Đặt vấn đề Ngày nay với sự phát triển vƣợt bậc của khoa học cũng nhƣ y học, con ngƣời đã đƣợc tiếp cận, sử dụng nhiều hơn các sản phẩm sinh học, chế phẩm probiotic trong việc điều trị và phòng ngừa một số loại bệnh nhằm hƣớng tới hiệu quả và an toàn cao hơn so với các loại thuốc thông thƣờng. Probiotic theo định nghĩa của FAO/WHO là các vi sinh vật sống khi đƣợc sử dụng với một lƣợng thích hợp sẽ mang lại lợi ích cho sức khoẻ vật chủ. Bởi vậy mà ngày càng có nhiều nghiên cứu về probiotic và các chế phẩm thƣơng mại có nguồn gốc từ chúng. Một trong số đó không thể không kể đến chủng nấm men probiotic là Saccharomyces boulardii.
Trên thế giới, Saccharomyces boulardii hiện đang đƣợc sử dụng rộng rãi trong sản xuất men tiêu hoá để phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh tiêu chảy ở ngƣời và vật nuôi. Đây cũng là loại men vi sinh duy nhất đƣợc chiết xuất từ nấm men. Ngoài khả năng giúp cân bằng hệ vi khuẩn đƣờng ruột tƣơng tự vi khuẩn lactic, nấm men này còn mang một ƣu điểm vƣợt trội là có thể đề kháng kháng sinh. Bên cạnh đó, Saccharomyces boulardii cũng đƣợc biết đến với khả năng ức chế các cytokine gây viêm bằng việc tiết ra nhiều loại proteases.
Một số nghiên cứu mới đây còn chỉ ra rằng khác với các loại nấm men họ hàng, S. boulardii có thể tồn tại đƣợc trong các môi trƣờng khắc nghiệt nhƣ: môi trƣờng axit dịch vị (pH thấp), axit mật hay ở môi trƣờng có nhiệt độ chênh lệch so với nhiệt độ phát triển bình thƣờng của vi sinh vật. Đây chính là cơ sở để Saccharomyces boulardii đƣợc lựa chọn làm thành phần trong các loại chế phẩm probiotic nhƣ: men vi sinh, phân bón vi sinh,… phục vụ đắc lực cho đời sống của con ngƣời. Chính vì những đặc tính hữu ích mà Saccharomyces boulardii mang lại nên việc nghiên cứu phát triển, kiểm tra và phát hiện sự có mặt của S.
boulardii chứa trong các chế phẩm probiotic là một khâu vô cùng quan trọng và cần thiết. Bởi 1 vậy, trong đề xuất này chúng tôi đã tiến hành phân lập và định danh các chủng Saccharomyces boulardii để hiểu rõ hơn về đặc điểm hình thái, phân loại cũng nhƣ xác định đƣợc mật độ của chúng trong một số chế phẩm probiotic. Mục tiêu của đề tài Phân lập và định danh chủng nấm men Saccharomyces boulardii từ một số mẫu chế phầm probiotic đồng thời xác định đƣợc mật độ của nấm S. boulardii chứa trong các mẫu nghiên cứu.
Yêu cầu của đề tài Phân lập đƣợc nấm Saccharomyces boulardii, định danh các chủng S. boulardii bằng phƣơng pháp giải trình tự gen vùng ITS. Xác định đƣợc một số đặc tính sinh học của nấm đồng thời kiểm tra mật độ nấm men Saccharomyces boulardii trong các mẫu chế phẩm probiotic bằng phƣơng pháp đếm tản nấm trên đĩa thạch. 2 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.
Giới thiệu chung về nấm men Saccharomyces boulardii. Lịch sử nghiên cứu Saccharomyces boulardii Vào những năm 1920, nhà sinh học ngƣời Pháp Henri Boulard đã thực hiện một chuyến đi vòng quanh Châu Á với mục đích tìm kiếm chủng vi sinh vật chịu nhiệt đƣợc dùng trong sản xuất rƣợu vang. Khi đặt chân đến Đông Nam Á, ông đã tận mắt chứng kiến đợt bùng phát ổ dịch tả lớn trong một ngôi làng. Nhờ sự kiện này, ông đã phát hiện ra ngƣời dân bản địa dùng một loại trà làm từ vỏ của trái vải và măng cụt để kiểm soát các triệu chứng của bệnh tả.
Sau đó, ông tiến hành nghiên cứu và phân lập đƣợc một chủng nấm men nhiệt đới thuộc loài Saccharomyces và dặt tên cho loài nấm men này là Saccharomyces boulardii. Bắt đầu từ năm 1980, hàng loạt các cuộc nghiên cứu về Saccharomyces boulardii đã đƣợc tiến hành để tìm hiểu về lợi ích của loài nấm này đối với vật chủ và cơ chế hoạt động của chúng. Phân loại Nguồn gốc phân loại của Saccharomyces boulardii dựa trên một số nghiên cứu (McFarland (1996); Mccullough et al. (1998); Hennequin et al.
(2001); Mitterdorfer et al. (2002)), cho thấy Saccharomyces boulardii thuộc: Giới : Nấm Ngành : Ascomycota Phân ngành : Saccharomycotina Lớp : Saccharomycetes Bộ : Saccharomycetales Họ : Saccharomycetaceae 3 2. Đặc điểm về hình thái, kích thƣớc, cấu tạo tế bào (Nguồn: https://www.au/blog-post/saccharomyces-boulardii-monograph). Hình ảnh minh hoạ nấm men Tế bào nấm men có hình elip, hình bầu dục hay đôi khi là hình cầu với vách tế bào dày (5 – 10 μm).
Thành tế bào chiếm khoảng 30% trọng lƣợng khô của tế bào, đƣợc cấu trúc bởi polysaccharide (85%) và protein (15%). Trong thành phần polysaccharomyces có glucose (80-91%), N – acetyglucosamine (GlcNAc) (1-2%), mannose (10 – 20%). Tế bào chất có chứa các aminoacid, vitamin B, enzyme và nhiều hợp chất khác (Lesage và cs. Cấu trúc hệ gen nấm Hệ gen của Saccharomyces boulardii gần giống với S.
cerevisiae – sinh vật có nhân điển hình. Trình tự bao gồm 13.275 gen, trong đó có 5885 gen mã hoá cho protein. Khoảng 140 gen mã hoá cho RNA ribosome (rRNA), 40 gen cho RNA thông tin (mRNA) và 275 gen cho RNA vận chuyển (tRNA). Khoảng 23% hệ gen của Saccharomyces boulardii giống hệt với bộ gen của con ngƣời (Goffcau và cs.
4 (Nguồn:https://www.com/search?q=genome+of+saccharomyces+boulardii&tbm=isch &ved=2ahUKEwja2eCum-z4AhUDTPUHHfHbAygQ2-cCegQIABAA&oq) Hình 2. Cấu trúc hệ gen Saccharomyces boulardii. Đặc điểm sinh học của nấm men Saccharomyces boulardii Saccharomyces boulardii là một loại nấm men nhiệt đới, chúng sinh trƣởng và phát triển tối ƣu ở nhiệt độ 37 độ C (nhiệt độ sinh lý bình thƣờng của cơ thể vật chủ, theo Czrucka và cs. boulardii còn có thể tồn tại đƣợc trong môi trƣờng khắc nghiệt (môi trƣờng axit dịch vị - pH thấp ở dạ dày, môi trƣờng muối mật ở ruột, môi trƣờng có phạm vi nhiệt độ rộng) và có khả năng đề kháng với kháng sinh.
Do đó nên Saccharomyces boulardii đã đƣợc lựa chọn là thành phần của nhiều loại chế phẩm probiotic, mang lại nhiều lợi ích cho sức khoẻ con ngƣời. Saccharomyces boulardii là loài nấm men yếm khí không bắt buộc (chúng có thể phát triển trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí). Loại nấm men này không có khả năng đồng hoá hay lên men đƣờng lactose nhƣng lại sinh trƣởng và phát triển tốt trên cơ chất chứa galactose hay glucose. Trong quá trình chuyển hoá carbohydrate, có sinh một lƣợng nhỏ acid lactic (1,04%) và rƣợu (0,5%).
5 Ngoài ra, Saccharomyces boulardii còn chuyển hoá đƣợc các monosaccharide, polysaccharide, oligosaccharide, ethanol, acetate, glycerol, pyruvate và lactate. Saccharomyces boulardii là vi sinh vật (VSV) dị dƣỡng, sử dụng năng lƣợng từ glucose qua con đƣờng glycolysis. Loài nấm men này cũng không thích sử dụng một số acid hữu cơ nhƣ: acid citric và acid succinic nhƣng tăng trƣởng tốt trên môi trƣờng chứa acid lactic và không thuỷ phân các hợp chất protein, lipid. Sinh sản ở nấm men Nấm men có 3 hình thức sinh sản: sinh sản sinh dƣỡng, sinh sản đơn tính và sinh sản hữu tính.
Sinh sản sinh dƣỡng là hình thức sinh sản đơn giản nhất. Ở nấm men, có hai hình thức sinh sản sinh dƣỡng đó là nảy chồi và phân đôi tế bào theo chiều ngang tƣơng tự nhƣ ở vi khuẩn. Tuy nhiên, nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến nhất ở nấm men. Ở điều kiện nhất định, nấm men sinh sôi nảy nở với tốc độ rất nhanh.
Lối phân cắt tế bào ở nấm men cũng tƣơng tự nhƣ ở vi khuẩn, quá trình này bắt đầu xuất hiện khi tế bào dài ra và ở giữa mọc ra vách ngăn chia tế bào làm hai phần bằng nhau, mỗi tế bào con chứa một nhân. Sinh sản đơn tính là quá trình tạo bào tử trực tiếp từ một tế bào đơn mà không cần qua quá trình tiếp hợp. Sinh sản hữu tính thƣờng hiếm thấy ở nấm men, nhƣng chúng lại mang một ƣu điểm là có thể tái tổ hợp các tính trạng di truyền từ thế hệ trƣớc. Quá trình sinh sản này xảy ra khi hai tế bào nấm men kết hợp với nhau để tạo thành hợp tử.
Hợp tử phân chia thành các bào tử trong nang. Sau đó, các bào tử sẽ tiếp tục phân chia và phát tán cho đến khi hai tế bào có kích thƣớc giống nhau tiếp hợp với nhau thì đƣợc gọi là tiếp hợp đẳng giao. Còn nếu hai tế bào nấm men khác nhau tiếp hợp với nhau thì đƣợc gọi là tiếp hợp dị giao. 6 (Nguồn: http://vietsciences.fr/khaocuu/nguyenlandung/vinam01b.
Một số hình thức sinh sản ở nấm men (Nguồn: https://healthvietnam.vn/thu-vien/tai-lieu-tieng-viet/ky-sinh-trung/dai-cuong-nam-y-hoc) Hình 2. Quá trình nảy chồi ở nấm men (A: Tế bào nấm men trưởng thành; B: Chồi mới bắt đầu hình thành trên chồi mẹ; C: Quá trình phân chia nhân và tế bào chất diễn ra; D: Chồi mới phát triển tới kích thước nhất định và chuẩn bị tách khỏi chồi mẹ; E: Chồi mới tách khỏi chồi mẹ khi đủ lớn). 7 a b c (Nguồn: https://voer.vn/m/phan-loai-nam-men/5fba489d) Hình 2. Một số kiểu nảy chồi điển hình ở nấm men (a): Nảy chồi đơn cực (b): Nảy chồi lưỡng cực (c): Nảy chồi đa cực 2.
Vai trò của nấm men Saccharomyces boulardii Các nghiên cứu đã chứng minh rằng Saccharomyces boulardii không chỉ mang lại hiệu quả đối với các bệnh liên quan đến đƣờng ruột mà còn là trợ thủ đắc lực đối với hệ miễn dịch: S. boulardii giữ vai trò quan trọng trong việc phát triển và hoạt động của hệ miễn dịch niêm mạc ruột, nó giúp hệ miễn dịch ruột sản sinh kháng thể IgA chống lại độc tố khi ruột nhiễm vi khuẩn gây bệnh (80% hệ miễn dịch của cơ thể nằm ở ruột). Theo nghiên cứu của Qamar và cs. (2000), nấm men Saccharomyces boulardii kích thích sản sinh một lƣợng lớn IgA – đóng vai trò quan trọng trong miễn dịch niêm mạc ruột.
Sự có mặt của S. boulardii sẽ tạo ra lƣợng kháng thể IgA lớn hơn so với các tác nhân khác. boulardii tiết ra polyamine (spermine và spermidine) trong quá trình vận chuyển qua đƣờng ruột để điều chỉnh tổng hợp gen và protein, kích thích hoạt động các enzyme ở niêm mạc đại tràng. Kích thích hệ miễn dịch tự nhiên: Kích hoạt hệ thống lƣới nội mô, gia tăng sự di cƣ của bạch cầu đơn nhân, bạch cầu hạt.
Hơn nữa, chúng còn làm gia tăng số lƣợng tế bào Kupfer (đại thực bào hình sao). 8 Ngăn ngừa dị ứng, Saccharomyces boulardii giúp hệ miễn dịch cơ thể phân biệt đƣợc giữa kháng nguyên bệnh và kháng nguyên vô hại. Nhờ đó ngăn ngừa hệ miễn dịch đáp ứng quá mẫn đối với kháng nguyên vô hại và không gây dị ứng. Theo Pothoulakis và cs.
(1993); Castagliuolo và cs. boulardii tiết ra protease 54kDa có vai trò ức chế độc tố (A và B) gây tiêu chảy ở ngƣời. Saccharomyces boulardii ức chế tăng trƣởng của C. dificile, có khả năng kích thích hoạt động niêm mạc của vật chủ để tăng cƣờng phản ứng miễn dịch niêm mạc ruột.