CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC Bùi Thị Thúy Quỳnh Page 9 Viện đại học Mở Hà Nội CỦA ĐỀ TÀI I. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng hoạt chất sinh học Sulforaphane trên Thế giới A. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 1. Sự hình thành, cấu trúc hóa học và tính chất hóa lý a) Sự hình thành: Hình 1.
Quá trình chuyển hóa Glucoraphanin thành Sulforaphane trong thực vật [1] Glucoraphanin là một glucosinolate được tìm thấy có hàm lượng cao trong các giống rau bông cải xanh (Brassica oleracea italica) và các loại rau khác của họ rau cải. Tất cả các glucosinolate đều bao gồm một cấu trúc cơ bản là một nhóm β-D-thioglucose, một nhóm oxime sulfonat hóa và một chuỗi bên axit amin. Glucosinolate cần phải được thủy phân enzyme để trở thành isothiocyanate có hoạt tính. Sulforaphane (C6H11NOS2) là isothiocyanate có hoạt tính sinh học được hình thành khi glucoraphanin được chuyển hóa bởi enzyme myrosinase.
Quá trình chuyển hóa glucoraphanin nêu trên Hình 1. b) Tên gọi: 1-Isothiocyanato-4-(methylsulfinyl)-Butane, 1-Isothiocyanato-4- (methylsulfinyl)butane, 4-Methylsulfinyl butyl isothiocyanate, DL-sulforaphane, SFN, Sulforafan, Sulforaphane, Sulforathane. c) Cấu trúc: Bùi Thị Thúy Quỳnh Page 10 Viện đại học Mở Hà Nội d) Công thức hóa học: C6H11NOS2 e) Khối lượng phân tử trung bình: 177.288 g) Số đăng ký CAS: 4478-93-7 h) Trạng thái vật lý: Chất lỏng không mùi, màu vàng sáng. i) Tính chất: Hòa tan trong nước lạnh, methanol, dimethyl sulfoxide (DMSO) và chloroform.
Phân bố trong tự nhiên Sulforaphane (SFN) đã được xác định trong mầm bông cải xanh, là rau thuộc họ cải, có hàm lượng SFN cao nhất. Nó cũng được tìm thấy trong cải brussel, cải bắp, súp lơ, rau cải, cải xoăn, bông cải xanh Trung Quốc, su hào, mù tạt, củ cải, rau arugula, và cải xoong [15]. Các hợp chất glucosinolate tìm thấy trong rau họ cải này mang lại hương vị đặc biệt của chúng. Mầm cải xanh 3 ngày tuổi là nguồn giàu glucoraphanin với hàm lượng glucoraphin gấp 10-100 lần về khối lượng khi so sánh với cải xanh trưởng thành.
Mầm cải xanh có chứa 73 mg glucoraphanin trên 1 auxơ (28,3 gam). Các loại rau họ cải thường chứa các loại glucosinolate khác nhau và mỗi loại khi bị thủy phân lại hình thành các isothiocyanate khác nhau. Ví dụ: cải xanh là 1 nguồn giàu glucoraphanin, đây là tiền chất của SFN và sinigrin, là tiền chất của allyl isothiocyanate (IAITC). Cải xoong là nguồn giàu gluconasturtin, là tiền chất của phenethyl isothicyanate (PEITC).
Mầm rau cải là nguồn giàu glucotropaeolin, là tiền chất của benzyl isothiocyanate (BITC). Hiện tại, các nhà khoa học quan tâm nhiều đến hoạt tính ngăn chặn ung thư của rau họ cải giàu các glucosinolate và các isothiocyanate. Hàm lượng SFN trong mầm súp lơ (1153 mg/100g trọng lượng khô) cao gấp 10 lần ở trong hoa súp lơ chín thu hoạch (44-171 mg/100g) [16]. Bùi Thị Thúy Quỳnh Page 11 Viện đại học Mở Hà Nội Không giống như một số chất có nguồn gốc thực vật khác, lượng glucosinolate trong khẩu phần ăn các loại rau họ cải thường ở nồng độ tương đối cao.
Ví dụ ½ chén cải xanh tươi có thể cung cấp hơn 25 mg các loại glucosinolate. Lượng các isothiocyanate hình thành từ các glucosinolate trong thực phẩm thì không đồng nhất và phụ thuộc 1 phần vào quá trình xử lý và chế biến thực phẩm. Các glucosinolate là những hợp chất tan trong nước nên có thể hòa tan vào nước khi nấu. Nấu các loại rau cải xanh trong 9-15 phút sẽ làm giảm 18-59% lượng các glucosinolate tổng số trong rau.
Các phương pháp nấu sử dụng ít nước như hấp, vi sóng có thể làm giảm lượng glucosinolate bị mất. Mặc dù vậy các cách nấu như luộc, hấp và vi sóng ở công suất sao (750-900W) có thể gây bất hoạt myrosinase trong cây có tác dụng xúc tác quá trình thủy phân glucosinolate. Tính chất dược lý có lợi cho sức khỏe của Sulforaphane a) Tác dụng trong phòng và điều trị ung thư: Nghiên cứu cận lâm sàng và trên động vật: Trong nhiều nghiên cứu vitro các dòng tế bào ruột kết, ung thư máu, tụy, phổi và ung thư da đã chứng minh tác dụng ức chế của SFN về bắt giữ vòng đời tế bào. Khả năng của Sulforaphane phá vỡ sự polyme hóa tubulin và ức chế phân bào cũng đã được chứng minh trong các mô hình động vật mắc bệnh ung thư vú.
Ức chế histone deacetylase và tăng sự chết tế bào trong ruột kết, tuyến tiền liệt, và các dòng tế bào thận cũng đã được báo cáo. Trong một nghiên cứu thử nghiệm lớn bao gồm 3 nhóm tình nguyện viên khỏe mạnh (tuổi từ 18-55), với liều dùng một lần mỗi ngày 68g BroccoSprouts® (khoảng 105mg SFN) đã ức chế đáng kể hoạt tính của HDAC trong máu ngoại vi nuôi cấy tế bào đơn nhân sau 3 và 6 giờ dùng thuốc. Điều này chứng tỏ SFN có thể tạo ra sự bắt giữ vòng đời tế bào và quá trình chết tế bào ở người [17]. Bùi Thị Thúy Quỳnh Page 12 Viện đại học Mở Hà Nội Ở những con chuột với bệnh ung thư tuyến tiền liệt gây thực nghiệm, 6 micro-mol Sulforaphane cho uống qua miệng, 3 lần một tuần từ sáu tuần tuổi trở đã làm giảm tỷ lệ di căn phổi 50%.
Mẫu mô tuyến tiền liệt cho thấy giảm tăng sinh tế bào và tăng độ chết tế bào khi so sánh với nhóm chuột đối chứng. Phối tử gây chết tế bào liên quan đến yếu tố hoại tử khối u (TRAIL) đã gây ra sự chết tế bào trong một loạt các tế bào ung thư. Trong một mô hình chuột bị ung thư tuyến tiền liệt, những con chuột đực mang khối u đã được dùng SFN (40 mg/kg), TRAIL + SFN (40 mg/kg), TRAIL (15 mg/kg) tại những khoảng thời gian khác nhau trong bốn tuần. Mặc dù SFN và TRAIL đều làm giảm tốc độ tăng trưởng khối u, nhưng sự kết hợp của Sulforaphane và TRAIL có hiệu quả hơn, cho thấy SFN có tác dụng tốt đối với TRAIL [18].
Sơ đồ các tác dụng ức chế phát triển khối u của SFN Các nghiên cứu lâm sàng: Quan sát trực tiếp đầu tiên tác dụng ức chế của SFN tới ung thư ở người đã được thực hiện với 200 người lớn khỏe mạnh (tuổi từ 25-65) ở tỉnh Giang Tô của Trung Quốc, một khu vực có tỷ lệ cao về ung thư biểu mô tế bào gan do tiếp xúc quá mức với thực phẩm chứa nhiều aflatoxin và bị bệnh viêm gan B nhiễm trùng mãn tính. Mục tiêu của thử nghiệm là xác định tác dụng của dịch mầm bông cải xanh (chứa 400 micro-mol glucoraphanin) thông qua chỉ tiêu làm giảm sản phẩm cộng AND do aflatoxin - một chỉ số về tổn thương DNA qua bài tiết Bùi Thị Thúy Quỳnh Page 13 Viện đại học Mở Hà Nội nước tiểu. Kết quả cho thấy có một tương quan nghịch giữa sự bài tiết của dithiocarbamates (chất chuyển hóa isothiocyanate của glucoraphanin) và sản phẩm cộng DNA ở những bệnh nhân được điều trị bằng dịch mầm bông cải xanh [19]. b) Phòng và điều trị bệnh tim mạch và tăng huyết áp Glucoraphanin và Sulforaphane đủ khả năng bảo vệ tim mạch thông qua các tính chất chống oxy hóa và chống viêm của chúng, dẫn đến giảm stress oxy hóa, cải thiện công thức lipid và giảm huyết áp.
Thử nghiệm giai đoạn 1 liên quan đến hút thuốc lá (sáu người đàn ông và sáu phụ nữ) để điều tra mức sử dụng 100g mầm bông cải xanh tươi hàng ngày (hàm lượng Glucoraphanin/ Sulforaphane không quy định) trong một tuần ảnh hưởng đến dấu hiệu stress oxy hóa và giá trị cholesterol. Mức cholesterol, axit amin trong huyết tương, hoạt tính giết tế bào tự nhiên, coenzyme huyết thanh Q10 và các dấu hiệu của stress oxy hóa là phosphatidyl choline-hydroperoxide (PCOOH) huyết tương, 8- iso-prostane nước tiểu, 8-hydroxy-deoxyguanosine nước tiểu được đo trước và sau điều trị. Chỉ sau một tuần sử dụng mầm bông cải xanh, tất cả các đối tượng đã chứng minh giảm tổng số và LDL-cholesterol và giảm tất cả các dấu hiệu căng thẳng oxy hóa [20]. c) Chống viêm đường hô hấp trên Các hạt bụi từ khí thải động cơ diesel trong không khí là nguyên nhân làm tăng bệnh phổi và bệnh tim mạch vì gây stress oxy hóa.
SFN ức chế sự sản xuất cytokine trong tế bào biểu mô đường hô hấp của người tiếp xúc với phế thải dầu diesel qua sự cảm ứng của các gen enzyme giai đoạn 2 NQO1 và glutathione-S- transferase M1. Trong nghiên cứu đầu tiên để chứng minh khả năng điều hòa của Sulforaphane trong đường hô hấp của người, Reidl và cs đã cho sử dụng sản phẩm BroccoSprouts® (BSH) ở 57 tình nguyện viên khỏe mạnh (tuổi trung bình 34) với liều lượng tăng dần (25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 và 200g). Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự tăng đáng kể về glutathione-S-transferases, HO-1 và Bùi Thị Thúy Quỳnh Page 14 Viện đại học Mở Hà Nội NQO1 ở liều lượng 200g BSH so với nhóm đối chứng dùng giả dược. Tất cả các liều được dung nạp tốt và không có tác dụng phụ nghiêm trọng [22].
d) Chống viêm khớp dạng thấp Viêm khớp dạng thấp (RA) liên quan đến việc mở rộng như khối u của màng hoạt dịch đặc trưng bởi tăng sinh synoviocyte, xâm nhập của các tế bào T và B, và tăng interleukin (IL) -6, -8, và -17. Điều trị RA, do đó, liên quan đến việc cần ức chế sự tăng sinh synoviocyte và sản xuất cytokine. Do đặc tính “như khối u" của synoviocyte và vai trò của chất này đối với tiến triển RA, Kong và cs đã nghiên cứu tác động của SFN đối với synoviocyte trong một mô hình chuột bị RA. SFN được cho uống ở chuột đực nồng độ 12,8; 63,8 và 318,8 mg/ml/kg mỗi ngày trong năm tuần.
Kết quả cho thấy SFN giảm tỷ lệ sống synoviocyte lên đến 51% so với ban đầu, giảm đáng kể IL-17 và TNF-α, và áp chế các phản ứng tăng sinh trong các tế bào đa nhân trung tính ở mức cơ bản. Kiểm tra mô học cho thấy ít viêm, ít tăng sản hoạt dịch và ít phá hủy xương ở những con chuột được điều trị bằng SFN so với nhóm đối chứng [23]. Cơ chế tác dụng của Sulforaphane a) Chất chống ô xy hóa gián tiếp và giải độc tố gây ung thư Sulforaphane là một chất cảm ứng mạnh của các enzym pha 2 phụ thuộc vào Nrf2 (ery-throid-derived 2) tham gia vào giải độc xenobiotic. Các enzyme cảm ứng bởi SFN bao gồm thành phần đáp ứng chất chống oxy hóa (ARE) nhằm vào: NQO1, 4γ-glutamylcysteine synthetase (GGCS), HO-1, 32 glutathione transferases (GST), transferases glucuro-nosyl, và hydrolases epoxide.
Các enzym này được quy định bởi các yếu tố chuyển nạp Nrf2, được giải phóng từ protein 1 liên kết với ECH kiểu Kelch (KEAP1), gắn kết vào các vị trí ARE trong các gen của enzyme và tiếp tục điều khiển khử độc chất gây ung thư.