Luận văn thạc sĩ nghiên cứu khả năng nhân giống cây giảo cổ lam gynostemma pentaphyllum bằng phương pháp in vitro

Nghiên cứu nhân giống cây giảo cổ lam Gynostemma Pentaphyllum bằng phương pháp in vitro, ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại trong bảo tồn và phát triển dược liệu quý.

• Tác giả: Phạm Thị Hiệng
• Người hướng dẫn: TS. Ngô Xuân Bình
• Trường học: Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu khả năng nhân giống cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) bằng phương pháp in vitro
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích nghiên cứu
• 1.2. Yêu cầu của đề tài
• 1.3. Ý nghĩa của đề tài
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Khái quát về cây Giảo cổ lam
• 2.2. Nguồn gốc phân bố của cây Giảo cổ lam
• 2.3. Phân loại
• 2.4. Đặc điểm thực vật học của cây Giảo cổ lam
• 2.5. Điều kiện sinh thái của cây Giảo cổ lam
• 2.6. Vị trí cây Giảo cổ lam trong hệ thống thực vật học và cây dược liệu
• 2.7. Nghiên cứu về giá trị y học của Giảo cổ lam
• 2.7.1. Thành phần hóa học
• 2.7.2. Tác dụng dược lý
• 2.7.2.1. Tác dụng đến chuyển hóa lipit và đường huyết
• 2.7.2.2. Tác dụng đến tim mạch
• 2.7.2.3. Tác dụng đến hệ thần kinh trung ương
• 2.7.2.4. Tác động đến chức năng miễn dịch và chống khối u
• 2.7.3. Công dụng
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu
• 3.2. Hóa chất và thiết bị
• 3.3. Điều kiện nuôi cấy
• 3.4. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
• 3.5. Nội dung nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Nội dung nghiên cứu
• 3.5.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.3. Thu thập số liệu
• 3.6. Các chỉ tiêu theo dõi
• 3.7. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn cây Giảo cổ lam
• 4.2. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng môi trường MS, ½ MS đến khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam (sau 20 ngày nuôi cấy)
• 4.3. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng kinetin đến cảm ứng chồi Giảo cổ lam
• 4.4. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng kinetin tốt nhất kết hợp với hàm lượng BA thích hợp đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam
• 4.5. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng kinetin tốt nhất kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh giống Giảo cổ lam
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• LỜI CAM ĐOAN

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung vào nhân giống cây Giảo cổ lam (Gynostemma Pentaphyllum) bằng phương pháp in vitro. Giảo cổ lam là một loại cây dược liệu quý, có giá trị y học cao, được sử dụng trong nhiều bài thuốc truyền thống. Tuy nhiên, do khai thác quá mức, nguồn Giảo cổ lam trong tự nhiên đang bị đe dọa. Phương pháp in vitro được lựa chọn để nhân giống cây một cách hiệu quả, đảm bảo sản xuất số lượng lớn cây giống đồng đều và sạch bệnh. Nghiên cứu này nhằm xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô, bao gồm thời gian khử trùng, hàm lượng môi trường dinh dưỡng, và các chất kích thích sinh trưởng.

1.1. Mục đích nghiên cứu

Mục đích chính của nghiên cứu là tìm ra quy trình nhân giống cây Giảo cổ lam bằng phương pháp in vitro. Quy trình này sẽ giúp tạo ra số lượng lớn cây giống đồng đều, sạch bệnh, phục vụ cho mục đích bảo tồn và sản xuất dược liệu. Nghiên cứu cũng nhằm xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái sinh chồi, nhân nhanh chồi, và ra rễ của cây.

1.2. Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo tồn và phát triển nguồn cây dược liệu Giảo cổ lam. Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở cho các ứng dụng thực tiễn trong công nghệ sinh học, đặc biệt là trong lĩnh vực nuôi cấy mô thực vật. Đồng thời, nghiên cứu cũng góp phần nâng cao hiểu biết về sinh sản thực vật và các kỹ thuật nhân giống cây hiện đại.

II. Tổng quan về cây Giảo cổ lam

Giảo cổ lam (Gynostemma Pentaphyllum) là một loại cây dược liệu thuộc họ Cucurbitaceae, có nguồn gốc từ các vùng núi ở Trung Quốc, Nhật Bản, và Đông Nam Á. Cây được biết đến với nhiều tên gọi khác như Thất diệp đởm, cây trường sinh, và cây cỏ thần kỳ. Giảo cổ lam chứa hơn 100 loại saponin, trong đó nhiều loại có cấu trúc tương tự như saponin trong nhân sâm và tam thất. Ngoài ra, cây còn chứa flavonoid, một chất có khả năng chống lão hóa mạnh và tăng cường sức khỏe.

2.1. Đặc điểm thực vật học

Giảo cổ lam là cây thân thảo, có tua cuốn để leo. Lá cây có hình chân vịt, mỗi lá gồm từ 3-7 lá chét. Hoa nhỏ, màu trắng, hình sao, và quả khô, tròn, có màu đen khi chín. Cây sinh trưởng tốt trong điều kiện ẩm ướt và ánh sáng tán xạ, thường mọc trong rừng hoặc trên các vách đá.

2.2. Giá trị y học

Giảo cổ lam được sử dụng trong nhiều bài thuốc truyền thống với các tác dụng như hạ lipid máu, ổn định huyết áp, chống lão hóa, và ngăn ngừa ung thư. Các nghiên cứu khoa học đã chứng minh rằng saponin và flavonoid trong cây có tác dụng dược lý mạnh, giúp cải thiện sức khỏe tim mạch và hệ thần kinh.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng phương pháp in vitro để nhân giống cây Giảo cổ lam. Các bước chính bao gồm khử trùng mẫu cây, tái sinh chồi, nhân nhanh chồi, và ra rễ. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô được xác định thông qua các thí nghiệm với các hàm lượng môi trường dinh dưỡng khác nhau (MS, 1/2MS) và các chất kích thích sinh trưởng như kinetin, BA, và NAA.

3.1. Khử trùng mẫu cây

Mẫu cây được khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% để loại bỏ nấm và vi khuẩn. Thời gian khử trùng được điều chỉnh để đảm bảo mẫu cây sạch bệnh mà không bị tổn thương.

3.2. Tái sinh chồi

Mẫu cây sau khi khử trùng được nuôi cấy trên môi trường MS và 1/2MS để tái sinh chồi. Hàm lượng kinetin được điều chỉnh để tối ưu hóa quá trình cảm ứng chồi.

3.3. Nhân nhanh chồi

Chồi tái sinh được nhân nhanh bằng cách sử dụng kết hợp kinetin với BA hoặc NAA. Các thí nghiệm được thực hiện để xác định hàm lượng tối ưu của các chất kích thích sinh trưởng.

3.4. Ra rễ

Chồi được chuyển sang môi trường có bổ sung IBA để kích thích ra rễ. Hàm lượng IBA được điều chỉnh để đảm bảo tỷ lệ ra rễ cao và rễ phát triển khỏe mạnh.

IV. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian khử trùng tối ưu là 10 phút, giúp loại bỏ hoàn toàn nấm và vi khuẩn mà không gây tổn thương mẫu cây. Môi trường MS với hàm lượng kinetin 1.0 mg/l cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất. Kết hợp kinetin với BA ở hàm lượng 0.5 mg/l giúp nhân nhanh chồi hiệu quả. Hàm lượng IBA 0.1 mg/l cho tỷ lệ ra rễ cao và rễ phát triển khỏe mạnh.

4.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng

Thời gian khử trùng 10 phút là tối ưu, giúp mẫu cây sạch bệnh mà không bị tổn thương. Thời gian ngắn hơn không đảm bảo loại bỏ hoàn toàn nấm và vi khuẩn, trong khi thời gian dài hơn gây tổn thương mẫu cây.

4.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng

Môi trường MS cho tỷ lệ tái sinh chồi cao hơn so với 1/2MS. Hàm lượng kinetin 1.0 mg/l là tối ưu cho quá trình cảm ứng chồi.

4.3. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng

Kết hợp kinetin với BA ở hàm lượng 0.5 mg/l giúp nhân nhanh chồi hiệu quả. Hàm lượng IBA 0.1 mg/l cho tỷ lệ ra rễ cao và rễ phát triển khỏe mạnh.

V. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã xác định được quy trình nhân giống cây Giảo cổ lam bằng phương pháp in vitro hiệu quả. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô đã được xác định, bao gồm thời gian khử trùng, hàm lượng môi trường dinh dưỡng, và các chất kích thích sinh trưởng. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo tồn và phát triển nguồn cây dược liệu Giảo cổ lam, đồng thời góp phần nâng cao hiểu biết về sinh sản thực vật và công nghệ sinh học.

5.1. Kết luận

Nghiên cứu đã thành công trong việc xác định quy trình nhân giống cây Giảo cổ lam bằng phương pháp in vitro. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô đã được xác định và tối ưu hóa.

5.2. Kiến nghị

Cần tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện quy trình nhân giống cây Giảo cổ lam, đồng thời ứng dụng các kết quả nghiên cứu vào thực tiễn sản xuất dược liệu. Ngoài ra, cần mở rộng nghiên cứu về các loại cây dược liệu khác để góp phần bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên thực vật quý giá.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Công nghệ sinh học của tác giả Phạm Thị Hiệng, thực hiện tại Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên (năm 2015) dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Ngô Xuân Bình và ThS. Nguyễn Thị Tình, tập trung vào đề tài: "Nghiên cứu khả năng nhân giống cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) bằng phương pháp in vitro".

Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino) thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae), là loài dược liệu quý chứa hơn 100 loại saponin (nhiều loại có cấu trúc tương tự ginsenoside trong nhân sâm và tam thất) cùng hàm lượng cao flavonoid. Dược liệu này có tác dụng hạ mỡ máu, ổn định huyết áp, hạ đường huyết, chống oxy hóa, hỗ trợ điều trị bệnh tim mạch và hạn chế sự phát triển của một số dòng tế bào khối u. Nhu cầu khai thác thương mại để làm trà, thuốc đông dược và thực phẩm chức năng ngày càng tăng khiến các quần thể Giảo cổ lam tự nhiên tại vùng núi đá vôi phía Bắc (Lào Cai, Cao Bằng, Bắc Kạn...) bị suy giảm nghiêm trọng. Loài cây này đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam (phân hạng IUCN 1994: EN A1a,c,d). Phương pháp nhân giống truyền thống bằng hạt bị hạn chế bởi tính phân ly di truyền, hạt nhanh mất sức nảy mầm và thời gian ngủ nghỉ kéo dài; trong khi phương pháp giâm cành hom thông thường dễ tích lũy và lây truyền mầm bệnh qua các thế hệ. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) là giải pháp tối ưu nhằm sản xuất số lượng lớn cây giống đồng đều, sạch nấm khuẩn và bảo tồn nguồn gen quý.

Mục tiêu chung của nghiên cứu là tìm ra quy trình nhân nhanh giống Giảo cổ lam bằng phương pháp in vitro. Cụ thể, tác giả xác định 4 nhiệm vụ nghiên cứu:

1. Xác định ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn cây Giảo cổ lam.
2. Xác định ảnh hưởng của hàm lượng môi trường MS đến khả năng tái sinh chồi cây Giảo cổ lam.
3. Xác định ảnh hưởng của hàm lượng một số chất kích thích sinh trưởng (Kinetin, BA, NAA) đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam.
4. Xác định ảnh hưởng của hàm lượng auxin (IBA) đến khả năng ra rễ cây Giảo cổ lam.

Đối tượng nghiên cứu là loài Giảo cổ lam 5 lá (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino) thu thập tại tỉnh Bắc Kạn và Thái Nguyên, sau đó trồng tại vườn lan thuộc Khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Mẫu vật liệu cấy ban đầu là các đoạn thân non mang mắt ngủ ở nách lá. Không gian thực nghiệm diễn ra tại Phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật của Khoa, thời gian thực hiện từ tháng 12/2014 đến tháng 05/2015.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên nguyên lý tính toàn năng của tế bào thực vật (Murashige & Skoog, 1962), cơ chế phân hóa và phản phân hóa tế bào dưới sự điều tiết của các nhóm phytohormone ngoại sinh. Tác giả vận dụng quy luật tương quan nồng độ giữa nhóm cytokinin (Kinetin, 6-Benzylaminopurine - BA) và auxin (α-Naphthalene acetic acid - NAA, Indole-3-butyric acid - IBA) để định hướng phát sinh hình thái chồi bất định và hình thành rễ.

Môi trường dinh dưỡng cơ bản được sử dụng xuyên suốt là Murashige & Skoog (MS, 1962), chứa đầy đủ khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin nhóm B (B1, B3, B6), bổ sung myo-inositol 100 mg/l, đường saccharose 30 g/l và agar 5 g/l để làm đông môi trường. Độ pH được chuẩn hóa ở mức 5,6 - 5,8 trước khi hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút. Điều kiện phòng nuôi cấy được kiểm soát ổn định: nhiệt độ 25 ± 2°C, chu kỳ chiếu sáng 16 giờ sáng và 8 giờ tối, cường độ chiếu sáng 2000 - 2500 lux, độ ẩm phòng nuôi 60 - 65%.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được thiết kế theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn (CRD):

• Khử trùng mẫu: Mẫu mắt ngủ được làm sạch sơ bộ bằng xà phòng loãng, tráng nước sạch, xử lý bề mặt bằng cồn 70° trong 45 giây trong tủ cấy vô trùng cấp II, rửa 3 - 4 lần bằng nước cất khử trùng, sau đó ngâm dung dịch HgCl2 0,1% theo các mốc thời gian 0 (đối chứng), 5, 7, và 10 phút, rồi tráng lại 5 - 7 lần bằng nước cất vô trùng.
• Tái sinh và cảm ứng chồi: So sánh môi trường dinh dưỡng MS nguyên nồng độ và 1/2 MS. Khảo sát bổ sung Kinetin đơn lẻ ở các dải nồng độ 0,0; 0,2; 0,4; 0,5; 1,5 mg/l (theo dõi sau 20 ngày nuôi cấy).
• Nhân nhanh chồi: Bổ sung tổ hợp Kinetin (nồng độ tối ưu 0,5 mg/l) kết hợp với BA (0,0; 0,1; 0,3; 0,5; 1,0 mg/l) hoặc kết hợp với NAA (0,0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 mg/l), theo dõi sau 30 ngày nuôi cấy.
• Kích thích tạo rễ in vitro: Bổ sung IBA ở các mức 0,0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 mg/l (hoặc dải kiểm tra lên tới 1,0 mg/l), theo dõi sau 30 ngày nuôi cấy.

Mỗi công thức thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần từ 10 đến 15 mẫu. Số liệu định lượng được tổng hợp bằng Microsoft Excel 2007 và xử lý thống kê bằng phần mềm IRRISTART 4.0; phân tích sai khác giữa các giá trị trung bình bằng phép thử LSD (Least Significant Difference) ở mức ý nghĩa p = 0,05 (độ tin cậy 95%) cùng hệ số biến động CV%.

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Phần này trình bày lý do chọn đề tài dựa trên hiện trạng cạn kiệt nguồn tài nguyên Giảo cổ lam ngoài tự nhiên và nhu cầu nguyên liệu sạch bệnh cho ngành dược phẩm. Tác giả xác định mục tiêu xây dựng quy trình nhân giống vô tính in vitro từ đoạn thân non mang mắt ngủ, phân kỳ thành 4 nội dung kỹ thuật tương ứng với 4 giai đoạn sinh trưởng mô tế bào, đồng thời khẳng định ý nghĩa khoa học và thực tiễn của công trình.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa các tư liệu khoa học về cây Giảo cổ lam: vị trí phân loại học (ngành Ngọc lan, lớp Ngọc lan, họ Bầu bí Cucurbitaceae, chi Gynostemma, loài G. pentaphyllum), đặc điểm hình thái thân thảo leo có tua cuốn, lá kép chân vịt 5 lá chét, hoa đơn tính khác gốc và quả mọng hình cầu. Tổng quan nêu bật các nghiên cứu hóa thực vật xác định 15 nguyên tố vô cơ và hơn 100 loại saponin dammaran (gypenoside, phanoside) có hoạt tính kích thích giải phóng insulin, hạ cholesterol, bảo vệ cơ tim và ức chế tế bào ung thư. Phần này cũng phân tích cơ sở sinh lý nuôi cấy mô (tính toàn năng, phân hóa tế bào, vai trò của auxin và cytokinin ngoại sinh) và tổng kết các công trình nhân giống Giảo cổ lam trong và ngoài nước của Zhang (1989), Anchalee Jale (2012), Phạm Thanh Kỳ (2000, 2007) và Viện Dược liệu.

Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Nội dung chương mô tả chi tiết nguồn gốc vật liệu thực vật (Bắc Kạn, Thái Nguyên), thông số kỹ thuật của trang thiết bị thí nghiệm (tủ cấy Airtech, máy đo pH Hanna HI2210, nồi hấp ALP, cân phân tích Olhous-Vietlabcu, tủ sấy Memmert). Chương này cung cấp công thức tính toán tường minh cho các chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu chết (%), tỷ lệ mẫu nhiễm vi khuẩn/nấm (%), tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%), tỷ lệ tái sinh chồi (%), hệ số nhân chồi (số chồi thu được trên tổng số mẫu cấy), số rễ trung bình trên cây và tiêu chí định tính phân loại chất lượng chồi (tốt, trung bình, kém) cùng chất lượng rễ (tốt, trung bình, kém).

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 là phần nội dung thực nghiệm trọng tâm, trình bày dữ liệu đo đạc cụ thể qua 5 thí nghiệm riêng biệt:

1. Hiệu quả khử trùng mẫu vật liệu bằng HgCl2 0,1% (sau 10 ngày): Đối chứng không xử lý HgCl2 có tỷ lệ nhiễm đạt 100%. Khi xử lý HgCl2 0,1% trong 5 phút, tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt cao nhất là 86,67% (tỷ lệ chết 6,67%, tỷ lệ nhiễm 6,67%). Khi kéo dài thời gian khử trùng lên 7 phút và 10 phút, độc tính của thủy ngân clorua làm tăng tỷ lệ mẫu chết lên tương ứng 8,89% và 77,05%, khiến tỷ lệ mẫu sống không nhiễm giảm mạnh xuống 20,00% và 17,77%.

Công thức	Thời gian ngâm HgCl2 0,1% (phút)	Tổng số mẫu (mẫu)	Tỷ lệ mẫu chết (%)	Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)	Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%)
CT1 (Đ/C)	0	45	0,00	100,00	0,00
CT2	5	45	6,67	6,67	86,67
CT3	7	45	8,89	71,11	20,00
CT4	10	45	77,05	5,12	17,77

2. Ảnh hưởng của môi trường MS và 1/2 MS đến khả năng tái sinh chồi (sau 20 ngày): Môi trường MS nguyên nồng độ khoáng cho tỷ lệ tái sinh chồi đạt 86,67% (26/30 mẫu), chồi sinh trưởng mập và có màu xanh đậm. Môi trường giảm nồng độ khoáng 1/2 MS chỉ đạt tỷ lệ tái sinh 70,00% (21/30 mẫu). Sự sai khác giữa hai môi trường có ý nghĩa thống kê ở mức p = 0,05 (LSD0.05 = 9,23; CV = 5,2%).

3. Ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến cảm ứng tạo chồi (sau 20 ngày): Bổ sung Kinetin thúc đẩy mạnh mẽ khả năng bật chồi nách so với đối chứng không bổ sung (76,67%). Nồng độ Kinetin 0,5 mg/l cho tỷ lệ bật chồi đạt tuyệt đối 100% (30/30 mẫu), tuy nhiên chồi mảnh và nhỏ. Ở nồng độ Kinetin 0,4 mg/l, tỷ lệ bật chồi đạt 86,67% và chồi có hình thái mập, xanh đậm. Khi tăng nồng độ lên 1,5 mg/l, tỷ lệ bật chồi giảm xuống 90,00%. Nồng độ 0,5 mg/l Kinetin được lựa chọn làm môi trường nền (ký hiệu A) cho các thí nghiệm nhân nhanh kế tiếp.

Công thức	Hàm lượng Kinetin (mg/l)	Số mẫu nuôi cấy	Số mẫu bật chồi	Tỷ lệ bật chồi (%)	Chất lượng chồi
CT1 (Đ/C)	0,0	30	23	76,67	Mập, xanh
CT2	0,2	30	25	83,33	Mập, xanh
CT3	0,4	30	26	86,67	Mập, xanh
CT4	0,5	30	30	100,00	Nhỏ, xanh
CT5	1,5	30	27	90,00	Nhỏ, xanh

4. Ảnh hưởng của tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi (sau 30 ngày):
   • Tổ hợp MS + Kinetin 0,5 mg/l + BA: Hệ số nhân chồi tăng tỷ lệ thuận với nồng độ BA từ 0,1 đến 0,5 mg/l. Nồng độ BA 0,5 mg/l cho hệ số nhân cao nhất đạt 4,36 lần (thu được 131 chồi/30 mẫu ban đầu), chồi có kích thước nhỏ. Ở nồng độ BA 0,3 mg/l, hệ số nhân đạt 2,93 lần (88 chồi) với chất lượng chồi mập và xanh tốt. Khi tăng BA lên 1,0 mg/l, hệ số nhân giảm còn 3,93 lần (LSD0.05 = 0,25; CV = 4,7%).
   • Tổ hợp MS + Kinetin 0,5 mg/l + NAA: Nồng độ NAA 0,2 mg/l cho hệ số nhân chồi đạt đỉnh ở mức 3,33 lần (thu 100 chồi/30 mẫu), chồi nhỏ và xanh. Ở nồng độ NAA 0,05 mg/l, hệ số nhân đạt 1,86 lần nhưng chồi đạt phẩm chất mập khỏe. Khi tăng NAA lên 0,5 mg/l, hệ số nhân giảm xuống 2,90 lần (LSD0.05 = 0,16; CV = 4,1%).

Công thức	Kinetin (mg/l)	BA (mg/l)	Hệ số nhân BA (lần)	NAA (mg/l)	Hệ số nhân NAA (lần)
CT1 (Đ/C)	0,5	0,00	1,00	0,00	1,00
CT2	0,5	0,10	2,20	0,05	1,86
CT3	0,5	0,30	2,93	0,10	2,26
CT4	0,5	0,50	4,36	0,20	3,33
CT5	0,5	1,00	3,93	0,50	2,90

5. Ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng kích thích ra rễ (sau 30 ngày): Đối chứng không bổ sung auxin chỉ tạo trung bình 1,1 rễ/cây với đặc điểm rễ mảnh ngắn. Bổ sung auxin IBA kích thích mạnh mẽ sự hình thành rễ bất định. Công thức MS bổ sung IBA 0,1 mg/l đạt số rễ trung bình cao nhất là 4,16 rễ/cây, hệ rễ phát triển dài và khỏe mạnh. Khi tăng nồng độ IBA lên 0,2 mg/l, số rễ đạt 3,86 rễ/cây (rễ khỏe, dài); ở nồng độ 0,3 mg/l rễ ngắn lại; và ở 0,4 mg/l số rễ tiếp tục giảm xuống 3,10 rễ/cây với chất lượng rễ nhỏ và ngắn (CV = 4,23%).

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã xác lập các thông số kỹ thuật cho từng công đoạn nhân giống in vitro cây Giảo cổ lam 5 lá:

• Khử trùng bề mặt đoạn thân chứa mắt ngủ: Xử lý cồn 70° trong 45 giây kết hợp dung dịch HgCl2 0,1% trong thời gian 5 phút cho tỷ lệ tạo mẫu sạch nấm khuẩn đạt 86,67%.
• Môi trường tái sinh và cảm ứng tạo chồi: Môi trường MS cơ bản bổ sung 0,5 mg/l Kinetin cho tỷ lệ tạo chồi đạt 100%. Nếu ưu tiên phẩm chất chồi mập xanh, nồng độ Kinetin 0,4 mg/l cho tỷ lệ đạt 86,67%.
• Môi trường nhân nhanh chồi: Bổ sung tổ hợp 0,5 mg/l Kinetin và 0,5 mg/l BA cho hệ số nhân cao nhất đạt 4,36 lần sau 30 ngày nuôi cấy; hoặc bổ sung 0,5 mg/l Kinetin kết hợp 0,2 mg/l NAA cho hệ số nhân đạt 3,33 lần.
• Môi trường tạo rễ tạo cây hoàn chỉnh: Môi trường MS bổ sung 0,1 mg/l IBA kích thích chồi ra rễ đạt 4,16 rễ/cây, rễ dài và sinh trưởng khỏe mạnh.

Về mặt đóng góp khoa học, kết quả nghiên cứu cung cấp dữ liệu thực nghiệm kiểm chứng mối tương quan giữa cytokinin và auxin trên đối tượng Giảo cổ lam xuất xứ vùng miền núi phía Bắc. Công trình khẳng định sự phối hợp giữa Kinetin và BA có hiệu lực gia tăng hệ số nhân chồi vượt trội so với phối hợp Kinetin với NAA. Về mặt thực tiễn, quy trình kỹ thuật này cung cấp cơ sở để chủ động nhân nhanh số lượng lớn cây giống sạch virus và vi sinh vật gây hại, giảm bớt áp lực khai thác cạn kiệt từ các quần thể tự nhiên.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận hoàn thành mục tiêu xây dựng các giai đoạn in vitro trong phòng thí nghiệm, song vẫn tồn tại một số hạn chế gắn liền với phạm vi nghiên cứu:

• Đề tài chỉ dừng lại ở bước tạo cây con hoàn chỉnh có rễ trong bình tam giác thủy tinh, chưa tiến hành thử nghiệm giai đoạn huấn luyện (ra ngôi) cây con ngoài vườn ươm, chưa xác định tỷ lệ sống sót của cây giống khi chuyển giao sang các loại giá thể đất thực tế.
• Khóa luận chưa tiến hành định lượng hàm lượng hoạt chất đặc trưng (saponin toàn phần, flavonoid) của cây con tái sinh in vitro để so sánh đối chứng với cây mẹ thu hái ngoài tự nhiên.
• Các hướng nghiên cứu tiếp theo cần tập trung: thử nghiệm công thức giá thể (xơ dừa, mùn, đất cát) và chế độ che sáng, độ ẩm thích hợp cho giai đoạn thuần dưỡng cây giống ngoài tự nhiên; đồng thời phân tích hóa học đánh giá sự ổn định hàm lượng gypenoside của các thế hệ nhân giống vô tính.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên ngành trực tiếp cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các ngành Công nghệ sinh học, Nông học, Dược liệu học và Lâm nghiệp.

Các phần có giá trị trích dẫn và ứng dụng cao trong tài liệu bao gồm:

• Quy trình khử trùng mô thực vật dạng dây leo thân thảo tiếp xúc sát mặt đất bằng HgCl2 0,1% với mốc thời gian chuẩn hóa 5 phút.
• Dải nồng độ chất điều hòa sinh trưởng chi tiết (Kinetin, BA, NAA, IBA) phục vụ xây dựng môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô các loài thuộc chi Gynostemma hoặc họ Bầu bí (Cucurbitaceae).
• Phương pháp bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên hoàn toàn (CRD), hệ thống công thức tính chỉ tiêu hình thái in vitro và quy trình xử lý phương sai thống kê nông học thông qua phần mềm IRRISTART 4.0.

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu vật liệu khởi đầu được sử dụng trong nghiên cứu là bộ phận nào và thu thập từ đâu? Mẫu khởi đầu là các đoạn thân non mang mắt ngủ ở nách lá của cây Giảo cổ lam 5 lá (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino), được thu thập tại hai tỉnh Bắc Kạn và Thái Nguyên, sau đó trồng lưu giữ tại vườn lan thuộc Khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.

2. Tại sao tác giả chọn mốc thời gian 5 phút khi khử trùng bằng HgCl2 0,1%? Thực nghiệm sau 10 ngày cho thấy ngâm mẫu trong HgCl2 0,1% trong 5 phút đạt tỷ lệ mẫu sống không nhiễm cao nhất (86,67%), tỷ lệ chết và nhiễm đều ở mức thấp (6,67%). Nếu tăng thời gian ngâm lên 7 phút hoặc 10 phút, hóa chất gây độc tế bào thực vật làm tỷ lệ chết tăng vọt lên lần lượt 8,89% và 77,05%, khiến tỷ lệ mẫu sạch sống sót giảm chỉ còn 20,00% và 17,77%.

3. Công thức dinh dưỡng nào cho hệ số nhân chồi Giảo cổ lam cao nhất trong các thí nghiệm? Công thức môi trường nền MS bổ sung 0,5 mg/l Kinetin kết hợp với 0,5 mg/l BA mang lại hệ số nhân chồi cao nhất, đạt 4,36 lần sau 30 ngày nuôi cấy (tạo ra 131 chồi từ 30 mẫu ban đầu), vượt trội hơn so với công thức phối hợp Kinetin với NAA (chỉ đạt tối đa 3,33 lần ở mức 0,2 mg/l NAA).

4. Yếu tố nào quyết định đến tỷ lệ và chất lượng ra rễ của chồi in vitro? Chất kích thích sinh trưởng nhóm auxin là IBA đóng vai trò quyết định. Bổ sung IBA ở nồng độ thấp 0,1 mg/l trên nền môi trường MS cho số rễ trung bình cao nhất đạt 4,16 rễ/cây với chất lượng rễ mập khỏe, dài; trong khi đối chứng không có auxin chỉ đạt 1,1 rễ/cây và rễ ngắn, mảnh.

5. Khóa luận sử dụng công cụ thống kê nào để kiểm chứng độ tin cậy của các số liệu thực nghiệm? Tác giả sử dụng bảng tính Microsoft Excel 2007 để tổng hợp số liệu thô và chương trình phần mềm chuyên dụng IRRISTART 4.0 để phân tích phương sai, so sánh sai khác có ý nghĩa thống kê giữa các giá trị trung bình bằng phép thử LSD ở mức ý nghĩa 95% (p = 0,05) cùng hệ số biến động CV%.

Kết luận

Khóa luận của tác giả Phạm Thị Hiệng đã nghiên cứu thành công quy trình nhân giống vô tính in vitro cây Giảo cổ lam 5 lá (Gynostemma pentaphyllum), xác định chuẩn xác các thông số từ khử trùng mẫu mắt ngủ bằng HgCl2 0,1% trong 5 phút, tái sinh chồi trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l Kinetin, đến nhân nhanh chồi bằng tổ hợp Kinetin 0,5 mg/l phối hợp BA 0,5 mg/l đạt hệ số nhân 4,36 lần và tạo rễ hoàn chỉnh với 0,1 mg/l IBA đạt 4,16 rễ/cây. Toàn bộ các kết luận đều dựa trên số liệu thực nghiệm định lượng được xử lý thống kê chặt chẽ bằng phần mềm IRRISTART 4.0. Đề tài mở ra tiềm năng ứng dụng công nghệ sinh học trong việc bảo tồn nguồn gen dược liệu bản địa có nguy cơ tuyệt chủng và cung ứng cây giống sạch bệnh phục vụ sản xuất.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Giảo cổ lam có tên khoa học là Gynostemma pentaphyllum (Thunb) thuộc họ Cucurbitaceae. Còn được gọi là Thất diệp đởm, cây trà vạn, cây trường sinh, cây cỏ thần kỳ. Đây là dược liệu quý được ghi trong sách cổ “Nông chính toàn thư hạch chú”. Từ xưa được sử dụng cho vua chúa để tăng sức khỏe, kéo dài tuổi thọ và làm đẹp.

Giảo cổ lam phân bố tại một số quốc gia như Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Triều Tiên, Việt Nam… Ở nước ta cây Giảo cổ lam được phát hiện tại các tỉnh trung du miền núi phía Bắc như Lào Cai, Cao Bằng, Bắc Kạn,…và một số địa phương khác (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [14]. Theo nghiên cứu của GS.TS Phạm Thanh Kỳ cho thấy Giảo cổ lam chứa hơn 100 loại Saponin trong đó có nhiều cấu trúc giống như Saponin của nhân sâm và tam thất. Ngoài ra trong Giảo cổ lam còn chứa Flavonoid. Đây là chất có khả năng chống lão hóa mạnh, tăng cường sức khỏe, giúp ổn định huyết áp, làm tan huyết khối, ngăn ngừa xơ vữa mạch, phòng chống các tai biến về tim, mạch, não, chống lão hóa, ngăn ngừa stress, ngừa ung thư não, tử cung, da, … (Bô ̣ Y Tế, 2009) [6].

Với các tác dụng như trên nên hiện nay đã có các sản phẩm thuốc, trà và thực phẩm chức năng sử dụng Giảo cổ lam làm nguyên liệu, do đó nguồn Giảo cổ lam trong tự nhiên đã và đang bị khai thác quá mức và có thể bị tuyệt chủng. Theo sách đỏ Việt Nam Giảo cổ lam được xếp trong thang bậc phân hạng IUCN 1994 sách đỏ VN: EN A1a,c,d (Bộ môn Thực vật, 2004) [5]. Vì vậy việc nghiên cứu nhân giống cây Giảo cổ lam phục vụ cho công tác sản xuất là rất cần thiết. Việc nhân giống Giảo cổ lam có thể được tiến hành thông qua đoạn thân hay hạt.

Tuy nhiên để tạo ra một lượng giống lớn, n 2 đồng đều và sạch bệnh trong thời gian ngắn để phục vụ cho sản xuất và bảo tồn thì nuôi cấy mô tế bào là một phương pháp tối ưu. Xuất phát từ tình hình thực tiễn đó, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân giống cây Giảo cổ lam (gynostemma pentaphyllum bằng phương pháp in vitro’’ 1. Mục đích nghiên cứu - Tìm ra quy trình nhân nhanh giống Giảo cổ lam bằng phương pháp in vitro 1. Yêu cầu của đề tài Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái sinh: - Xác định ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn cây Giảo cổ lam.

- Xác định ảnh hưởng của hàm lượng môi trường MS đến khả năng tái sinh chồi cây Giảo cổ lam. - Xác định ảnh hưởng của hàm lượng một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam. - Xác định ảnh hưởng của hàm lượng auxin đến khả năng ra rễ cây Giảo cổ lam. Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa trong khoa học + Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và nghiên cứu khoa học.

+ Biết được phương pháp nghiên cứu vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, biết cách trình bày một bài báo khoa học. - Ý nghĩa thực tiễn Xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến nuối cấy, làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo. n 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Khái quát về cây Giảo cổ lam 2.

Nguồn gốc phân bố của cấy Giảo cổ lam Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) có nguồn gốc từ các vùng núi của miền nam Trung Quốc, Nhật Bản và Đông Nam Á (Hoàng Ngọc Thuận, 2000) [26]. Cây phát triển tự nhiên trong rừng, trong các thung lũng, mọc leo trên các cây gỗ hay các bụi tại các nơi ẩm ướt ở độ cao từ 300 – 3. Trên thế giới Giảo cổ lam phân bố ở Ấn Độ, Srilanca, Myanma, Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Thái Lan, Lào và bán đảo Malaixia (Chen J. Tại Việt Nam Giảo cổ lam phân bố khắp các vùng núi thuộc miền bắc và miền trung, chủ yếu ở các vùng có núi đá vôi (Lê Văn Cường, 1998) [9], (Bộ Khoa Học và Công Nghệ, 2007) [3].

Mọc nhiều trong rừng, rừng thưa, lùm bụi từ vùng đồng bằng đến độ cao 2000m như ở Lào Cai, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hòa Bình, Bắc Kạn (Bô ̣ Y Tế, 2009) [6]. Phân loại Giảo cổ lam có tên khoa học là Gynostemma pentaphyllum (Thunb) thuộc chi Gynostemma, họ Cucurbitaceae (Viện Dược Liệu, 1996) [28]. Theo các tài liệu phân lọai thực vật chuẩn như “Thực vật chí Đông Dương” và các tác phẩm “Cây cỏ Việt Nam” của Viện Khoa học Việt Nam công bố cây Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma, nằm trong họ bầu bí - Cucurbitaceae. Cây còn có tên gọi khác là: Thất diệp đởm, cỏ thần kì, cây bổ đắng, cây dền toong hoặc sâm phương nam.

Đặc điểm thực vật học của cây Giảo cổ lam.  Thân cây Giảo cổ lam: cây thân dạng thảo, có 4 cạnh, thường mọc leo trên các cây khác hay vách đá, có tua cuốn để leo. n 4  Lá cây Giảo cổ lam: lá kép hình chân vịt, mỗi lá gồm từ 3-7 lá chét. Mặt trên lá có màu xanh thẫm và mặt dưới có màu xanh lá cây, lá mọc cách trên thân, đầu lá nhọn, mép lá có răng cưa, mỗi lá chét có cuống riêng, cuống dài 3 - 4cm.

 Hoa cây Giảo cổ lam: hoa nhỏ, màu trắng, hình sao, ống bao hoa ngắn, cánh hoa rời nhau, cao 2,5mm bao phấn dính thành đĩa, có 3 vòi nhụy, ra hoa từ tháng 7 – 9, có quả từ tháng 9 – 10.  Quả cây Giảo cổ lam: quả khô, tròn, to 5 – 9mm, có màu đen, mỗi quả có từ 2 – 3 hạt, khi chín có màu đỏ, kích thước hạt khoảng 4mm (Viện Dược Liệu, 1998) [29], (Ngô Quốc Luật và cs, 2010) [20]. Điều kiện sinh thái của cây Giảo cổ lam Giảo cổ lam là cây ưa ẩm và ánh sáng tán xạ, ưa bóng điển hình, vì vậy ánh sáng là yếu tố quan trọng đầu tiên cần được cân nhắc trong quá trình trồng trọt (Vũ Quang Sáng và cs, 2007) [22]. Giảo cổ lam có thể sinh trưởng, phát triển ở hầu hết các vùng khí hậu nhưng tốt nhất là ở các vùng ẩm và trên nhiều loại đất như đất cát, đất mùn, đất thịt.

Cây yêu cầu đất thoát nước tốt nhưng phải giữ được ẩm, đất giàu dinh dưỡng, đặc biệt là đạm. Ngoài ra Giảo cổ lam còn có khả năng chịu lạnh khá tốt, nó có thể sinh trưởng, phát triển bình thường trong khoảng nhiệt độ thấp từ - 10 - -50C (Vũ Quang Sáng và cs, 2007) [22], (Phạm Anh Thắng, 2001) [23]. Cây sinh trưởng trong điều kiện lý tưởng có thể đạt chiều dài thân từ 8 – 9m/mùa (có thể cao hơn ở những vùng ẩm) (Vũ Quang Sáng và cs, 2007) [22]. Vị trí cây Giảo cổ lam trong hệ thống thực vật học và cây dược liệu Giảo cổ lam là một loài cây leo sống nhiều năm thuộc chi Gynostemma, họ Cucurbitaceae (Chen J.

Theo các tài liệu phân loại thực vật chuẩn như “Thực vật chí Đông Dương” và tác phẩm “Cây cỏ Việt Nam” của Viện Khoa học Việt Nam công bố cây Giảo cổ lam thuộc chi n 5 Gynosemma, nằm trong họ Bầu bí – Cucurbitaceae. Vị trí của loài Giảo cổ lam trong hệ thống phân loại thực vật được tóm tắt như sau: Ngành Ngọc lan: Magnoliophyt Lớp Ngọc lan: Magnoliopsida Phân lớp số: Dillieniiae Liên bộ hoa tím: Violanae Bộ bầu bí: Cucurbitales Họ Bầu bí: Cucurbitaceae Chi: Gynostemma Loài: Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makino - Loài Giảo cổ lam 3 lá: Gynostemma laxum (Wall. - Loài Giảo cổ lam 5 lá: Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makino - Loài Giảo cổ lam 7 lá: Gynostemma pubescens (Gagnep) C. - Loài Giảo cổ lam 9 lá: Gynostemma sp.

Trong hệ thống cây dược liệu Giảo cổ lam với tên Việt Nam chính là Dền toong, tên khoa học là Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makino. Cây có nhiều tên gọi như: Cổ yếm, Thư tràng 5 lá, Thất Diệp Đởm, Tiểu Khổ Dược (Nhật Bản), Giảo cổ lam (Trung Quốc),…Tên Trung Quốc gọi là Jiaogulan, Qi Ye Dan, Gong Luo Guo Di, Pian Sheng Gen, Xiao Ku Yao, Amachazuru, Dung kulcha (Nguyễn Tiến Dẫn, 1999) [10]. Cây do bị khai thác quá mức để lấy nguyên liệu làm thuốc nên đã được xếp trong thang bậc phân hạng IUCN 1994 sách đỏ VN: EN A1a,c trong sách đỏ Việt Nam (Bộ môn Dược liệu, 1998) [4]. Nghiên cứu về giá trị y học của Giảo cổ lam  Thành phần hóa học Bằng phương pháp đo phổ xạ tia X đã xác định trong cây có 15 nguyên tố vô cơ: Al, Si, Mg, Ca, K, Mn, Na, Fe, Ba, Ti, Cu, Cr, Pb, Ag.

Trong đó nguyên tố n 6 có hàm lượng cao nhất là Si (0,1%) và thấp nhất là Ag (0,0001%) (Đỗ Tất Lợi, 1999) [19]. Trong Giảo cổ lam có chứa hơn 100 loại saponin trong đó có nhiều loại saponin giống với nhân sâm và tam thất. Ngoài ra Giảo cổ lam còn chứa Flavonoid. Đây là chất có tác dụng sinh học cao và chống lão hóa mạnh.

Số Saponin trong Giảo cổ lam nhiều gấp 3-4 lần so với nhân sâm. Trong đó, một số có cấu trúc hóa học giống như cấu trúc có trong nhân sâm (gisenozit) (Phạm Thanh Hương, 2003) [16]. Cấu trúc hóa học: Flavononid Saponin Hình 2. Cấu trúc hóa học của Flavononit và Saponin  Tác dụng dược lý Giá trị dược lý của Giảo cổ lam chính là thành phần Saponin và Flavononit, thành phần này đã trở thành mục tiêu nghiên cứu của các nhà nghiên cứu dược học tại Trung Quốc (Đỗ Tất Lợi, 1999) [19].

Tính chất đa tác dụng của loài cây này đã được đặt tên là cây trường sinh - “the immortality herb”. - Tác dụng đến chuyển hóa lipit và đường huyết Tác dụng của Giảo cổ lam đến chuyển hóa lipid đã được nghiên cứu rộng rãi. Tác dụng hạ lipid đã được nghiên cứu khi dùng nước sắc của Giảo cổ lam cùng với hai loại dược liệu khác. Hỗn hợp này làm giảm đáng kể hàm n 7 lượng triglycerid và cholesterol trong huyết tương thỏ và chim cút (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [14].

Tác dụng đến đường huyết: Phân đoạn saponin của Giảo cổ lam (liều 1mg/kg) đã làm giảm đáng kể lượng đường trong máu khi điều trị trong 2 tuần chuột cống đã được kích thích tăng đường huyết bằng Streptozocin (STZ) (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [14]. Thành phần phanosid (một saponin dammaran) từ Giảo cổ lam kích thích giải phóng insunin từ tụy chuột cống cô lập. Cho chuột cống uống phanosid (liều 40 và 80mg/ml) đã cải thiện được sự dung nạp đường và năng lượng insulin trong huyết thanh trong bệnh tăng đường huyết.