Đặt vấn đề PGS, TS Lê Xuân Cảnh (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật) cho biết: năm 1992, trung tâm giám sát bảo tồn thế giới xếp Việt Nam là một trong 16 quốc gia có đa dạng sinh học cao nhất thế giới. Theo số liệu báo cáo quốc gia về đa dạng sinh học (năm 2011) cho thấy, tại Việt Nam ghi nhận đƣợc khoảng hơn 49 nghìn loài sinh vật, bao gồm: khoảng 7.500 loài/chủng vi sinh vật; 20 nghìn loài thực vật trên cạn và dƣới nƣớc; 10.500 loài động vật trên cạn; hơn 11 nghìn sinh vật biển. Nguồn dƣợc liệu của Việt Nam cũng rất phong phú, đa dạng và đƣợc sử dụng rộng rãi trong cộng đồng để chữa trị nhiều bệnh khác nhau. Theo kết quả điều tra nguồn tài nguyên dƣợc liệu ở Việt Nam giai đoạn 2001 – 2005 của Viện dƣợc liệu (2006) cho biết Việt Nam có khoảng 3.948 loài thực vật bậc cao, bậc thấp và nấm lớn đƣợc dùng làm thuốc [45].
Một trong số cây thuốc đƣợc sử dụng nhiều là cây Bình Vôi. Trong củ Bình Vôi có chứa alkaloid bao gồm L-tetrahydropalmatin (rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin. Ngoài ra còn có tinh bột, đƣờng khử oxygen, acid malic, men oxydase [22]. Trong đó quan trọng nhất là L- tetrahydropalmatin (rotundin) và roemerin và cepharanthin.
Rotundin có tác dụng giảm đau, an thần, gây ngủ rất hiệu quả, điều hòa hô hấp và điều hòa tốt đối với tim mạch [12]. Hàm lƣợng hoạt chất này có trong củ Bình Vôi tƣơi khoảng 0,12 – 0,3%. Roemerin có tác dụng gây tê niêm mạc, giãn mạch, hạ huyết áp. Cepharanthin đƣợc coi là một chất có tác dụng kích thích miễn dịch và làm giảm nhẹ một cách hữu hiệu những tác dụng phụ của các thuốc chống ung thƣ.
Ngoài ra, Bun Sok-Siya và cs (2009) đã chiết xuất cepharanthin có tác dụng ức chế 2 dòng tế bào ung thƣ đại trực tràng và ung thƣ gan [40]. Mặt khác, còn ức chế sự phát triển của trực khuẩn lao. Ngoài công dụng điều trị bệnh, củ Bình Vôi còn dùng làm vật trang trí đẹp và đƣợc nhiều ngƣời ƣa chuộng [5]. n 2 Ở Việt Nam củ Bình Vôi đƣợc tìm thấy ở những vùng có núi đá nhƣ: Hà Giang, Tuyên Quang, Ninh Bình, Hòa Bình, Hà Tây, Hà Nam, Hải Phòng, Cao Bằng, Bắc Kạn, Lạng Sơn, Thanh Hóa.
Tuy nhiên giá trị dƣợc liệu của củ Bình vôi lại phụ thuộc rất nhiều vào vùng phân bố và điều kiện sinh thái. Hiện nay, nguồn củ Bình vôi chủ yếu đƣợc khai thác từ tự nhiên mà ít có các nghiên cứu về trồng trọt và nhân giống. Bình vôi nhân giống bằng hạt đƣợc tạo ra từ quá trình thụ phấn giữa hoa đực và hoa cái [5]. Tuy nhiên cây cho hoa đực và cây cho hoa cái nằm khác gốc vì vậy việc thụ phấn gặp nhiều khó khăn [46].
Với phƣơng pháp cắt phần củ thành từng mảnh đem trồng không đem lại hiệu quả cao do điều kiện thời tiết nóng ẩm mƣa nhiều của nƣớc ta, vi sinh vật hoạt động mạnh dẫn đến thối củ. Vì vậy hiện nay củ Bình vôi đang rất khan hiếm trong tự nhiên và đã đƣợc đƣa vào danh mục cần bảo tồn. Theo Nghị định số 32/2006, NĐ-CP ngày 30 tháng 3 năm 2006 của Chính phủ, trong danh mục “Thực vật rừng nguy cấp, quý hiếm” thì các loài Bình vôi (Stephania sp.) đƣợc xếp trong nhóm IIA (Thực vật rừng hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thƣơng mại) [5]. Phƣơng pháp nhân giống in vitro với những ƣu điểm là tạo ra những giống cây trồng sạch bệnh, chất lƣợng tốt, đồng đều và hệ số nhân lớn trong thời gian ngắn.
Nhận thức đƣợc việc bảo tồn và phát triển loài cây thuốc quý tiềm năng, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân giống cây Bình Vôi (Stephania rotunda Lour) bằng phương pháp in vitro”. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 1. Mục tiêu đề tài - Xác định đƣợc ảnh hƣởng nồng độ và thời gian khử trùng của chất khử trùng dến khả năng tạo vật liệu vô trùng trong nuôi cấy cây Bình Vôi bằng phƣơng pháp in vitro. - Xác định đƣợc ảnh hƣởng của một số chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi, ra rễ từ đoạn thân mang chồi ngủ cây Bình Vôi bằng phƣơng pháp in vitro.
Yêu cầu đề tài - Xác định đƣợc ảnh hƣởng của nồng độ, thời gian chất khử trùng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vtiro. - Xác định đƣợc ảnh hƣởng của một số chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng tái sinh chồi cây Bình Vôi. - Xác định đƣợc ảnh hƣởng của một số chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng nhân nhanh chồi cây Bình Vôi. - Xác định đƣợc ảnh hƣởng của một số chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng ra rễ cây Bình Vôi.
Ý nghĩa của đề tài 1. Ý nghĩa trong khoa học: + Quá trình nghiên cứu sẽ đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của một số chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi và ra rễ từ đoạn thân mang chồi ngủ của cây Bình Vôi. + Cung cấp tài liệu tham khảo, nghiên cứu cho sinh viên, giúp sinh viên hoàn thiện cả về kiến thức lý thuyết lẫn thực tiễn. Ý nghĩa trong thực tiễn: Góp phần nhân nhanh tạo số lƣợng lớn cây giống phục vụ mục tiêu bảo tồn loài dƣợc liệu quý theo Nghị định số 32/2006, NĐ-CP ngày 30 tháng 3 năm 2006 của Chính phủ, đảm bảo nguồn nguyên liệu chất lƣợng cung cấp cho ngành y dƣợc.
n 4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu chung về chi Bình vôi 2. Nguồn gốc Chi Bình vôi (Stephania) thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae) có nguồn gốc ở miền Đông, Nam Châu Á và Australia [16]. Ở Việt Nam, cây mọc hoang tại nhiều vùng rừng núi.
Phân loại Chi Bảng 2.1: Phân loại khoa học Chi Bình vôi (Stephania spp) [2] Giới (regnum) Plantae Ngành Magloliophyta Phân lớp Magloliosida (Dicotyedones) Bộ (ordo) Ranunculales Họ (familia) Menispermaceae Chi (genus) Stephania Loài (Species) Rotunda Chi Bình Vôi hay chi Thiên kim đằng (danh pháp khoa học: Stephania spp, đồng nghĩa: Perichasma) là một chi thực vật có hoa trong họ Biển bức cát (Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê). Một số loài công bố ở Việt Nam: Stephania glabra (Roxb) Miers, S. Trên thế giới, chi Bình vôi có hơn 40 loài. Ở Việt Nam, chi Bình vôi có 13 loài với 4 loài đã có tên trong “Sách đỏ Việt Nam” [20].
Đặc điểm hình thái và phân bố Bình vôi là tên gọi của nhiều loài cây là dây leo có rễ củ thuộc chi Stephania, họ Tiết dê (Menispermaceae). Ở Việt Nam còn có các tên gọi khác nhƣ là: cây củ một, củ mối tròn, dây mối trơn, củ gà ấp,… n 5 Hình 2.1: Cây Bình Vôi (Stephania rotunda Lour) Bình vôi là cây mọc hoang dại, thích hợp ở nhiệt độ trung běnh năm 21-230C, lƣợng mƣa 2000 – 2500 mm, ƣa đất nhiều mùn, thoát nƣớc, độ pH = 6,5-7. Các loại Bình vôi có đặc điểm chung nhƣ sau: dây leo, thân nhẵn hơi xoắn vặn, thƣờng xanh, sống lâu năm. Rễ củ đa dạng, có thể rất to và nặng tới gần 20kg, vỏ ngoài xù xì màu nâu - nâu đen.
Lá mọc so le, cuống lá dài, đính vào trong phiến lá khoảng 1/3; phiến lá mỏng, hình tim, gần hình tròn, có cạnh hoặc tam giác tròn, hai mặt nhẵn; gân lá xuất phát từ chỗ đính của cuống lá, nổi rõ ở mặt dƣới lá. Cụm hoa hình xim tán mọc ở kẽ lá hoặc những cành già đã rụng lá; hoa đực và hoa cái khác gốc, hoa đực có 6 lá đài xếp thành hai vòng, 3 cánh hoa màu vàng cam; nhị: 2-6, thƣờng là 4; hoa cái có 1 lá đài, 2 cánh hoa; bầu hình trứng. Quả hạch hơi dẹt, mọng nƣớc màu đỏ hoặc da cam; hạt cứng, hình móng ngựa, hình trứng hoặc gần tròn mang 4 hàng vân dạng gai, hai mặt bên lõm ở giữa có lỗ thủng hoặc không. Mùa hoa: tháng 4-6; mùa quả: tháng 8-10 [11],[26].
Đặc điểm hình thái của một số loài Bình vôi [26], [43]: Củ Bình vôi (Stephania rotunda Lour): Dây leo có rễ củ vùi dƣới đất một nửa giống hình củ bình vôi, ruột màu vàng, thơm. Lá hình khiên, mọc cách. Phổ biến ở các rừng thƣa Phú Thọ, Vĩnh Yên, Ninh Bình,… Stephania pierrei Diels: Ngọn non có nhiều chấm màu tím hồng. Lá có kích thƣớc nhỏ hơn tất cả các loài khác.
Hoa đực không có cánh hoa. Tsoong: Cành non và cuống lá có dịch màu trắng hoặc vàng nhạt. cambodia Gagnep: Cuống cụm hoa và cuống tán giả dài hơn so với các loài khác.Wu: Nửa cuống lá phía đính vào phiến lá và gân lá mặt sau có màu tím hay tím hồng.Lo: Cuống lá rất dài, có khi đến 14cm, giá noãn có lỗ lệch một bên. cepharantha Hay: Giá noãn không có lỗ.
sinica Diels: Giá noãn không có lỗ.Lo et Yang: Lá có phiến hình tam giác, cuống lá bằng hoặc dài hơn phiến lá. Các loại Bình vôi ở nƣớc ta có diện phân bố rất rộng trên cả ba miền Bắc, Trung, Nam. Thƣờng tập trung ở vùng núi đá vôi nhƣ Tuyên Quang, Cao Bằng, Thái Nguyên, Phú Thọ, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Lâm Đồng, Bà Rịa - Vũng Tàu. Sự phân bố của mỗi loài rất khác nhau, tùy theo đặc tính sinh học.
Giá trị của cây Bình Vôi 2. Giá trị về kinh tế Cây Bình Vôi là một loại cây thuốc nam mọc tự nhiên ở một số vùng của nƣớc ta, là một loại cây dạng leo dễ trồng, phù hợp với điều kiện khí hậu của Việt Nam. Nó có thể phát triển tốt khi đƣợc trồng trong đất tơi xốp, nhiều mùn, thoát nƣớc mà không cần tốn công chăm sóc hay kỹ thuật canh tác cao nhƣng lại mang giá trị kinh tế cao cho ngƣời trồng. Cây Bình Vôi đƣợc coi là cây trồng “xóa đói giảm nghèo” của ngƣời dân tộc vùng cao.
Bên cạnh đó, cây Bình Vôi còn là cây có tiềm năng lớn trong y học, là nguồn nguyên liệu cho ngành dƣợc. Tuy nhiên, trƣớc việc khai thác ồ ạt của ngƣời dân thì loại cây quý này đang dần cạn kiệt và có nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên. Giá trị về dược liệu n 7 Cây Bình Vôi thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae), là cây chứa nhiều hoạt chất có giá trị về dƣợc liệu. Cây bình vôi có tác dụng thanh nhiệt, giải độc.
hoạt chất đƣợc các nhà khoa học quan tâm và chiết suất nhiều từ cây bình vôi là rotundin - một hoạt chất rất cần trong y học. Nhiều thí nghiệm lâm sàng trên chuột cống trắng cho thấy Bình Vôi có tác dụng an thần, gây ngủ. Theo kinh nghiệm trong y học cổ truyền Bình Vôi đƣợc dùng dƣới dạng thuốc sắc hay ngâm rƣợu để chữa bệnh mất ngủ, ho hen, kiết lỵ, sốt, đau bụng,… Liều dùng: 3 - 6 g/ngày.