Mở đầu 1. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Nghiên cứu lý thuyết Thu thập tài liệu trong và ngoài nước có liên quan đến nội dung nghiên cứu. Tổng hợp phân tích, so sánh và đánh giá lựa chọn hướng nghiên cứu phù hợp.
Phân tích đánh giá điều kiện thực tế về kỹ thuật, kinh tế, xã hội để xác định giới hạn nghiên cứu và phương án thực nghiệm. Nghiên cứu thực nghiệm Lập kế hoạch thực hiện thí nghiệm. Xử lý kết quả bằng Excel và phần mềm Statgraphics. GIỚI HẠN ĐỀ TÀI Vì lý do giới hạn về thời gian và kinh tế, đề tài chỉ thực hiện tủa enzyme với ba tác nhân tủa (muối, cồn và aceton), tinh sạch enzyme bromelain trên Biogel P-100, điện di bằng phương pháp SDS-PAGE và chỉ thực hiện cố định enzyme trên cơ chất Natrialginate ở quy mô phòng thí nghiệm.
Trang 3 Chương 2: Tổng quan về vấn đề nghiên cứu CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2. SƠ LƯỢC VỀ CÂY DỨA Hình 2.1: Dứa trước khi thu hoạch Hình 2.2: Dứa sau khi thu hoạch 2. Lịch sử và sự phát triển của cây dứa Dứa là trái cây của miền nhiệt đới, có nguồn gốc từ các quốc gia Brazil, Paraguay ở Trung và Nam Mỹ. Khi Christopher Columbus (1451-1506) thám hiểm châu Mỹ, thấy dứa trồng ở quần đảo Guadeloup rất ngon, bèn mang về triều cống nữ hoàng Tây Ban Nha Isabella Đệ Nhất.
Từ đó, dứa được đem trồng ở các thuộc địa của Tây Ban Nha, nhất là các quốc gia thuộc khu vực Thái Bình Dương như Phi Luật Tân. Tiếng Anh của Dứa là Pinapple. Các nhà thám hiểm Tây Ban Nha thấy trái dứa nom giống như chốp quả thông, bèn đặt tên là “Pina”. Người Anh thêm chữ “Apple” để nói rõ hơn về tính ngọt dịu, ăn được của trái này.
Tiếng Việt còn gọi Dứa là trái Thơm hay Khóm, có lẽ vì hương thơm dìu dịu thoát ra từ trái dứa vừa chín tới. Trang 4 Chương 2: Tổng quan về vấn đề nghiên cứu Dứa là trái cây nhiệt đới, thích hợp với môi trường ẩm thấp, nhưng có thể chịu đựng tới nhiệt độ 280F (-20C), nhưng ở nhiệt độ lạnh, cây chậm lớn và trái chua. Nông trại trồng dứa quy mô lớn đầu tiên trên thế giới được thiết lập ở Hawaii vào năm 1885. Sau đó, Phi Luật Tân là nước trồng nhiều và sản xuất cảng nhiều nhất.
Các quốc gia khác ở Đông Nam Á cũng sản xuất một khối lượng dứa khá lớn. Dứa có quanh năm, nhưng nhiều nhất vào tháng 3 và tháng 7. Trung bình thời gian từ lúc trồng tới lúc thu hoạch là 18 tháng. Dứa thường được hái khi đã chín, sẵn sàng để ăn.
Hái khi dứa còn xanh, dứa sẽ không chín tiếp vì không có đủ tinh bột để chuyển thành đường. Ở Việt Nam, dứa được trồng rất nhiều ở Phú Thọ, Ninh Bình, Lâm Đồng, Long An, Kiên Giang, Cần Thơ. Dứa Bến Lức vẫn nổi tiếng khắp miền Nam. Mỗi trái dứa có thể nặng khoảng từ 1/2 kg đến 3 kg.
Thành phần dinh dưỡng trong dứa Dứa có nhiều sinh tố C, chất xơ pectin và chất gum. Thành phần dinh dưỡng trong 100g dứa: Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của 100g dứa Độ ẩm 81.2 g Tinh chất Ether 0.267 mg Ascorbic Acid 27.2 mg Trang 5 Chương 2: Tổng quan về vấn đề nghiên cứu 2. Các bộ phận trên cây dứa có thể cho enzyme bromelain 2. Quả Quả dứa thuộc loại quả tụ, do 100-200 quả nhỏ hợp lại.
Các giống khác nhau thì hình dạng quả và mắt quả cũng khác nhau. Bộ phận ăn được của quả dứa là do trục của chùm hoa và lá bắc phát triển nên. Sau khi hòa tàn thì quả bắt đầu phát triển. Đây là bộ phận cho nhiều enzyme bromelain nhất, chiếm 50% protein của quả dứa.
(Nguồn:http://www.uk/iubmb/enzyme/EC34/3422. Thân Thân cây dứa chia làm hai phần: một phần trên mặt đất và một phần dưới mặt đất. Phần ở trên thường bị các lá che kín nên khó nhìn thấy. Khi cây đã phát triển đến mức độ nhất định, có thể dùng các mầm ngủ trên các đốt để nhân giống.
Năm 1957, Heinicke nhận thấy trong thân cây dứa có một lượng lớn bromelain và người ta bắt đầu tìm cách tách chiết nó và sản xuất dưới dạng thuốc để chữa bệnh. (Nguồn:http://www.uk/iubmb/enzyme/EC34/3422. Lá Lá dứa mọc trên thân cây theo hình xoắn ốc. Lá thường dày, không có cuốn, hẹp ngang và dài.
Bề mặt và lưng lá thường có một lớp phấn trắng hoặc một lớp sáp có tác dụng làm giảm tốc độ bốc hơi nước ở lá. Các giống dứa thường có gai nhọn và cứng ở mép lá, nhưng cũng có giống lá không gai. Tuỳ theo giống, một cây dứa trưởng thành có khoảng 60-70 lá (Nguyễn Văn Kế, 2001). Đây cũng là nguồn có thể thu nhận được enzyme bromelain.
Rễ Rễ dứa gồm rễ cái và rễ nhánh (mọc ra từ phôi hạt); rễ bất định (mọc ra từ mầm rễ trên các đốt của các loại chồi dứa trước khi đem trồng). Rễ dứa thuộc loại ăn nông, Trang 6 Chương 2: Tổng quan về vấn đề nghiên cứu phần lớn do nhân giống bằng chồi nên mọc từ thân ra, rễ nhỏ và phân nhiều nhánh. Bộ rễ dứa thường tập trung ở tầng đất 10-26 cm và phát triển rộng đến 1 m (Nguyễn Văn Kế, 2001). Đây cũng là nguồn có thể thu nhận được enzyme bromelain.
GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ ENZYME Enzyme hay còn gọi là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. Enzyme có trong mọi cơ thể sinh vật, nó không những làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật (invivo) mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào (invitro). Vì có nguồn gốc từ sinh vật cho nên enzyme thường được gọi là chất xúc tác sinh học (biocatalisateur) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác. Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy ra trong điều kiện thường ở ngoài cơ thể (do cần nhiệt độ, áp suất cao, acid mạnh hay kiềm mạnh…) nhưng trong cơ thể nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện hết sức êm dịu, nhẹ nhàng (370C, áp suất thường, không kiềm mạnh hay acid mạnh…).
Đặc tính quan trọng nhất của enzyme là tính đặc hiệu. Tính đặc hiệu là khả năng xúc tác chọn lọc, xúc tác sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định: đặc hiệu cảm ứng và đặc hiệu cơ chất. Enzyme không thể tổng hợp bằng con đường hóa học. Do đó muốn thu nhận enzyme chỉ có con đường duy nhất là thu nhận từ cơ thể sinh vật.
Tất cả các tế bào động vật, thực vật, vi sinh vật đều chứa enzyme nhưng mức độ enzyme thì hoàn toàn khác nhau. Hiện nay người ta khai thác enzyme từ ba nguồn cơ bản: Động vật (hạn chế) Thực vật (hạn chế) Vi sinh vật (phổ biến) Trang 7 Chương 2: Tổng quan về vấn đề nghiên cứu Việc khai thác enzyme từ động vật và thực vật rất phức tạp vì nguồn nguyên liệu thu nhận khó khăn, hiệu suất thấp dẫn đến giá thành cao nên hạn chế. Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật có những ưu điểm như sau: Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng và phát triển rất ngắn. Hệ enzyme của vi sinh vật vô cùng phong phú.
Việc cải tạo giống vi sinh vật để tạo ra những chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp ra các loại enzyme theo ý muốn được thực hiện một cách dễ dàng trong một thời gian ngắn vì khả năng thích ứng môi trường của vi sinh vật là rất cao. Vi sinh vật có tốc độ sinh sản cực nhanh Vi sinh vật không đòi hỏi nghiêm ngặt về môi trường dinh dưỡng nên có thể tận dụng những phụ phế liệu công nông nghiệp để sản xuất enzyme và có thể dễ dàng điều khiển các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy để có thể thu được hiệu suất cao trong sản xuất. Sản xuất enzyme từ vi sinh vật hoàn toàn có thể thực hiện theo quy mô công nghiệp. ENZYME PROTEASE Enzyme protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-) của phân tử protein và peptide thành các acid amin tự do, một peptide ngắn,pepton.
Giới thiệu sơ lược các Enzyme protease 2. Protease vi sinh vật Protease từ vi khuẩn Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm Trang 8 Chương 2: Tổng quan về vấn đề nghiên cứu khoảng 59% lượng enzyme được sử dụng. Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium.
subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998). Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu. Protease từ nấm Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. saitoi, Penicillium chysogenum… Protease từ xạ khuẩn Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc.
Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. Protease động vật - Tụy tạng: Đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều enzymenhất. - Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm Protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ phomat.
Renin làm biến đổi casein thành paracasein có khả năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+. Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất. Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiễm pepsin thì khả năng đông tụ sữa kém đi. Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus.
Trang 9 Chương 2: Tổng quan về vấn đề nghiên cứu Bảng 2.2: Protease động vật Protease pH Chất hoạt hóa Pepsin 1,5 – 4,0 H+, protease Chymosin 5–6 Ca2+ Trypsin 6,5 – 9,0 Enserkinase, Ca2+ Chymotrypsin 7,0 – 8,5 Ca2+ Carboxypeptidase 6,0 – 8,5 Trypsin Aminopeptidase 6,5 – 8,0 - 2. Protease thực vật Protease thực vật tập trung chủ yếu ở một số cây vùng nhiệt đới như đu đủ, dứa, cây sung, articho và đậu tương. Tất cả protease thực vật đều cùng thuộc một nhóm enzyme chứa gốc – SH trong tâm hoạt động. Thí dụ: papain từ mủ đu đủ, bromelain từ dứa, ficin từ quả sung.