong phạm vi chuyên đề khóa luận tốt nghiệp, chúng tôi thực hiện đề tài khoa học: “Khảo sát một số dạng đột biến điểm gen ApoB trên một số bệnh phẩm máu ở người Việt Nam”. Mục tiêu nghiên cứu: - Ứng dụng kỹ thuật PCR kết hợp giải trình tự để xác định sự tương quan giữa một số dạng đột biến điểm: R3527Q, R3527W xảy ra trên gen ApoB và sự tăng cao cholesterol trong máu ở người Việt Nam.
Nội dung và kế hoạch thực hiện đề tài: - Khai thác dữ liệu trên nguồn dữ liệu khoa học trên NCBI, Google về bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (FH, FDB) trên thế giới và ở Việt Nam và sự xuất hiện một số dạng đột biến điểm: R3527Q, R3527W gen ApoB trên người bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình trên thế giới. - Phân tích tổng hợp (Meta - analysis) Sử dụng công cụ thống kê phù hợp phân tích sự tương quan giữa một số dạng đột biến điểm: R3527Q, R3527W gen ApoB trên người bệnh tăng cholesterol máu trên thế giới hoặc mắc bệnh tim mạch do tăng cholesterol trong máu. - Khảo sát trên máy tính (In silico) Thu thập trình tự gen ApoB trên nguồn dữ liệu NCBI (GenBank). Dựa vào một số công cụ tin sinh học (BLAST, Oligoanalyzer - IDT, Annhyb,.) nhằm khảo sát một số đặc tính (tính đặc hiệu, thông số vật lý,…) của bộ mồi phù hợp với phương pháp PCR kết hợp giải trình tự xác định một số dạng đột biến điểm trên gen ApoB.
- Khảo sát thực nghiệm Khảo sát quy trình PCR kết hợp giải trình tự xác định một số dạng đột biến điểm gen ApoB trên một số mẫu bệnh phẩm (mẫu máu) của người Việt Nam. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU I. Tổng quan về bệnh tăng cholesterol máu có tính gia đình I. Khái niệm về cholesterol và lipoprotein Cholesterol là lipid không phân cực, là thành phần cơ bản của cấu trúc màng tế bào động vật và tế bào người.
Cholesterol là tiền thân của các thành phần quan trọng trong cơ thể người: nhóm nội tiết tố steroid và axit mật (Cox et al.1 Cấu trúc của LDL huyết tương và phức hợp của cholesterol và cholesteryl esters (Brown et al., 1984) Lipoprotein là phức hợp lipid và protein, có chức năng vận chuyển chất béo trong hệ mạch máu và hệ thể dịch đến các tế bào trong các quá trình đồng hóa và tiêu thụ năng lượng (Wasan et al. Các dạng Lipoprotein gồm có chylomicrons (lipoprotein lớn nhất về kích thước), lipoprotein mật độ cao (High Density Lipoprotein – HDL), lipoprotein mật độ thấp (Low Density Lipoprotein – LDL), lipoprotein mật độ trung bình (Intermediate Density Lipoprotein – IDL) và lipoprotein mật độ rất thấp (Very Low Density Lipoprotein – VLDL) (Wasan et al. Thể phức hợp Apolipoprotein gồm lipoprotein và protein ApoB (Apoprotein B) theo tỷ lệ 1:1 (Carmena et al.1 mô tả cấu trúc của LDL huyết tương và phức hợp của cholesterol và cholesteryl esters. Mỗi hạt LDL có khối lượng 3 x l06 dalton và đường kính 22 nm, gồm khoảng 1500 phân tử “cholesteryl 3 ester” được bao quanh bởi một lớp ưa nước với khoảng 800 phân tử phospholipid, 500 phân tử cholesterol không ester hóa và 1 phân tử Apoprotein B-100 có trọng lượng 387.000 dalton (Brown et al.
Bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (Familial Hypercholesterolemia – FH) Bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình (Familial Hypercholesterolemia - FH) là một dạng bệnh lý rối loạn chuyển hóa lipid, nguyên nhân do khiếm khuyết di truyền xảy ra trên các gen mã hóa protein tham gia chuyển hóa lipid, cholesterol trong máu (Brown et al. Bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình gồm có: ADH (Autosomal Dominant Hypercholesterolemia) là dạng bệnh lý tăng cholesterol máu tính trạng trội trên nhiễm sắc thể thường; ARH (Autosomal Recessive Hypercholesterolemia) là dạng bệnh lý tăng cholesterol máu tính trạng lặn trên nhiễm sắc thể thường (Taranto et al. Công bố khoa học Austin và cộng sự (2004), Khachadurian và cộng sự (1964) ghi nhận bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (FH) gồm có thể đồng hợp (Homozygous Familial Hypercholesterolemia - HoFH) và thể dị hợp (Heterozygous Familial Hypercholesterolemia - HeFH). Theo Brown và cộng sự (1984), tỷ lệ mắc bệnh thể dị hợp HeFH khoảng 1/500 với biểu hiện LDL trong huyết tương cao gấp đôi người bình thường và tỷ lệ mắc bệnh thể đồng hợp HoFH là 1/1.000 với biểu hiện LDL trong huyết tương cao gấp sau lần người bình thường.
Ở bệnh nhân HeFH, nồng độ cholesterol toàn phần và LDL-C trong khoảng 8 - 15 mmol/L (310 – 580 mg/dL) và ở bệnh nhân HoFH, nồng độ cholesterol toàn phần và LDL - C trong khoảng từ 12 - 30 mmol/L (460 – 1160 mg/dL) (Nordestgaard et al. Nguyên nhân bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình Nguyên nhân chính dẫn đến bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình dạng ADH là do tính chất đột biến trên một số gen khoảng 95% đột biến được phát hiện nằm trong gen Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR), 2 – 11% là đột biến trên gen Apolipoprotein B (ApoB) và 1% trong Proprotein Convertase Subtilisin– Kexin type 9 (PCSK9) (Benn et al. Chức năng của thụ thể LDL bị khiếm 4 khuyết dẫn đến tích tụ lượng lớn cholesterol trong huyết tương, gây xơ vữa động mạch (Brown et al. Nồng độ LDL - C tăng cao là kết quả của việc giải phóng không hiệu quả các hạt LDL xuất phát từ các khiếm khuyết trong gen ApoB – 100 (Soria et al.
Sự tích tụ LDL - C trong máu cao dẫn đến nguy cơ mắc bệnh động mạch vành tăng gấp 20 lần (Knowles et al. Bệnh tăng cholesterol máu thể nặng với chỉ số LDL - C >190 mg/dL (Khera et al. Ngoài ra còn có nguyên nhân khác dẫn đến bệnh tăng cholestreol máu như các yếu tố môi trường, giới tính, tuổi tác, thói quen sinh hoạt (hút thuốc lá, ít vận động.) (Soutar et al. Thể khiếm khuyết Apolipoprotein B – 100 có tính chất gia đình (Familial defective Apolipoprotein B-100 – FDB) là một dạng bệnh FH, thuộc nhóm ADH (Azian et al.
Nguyên nhân dẫn đến bệnh lý FDB là do các dạng đột biến xuất hiện trên gen ApoB: R3500 (tên gọi khác R3527Q), R3500W, R3531C và R3480P…Những dạng đột biến sai nghĩa dẫn đến sự sai hỏng (khiếm khuyết) trên cấu trúc của protein ApoB - 100, từ đó thay đổi cấu trúc của protein ApoB - 100 cản trở sự tương tác giữa ApoB và với thụ thể LDLR làm giảm sự hấp thu LDL vào trong tế bào, do đó nồng độ cholesterol trong máu tăng cao bất thường (Ejarque et al., 2008; Azian et al. Theo công bố của Tybjærg-Hansen và cộng sự (1992), tỷ lệ mắc bệnh FDB 1/500 đến 1/700 ở châu Âu và châu Mỹ. Tiêu chí chẩn đoán bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình Trên thế giới, bệnh nhân tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình được chẩn đoán dựa vào các tiêu chí đánh giá của: tiêu chuẩn Hà Lan (Dutch Lipid Clinic Network - DLCN), Simon Broome của Vương quốc Anh và tiêu chuẩn của Hoa Kỳ (Make Early Diagnoses Prevent Early Deaths Program Diagnostic Criteria - MEDPED) (Benn et al.1 Tiêu chí chẩn đoán bệnh FH của tổ chức DLCN (Shapiro et al., 2018) Nhóm Tiêu chí Điểm Nhóm 1: Tiểu sử gia đình Người có quan hệ huyết thống mắc bệnh động mạch 1 vành sớm (nam dưới 55 tuổi và nữ dưới 60 tuổi). Người có quan hệ huyết thống có nồng độ 1 cholesterol LDL trong máu cao hơn 95% theo độ tuổi và giới tính của quốc gia.
Người có quan hệ huyết thông có xuất hiện 2 xanthoma trong gân và/hoặc cung giác mạc. Trẻ em dưới 18 tuổi có nồng độ cholesterol LDL 2 trong máu cao hơn 95% theo độ tuổi và giới tính của quốc gia. Nhóm 2: Tiền sử lâm sàng Đối tượng mắc bệnh tim mạch vành sớm (nam dưới 2 55 tuổi, nữ dưới 60 tuổi). Đối tượng mắc bệnh động mạch máu não hoặc động 1 mạch ngoại vi sớm (nam dưới 55 tuổi, nữ dưới 60 tuổi).
Nhóm 3: Kiểm tra thể chất Xuất hiện xanthoma trong gân 6 Xuất hiện xanthoma trong cung giác mạc ở người 4 dưới 45 tuổi. Nồng độ cholesterol LDL* (mg/dL) >8,5 mmol/L (>325 mg/dL) 8 6,5 – 8,4 mmol/L (251 – 325 mg/dL) 5 5,0 – 6,4 mmol/L (191 – 259 mg/dL) 3 4,0 – 4,9 mmol/L (155 – 190 mg/dL) 1 Phân tích DNA: Xuất hiện các đột biến gây bệnh FH 8 trên các gen LDLR, ApoB hay PCSK9 Đánh giá Xác định mắc bệnh FH >8 Rất có khả năng mắc bệnh FH 6–8 Có khả năng mắc bệnh FH 3–5 Không mắc bệnh FH <3 Bảng I.2 Tiêu chí chẩn đoán bệnh FH của tổ chức MEDPED (Williams et al.