Khảo Sát Một Số Dạng Đột Biến Điểm Gen APOB Trên Bệnh Phẩm Máu Ở Người Việt Nam

Khảo sát đột biến điểm gen apob trong bệnh phẩm máu người Việt Nam, cung cấp thông tin quan trọng cho nghiên cứu di truyền và y học.

• Tác giả: Lâm Thị Ngọc
• Người hướng dẫn: ThS. Trương Kim Phượng
• Trường học: Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Y Dược
• Đề tài: Khảo Sát Một Số Dạng Đột Biến Điểm Gen APOB Ở Người Việt Nam
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 2.1. Tổng quan về bệnh tăng cholesterol máu có tính gia đình
• 2.2. Khái niệm về cholesterol và lipoprotein
• 2.3. Bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (Familial Hypercholesterolemia – FH)
• 2.4. Nguyên nhân bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình
• 2.5. Tiêu chí chẩn đoán bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình
• 2.6. Chức năng và con đường chuyển hóa của protein ApoB
• 2.7. Tình hình nghiên cứu tính chất đột biến trên gen ApoB và bệnh tăng cholesterol trong máu có tính gia đình
• 2.8. Một số phương pháp xác định tính chất đột biến điểm trên gen ApoB
• 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Phương pháp
• 3.2. Khai thác dữ liệu (Data - mining)
• 3.3. Phân tích tổng hợp (Meta – analysis)
• 3.4. Khảo sát trên máy tính (In silico)
• 3.5. Khảo sát thực nghiệm
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả thu thập dữ liệu và phân tích tổng hợp gen ApoB
• 4.2. Phân tích chỉ số Proportion
• 4.3. Xác định chỉ số tỷ suất chênh (Odds ratio)
• 4.4. Kết quả khảo sát In silico trên gen ApoB
• 4.5. Kết quả khảo sát thực nghiệm
• 4.6. Kết quả tách chiết DNA
• 4.7. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự exon 26 gen ApoB
• 4.8. Kết quả phân tích kết quả giải trình tự exon 26 gen ApoB
• 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về khảo sát đột biến gen APOB ở người Việt Nam

Khảo sát đột biến gen APOB là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong y học hiện đại, đặc biệt là trong việc hiểu rõ các bệnh lý liên quan đến cholesterol. Gen APOB mã hóa cho apolipoprotein B, một thành phần chính trong lipoprotein, có vai trò quan trọng trong chuyển hóa lipid. Nghiên cứu này nhằm mục đích xác định các dạng đột biến điểm trên gen APOB ở người Việt Nam, từ đó cung cấp thông tin quý giá cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh lý tăng cholesterol máu có tính chất gia đình.

1.1. Định nghĩa và vai trò của gen APOB trong cơ thể

Gen APOB mã hóa cho apolipoprotein B, có vai trò quan trọng trong việc vận chuyển cholesterol và lipid trong máu. Protein này giúp hình thành lipoprotein, đặc biệt là LDL, có liên quan mật thiết đến bệnh lý tim mạch. Sự đột biến trong gen APOB có thể dẫn đến rối loạn chuyển hóa lipid, gây tăng cholesterol trong máu.

1.2. Tình hình nghiên cứu gen APOB ở người Việt Nam

Nghiên cứu về gen APOB ở người Việt Nam còn hạn chế. Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ đột biến gen này có thể ảnh hưởng đến tình trạng cholesterol trong máu. Việc khảo sát gen APOB sẽ giúp hiểu rõ hơn về tình trạng sức khỏe của người dân Việt Nam.

II. Vấn đề và thách thức trong khảo sát đột biến gen APOB

Khảo sát đột biến gen APOB gặp nhiều thách thức, bao gồm việc thu thập mẫu bệnh phẩm và phân tích dữ liệu. Các yếu tố di truyền và môi trường cũng ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu. Đặc biệt, việc thiếu thông tin về di truyền học trong cộng đồng người Việt Nam làm cho việc xác định các dạng đột biến trở nên khó khăn hơn.

2.1. Khó khăn trong việc thu thập mẫu bệnh phẩm

Việc thu thập mẫu bệnh phẩm từ người dân gặp nhiều khó khăn do thiếu sự hợp tác và nhận thức về tầm quan trọng của nghiên cứu gen. Điều này ảnh hưởng đến số lượng và chất lượng mẫu thu thập.

2.2. Ảnh hưởng của yếu tố di truyền và môi trường

Yếu tố di truyền và môi trường có thể tác động đến sự xuất hiện của các đột biến gen APOB. Việc phân tích các yếu tố này là cần thiết để hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh và phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả.

III. Phương pháp khảo sát đột biến gen APOB hiệu quả

Để khảo sát đột biến gen APOB, các phương pháp hiện đại như PCR và giải trình tự gen được áp dụng. Những phương pháp này cho phép xác định chính xác các dạng đột biến điểm, từ đó đánh giá mối liên hệ với tình trạng cholesterol trong máu.

3.1. Phương pháp PCR trong khảo sát gen

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được sử dụng để khuếch đại các đoạn gen cần thiết cho việc phân tích. Kỹ thuật này giúp tăng cường độ nhạy và độ chính xác trong việc phát hiện các đột biến gen.

3.2. Giải trình tự gen và phân tích dữ liệu

Giải trình tự gen cho phép xác định chính xác trình tự nucleotide của gen APOB. Dữ liệu thu được sẽ được phân tích để tìm ra các đột biến điểm và mối liên hệ với bệnh lý tăng cholesterol máu.

IV. Kết quả khảo sát và ứng dụng thực tiễn

Kết quả khảo sát đột biến gen APOB sẽ cung cấp thông tin quan trọng về tình trạng sức khỏe của người dân Việt Nam. Những phát hiện này có thể được ứng dụng trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh lý tăng cholesterol máu, từ đó nâng cao chất lượng cuộc sống.

4.1. Phân tích kết quả khảo sát gen APOB

Kết quả khảo sát cho thấy tỷ lệ đột biến gen APOB ở người Việt Nam có sự khác biệt so với các quốc gia khác. Những đột biến này có thể liên quan đến tình trạng cholesterol trong máu và nguy cơ mắc bệnh tim mạch.

4.2. Ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị

Thông tin từ khảo sát gen APOB có thể được sử dụng để phát triển các phương pháp chẩn đoán sớm và điều trị hiệu quả cho bệnh nhân mắc bệnh lý tăng cholesterol máu có tính chất gia đình.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Khảo sát đột biến gen APOB là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng, có tiềm năng lớn trong việc cải thiện sức khỏe cộng đồng. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh mà còn mở ra hướng đi mới cho các phương pháp điều trị hiệu quả.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu gen APOB

Nghiên cứu gen APOB đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện và điều trị bệnh lý tăng cholesterol máu. Những phát hiện từ nghiên cứu này có thể giúp cải thiện chất lượng cuộc sống cho nhiều người.

5.2. Triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Triển vọng nghiên cứu gen APOB trong tương lai rất hứa hẹn. Việc áp dụng công nghệ sinh học hiện đại sẽ giúp phát hiện sớm và điều trị hiệu quả các bệnh lý liên quan đến cholesterol.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2016), bệnh tim mạch vành (Coronary Heart Disease - CHD) hay thiếu máu cục bộ tim (Coronary Artery Disease - CAD) là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên phạm vi toàn cầu, cướp đi sinh mạng của khoảng 17,9 triệu người mỗi năm (chiếm 31% tổng số ca tử vong). Căn nguyên trực tiếp dẫn đến xơ vữa động mạch và tắc nghẽn mạch vành bắt nguồn từ tình trạng gia tăng nồng độ cholesterol gắn lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL-C) trong huyết tương. Trong các nguyên nhân gây tăng lipid máu, tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (Familial Hypercholesterolemia - FH) là bệnh lý di truyền đơn gen trên nhiễm sắc thể thường phổ biến nhất, với tần suất lưu hành ước tính khoảng 1/500 (0,2%) ở dân số nói chung và có thể lên tới 1/250 ở người trưởng thành (Akioyamen et al., 2017).

Về mặt di truyền học phân tử, khoảng 95% ca bệnh FH do đột biến trên gen thụ thể LDL (LDLR), 2–11% liên quan đến đột biến gen Apolipoprotein B (APOB) và khoảng 1% xuất phát từ gen PCSK9. Bệnh lý khiếm khuyết Apolipoprotein B-100 gia đình (Familial Defective Apolipoprotein B-100 - FDB) là một phân nhóm của FH, đặc trưng bởi các đột biến sai nghĩa tại exon 26 của gen APOB (điển hình như R3500Q/R3527Q, R3500W, R3531C, R3480P). Các biến đổi này làm sai lệch cấu trúc domain liên kết của phối tử ApoB-100 với thụ thể LDLR, cản trở quá trình nhập bào của LDL vào tế bào gan và gây tích tụ cholesterol nghiêm trọng trong máu. Tại Việt Nam, nghiên cứu sơ khởi của Truong et al. (2017) từng ghi nhận tỷ lệ đột biến xung quanh codon 3500 trên gen APOB lên đến 67,5% trên 40 bệnh nhân FH. Xuất phát từ thực tiễn dịch tễ học và yêu cầu chẩn đoán sớm, khóa luận thực hiện đề tài nhằm làm sáng tỏ đặc điểm phân tử của gen APOB tại Việt Nam.

Mục tiêu nghiên cứu:

• Ứng dụng kỹ thuật PCR kết hợp giải trình tự Sanger nhằm xác định mối tương quan giữa một số dạng đột biến điểm (R3527Q, R3527W) trên gen APOB và tình trạng tăng cholesterol máu ở người Việt Nam.

Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Khai thác dữ liệu khoa học từ các hệ thống cơ sở dữ liệu NCBI và Google về bệnh FH/FDB cùng sự xuất hiện của đột biến R3527Q, R3527W trên thế giới và tại Việt Nam.
2. Thực hiện phân tích tổng hợp (Meta-analysis) bằng mô hình thống kê chuyên dụng nhằm lượng hóa tỷ lệ đột biến và đánh giá nguy cơ liên quan giữa biến thể gen APOB với bệnh tăng cholesterol máu/tim mạch.
3. Khảo sát trên máy tính (in silico) thông qua các công cụ tin sinh học (BLAST, OligoAnalyzer, Annhyb) nhằm đánh giá thông số lý - hóa và độ đặc hiệu của các cặp mồi khuếch đại vùng exon 26 gen APOB.
4. Khảo sát thực nghiệm quy trình tách chiết DNA, phản ứng PCR và giải trình tự Sanger nhằm phát hiện các biến thể điểm trên mẫu bệnh phẩm máu của người Việt Nam có chỉ số cholesterol cao.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Gen APOB (tập trung vào vùng exon 26 mã hóa cho domain gắn thụ thể LDLR) trên DNA bộ gen người; các bộ dữ liệu công bố quốc tế về bệnh nhân FH/FDB.
• Phạm vi không gian: Nghiên cứu thực nghiệm tiến hành tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh; mẫu máu thu thập từ các bệnh nhân có biểu hiện tăng cholesterol máu tại các bệnh viện ở Thành phố Hồ Chí Minh.
• Phạm vi thời gian: Dữ liệu tổng quan và phân tích tổng hợp được rà soát, cập nhật đến tháng 1 năm 2019; khóa luận hoàn thành vào tháng 5 năm 2019. Đề tài nằm trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ (Mã số: B2018-MBS-08).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên nền tảng lý thuyết về cấu trúc lipoprotein và cơ chế bệnh sinh của rối loạn lipid máu di truyền. Phân tử LDL huyết tương có khối lượng phân tử khoảng 3 x 10^6 Dalton, đường kính 22 nm, chứa lõi khoảng 1.500 phân tử cholesteryl ester được bao bọc bởi lớp vỏ đơn phân tử gồm phospholipid, cholesterol tự do và một phân tử protein ApoB-100 (trọng lượng 387.000 Dalton gồm 4.536 axit amin). Gen APOB định vị tại cánh ngắn nhiễm sắc thể số 2 (vị trí 2p24.1), có kích thước khoảng 43 kb gồm 29 exon và 28 intron. Vùng exon 26 là exon có kích thước lớn nhất, chứa trình tự mã hóa cho vùng liên kết phối tử của ApoB-100 với thụ thể LDLR. Bệnh nhân FH được phân loại theo thể đồng hợp (HoFH) hoặc dị hợp (HeFH), đồng thời được đánh giá nguy cơ dựa trên ba hệ thống tiêu chuẩn chẩn đoán lâm sàng quốc tế:

• Tiêu chuẩn Mạng lưới Phòng khám Lipid Hà Lan (DLCN): dựa trên điểm số tích lũy từ tiền sử gia đình, bệnh sử tim mạch sớm, dấu hiệu thực thể (u vàng gân xanthoma, cung giác mạc trước 45 tuổi), mức LDL-C và phân tích đột biến DNA (gen LDLR, APOB, PCSK9).
• Tiêu chuẩn MEDPED (Hoa Kỳ): phân ngưỡng cholesterol toàn phần theo độ tuổi và cấp bậc quan hệ gia đình (thế hệ thứ nhất, thứ hai, thứ ba).
• Tiêu chuẩn Simon Broome (Vương quốc Anh): chẩn đoán xác định hoặc chẩn đoán nghi ngờ dựa trên nồng độ cholesterol toàn phần (> 7,5 mmol/L ở người lớn; > 6,7 mmol/L ở trẻ em), LDL-C (> 4,9 mmol/L ở người lớn; > 4,0 mmol/L ở trẻ em), tiền sử nhồi máu cơ tim sớm và dấu hiệu xanthoma gân.

Hệ thống phương pháp nghiên cứu gồm ba hợp phần tích hợp:

• Khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp (Meta-analysis): Quy trình thu thập dữ liệu tuân thủ hướng dẫn PRISMA và mô hình PICO từ các cổng thông tin PubMed, PubMed Central (NCBI). Dữ liệu nhị phân từ các nghiên cứu đoàn hệ (cohort) và bệnh chứng (case-control) được phân tích trên phần mềm MedCalc (phiên bản v18). Tỷ lệ gộp (Proportion - PR%) và tỷ suất chênh (Odds Ratio - OR) được tính toán kèm khoảng tin cậy 95% (95% CI). Chỉ số bất đồng nhất $I^2$ được xác định dựa trên kiểm định Chi bình phương Cochran Q để lựa chọn mô hình phân tích ảnh hưởng cố định (Fixed-effects) hay ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random-effects).
• Khảo sát tin sinh học (In silico): Trình tự tham chiếu gen APOB thu nhận từ GenBank (mã số NC_000002.12, NG_011793.1, NM_000384.2). Khảo sát mức độ tương đồng bằng Clustal W trên phần mềm BioEdit v7. Thiết kế và kiểm tra 4 cặp mồi khuếch đại exon 26 bằng công cụ OligoAnalyzer 3.1 (IDT), Annhyb 4.946 và BLAST (NCBI) để đánh giá chiều dài, %GC, nhiệt độ nóng chảy ($T_m$), cấu trúc kẹp tóc (hairpin), bắt cặp bổ sung nội phân tử (self-dimer) và liên phân tử (hetero-dimer).
• Khảo sát thực nghiệm sinh học phân tử:
  • Tách chiết DNA tổng số từ 50 µl máu toàn phần bằng phương pháp Phenol/Chloroform truyền thống (ly giải tế bào bằng dung dịch NaCl 0,45 M, Tris-HCl 10 mM pH 8,2, EDTA 1 M pH 8, SDS 10% và Proteinase K 18,5 mg/ml ở 56°C trong 1 giờ; chiết tách hữu cơ với Phenol:Chloroform 1:1; kết tủa DNA bằng Ammonium acetate 5 M và Ethanol tuyệt đối lạnh; rửa tủa bằng Ethanol 70%; hòa tan trong dung dịch TE pH 8,0).
  • Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng máy đo quang phổ hấp thụ UV ở bước sóng 260 nm và 280 nm theo tỷ lệ $A_{260}/A_{280}$ và công thức $C = 50 \times A_{260} \times d$ (µg/ml).
  • Khuếch đại vùng exon 26 bằng kỹ thuật PCR trong tổng thể tích 50 µl (chứa 25 µl Master mix 2X của BioLine, 0,5 µl mỗi mồi nồng độ 10 µg/ml, DNA bản mẫu và nước cất). Chu trình nhiệt: biến tính ban đầu ở 95°C trong 5 phút; 35 chu kỳ gồm 95°C trong 30 giây, bắt cặp ở 54°C trong 30 giây, kéo dài ở 72°C trong 30 giây; kéo dài lần cuối ở 72°C trong 10 phút.
  • Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên bản gel agarose 1,5% với thuốc nhuộm GelRed trong dung dịch đệm, chạy ở hiệu điện thế 70 V trong 30 phút, đọc ảnh gel dưới tia UV trên hệ thống Gel Doc XR (Bio-Rad) so sánh với thang chuẩn 50 bp.
  • Giải trình tự Sanger sản phẩm PCR thông qua dịch vụ của Công ty Cổ phần Công nghệ TBR; phân tích và đối chiếu sắc phổ giải trình tự bằng phần mềm Chromas Lite 2.6 và CodonCode Aligner 8.2 đối chiếu với trình tự tham chiếu NG_011793.1 và NM_000384.2.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan nghiên cứu

Chương này hệ thống hóa các hiểu biết kinh điển và cập nhật về bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình và phân tử ApoB. Tác giả trình bày chi tiết bản chất sinh hóa của cholesterol, con đường vận chuyển nội sinh và ngoại sinh của lipoprotein, phân biệt cơ chế di truyền trội (ADH) và lặn (ARH). Nội dung tập trung làm rõ chức năng của ApoB-100 như một protein cấu trúc gắn kết bề mặt của các hạt VLDL, IDL và LDL, đóng vai trò phối tử nhận diện thụ thể LDLR tại tế bào gan. Đột biến sai nghĩa tại exon 26 làm suy giảm ái lực gắn thụ thể, kéo dài thời gian bán hủy của LDL trong hệ tuần hoàn.

Chương tổng quan cũng tổng hợp chi tiết các tiêu chuẩn chẩn đoán lâm sàng quốc tế gồm DLCN, MEDPED và Simon Broome. Đồng thời, tác giả khảo sát tình hình dịch tễ của bệnh FDB trên toàn cầu, ghi nhận sự phân bố không đồng đều về mặt địa lý (tần suất khoảng 1/500 đến 1/700 tại châu Âu và Bắc Mỹ, trẻ em Na Uy có tỷ lệ mắc cao, Đan Mạch ghi nhận đột biến Arg3500Gln ở mức 1/1.000). Phần cuối chương điểm luận các phương pháp sinh học phân tử kinh điển dùng để sàng lọc và xác định đột biến điểm trên gen APOB, bao gồm PCR-Sequencing, SSCP, AS-PCR và DGGE, nêu bật ưu thế của phương pháp giải trình tự Sanger trực tiếp về tính chính xác trong định danh nucleotide biến dị.

Chương II: Vật liệu và phương pháp

Chương II mô tả chuẩn hóa các vật liệu sinh học, thiết bị máy móc, hóa chất phân tích và thuật toán tin sinh học. Tác giả liệt kê chi tiết các cơ sở dữ liệu (NCBI GenBank, PubMed, PMC), hệ thống phần mềm (MedCalc v18, BioEdit v7, Clustal Omega, OligoAnalyzer 3.1 IDT, Annhyb 4.946, Chromas Lite 2.6, CodonCode Aligner 8.2). Quy trình trích xuất tài liệu tổng quan hệ thống được biểu diễn rõ ràng qua sơ đồ PRISMA, xác định rõ tiêu chí đưa vào và loại trừ dựa trên câu hỏi nghiên cứu PICO và mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên/cố định cho dữ liệu nhị phân.

Toàn bộ quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa chi tiết từng bước: quy trình tách chiết DNA bằng dung dịch hữu cơ Phenol/Chloroform, kiểm tra trắc quang nồng độ và tỷ lệ quang phổ $A_{260}/A_{280}$, thành phần pha chế phản ứng PCR thể tích 50 µl với cặp mồi APOB_26_F1/R1, chu trình luân nhiệt 3 bước với nhiệt độ gắn mồi 54°C, kỹ thuật điện di agarose 1,5% đối chứng với thang DNA 50 bp, và quy trình xử lý dữ liệu giải trình tự Sanger.

Chương III: Kết quả và thảo luận

Chương III trình bày toàn bộ phát hiện nghiên cứu qua ba giai đoạn:

1. Kết quả phân tích tổng hợp: Từ 109 bài báo ban đầu, tác giả sàng lọc được 24 công trình quốc tế đáp ứng đầy đủ tiêu chí với tổng cộng 14.035 mẫu bệnh nhân FH/FDB. Do chỉ số bất đồng nhất rất cao ($I^2 = 99,07%$, $P < 0,0001$), mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects) được áp dụng. Tỷ lệ đột biến chung trên gen APOB đạt 23,968% (95% CI: 16,281 - 32,616). Khi phân nhóm, tỷ lệ này ở nhóm ca riêng lẻ (Proband, n=21) là 25,770% cao hơn nhóm gia đình (Family, n=3) là 10,045%. Nhóm nghiên cứu dùng kỹ thuật PCR-giải trình tự ghi nhận tỷ lệ đột biến 34,868%, vượt trội so với các kỹ thuật khác (19,469%). Xét theo yếu tố địa lý, quần thể châu Á ghi nhận tỷ lệ đột biến cao nhất với 36,216%, tiếp đến là châu Âu (19,762%) và châu Mỹ (17,750%). Phân tích sâu trên các exon cho thấy exon 26 có tỷ lệ đột biến cao áp đảo (20,342%), trong đó đột biến kinh điển R3527Q chiếm tỷ lệ gộp 11,488% (95% CI: 7,672 - 15,956). Đánh giá tỷ suất chênh (OR) trên 5 nghiên cứu ca chứng (2.321 ca bệnh và 2.428 mẫu lành) ghi nhận OR chung là 1,235 (95% CI: 0,953 - 1,602; $p = 0,111$; $I^2 = 65,25%$). Ở phân nhóm bệnh nhân FH, tỷ suất chênh OR tăng lên 5,828 (95% CI: 0,167 - 203,944; $p = 0,331$), tuy nhiên chưa đạt mức có ý nghĩa thống kê do khoảng tin cậy mở rộng.
2. Kết quả khảo sát in silico: Khảo sát 4 cặp mồi khuếch đại exon 26 bao quanh vị trí codon 3527 (tại nucleotide 10.580 trên NM_000384.2 và vị trí 42.786 trên NG_011793.1). Cặp mồi APOB_F1 (5'-GACCACAAGCTTAGCTTGG-3', chiều dài 19 bp, %GC 52,6%, $T_m$ 53,6°C) và APOB_R1 (5'-GGGTGGCTTTGCTTGTATG-3', chiều dài 19 bp, %GC 52,6%, $T_m$ 54,3°C) được lựa chọn nhờ đáp ứng tối ưu các tiêu chuẩn nhiệt động học, sai lệch $T_m$ thấp (< 1°C), năng lượng tự bắt cặp thấp hơn ngưỡng -9 kcal/mol, độ bao phủ 100% và tương đồng 100% trên công cụ BLAST với phân đoạn sản phẩm khuếch đại dài 334 bp (tọa độ 42.638 đến 42.971 trên NG_011793.1).
3. Kết quả thực nghiệm trên mẫu người Việt Nam: DNA tách chiết từ 2 mẫu máu bệnh nhân cho kết quả trắc quang: mẫu 1 đạt tỷ lệ $A_{260}/A_{280} = 1,8449$ (nồng độ 197,94 µg/ml), mẫu 2 đạt $1,4355$ (nồng độ 71,864 µg/ml). Phản ứng PCR khuếch đại thành công phân đoạn 334 bp cho cả 2 mẫu với băng điện di đậm, sắc nét, không có sản phẩm phụ. Phân tích giải trình tự Sanger phát hiện 4 dạng biến thể/đột biến cụ thể: biến thể mất đoạn gây dịch khung c.10482delA (lệch khung từ codon 3494 Ser kéo dài 7 nucleotide về phía 3'); biến thể dịch khung c.10712delT (lệch khung từ codon 3571 Leu kéo dài 23 nucleotide ở mẫu 1 và 25 nucleotide ở mẫu 2); đột biến sai nghĩa c.10594C>A làm thay đổi axit amin Leu3532Met xuất hiện trên cả 2 mẫu; và riêng mẫu 1 xuất hiện thêm hai đột biến sai nghĩa c.10652C>A (Ala3551Asp) và c.10684C>T (Leu3562Phe).

Chương IV: Kết luận và đề nghị

Chương IV tóm lược cô đọng các chỉ số dịch tễ và thống kê sinh học từ phân tích tổng hợp, khẳng định tính khả thi của cặp mồi APOB_F1/R1 qua kiểm chứng thực nghiệm khuếch đại băng đặc hiệu 334 bp và phát hiện các biến thể phân tử trên mẫu máu người Việt Nam. Đề nghị tập trung mở rộng quy mô mẫu khảo sát trên bệnh nhân lâm sàng, đối chiếu nồng độ lipid huyết tương (cholesterol toàn phần, HDL, LDL) với cấu hình biến thể phân tử, và triển khai các thử nghiệm chuyên sâu nhằm đánh giá ảnh hưởng cấu trúc chức năng protein của các đột biến mới được phát hiện.

---

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã cung cấp bức tranh dữ liệu dịch tễ học phân tử đa tầng đối với gen APOB thông qua sự kết hợp giữa phân tích thống kê gộp dữ liệu toàn cầu và thực nghiệm kiểm chứng tại chỗ.

Dữ liệu phân tích tổng hợp (Meta-analysis)

Phân hạng phân tích	Số lượng công trình (N)	Chỉ số Proportion gộp (%)	Khoảng tin cậy 95% (95% CI)	Chỉ số bất đồng nhất $I^2$ (%)	Mô hình phân tích
Tổng thể chung	24	23,968	16,281 – 32,616	99,07	Ngẫu nhiên (R)
Nhóm bệnh nhân:
- Proband (ca riêng lẻ)	21	25,770	17,711 – 19,003*	99,18	Ngẫu nhiên (R)
- Family (phả hệ gia đình)	3	10,045	4,265 – 17,910	27,88	Ngẫu nhiên (R)
Phương pháp xác định:
- PCR - Giải trình tự	8	34,868	16,552 – 55,881	97,36	Ngẫu nhiên (R)
- Các phương pháp khác	16	19,469	11,847 – 28,448	99,16	Ngẫu nhiên (R)
Quần thể địa lý:
- Châu Á	7	36,216	24,185 – 49,197	97,30	Ngẫu nhiên (R)
- Châu Âu	14	19,762	9,424 – 32,751	98,89	Ngẫu nhiên (R)
- Châu Mỹ	3	17,750	3,464 – 39,790	99,37	Ngẫu nhiên (R)
Vùng exon trên gen:
- Exon 26	23	20,342	13,816 – 27,764	99,07	Ngẫu nhiên (R)
- Đột biến R3527Q (trên exon 26)	13	11,488	7,672 – 15,956	95,81	Ngẫu nhiên (R)
- Đột biến/biến thể khác (exon 26)	10	31,259	20,650 – 42,939	98,58	Ngẫu nhiên (R)

*Ghi chú: Giá trị khoảng tin cậy trích xuất nguyên văn theo bảng số liệu Bảng III.2 của văn bản.

Về chỉ số nguy cơ, phân tích trên 5 công trình ca chứng xác định tỷ suất chênh chung về khả năng mang đột biến gen APOB giữa nhóm bệnh phẩm và nhóm chứng lành là $\text{OR} = 1,235$ (95% CI: 0,953 – 1,602; $p = 0,111; I^2 = 65,25%$). Ở phân hạng bệnh FH thuần túy (2 công trình), chỉ số OR đạt 5,828 (95% CI: 0,167 – 203,944; $p = 0,331; I^2 = 84,50%$). Nhóm bệnh lý chuyển hóa/tim mạch khác (đái tháo đường type 2, nhồi máu cơ tim, CAD; 3 công trình) đạt $\text{OR} = 1,171$ (95% CI: 0,876 – 1,565; $p = 0,286; I^2 = 60,98%$).

Các biến thể phát hiện trên mẫu bệnh phẩm Việt Nam

Mẫu máu	Tọa độ trên NG_011793.1	Tọa độ trên NM_000384.2	Tọa độ trên NC_000002.12	Dạng biến thể danh pháp HGVS	Thay đổi axit amin
Mẫu 1 & 2	g.42688delA	c.10482delA	g.21006386delA	Mất 1 nucleotide (delA)	Dịch khung (Ser3494)
Mẫu 1 & 2	g.42918delT	c.10712delT	g.21006156delT	Mất 1 nucleotide (delT)	Dịch khung (Leu3571)
Mẫu 1 & 2	g.42800C>A	c.10594C>A	g.21006274C>A	Thay thế nucleotide (C>A)	Leu3532Met
Mẫu 1	g.42858C>A	c.10652C>A	g.21006216C>A	Thay thế nucleotide (C>A)	Ala3551Asp
Mẫu 1	g.42890C>T	c.10684C>T	g.21006184C>T	Thay thế nucleotide (C>A)*	Leu3562Phe

*Ghi chú: Tại vị trí g.42890C>T, cột dạng biến thể trong Bảng III.9 của văn bản ghi chú tương ứng là C>T.

Đóng góp của tác giả tự nêu trong công trình:

• Thiết lập hệ thống dữ liệu phân tích tổng hợp chứng minh tỷ lệ mang đột biến gen APOB ở bệnh nhân FH châu Á (36,216%) cao hơn đáng kể so với quần thể người châu Âu và châu Mỹ.
• Chứng minh phương pháp PCR kết hợp giải trình tự trực tiếp cho hiệu quả phát hiện đột biến cao nhất (34,868%) so với các phương pháp sàng lọc khác.
• Lựa chọn và thẩm định thành công cặp mồi đặc hiệu APOB_F1/R1, tối ưu hóa quy trình PCR khuếch đại vùng exon 26 kích thước 334 bp trên DNA tách chiết từ mẫu máu người Việt Nam.
• Lần đầu tiên ghi nhận sự hiện diện đồng thời của các biến thể dịch khung (c.10482delA, c.10712delT) và biến thể sai nghĩa (Leu3532Met, Ala3551Asp, Leu3562Phe) nằm trong miền chức năng gắn thụ thể LDLR trên bệnh nhân Việt Nam có nồng độ cholesterol máu cao (> 5 mmol/L).

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận tự chỉ ra các giới hạn nghiên cứu chính:

• Quy mô mẫu thực nghiệm hạn chế: Do điều kiện cơ sở vật chất phòng thí nghiệm còn khó khăn, nội dung thực nghiệm mới chỉ tiến hành kiểm chứng được trên 2 mẫu máu bệnh phẩm của người Việt Nam. Cỡ mẫu này chưa đủ để thực hiện các phân tích thống kê dịch tễ diện rộng hay xác định tần suất alen trong quần thể.
• Độ bất đồng nhất dữ liệu cao: Trong phân tích tổng hợp, chỉ số bất đồng nhất giữa các nghiên cứu quốc tế rất lớn ($I^2 > 95%$), phản ánh sự khác biệt sâu sắc về tiêu chuẩn chọn mẫu, chủng tộc và độ nhạy của các phương pháp sinh học phân tử giữa các phòng thí nghiệm trên thế giới.
• Ý nghĩa thống kê của chỉ số Odds Ratio: Phân tích tỷ suất chênh (OR) trên 5 nghiên cứu ca chứng cho khoảng tin cậy mở rộng và giá trị $p > 0,05$, chưa đạt độ tin cậy thống kê tuyệt đối, đòi hỏi cần bổ sung các công bố mới để tái phân tích.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Mở rộng số lượng mẫu bệnh phẩm máu thu nhận từ các cơ sở y tế tại Việt Nam để nâng cao tính đại diện.
• Phân tích tương quan chuyên sâu giữa các chỉ số hóa sinh máu lâm sàng cụ thể (Cholesterol toàn phần, Triglyceride, HDL-C, LDL-C) với các dạng biến thể trên exon 26 gen APOB.
• Thực hiện các thử nghiệm sinh học phân tử chức năng nhằm kiểm chứng mức độ thay đổi cấu trúc không gian của ApoB-100 do các đột biến sai nghĩa (Leu3532Met, Ala3551Asp, Leu3562Phe) gây ra, đánh giá mức suy giảm ái lực liên kết với thụ thể LDLR trên mô hình tế bào.

---

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận là tài liệu hữu ích cho:

• Sinh viên và học viên cao học: Thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học Y Dược, Di truyền học phân tử, Hóa sinh Y học và Y học dự phòng. Tài liệu cung cấp quy trình chi tiết về việc xây dựng bài nghiên cứu phối hợp giữa tin sinh học (in silico), thống kê y sinh (Meta-analysis theo chuẩn PRISMA/MedCalc) và sinh học phân tử thực nghiệm.
• Cán bộ nghiên cứu chẩn đoán phân tử: Tham khảo cặp mồi tối ưu APOB_F1/APOB_R1 và chu trình nhiệt PCR đã được chuẩn hóa để khuếch đại vùng exon 26 gen APOB kích thước 334 bp từ DNA máu toàn phần.
• Bác sĩ tim mạch và nội tiết: Cung cấp dẫn chứng thực nghiệm về sự tồn tại của các dạng đột biến gen APOB trên bệnh nhân có biểu hiện tăng lipid máu tại Việt Nam, phục vụ định hướng sàng lọc di truyền học lâm sàng kết hợp với tiêu chuẩn DLCN.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Cặp mồi nào được tác giả lựa chọn để khuếch đại exon 26 gen APOB và có các thông số kỹ thuật như thế nào?
Tác giả lựa chọn cặp mồi APOB_F1 (5'-GACCACAAGCTTAGCTTGG-3') và APOB_R1 (5'-GGGTGGCTTTGCTTGTATG-3') từ công bố của Bui et al. (2016) và Truong et al. (2016). Cả hai mồi đều có chiều dài 19 bp, tỷ lệ GC đạt 52,6%, nhiệt độ nóng chảy $T_m$ lần lượt là 53,6°C và 54,3°C. Cặp mồi khuếch đại phân đoạn DNA kích thước 334 bp (định vị từ vị trí 42.638 đến 42.971 trên trình tự tham chiếu NG_011793.1), bao quanh codon mục tiêu 3527.

2. Tỷ lệ phát hiện đột biến gen APOB ở bệnh nhân FH châu Á qua phân tích tổng hợp là bao nhiêu so với các khu vực khác?
Kết quả phân tích tổng hợp từ 24 nghiên cứu quốc tế theo mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên cho thấy tỷ lệ đột biến gen APOB ở nhóm bệnh nhân FH châu Á là 36,216% (95% CI: 24,185 – 49,197). Tỷ lệ này cao hơn rõ rệt so với nhóm bệnh nhân tại châu Âu (19,762%; 95% CI: 9,424 – 32,751) và châu Mỹ (17,750%; 95% CI: 3,464 – 39,790).

3. Kết quả đo quang phổ DNA tách chiết từ hai mẫu máu bệnh phẩm đạt chất lượng như thế nào?
Đo quang phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm ghi nhận mẫu (1) có tỷ số $A_{260}/A_{280} = 1,8449$ và nồng độ DNA đạt 197,94 µg/ml; mẫu (2) có tỷ số $A_{260}/A_{280} = 1,4355$ và nồng độ đạt 71,864 µg/ml. Mẫu 1 đạt độ tinh sạch chuẩn ($1,8 - 2,0$), trong khi mẫu 2 có tỷ số quang phổ thấp hơn ngưỡng tối ưu nhưng cả hai mẫu đều khuếch đại thành công trong phản ứng PCR.

4. Những biến thể/đột biến cụ thể nào đã được ghi nhận trên mẫu máu người Việt Nam qua phân tích giải trình tự Sanger?
Nghiên cứu phát hiện 4 dạng biến đổi phân tử trên exon 26: hai biến thể mất nucleotide gây dịch khung là c.10482delA và c.10712delT (xuất hiện trên cả hai mẫu 1 và 2); một biến thể sai nghĩa c.10594C>A gây thay đổi axit amin Leu3532Met (xuất hiện trên cả hai mẫu); và riêng mẫu 1 xuất hiện thêm hai đột biến sai nghĩa khác là c.10652C>A (Ala3551Asp) và c.10684C>T (Leu3562Phe).

5. Vì sao nghiên cứu lại áp dụng mô hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random-effects model) cho phân tích tổng hợp?
Trong phân tích gộp 24 nghiên cứu đoàn hệ về tỷ lệ đột biến gen APOB, kiểm định tính bất đồng nhất Chi bình phương cho thấy giá trị $I^2 = 99,07%$ với $P < 0,0001$. Do chỉ số $I^2 > 75%$ thể hiện mức độ bất đồng nhất rất cao giữa các tập dữ liệu độc lập, mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên bắt buộc phải được áp dụng thay thế cho mô hình ảnh hưởng cố định nhằm phản ánh chính xác khoảng tin cậy của quần thể.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Lâm Thị Ngọc đã hoàn thành các mục tiêu nghiên cứu thông qua việc tích hợp phương pháp phân tích tổng hợp dữ liệu toàn cầu, phân tích tin sinh học in silico và thực nghiệm kiểm chứng bằng kỹ thuật PCR kết hợp giải trình tự Sanger. Kết quả nghiên cứu đã lượng hóa được tỷ lệ đột biến gen APOB ở quần thể bệnh nhân FH châu Á (36,216%), chứng minh exon 26 là vùng điểm nóng đột biến và xác lập cặp mồi khuếch đại đặc hiệu 334 bp. Đồng thời, công trình bước đầu định danh được 4 dạng biến thể/đột biến điểm (bao gồm cả biến thể dịch khung và biến thể sai nghĩa trong vùng gắn thụ thể LDLR) trên mẫu máu người bệnh có chỉ số cholesterol cao tại Việt Nam, đặt cơ sở khoa học cho các nghiên cứu dịch tễ phân tử diện rộng tiếp theo.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Theo Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization – WHO), thiếu máu cục bộ tim (Coronary Artery Disease – CAD) còn được gọi là bệnh tim mạch vành (Coronary Heart Disease - CHD) là dạng bệnh lý gây tử vong cao trên thế giới. Năm 2016, ước tính có 17,9 triệu người chết vì bệnh tim mạch, chiếm 31% tổng số ca tử vong toàn thế giới (WHO, 2016). Nguyên nhân chính dẫn tới bệnh tim mạch (CVD - Coronary Artery Disease) là do sự tăng bất thường nồng độ LDL cholesterol (LDL - C) trong máu, dẫn đến sự tích tụ mảng xơ vữa ở động mạch và động mạch chủ, tắc nghẽn mạch máu, thiếu máu cục bộ ở tim (Versmissen et al., 2008, Elis et al. Familial hypercholesterolaemia (FH) là dạng bệnh lý tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình, thuộc nhóm bệnh lý di truyền trên nhiễm sắc thể thường gây rối loạn chuyển hóa lipid thường gặp trên thế giới (Taranto et al.

Nguyên nhân dẫn đến bệnh FH là do các dạng đột biến điểm xuất hiện trên các gen có chức năng mã hóa protein tham gia chuyển hóa cholesterol, lipid trong máu, cụ thể là gen: Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR), Apolipoprotein B (ApoB) hoặc Proprotein Convertase Subtilisin–Kexin type 9 (PCSK9) (Sjouke et al. Bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình với tỷ lệ ước tính trên toàn thế giới là 1/500 (0,2%) (Austin et al. Nhiều công bố khoa học ghi nhận bênh lý tim mạch (bệnh mạch vành) thuộc nhóm bệnh lý rối loạn đa yếu tố, với sự tác động của cả hai yêu tố môi trường và di truyền (Backer et al. Tuy nhiên, bệnh lý FH (Familial hypercholesterolaemia) là nguyên nhân chính dẫn đến các bệnh lý về tim (Austin et al., 2004, Goldstein et al.

Gen ApoB (Apolipoprotein B) là gen mã hóa cho protein ApoB – 100 và ApoB – 48, giữ vai trò quan trọng trong việc hình thành phức hợp giữa Low Density Lipoprotein (LDL) và Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR) (Chen et al. 1 Những dẫn chứng nêu trên cho thấy ý nghĩa khoa học của ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định tính chất đột biến điểm liên quan đến bệnh lý tăng cholesterol có tính chất gia đình. Do đó trong phạm vi chuyên đề khóa luận tốt nghiệp, chúng tôi thực hiện đề tài khoa học: “Khảo sát một số dạng đột biến điểm gen ApoB trên một số bệnh phẩm máu ở người Việt Nam”. Mục tiêu nghiên cứu: - Ứng dụng kỹ thuật PCR kết hợp giải trình tự để xác định sự tương quan giữa một số dạng đột biến điểm: R3527Q, R3527W xảy ra trên gen ApoB và sự tăng cao cholesterol trong máu ở người Việt Nam.

Nội dung và kế hoạch thực hiện đề tài: - Khai thác dữ liệu trên nguồn dữ liệu khoa học trên NCBI, Google về bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (FH, FDB) trên thế giới và ở Việt Nam và sự xuất hiện một số dạng đột biến điểm: R3527Q, R3527W gen ApoB trên người bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình trên thế giới. - Phân tích tổng hợp (Meta - analysis) Sử dụng công cụ thống kê phù hợp phân tích sự tương quan giữa một số dạng đột biến điểm: R3527Q, R3527W gen ApoB trên người bệnh tăng cholesterol máu trên thế giới hoặc mắc bệnh tim mạch do tăng cholesterol trong máu. - Khảo sát trên máy tính (In silico) Thu thập trình tự gen ApoB trên nguồn dữ liệu NCBI (GenBank). Dựa vào một số công cụ tin sinh học (BLAST, Oligoanalyzer - IDT, Annhyb,.) nhằm khảo sát một số đặc tính (tính đặc hiệu, thông số vật lý,…) của bộ mồi phù hợp với phương pháp PCR kết hợp giải trình tự xác định một số dạng đột biến điểm trên gen ApoB.