Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Sự phát triển của khoa học sinh học và y dược học đã thúc đẩy việc ứng dụng các chế phẩm sinh học, đặc biệt là probiotic, trong công tác phòng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh lý đường tiêu hóa. Theo định nghĩa của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc phối hợp cùng Tổ chức Y tế Thế giới (FAO/WHO), probiotic là các vi sinh vật sống mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ khi được bổ sung với liều lượng thích hợp. Trong số các chủng vi sinh vật hữu ích, Saccharomyces boulardii là chủng nấm men probiotic duy nhất được ứng dụng phổ biến trong sản xuất men vi sinh tiêu hóa cho người và vật nuôi.

Khác với các nhóm vi khuẩn lactic thông thường, S. boulardii sở hữu đặc tính sinh học đặc thù như khả năng đề kháng tự nhiên với nhiều loại kháng sinh, khả năng chịu đựng môi trường khắc nghiệt (pH thấp của dịch vị dạ dày, muối mật ở ruột) và khả năng tiết enzyme protease ức chế các cytokine tiền viêm cũng như trung hòa độc tố vi khuẩn đường ruột. Nhờ những đặc tính này, nấm men S. boulardii được bổ sung rộng rãi vào các chế phẩm men vi sinh thương mại dạng đông khô. Do đó, việc nghiên cứu phát triển quy trình phân lập, định danh chính xác và kiểm tra mật độ sống của nấm men trong các sản phẩm thương mại là nhiệm vụ cần thiết trong kiểm soát chất lượng và nghiên cứu vi sinh học ứng dụng.

Mục tiêu chung của đề tài là phân lập và định danh chủng nấm men Saccharomyces boulardii từ một số mẫu chế phẩm probiotic thương mại trên thị trường, đồng thời xác định mật độ tế bào nấm men sống chứa trong các mẫu nghiên cứu.

Nhiệm vụ và yêu cầu nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể như sau:

  1. Phân lập được nấm men Saccharomyces boulardii từ các chế phẩm men vi sinh; định danh chủng phân lập bằng phương pháp giải trình tự gen vùng ITS với cặp mồi chuyên biệt.
  2. Xác định một số đặc tính sinh học, đặc điểm hình thái của nấm men; kiểm tra và tính toán mật độ tế bào nấm men Saccharomyces boulardii trong các mẫu chế phẩm probiotic bằng phương pháp đếm tản nấm (CFU) trên đĩa thạch.

Đối tượng nghiên cứu của đề tài gồm 4 mẫu chế phẩm probiotic thương mại đang lưu hành trên thị trường:

  • Bioflora (ký hiệu: BF) do Công ty Biocodex (Pháp) cung cấp, thành phần công bố là Saccharomyces boulardii CNCM I-745.
  • Bio-acimin Gold (ký hiệu: BM) do Công ty Cổ phần Dược phẩm Việt Đức phân phối, thành phần công bố gồm Saccharomyces boulardii ($10^8$ CFU), Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus coagulans cùng một số vi chất.
  • Bolabio (ký hiệu: BL) do Công ty TNHH Liên doanh Hasan - Dermapharm sản xuất, thành phần chính là Saccharomyces boulardii đông khô ($10^9$ CFU).
  • Biozyme (ký hiệu: BZ) do Công ty Cổ phần Dược phẩm Ngọc Quý sản xuất, thành phần công bố gồm 3 chủng vi sinh vật: Lactobacillus sporogenes, Saccharomyces boulardii, Bacillus subtilis.

Phạm vi không gian và thời gian: Các thí nghiệm thực nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam trong năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Về mặt phân loại học, nấm men Saccharomyces boulardii thuộc giới Nấm (Fungi), ngành Ascomycota, phân ngành Saccharomycotina, lớp Saccharomycetes, bộ Saccharomycetales, họ Saccharomycetaceae. Chủng nấm này được nhà sinh vật học người Pháp Henri Boulard phân lập lần đầu tiên vào những năm 1920 từ vỏ quả vải và măng cụt tại khu vực Đông Nam Á. Hệ gen của S. boulardii bao gồm khoảng 13.275 gen (trong đó có 5.885 gen mã hóa protein, 140 gen rRNA, 40 gen mRNA và 275 gen tRNA), có mức độ tương đồng khoảng 23% với hệ gen người và rất gần gũi với Saccharomyces cerevisiae. S. boulardii là vi sinh vật dị dưỡng kỵ khí không bắt buộc, phát triển tối ưu ở $37^\circ\text{C}$, sử dụng năng lượng qua con đường đường phân (glycolysis), có khả năng chuyển hóa galactose và glucose nhưng không lên men lactose.

Về cơ chế tác động, S. boulardii kích thích tổng hợp kháng thể miễn dịch niêm mạc IgA, tiết ra enzyme protease trọng lượng phân tử 54 kDa có khả năng thủy phân độc tố A và B của Clostridium difficile, sinh protein 120 kDa ức chế enzyme adenylate cyclase giúp giảm bài tiết dịch điện giải chloride ($Cl^-$) do độc tố tả, và tiết protein 63 kDa khử nhóm phosphate của nội độc tố lipopolysaccharide (LPS) từ Escherichia coli.

Khóa luận đã tổng quan và đối chiếu các phương pháp định danh vi sinh vật hiện đại gồm: phương pháp hình thái học - sinh lý sinh hóa truyền thống, phương pháp khối phổ MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry), hệ thống định danh tự động VITEK, và phương pháp sinh học phân tử dựa trên giải trình tự vùng đệm phiên mã nội bộ ITS (Internal Transcribed Spacer) của ribosome.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được thiết kế và thực hiện đồng bộ qua các kỹ thuật vi sinh và sinh học phân tử:

  • Phương pháp chuẩn bị và khảo sát môi trường chọn lọc: Sử dụng môi trường thạch YPDA (thành phần: Cao nấm men 10 g/L, Peptone 20 g/L, D-Glucose 20 g/L, Agar 15-20 g/L, nước cất 1000 mL) có bổ sung kháng sinh Chloramphenicol ở 4 mức nồng độ: 0,005%; 0,01%; 0,015% và 0,02% (m/v) nhằm ức chế sự phát triển của vi khuẩn tạp nhiễm trong mẫu probiotic đa thành phần.
  • Phương pháp pha loãng và cấy trải: Các mẫu thử được hoạt hóa trong nước cất vô trùng và pha loãng theo bậc thập phân liên tiếp ($10^{-1}$ đến $10^{-9}$). Hút 0,1 mL dịch huyền phù ở từng độ pha loãng cấy trải đều lên đĩa môi trường chọn lọc (mỗi độ pha loãng lặp lại 3 đĩa), nuôi ủ ở $30^\circ\text{C}$ trong 48–72 giờ.
  • Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật: Đếm số lượng khuẩn lạc (tản nấm) trên các đĩa thạch có số lượng nằm trong khoảng tin cậy 25 – 250 CFU. Mật độ tế bào nấm men được tính theo công thức: $$N = 10 \times A \times \frac{1}{10^n}$$ Trong đó: $N$ là số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trong 1 g hoặc 1 mL mẫu; $A$ là số lượng tản nấm trung bình đếm được ở độ pha loãng đã chọn; $n$ là bậc pha loãng.
  • Phương pháp hình thái học: Quan sát đặc điểm đại thể tản nấm (kích thước, màu sắc, bề mặt, viền khuẩn lạc) và kiểm tra hình thái vi thể tế bào (kích thước, hình dạng, phương thức nảy chồi, cấu trúc bào tử) dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại từ 250 đến 1000 lần.
  • Phương pháp tách chiết DNA tổng số: Áp dụng quy trình ly giải tế bào bằng đệm Lysis buffer (chứa 3% SDS, 0,2 N NaOH, 10 mM EDTA), kết tủa protein tạp bằng dung dịch Potassium Acetate (KOAc 3M), kết tủa acid nucleic bằng Isopropanol, rửa tinh sạch bằng Ethanol 70% và hòa tan lại trong đệm TE 0,1X.
  • Phương pháp khuếch đại gen (PCR) và giải trình tự gen vùng ITS: Sử dụng cặp mồi chuyên biệt ITS1 (trình tự: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) và ITS4 (trình tự: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’). Hỗn hợp phản ứng 20 µL gồm: 10 µL PCR MasterMix 6X (MyTaq), 2 µL mồi ITS1 (10 µM), 2 µL mồi ITS4 (10 µM), 1 µL DNA khuôn và 5 µL $H_2O$ vô trùng không chứa nuclease. Chu trình nhiệt: biến tính ban đầu $96^\circ\text{C}$ (3 phút); 35 chu kỳ gồm biến tính $95^\circ\text{C}$ (45 giây), gắn mồi $55^\circ\text{C}$ (45 giây), kéo dài $72^\circ\text{C}$ (2 phút); kéo dài kết thúc $72^\circ\text{C}$ (7 phút).
  • Phương pháp điện di và xử lý dữ liệu trình tự: Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 2% trong đệm chuyên dụng ở điện thế 120V trong 20 phút. Trình tự nucleotide được giải theo phương pháp Sanger, đọc và chỉnh sửa file sắc ký đồ bằng phần mềm Chromas (phiên bản 2), sau đó so sánh đối chiếu độ tương đồng trên ngân hàng gen GenBank thông qua thuật toán BLASTN của NCBI.

Nguồn dữ liệu của nghiên cứu là các thông số thực nghiệm ghi nhận trực tiếp từ quá trình nuôi cấy, đếm khuẩn lạc, hình ảnh kính hiển vi, ảnh chụp gel điện di và dữ liệu giải trình tự nucleotide. Thiết bị và thao tác phòng thí nghiệm tuân thủ tiêu chuẩn TCVN 6404 (ISO 7218).

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Mở đầu

Chương này phân tích lý do chọn đề tài dựa trên nhu cầu sử dụng men vi sinh probiotic trong y dược và nông nghiệp. Tác giả nêu bật vai trò sinh học của Saccharomyces boulardii, khẳng định tính cấp thiết của việc kiểm tra thành phần vi sinh vật trong các chế phẩm thương mại, đồng thời công bố mục tiêu và hai yêu cầu nghiên cứu chính của khóa luận.

Phần II: Tổng quan tài liệu

Chương tổng quan hệ thống hóa toàn diện các tài liệu khoa học liên quan đến Saccharomyces boulardii:

  • Lịch sử phân lập, phân loại học và cấu tạo tế bào (vách tế bào dày 5–10 µm chiếm 30% trọng lượng khô, cấu thành bởi 85% polysaccharide và 15% protein).
  • Đặc điểm sinh học, con đường trao đổi chất và ba hình thức sinh sản (sinh dưỡng qua nảy chồi/phân cắt, đơn tính và hữu tính đẳng giao/dị giao).
  • Vai trò miễn dịch đường ruột, cơ chế kháng độc tố tả, kháng vi khuẩn Clostridium difficile, Escherichia coli, và khả năng đề kháng kháng sinh.
  • Các phương pháp định danh vi sinh vật hiện hành (hình thái sinh hóa, MALDI-TOF MS, hệ thống VITEK, giải trình tự vùng gen ITS).
  • Lược khảo các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước: Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy bằng ma trận Plackett-Burman kết hợp phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM-CCD); nghiên cứu tính kháng khuẩn in vitro với Salmonella enterica; đánh giá khả năng sống sót trong muối mật và pH acid; phân tích mối quan hệ phát sinh loài qua trình tự vùng D1/D2 26S rDNA, ITS1-5.8S-ITS2 và gen ty thể COX2; nghiên cứu đột biến gen PGM2 ảnh hưởng đến chuyển hóa galactose; các dữ liệu dược động học trên mô hình chuột và người.

Phần III: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết danh mục trang thiết bị phòng thí nghiệm đạt chuẩn TCVN 6404 (ISO 7218), nguyên liệu 4 mẫu men probiotic thương mại (BF, BM, BL, BZ), thành phần môi trường thạch YPDA và công thức bổ sung Chloramphenicol. Tác giả trình bày tường minh các bước kỹ thuật: phương pháp pha loãng mẫu, cấy trải đĩa thạch, quy trình tách chiết DNA bằng hệ đệm SDS-NaOH và KOAc 3M, thông số phản ứng PCR với cặp mồi ITS1/ITS4, điều kiện điện di gel agarose 2%, phương pháp giải trình tự Sanger và thuật toán so sánh BLASTN.

Phần IV: Kết quả nghiên cứu

Chương kết quả trình bày toàn bộ số liệu và phát hiện thực nghiệm qua 4 nội dung trọng tâm:

1. Khảo sát nồng độ kháng sinh Chloramphenicol thích hợp: Khảo sát 4 mức nồng độ kháng sinh Chloramphenicol (0,005%; 0,01%; 0,015%; 0,02%) trên môi trường thạch YPDA ở cùng độ pha loãng $10^{-2}$ cho thấy:

  • Môi trường bổ sung 0,005% và 0,01% Chloramphenicol cho mật độ nấm men mọc dày đặc, sinh trưởng tốt và ức chế hoàn toàn các vi khuẩn cộng sinh/tạp nhiễm trong chế phẩm (Bacillus, Lactobacillus).
  • Môi trường bổ sung 0,015% và 0,02% Chloramphenicol cho số lượng tản nấm mọc ở mức trung bình đến trung bình cao.
  • Nồng độ 0,005% (tương đương 0,05 g/L) được lựa chọn làm nồng độ tối ưu cho môi trường phân lập vì vừa đảm bảo ức chế chọn lọc vi khuẩn, vừa giúp tiết kiệm chi phí hóa chất và giảm thiểu lượng kháng sinh tồn dư thải ra môi trường.

2. Đặc điểm hình thái phân lập của các chủng nấm men: Trên môi trường thạch YPDA bổ sung 0,005% Chloramphenicol nuôi ở $30^\circ\text{C}$ sau 48–72 giờ, các chủng phân lập từ 4 mẫu chế phẩm biểu hiện các đặc tính hình thái đại thể và vi thể:

  • Mẫu BF: Tản nấm hình tròn, có các vòng đồng tâm, màu trắng sữa, bề mặt nhẵn bóng, ướt, viền liền, đường kính 1–3 mm, độ dày khoảng 0,5 mm. Tế bào dưới kính hiển vi có dạng hình trứng, hình ovan lớn hoặc hình cầu, vách tế bào dày, bên trong chứa 1–3 bào tử hình trứng.
  • Mẫu BM: Tản nấm tròn, màu trắng đục, bề mặt nhẵn bóng, hơi lồi, có vòng đồng tâm, viền liền, đường kính 1–3 mm, dày 0,5 mm. Tế bào hình trứng hoặc cầu lớn, vách dày, chứa 1–4 bào tử nhỏ hình cầu.
  • Mẫu BL: Tản nấm màu trắng sữa, bề mặt nhẵn bóng, hơi lồi, ướt, hình tròn viền liền, đường kính 2–3 mm, dày khoảng 1 mm. Tế bào hình ovan hoặc cầu, vách dày, quan sát rõ hiện tượng nảy chồi lưỡng cực.
  • Mẫu BZ: Tản nấm màu trắng sữa, bề mặt nhẵn bóng, hơi lồi, ướt, có vòng đồng tâm, hình tròn, đường kính 1–3 mm.

3. Kết quả định danh phân tử bằng giải trình tự gen vùng ITS: DNA tổng số tách chiết từ các chủng nấm men đạt độ tinh sạch và nồng độ yêu cầu. Sản phẩm khuếch đại PCR với cặp mồi ITS1/ITS4 khi điện di trên gel agarose 2% xuất hiện một băng đơn đặc hiệu, rõ nét, kích thước tương đồng giữa 4 mẫu. Kết quả giải trình tự Sanger và đối chiếu BLASTN trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) xác nhận cả 4 chủng phân lập từ các mẫu BF, BM, BL, BZ đều có trình tự vùng gen ITS tương đồng tuyệt đối với loài nấm men Saccharomyces boulardii.

4. Xác định độ pha loãng thích hợp và mật độ nấm men: Nghiên cứu đã khảo sát dãy pha loãng liên tiếp để chọn ra nồng độ cho số lượng khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 – 250 CFU/đĩa, từ đó tính toán mật độ tế bào nấm men sống:

Ký hiệu mẫu Chế phẩm thương mại Dải pha loãng khảo sát Độ pha loãng thích hợp Mật độ nấm men xác định thực tế (CFU/g) Thành phần nấm men nhà sản xuất công bố
BF Bioflora $10^{-6} - 10^{-9}$ $10^{-8}$ $9,7 \times 10^9$ S. boulardii CNCM I-745
BM Bio-acimin Gold $10^{-3} - 10^{-5}$ $10^{-4}$ $10^8$ S. boulardii $10^8$ CFU
BL Bolabio $10^{-5} - 10^{-8}$ $10^{-6}$ $10^9$ S. boulardii $10^9$ CFU
BZ Biozyme $10^{-2} - 10^{-4}$ $10^{-3}$ Tương đồng công bố S. boulardii (trong hỗn hợp 3 chủng)

Phần V: Kết luận và kiến nghị

Chương tổng kết các phát hiện chính của khóa luận, khẳng định quy trình phân lập và định danh đã thực hiện thành công, đồng thời kiến nghị ứng dụng quy trình trong kiểm tra chất lượng vi sinh vật cho các chế phẩm probiotic thương phẩm.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

Khóa luận đã hoàn thành toàn diện các nội dung thực nghiệm và thu được các kết quả định lượng cụ thể:

  • Xác định môi trường thạch YPDA bổ sung 0,005% Chloramphenicol (0,05 g/L) là điều kiện nuôi cấy chọn lọc tối ưu để tách nấm men S. boulardii ra khỏi các hỗn hợp vi khuẩn đường ruột trong chế phẩm probiotic.
  • Định danh chính xác cả 4 chủng vi nấm phân lập từ các mẫu chế phẩm BF, BM, BL, BZ thuộc loài Saccharomyces boulardii thông qua phân tích đặc điểm hình thái và giải trình tự gen vùng ITS1-5.8S rDNA-ITS2.
  • Xác định được độ pha loãng tối ưu để đếm khuẩn lạc cho từng loại mẫu: $10^{-8}$ đối với mẫu BF, $10^{-4}$ đối với mẫu BM, $10^{-6}$ đối với mẫu BL và $10^{-3}$ đối với mẫu BZ.
  • Xác định mật độ tế bào nấm men sống thực tế đạt $9,7 \times 10^9$ CFU/g đối với mẫu Bioflora (BF), $10^8$ CFU/g đối với mẫu Bio-acimin Gold (BM), và $10^9$ CFU/g đối với mẫu Bolabio (BL). Các kết quả định lượng này hoàn toàn tương đồng với chỉ tiêu vi sinh vật do nhà sản xuất công bố trên bao bì.

Đóng góp của khóa luận

  • Đưa ra quy trình thực nghiệm chuẩn hóa, đơn giản và hiệu quả trong việc phân lập nấm men probiotic từ các nền mẫu chế phẩm đa thành phần phức tạp chứa nhiều loài vi khuẩn (Bacillus, Lactobacillus).
  • Kết hợp chặt chẽ giữa phương pháp vi sinh truyền thống (quan sát hình thái đại thể, vi thể) và phương pháp sinh học phân tử hiện đại (PCR-Sanger vùng ITS), đảm bảo độ chính xác và tin cậy cao trong công tác định danh phân loại nấm men.
  • Cung cấp dữ liệu thực nghiệm phục vụ trực tiếp cho công tác kiểm định chất lượng, thẩm định chỉ tiêu số lượng vi sinh vật sống trong các chế phẩm probiotic đang lưu hành trên thị trường.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Nghiên cứu chỉ tập trung khảo sát trên 4 mẫu chế phẩm probiotic thương mại dạng uống; phạm vi phân tích phân tử dừng lại ở mức độ giải trình tự đoạn gen ITS1–ITS4 để định danh loài mà chưa phân tích sâu các chỉ thị di truyền dưới loài hoặc giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS); chưa tiến hành các thử nghiệm in vitro đánh giá lại hoạt tính sinh học chức năng (khả năng bám dính biểu mô, mức độ chịu acid/muối mật thực tế) của các chủng sau khi phân lập.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo: Mở rộng quy trình phân lập và kiểm định trên nhiều nhóm chế phẩm sinh học khác (chế phẩm xử lý môi trường, phân bón vi sinh vật, men vi sinh thủy sản); nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện lên men thu sinh khối chủng nấm men S. boulardii đã làm thuần; khảo sát sâu hơn các đặc tính probiotic chức năng và độ ổn định sống sót của chủng nấm men trong điều kiện mô phỏng hệ tiêu hóa in vitro.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo thiết thực cho:

  • Đối tượng: Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh học, Dược học, Công nghệ Thực phẩm và Kiểm nghiệm Dược phẩm - Mỹ phẩm.
  • Nội dung giá trị:
    • Quy trình thực nghiệm pha chế môi trường chọn lọc YPDA có bổ sung kháng sinh Chloramphenicol ở nồng độ thích hợp (0,005%) để tách nấm men khỏi vi khuẩn.
    • Phương pháp tách chiết DNA nấm men sử dụng hệ đệm Lysis buffer SDS-NaOH kết hợp KOAc và quy trình PCR khuếch đại vùng gen ITS1/ITS4.
    • Phương pháp tính toán và xử lý số liệu mật độ vi sinh vật (CFU) theo tiêu chuẩn TCVN 6404 (ISO 7218).

Câu hỏi thường gặp

1. Nghiên cứu đã lựa chọn nồng độ kháng sinh Chloramphenicol nào để bổ sung vào môi trường YPDA và vì sao?
Nghiên cứu đã khảo sát 4 mức nồng độ (0,005%; 0,01%; 0,015%; 0,02%) và lựa chọn nồng độ 0,005% (0,05 g/L). Nồng độ này đủ khả năng ức chế hoàn toàn các loại vi khuẩn tạp nhiễm có trong mẫu (Bacillus, Lactobacillus), giúp nấm men phát triển tối ưu, đồng thời tiết kiệm chi phí hóa chất và giảm thiểu lượng kháng sinh tồn dư thải ra môi trường.

2. Cặp mồi và chu trình nhiệt PCR nào được sử dụng để khuếch đại đoạn gen định danh nấm men trong khóa luận?
Nghiên cứu sử dụng cặp mồi ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) và ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’). Chu trình nhiệt gồm: biến tính ban đầu $96^\circ\text{C}$ (3 phút); 35 chu kỳ lặp lại ($95^\circ\text{C}$ trong 45 giây, $55^\circ\text{C}$ trong 45 giây, $72^\circ\text{C}$ trong 2 phút); và giai đoạn kéo dài cuối cùng ở $72^\circ\text{C}$ trong 7 phút.

3. Khóa luận đã tiến hành khảo sát trên những mẫu chế phẩm probiotic thương phẩm nào?
Khóa luận thực hiện trên 4 mẫu chế phẩm gồm: Bioflora (ký hiệu BF, do Biocodex sản xuất), Bio-acimin Gold (ký hiệu BM, do Dược phẩm Việt Đức phân phối), Bolabio (ký hiệu BL, do Hasan - Dermapharm sản xuất) và Biozyme (ký hiệu BZ, do Dược phẩm Ngọc Quý sản xuất).

4. Mật độ tế bào nấm men sống thực tế xác định được trong mẫu Bioflora (BF) là bao nhiêu và ở độ pha loãng nào?
Trong mẫu Bioflora (BF), độ pha loãng thích hợp nhất để đếm khuẩn lạc là $10^{-8}$ (trong dải khảo sát $10^{-6} - 10^{-9}$), xác định được mật độ nấm men sống đạt $9,7 \times 10^9$ CFU/g, tương đồng với thông tin công bố của nhà sản xuất.

5. Hóa chất chính được sử dụng trong quy trình tách chiết DNA nấm men của nghiên cứu là gì?
Quy trình sử dụng đệm phá màng Lysis buffer (chứa 3% SDS, 0,2 N NaOH, 10 mM EDTA), dung dịch kết tủa protein Potassium Acetate (KOAc 3M), cồn Isopropanol để kết tủa acid nucleic, Ethanol 70% để rửa mẫu và đệm TE 0,1X để bảo quản DNA.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Trương Thị Ngọc Ánh đã xây dựng thành công quy trình phân lập nấm men Saccharomyces boulardii từ các chế phẩm probiotic thương phẩm trên môi trường chọn lọc YPDA bổ sung 0,005% Chloramphenicol. Kết hợp giữa phân tích đặc điểm hình thái vi sinh và giải trình tự vùng gen ITS1/ITS4, nghiên cứu đã định danh chính xác cả 4 chủng vi nấm phân lập đều thuộc loài Saccharomyces boulardii. Kết quả định lượng mật độ tế bào sống đạt mức tương đồng cao với số liệu do nhà sản xuất công bố, cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm tin cậy phục vụ công tác kiểm tra, kiểm định chất lượng các sản phẩm probiotic trên thị trường.