Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ung thư cổ tử cung là một trong những gánh nặng y tế cộng đồng nghiêm trọng đối với sức khỏe phụ nữ trên toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), mỗi năm thế giới ghi nhận khoảng 11 triệu ca mắc ung thư mới với khoảng 50% trường hợp tử vong; trong đó, ung thư chiếm 12% tổng số nguyên nhân gây tử vong ở người. Riêng đối với nữ giới, ung thư cổ tử cung là bệnh lý phổ biến thứ hai (sau ung thư vú), với ước tính khoảng 500.000 ca mắc mới mỗi năm và gần 250.000 trường hợp tử vong. Đáng chú ý, các quốc gia đang phát triển chiếm tới 80% tổng số ca mắc. Bệnh thường xuất hiện ở độ tuổi từ 30 đến 59, tập trung nhiều nhất ở nhóm 45 đến 55 tuổi và rất hiếm gặp ở phụ nữ dưới 20 tuổi.

Tại Việt Nam, số ca ung thư mới ước tính khoảng 150.000 người và khoảng 50.000 đến 70.000 người tử vong hàng năm. Tỷ lệ phụ nữ mắc ung thư cổ tử cung đứng đầu tại Thành phố Hồ Chí Minh và đứng thứ năm tại Hà Nội. Theo số liệu từ Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC), Việt Nam có khoảng 30,77 triệu phụ nữ từ 15 tuổi trở lên có nguy cơ mắc bệnh; mỗi năm ghi nhận 2.472 ca tử vong trong tổng số 5.174 trường hợp được chẩn đoán. Trong giai đoạn 10 năm trước thời điểm nghiên cứu, có khoảng 6.000 phụ nữ tử vong do ung thư cổ tử cung, gấp đôi số ca tử vong do AIDS. Nguyên nhân căn bản dẫn đến tỷ lệ tử vong cao là phần lớn bệnh nhân chỉ được phát hiện ở giai đoạn muộn, trong khi tổn thương tiền ung thư nếu phát hiện sớm có khả năng điều trị khỏi tới 95%.

Thủ phạm chính gây bệnh là virus HPV (Human Papilloma Virus), liên quan trực tiếp đến 70% đến 80% trường hợp, đặc biệt là hai phân nhóm nguy cơ cao HPV-16 và HPV-18. Các oncoprotein E6 và E7 của virus làm bất hoạt hai protein ức chế khối u chủ chốt của tế bào chủ là p53 và RB. Bên cạnh các biến đổi di truyền học, cơ chế biểu sinh (epigenetics) đóng vai trò then chốt trong quá trình sinh ung thư. Sự methyl hóa bất thường tại các vị trí dinucleotide CpG vùng promoter dưới sự xúc tác của họ enzyme DNA methyltransferase (DNMTs) dẫn đến việc bất hoạt các gen ức chế khối u hoặc kích hoạt các gen sinh ung. Trong đó, gen DNMT3L (DNA cytosine-5-methyltransferase 3-like) tham gia điều hòa hoạt tính de novo methyltransferase của DNMT3A và DNMT3B. Một số công bố quốc tế đã chỉ ra hiện tượng giảm methyl hóa (hypomethylation) vùng promoter của DNMT3L trên bệnh nhân ung thư cổ tử cung, đưa gen này trở thành một chỉ dấu sinh học (biomarker) tiềm năng phục vụ sàng lọc sớm.

Khóa luận xác định hai nhiệm vụ và mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Thiết kế được cặp mồi khuếch đại đặc hiệu cho vùng khảo sát của gen DNMT3L trong phản ứng Bisulfite Sequencing PCR (BSP), phục vụ đánh giá mức độ methyl hóa gen DNMT3L trên các mẫu bệnh phẩm ung thư cổ tử cung trong thực nghiệm.
  2. Thực hiện phản ứng BSP đối với gen DNMT3L trên 7 mẫu bệnh phẩm thu nhận từ các bệnh nhân ung thư cổ tử cung tại khu vực miền Nam, Việt Nam.

Đối tượng nghiên cứu là vùng promoter của gen DNMT3L trên người. Phạm vi nghiên cứu về mặt không gian tập trung vào các mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh nhân ung thư cổ tử cung khu vực miền Nam, được cung cấp bởi Công ty Việt Á (các mẫu đã xác định dương tính với các chủng HPV nguy cơ cao gồm HPV 11, 18, 33), kết hợp mẫu máu ngoại vi phục vụ tối ưu hóa điều kiện phản ứng. Khóa luận được hoàn thành vào tháng 7 năm 2011 tại Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở TP.HCM.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận vận dụng khung lý thuyết biểu sinh học (epigenetics), tập trung vào hiện tượng methyl hóa DNA và mối liên hệ với cấu trúc chất nhiễm sắc. Quá trình methyl hóa diễn ra khi nhóm methyl (-CH3) từ hợp chất cho S-adenosyl methionine được chuyển tới vị trí carbon số 5 của vòng cytosine trong các cặp dinucleotide CpG, xúc tác bởi họ enzyme DNA methyltransferase (DNMTs). Ở tế bào động vật có vú, khoảng 2% đến 7% cytosine bị methyl hóa và chiếm 70% đến 80% các vị trí CpG trên toàn bộ hệ gen. Các vùng giàu dinucleotide CpG với tỷ lệ GC > 50% và chiều dài tối thiểu 200 bp được định nghĩa là đảo CpG (CpG islands), thường phân bố ở đầu 5' của khoảng 56% gen ở người.

Cấu trúc và chức năng của các thành viên trong họ gen DNMTs được tác giả tổng hợp có hệ thống:

Tên gen Vị trí nhiễm sắc thể Cấu trúc phân tử (Exon / Intron / Kích thước) Đặc điểm cấu trúc protein Chức năng sinh học chính
DNMT1 19p13 40 exon, 39 intron, 61.734 bp 1.620 acid amin, khối lượng 193,5 kDa; miền N chứa vùng PBD, NLS, ATRX; miền C có 10 motif bảo tồn Duy trì methyl hóa (maintenance methyltransferase) trong quá trình tái bản DNA; ưu tiên mạch hemimethylated
DNMT2 (TRDMT1) 10p15.1 11 exon, 10 intron 391 acid amin; miền N ngắn; chứa motif ATRX và PWWP Thiếu hoạt tính methyl hóa DNA in vitro; liên quan đến methyl hóa tRNA
DNMT3A 2p23 Điều khiển bởi 3 promoter (2 giàu CpG, 1 nghèo CpG) Miền N chứa vùng ATRX và PWWP; miền C xúc tác Enzyme de novo methyltransferase; thiết lập dấu ấn di truyền phôi thai
DNMT3B 20q11 Điều khiển bởi 2 promoter (1 giàu CpG, 1 nghèo CpG) Miền N chứa vùng ATRX và PWWP; miền C xúc tác Enzyme de novo methyltransferase; đột biến gây hội chứng ICF; biểu hiện quá mức trong khối u
DNMT3L 21q22.3 12 exon, 11 intron, 15.877 bp (tọa độ 45666223 - 45682099) 387 acid amin; chứa motif ATRX, domain PHD; thiếu domain PWWP và các gốc xúc tác Không có hoạt tính xúc tác độc lập; tương tác kích thích hoạt tính DNMT3A/3B và liên kết HDAC1 kìm hãm phiên mã

Do vùng promoter của gen DNMT3L (chiều dài 477 nt, thiếu hộp TATA) không chứa đảo CpG thực thụ, phương pháp Methylation Specific PCR (MSP) không khả thi. Tác giả chọn phương pháp Bisulfite Sequencing PCR (BSP). Nguyên lý của phương pháp dựa trên phản ứng xử lý sodium bisulfite: toàn bộ cytosine (C) không bị methyl hóa sẽ bị khử amin chuyển hóa thành uracil (U), trong khi 5-methylcytosine (5-mC) được giữ nguyên. Sau đó, cặp mồi đặc hiệu không chứa vị trí CpG được dùng để khuếch đại đồng thời cả allele methyl hóa và không methyl hóa, tạo sản phẩm cho bước giải trình tự trực tiếp mà không cần tạo dòng.

Phương pháp nghiên cứu kết hợp giữa công cụ tin sinh học (in silico) và kỹ thuật thực nghiệm:

  • Công cụ in silico: Dữ liệu trình tự thu nhận từ NCBI GenBank; phân tích đảo CpG bằng phần mềm trực tuyến Methprimer; xác định vị trí gắn yếu tố phiên mã thông qua phần mềm TFSEARCH; chuyển đổi bisulfite in silico qua Methprimer; phân tích thông số mồi (nhiệt độ nóng chảy $T_m$, tỷ lệ %GC, dimer, cấu trúc kẹp tóc - hairpin loop) bằng phần mềm Annhyb 4.942 và công cụ trực tuyến của IDT; kiểm tra độ đặc hiệu mồi bằng MethBlast.
  • Quy trình thực nghiệm:
    1. Tách chiết DNA: Phương pháp phenol/chloroform truyền thống, sử dụng proteinase K (20 mg/ml) ủ ở 48°C trong 2 giờ, tủa bằng sodium acetate ($NH_4OAc$ 5M) và ethanol 100% lạnh ở -20°C, rửa tủa bằng ethanol 70%.
    2. Kiểm tra chất lượng DNA: Đo quang phổ hấp thụ OD260/OD280 trên máy Bio-Rad; điện di trên gel agarose 2% với đệm TAE 1X ở hiệu điện thế 80V trong 30 phút, nhuộm ethidium bromide (10 mg/ml); chạy phản ứng PCR kiểm tra độ nguyên vẹn của bộ gen bằng cặp mồi hoang dại DcR1-W (nhiệt độ gắn mồi 68°C, 40 chu kỳ).
    3. Biến đổi bisulfite: Sử dụng bộ kít thương mại EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen) với chu trình luân nhiệt gồm 3 pha biến tính (95°C trong 5 phút) xen kẽ 3 pha ủ chuyển hóa (60°C lần lượt trong 25 phút, 85 phút và 175 phút), sau đó tinh sạch qua màng cột thu 40 µl dịch giải ly.
    4. Tối ưu hóa phản ứng BSP: Khảo sát trên mẫu máu biến đổi bisulfite với các dải nồng độ mồi, nồng độ DNA khuôn, nồng độ enzyme iTaq DNA polymerase và gradient nhiệt độ bắt cặp ($T_a$ từ 47°C đến 55°C).

Nguồn dữ liệu thực nghiệm gồm 7 mẫu mô bệnh phẩm ung thư cổ tử cung nhiễm HPV type độc do Công ty Việt Á cung cấp và các mẫu máu toàn phần của người khỏe mạnh làm mẫu chứng tối ưu hóa.

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Sơ lược về ung thư cổ tử cung và đại cương họ gen DNMTs

Chương này trình bày toàn diện tổng quan y văn về bệnh sinh ung thư cổ tử cung và cơ sở phân tử của họ gen DNMTs. Tác giả nhấn mạnh quá trình tiến triển từ biểu mô cổ tử cung bình thường đến ung thư xâm lấn là một quá trình diễn tiến kéo dài, mất từ 4-5 năm đến trung bình 10-20 năm. Diễn tiến này trải qua các giai đoạn: nhiễm HPV, tổn thương tiền ung thư (dị sản biểu mô lát từ nhẹ, vừa đến nặng), ung thư tại chỗ (carcinoma in situ), ung thư vi xâm lấn và ung thư xâm lấn di căn. Tác giả đối chiếu các phương pháp chẩn đoán lâm sàng hiện hành: phết tế bào cổ tử cung (Pap's smear) có độ nhạy dao động 44% đến 78%, độ đặc hiệu 91% đến 96% nhưng tỷ lệ âm tính giả còn cao (1,1% đến 29,7%); soi cổ tử cung (độ phóng đại 10-30 lần); sinh thiết giải phẫu bệnh; khoét chóp cổ tử cung; và kỹ thuật sinh học phân tử HPV-PCR (ts-PCR định type dựa trên gen E6/E7).

Về mặt dịch tễ học dự phòng, hai loại vaccine lưu hành là Gardasil (ngừa 4 chủng: 6, 11, 16, 18) và Cervarix (ngừa 2 chủng: 16, 18). Ở phần cơ chế phân tử, chương phân tích mối quan hệ chéo giữa methyl hóa DNA và các biến đổi đuôi N của histone (acetyl hóa bởi HAT, khử acetyl bởi HDAC, methyl hóa tại các gốc lysine K4 hoặc K9 của histone H3, và phosphoryl hóa). Cấu trúc của bốn gen mã hóa enzyme methyltransferase chính (DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B) và phân tử điều hòa DNMT3L được so sánh chi tiết, xác định DNMT3L đóng vai trò như một yếu tố trao đổi chất nền, kích thích hoạt tính của DNMT3A và DNMT3B, đồng thời tương tác với histone deacetylase 1 (HDAC1) thông qua domain PHD để ức chế phiên mã.

Chương II: Vật liệu và phương pháp

Chương II mô tả chi tiết toàn bộ các bước thao tác kỹ thuật, hóa chất, thiết bị và công thức phản ứng. Quy trình tách chiết phenol/chloroform được chuẩn hóa qua 11 bước cụ thể. Kiểm tra nồng độ và độ sạch của DNA thực hiện bằng đo quang phổ tại bước sóng 260 nm và tỷ số $OD_{260}/OD_{280}$, kết hợp kiểm tra độ đứt gãy bằng điện di gel agarose 2% đối chiếu thang chuẩn 100 bp (Bio-Rad). Để bảo đảm dịch chiết không chứa chất ức chế và DNA đủ độ nguyên vẹn, phản ứng PCR kiểm chứng được thiết lập với cặp mồi DcR1-W trong thể tích 25 µl gồm 12,5 µl Premium PCR Master Mix 2X, 0,5 µl mồi xuôi DcR1-WF (25 µM), 0,5 µl mồi ngược DcR1-WR (25 µM), 5 µl DNA khuôn (15 µg/ml) và 6,5 µl $H_2O$. Chu trình nhiệt gồm 95°C (5 phút); 40 chu kỳ lặp lại gồm [95°C (30 giây), 68°C (30 giây), 72°C (1 phút)]; và kéo dài cuối cùng tại 72°C (6 phút).

Quy trình biến đổi hóa học bisulfite bằng kít EpiTect Bisulfite (Qiagen) được mô tả chuẩn xác về lượng dịch hòa tan Bisulfite Mix (800 µl Rnase-free water), chế độ ủ luân nhiệt đa bước và quy trình rửa giải qua cột thu nhận 40 µl DNA biến đổi. Đối với phản ứng BSP, thành phần hỗn hợp phản ứng 15 µl được ấn định gồm: 1,5 µl đệm iTaq Buffer 10X; 0,45 µl $MgCl_2$ 50 mM; 0,3 µl dNTP 10 mM; 0,5 µl mồi xuôi 15 µM; 0,5 µl mồi ngược 15 µM; 5 µl DNA khuôn đã biến đổi; enzyme iTaq polymerase và $H_2O$ vừa đủ 15 µl. Chu trình nhiệt phản ứng BSP ấn định: biến tính ban đầu 95°C (5 phút); 40 chu kỳ gồm [95°C (30 giây), 55°C (30 giây), 72°C (60 giây)]; giữ ở 72°C (6 phút) và bảo quản ở 4°C.

Chương III: Kết quả và thảo luận

Nội dung chương trình bày hai nhóm kết quả chính: phân tích tin sinh học (in silico) và thực nghiệm sinh học phân tử:

  1. Kết quả in silico:
    • Vị trí gen DNMT3L được định vị trên nhiễm sắc thể 21 tại băng 21q22.3, có kích thước 15.877 bp (từ nucleotide 45666223 đến 45682099). Vùng promoter dài 477 nt kéo dài đến exon 1 không chứa đảo CpG theo tiêu chuẩn phần mềm Methprimer.
    • Phân tích bằng TFSEARCH phát hiện hàng loạt vị trí liên kết của các nhân tố phiên mã quan trọng phân bố tại promoter DNMT3L, bao gồm: Sp1 (xuất hiện với tần suất dày đặc), NF-$\kappa$B, GATA, AML1a, p300 và C/EBP. Sự methyl hóa tại các vị trí dinucleotide CpG nằm trong trình tự nhận diện của các nhân tố này có khả năng ngăn cản liên kết của protein phiên mã, gây phong tỏa hoạt tính của gen.
    • Đánh giá cặp mồi BSP thu thập từ công bố của Gokul và cộng sự (2007) ký hiệu là DNMT3L-S (3L-SF và 3L-SR) bằng công cụ IDT và Annhyb cho thấy cặp mồi thỏa mãn đầy đủ các yêu cầu khắt khe:
Ký hiệu mồi Chiều dài (nt) Trình tự nucleotide (5' - 3') Tỷ lệ %GC $T_m$ (°C) Hairpin $\Delta G$ (kcal/mol) Homodimer $\Delta G$ (kcal/mol) Heterodimer $\Delta G$ (kcal/mol) Kích thước sản phẩm Vị trí bắt cặp
3L-SF 27 TTT GAG GGT TTT ATT TTT TGA ATT TTA 18,5% 49,5 -11,37 -5,36 0,06 275 bp Vùng promoter (-408 đến -134)
3L-SR 23 AAA AAT CCA AAC CCA CCT AAA AC 34,8% 52,2 Không có -1,47

Chênh lệch nhiệt độ nóng chảy giữa hai mồi là 2,7°C (dưới ngưỡng khuyến cáo 5°C). Kích thước sản phẩm 275 bp nằm trong khoảng tối ưu (100-300 bp) cho phép khuếch đại hiệu quả trên khuôn DNA đã bị đứt gãy một phần do xử lý hóa chất bisulfite.

  1. Kết quả thực nghiệm:
    • Tách chiết DNA bộ gen từ các mẫu dịch phết mô bệnh phẩm và mẫu máu cho thấy dịch chiết đạt yêu cầu về nồng độ và độ tinh sạch. Kết quả điện di trên gel agarose cho thấy băng DNA gọn, không bị đứt gãy mạnh và không lẫn tạp chất RNA. Phản ứng PCR kiểm tra với cặp mồi hoang dại DcR1-W cho vạch sản phẩm đặc hiệu rõ nét, chứng minh chất lượng DNA khuôn đạt chuẩn để đưa vào xử lý bisulfite.
    • Thử nghiệm tối ưu hóa phản ứng BSP với cặp mồi DNMT3L-S trên mẫu máu đã biến đổi bisulfite được thực hiện qua các bước khảo sát đơn biến: nồng độ mồi (Hình III.7), nồng độ DNA khuôn (Hình III.8), gradient nhiệt độ gắn mồi từ 47°C đến 55°C (Hình III.9) và nồng độ enzyme iTaq polymerase (Hình III.10).
    • Ứng dụng quy trình đã tối ưu lên các mẫu bệnh phẩm ung thư cổ tử cung đã biến đổi bisulfite: sản phẩm PCR đặc hiệu kích thước 275 bp được khuếch đại thành công trên các mẫu bệnh phẩm đại diện mang mã số 31 (Hình III.11), 545 (Hình III.12), 452 và 477 (Hình III.13), và 476 (Hình III.14). Băng sản phẩm thu được rõ, gọn, không có hiện tượng tạo mồi kẹp không đặc hiệu.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã ghi nhận các kết quả cụ thể dựa trên số liệu thực nghiệm:

  • Đã phân tích toàn diện in silico cấu trúc gen DNMT3L trên nhiễm sắc thể 21q22.3, chứng minh vùng promoter dài 477 bp không có đảo CpG nhưng chứa nhiều vị trí gắn nhân tố phiên mã quan trọng như Sp1, NF-$\kappa$B, GATA, AML1a, p300, C/EBP.
  • Thẩm định và chuẩn hóa thành công cặp mồi BSP chuyên biệt (3L-SF: 27 nt, %GC 18,5%, $T_m$ 49,5°C; 3L-SR: 23 nt, %GC 34,8%, $T_m$ 52,2°C) có khả năng khuếch đại đoạn đích 275 bp nằm từ vị trí -408 đến -134 trên vùng promoter của gen DNMT3L.
  • Xây dựng và tối ưu hóa thành công chu trình phản ứng Bisulfite Sequencing PCR (BSP) cho gen DNMT3L, xác lập được các thông số nồng độ mồi, khuôn DNA, nồng độ iTaq polymerase và nhiệt độ gắn mồi ổn định ($T_a = 55^\circ\text{C}$).
  • Áp dụng thành công quy trình BSP đã tối ưu trên các mẫu bệnh phẩm thực tế từ bệnh nhân ung thư cổ tử cung nhiễm HPV type độc (khuếch đại thành công sản phẩm 275 bp trên các mẫu bệnh phẩm số 31, 545, 452, 477, 476).

Đóng góp của khóa luận thể hiện ở việc kế thừa và mở rộng chuỗi nghiên cứu về dấu ấn sinh học biểu sinh tại Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại học Mở TP.HCM (nối tiếp đề tài cấp trường về methyl hóa promoter 2 gen TRAIL-R3, TRAIL-R4). Nghiên cứu đã thiết lập được quy trình thực nghiệm hoàn chỉnh từ khâu xử lý biến đổi bisulfite đến phản ứng PCR chuyên biệt cho một gen không chứa đảo CpG như DNMT3L, tạo tiền đề kỹ thuật trực tiếp cho bước giải trình tự phân tích mức độ methyl hóa định lượng ở cấp độ từng nucleotide.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận phản ánh một số hạn chế gắn liền với phạm vi và điều kiện thực hiện:

  • Số lượng mẫu bệnh phẩm khảo sát còn hạn chế (7 mẫu bệnh phẩm ung thư cổ tử cung thu nhận từ khu vực phía Nam do Công ty Việt Á cung cấp).
  • Nghiên cứu dừng lại ở mức tối ưu hóa thành công phản ứng khuếch đại BSP và kiểm tra sản phẩm trên gel điện di; chưa thực hiện bước giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR (direct sequencing) hoặc tạo dòng giải trình tự để định lượng chính xác tỷ lệ methyl hóa tại từng vị trí cytosine cụ thể của các mẫu bệnh phẩm trong đợt báo cáo này.

Các hướng mở rộng tiếp theo được xác định bao gồm:

  • Tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR 275 bp và gửi giải trình tự nucleotide trực tiếp để lập bản đồ methyl hóa chi tiết các vị trí CpG trên promoter gen DNMT3L của 7 bệnh nhân.
  • Mở rộng cỡ mẫu nghiên cứu trên số lượng bệnh nhân lớn hơn, đối chứng song song với nhóm người khỏe mạnh không mắc ung thư cổ tử cung để xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của chỉ số giảm methyl hóa DNMT3L.
  • Khảo sát mối tương quan giữa mức độ methyl hóa promoter gen DNMT3L với các type HPV khác nhau và từng giai đoạn tiến triển lâm sàng của bệnh nhân ung thư cổ tử cung.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận là tài liệu tham khảo có giá trị học thuật và thực tiễn cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học Phân tử, Y sinh học và Di truyền Y học:

  • Về mặt phương pháp luận: Khóa luận cung cấp tài liệu hướng dẫn chi tiết quy trình tin sinh học (in silico) trong sàng lọc đảo CpG và thiết kế mồi chuyên biệt cho mẫu DNA biến đổi bisulfite – một kỹ thuật có độ phức tạp cao do sự suy giảm thành phần nucleotide (chuyển đổi C thành T/U làm giảm tính đa dạng trình tự).
  • Về mặt kỹ thuật phòng thí nghiệm: Các quy trình chi tiết về xử lý mô bệnh phẩm, tách chiết DNA bằng phenol/chloroform, quy trình luân nhiệt biến đổi bisulfite bằng bộ kít thương mại EpiTect và kỹ thuật tối ưu hóa đơn biến các thành phần phản ứng PCR (mồi, khuôn, enzyme, gradient nhiệt độ) là cẩm nang thực hành hữu ích cho các đề tài nghiên cứu về biểu sinh học ung thư.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu lại sử dụng phương pháp Bisulfite Sequencing PCR (BSP) mà không dùng phương pháp Methylation Specific PCR (MSP)?
Phương pháp MSP đòi hỏi thiết kế hai cặp mồi riêng biệt (một cặp cho allele bị methyl hóa và một cặp cho allele không bị methyl hóa) và các cặp mồi này bắt buộc phải bắt cặp trực tiếp trên các đảo CpG có mật độ cao. Qua phân tích tin sinh học bằng phần mềm Methprimer, vùng promoter dài 477 bp của gen DNMT3L không chứa đảo CpG. Do đó, phương pháp BSP là lựa chọn thích hợp vì cặp mồi BSP được thiết kế tại vùng không chứa dinucleotide CpG, cho phép khuếch đại trung tính cả allele methyl hóa lẫn không methyl hóa để sau đó đem giải trình tự phân tích toàn bộ các vị trí CpG bên trong đoạn khuếch đại.

2. Cặp mồi DNMT3L-S (3L-SF và 3L-SR) có những đặc điểm kỹ thuật gì để bảo đảm tính đặc hiệu trên khuôn DNA đã xử lý bisulfite?
Cặp mồi được tham khảo từ nghiên cứu của Gokul và cộng sự (2007) và kiểm chứng qua phần mềm IDT và Annhyb. Mồi xuôi 3L-SF dài 27 nt (%GC 18,5%, $T_m = 49,5^\circ\text{C}$), mồi ngược 3L-SR dài 23 nt (%GC 34,8%, $T_m = 52,2^\circ\text{C}$). Trình tự mồi không chứa bất kỳ vị trí CpG nào để tránh thiên lệch khuếch đại, có độ biến thiên năng lượng tự do dimer và hairpin loop ở mức an toàn ($\Delta G$ đều nằm trong ngưỡng cho phép), và tạo ra sản phẩm khuếch đại có kích thước 275 bp nằm ở vùng promoter từ vị trí -408 đến -134, phù hợp với mẫu DNA khuôn đã bị đứt đoạn sau xử lý hóa chất.

3. Quy trình kiểm tra chất lượng DNA sau tách chiết từ mô bệnh phẩm được thực hiện như thế nào trước khi xử lý bisulfite?
Chất lượng DNA tách chiết từ phương pháp phenol/chloroform được đánh giá qua ba bước nghiêm ngặt: (1) Đo mật độ quang tại bước sóng 260 nm và xác định độ sạch qua tỷ số $OD_{260}/OD_{280}$; (2) Điện di trên gel agarose 2% ở hiệu điện thế 80V trong 30 phút để kiểm tra độ nguyên vẹn của sợi DNA và sự hiện diện của tạp nhiễm RNA; (3) Chạy phản ứng PCR kiểm chứng với cặp mồi hoang dại DcR1-W (nhiệt độ gắn mồi 68°C, 40 chu kỳ). Khi phản ứng PCR DcR1-W cho vạch sản phẩm đặc hiệu rõ nét mới tiến hành đưa mẫu vào biến đổi bisulfite.

4. Chu trình biến đổi bisulfite bằng bộ kít EpiTect Bisulfite Kit của Qiagen diễn ra qua các pha nhiệt độ nào?
Chu trình luân nhiệt biến đổi bisulfite trên máy PCR bao gồm 3 chu kỳ biến tính và ủ xen kẽ: biến tính ở 95°C trong 5 phút, ủ ở 60°C trong 25 phút; tiếp tục biến tính ở 95°C trong 5 phút, ủ ở 60°C trong 85 phút; biến tính lần ba ở 95°C trong 5 phút, ủ kéo dài ở 60°C trong 175 phút; cuối cùng giữ mẫu ở 20°C trước khi chuyển sang bước tinh sạch trên cột.

5. Các mẫu bệnh phẩm ung thư cổ tử cung sử dụng trong đề tài có nguồn gốc từ đâu và mang đặc điểm vi sinh gì?
Đề tài sử dụng 7 mẫu bệnh phẩm ung thư cổ tử cung do Công ty Việt Á cung cấp từ các bệnh nhân khu vực miền Nam, Việt Nam. Các mẫu này đã được kiểm tra và khẳng định nhiễm các phân nhóm HPV type độc (nguy cơ cao), bao gồm các chủng HPV 11, HPV 18 và HPV 33.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Bùi Thị Tuyết Nga đã hoàn thành việc xây dựng và chuẩn hóa quy trình Bisulfite Sequencing PCR (BSP) nhằm khảo sát tình trạng methyl hóa vùng promoter của gen DNMT3L trên bệnh nhân ung thư cổ tử cung. Nghiên cứu đã kết hợp chặt chẽ giữa phân tích tin sinh học để lựa chọn cặp mồi tối ưu (kích thước sản phẩm 275 bp) và thực nghiệm sinh học phân tử để xác lập điều kiện phản ứng PCR chuẩn xác. Kết quả khuếch đại thành công trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng nhiễm HPV nguy cơ cao đã tạo cơ sở kỹ thuật vững chắc cho việc giải trình tự định lượng mức độ methyl hóa, phục vụ mục tiêu phát triển các dấu ấn sinh học hỗ trợ chẩn đoán sớm ung thư cổ tử cung.