Chẩn Đoán Nhanh Virus Mumps Gây Bệnh Quai Bị Bằng Kỹ Thuật Real-Time RT-PCR

Tài liệu nghiên cứu Chẩn đoán nhanh virus mumps gây bệnh quai bị bằng kỹ thuật real time rt pcr trên vùng gene sh, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên sâu

• Tác giả: Nguyễn Thảo Trang
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thụy Dạ Thảo
• Trường học: Trường Đại Học Mở TP.HCM
• Chuyên ngành: Vi Sinh-Sinh Học Phân Tử
• Đề tài: Chẩn Đoán Nhanh Virus Mumps Gây Bệnh Quai Bị Bằng Kỹ Thuật Real-Time RT-PCR
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Tp. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN I
• 1.1. Sơ lược về bệnh quai bị
• 1.1.1. Nguyên nhân gây bệnh
• 1.1.2. Dịch tễ học
• 1.1.3. Tình hình quai bị ở Việt Nam
• 1.1.4. Triệu chứng của quai bị
• 1.1.5. Biến chứng của quai bị
• 1.1.6. Phòng và điều trị
• 1.1.7. Phát hiện bệnh
• 1.1.8. Các công trình nghiên cứu trước
• 1.2. Sơ lược về virus Mumps gây bệnh quai bị
• 1.2.1. Phân họ paramyxovirinae
• 1.2.2. Bộ gene virus mumps
• 1.2.3. Sự nhân lên của virus
• 1.3. Gene SH-gene mục tiêu
• 1.4. Tổng quan về Real-time RT-PCR
• 1.4.1. Real-time PCR
• 1.4.2. Đường chuẩn của Real-time PCR
• 2. PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
• 2.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.1.2. Mồi và mẫu dò
• 2.1.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.1.3.1. Khai thác dữ liệu
• 2.1.3.2. Khảo sát in silico
• 2.1.3.3. Phương pháp xử lý mẫu
• 2.1.3.4. Phương pháp tách chiết RNA
• 2.2. Phương pháp tiến hành
• 2.2.1. Phương pháp PCR
• 2.2.2. Phương pháp RT
• 2.2.3. Phản ứng Realtime PCR
• 2.2.4. Phương pháp kiểm tra khả năng hoạt động của bộ mồi
• 2.2.5. Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu của mồi
• 2.2.6. Phương pháp kiểm tra khả năng hoạt động của mẫu dò
• 2.2.7. Phương pháp xác định nhiệt độ lai tối ưu của quy trình
• 2.2.8. Phương pháp xác định độ nhạy của quy trình
• 2.2.9. Khảo sát độ đặc hiệu của bộ mồi và mẫu dò
• 3. PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả thu thập dữ liệu và khảo sát in silico
• 3.1.1. Thu thập dữ liệu
• 3.1.2. Kết quả khảo sát in silico
• 3.2. Kết quả khảo sát bộ mồi mẫu dò trên thực nghiệm
• 3.2.1. Kết quả khảo sát sự hoạt động của bộ mồi
• 3.2.2. Kết quả khảo sát sự hoạt động của mẫu dò
• 3.2.3. Kết quả giải trình tự
• 3.2.4. Kết quả khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của mẫu dò
• 3.2.5. Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình
• 3.2.6. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của hệ mồi, mẫu dò
• 3.3. Kết quả ứng dụng quy trình trên mẫu bệnh phẩm lâm sàn
• 4. PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• 4.1. Kết luận và đề nghị
• PHẦN V TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Chẩn Đoán Nhanh Virus Mumps Gây Bệnh Quai Bị

Virus Mumps là tác nhân gây ra bệnh quai bị, một bệnh truyền nhiễm phổ biến ở trẻ em. Việc chẩn đoán nhanh chóng và chính xác virus này là rất quan trọng để ngăn ngừa các biến chứng nghiêm trọng. Kỹ thuật Real-Time RT-PCR đã được chứng minh là một phương pháp hiệu quả trong việc phát hiện virus mumps từ các mẫu lâm sàng. Phương pháp này không chỉ giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán mà còn nâng cao độ chính xác trong việc xác định virus gây bệnh.

1.1. Virus Mumps và Bệnh Quai Bị Nguyên Nhân và Triệu Chứng

Virus Mumps thuộc họ Paramyxoviridae, gây ra bệnh quai bị với triệu chứng điển hình như sốt, sưng tuyến nước bọt. Bệnh thường gặp ở trẻ em từ 5-9 tuổi, nhưng cũng có thể ảnh hưởng đến người lớn. Việc nhận biết triệu chứng sớm giúp giảm thiểu nguy cơ biến chứng.

1.2. Tình Hình Bệnh Quai Bị Tại Việt Nam

Bệnh quai bị vẫn lưu hành tại Việt Nam với tỷ lệ mắc bệnh cao, đặc biệt ở những khu vực đông dân cư. Việc tiêm vắc xin chưa phổ cập rộng rãi, dẫn đến sự gia tăng ca bệnh trong những năm gần đây. Cần có các biện pháp phòng ngừa hiệu quả để giảm thiểu sự lây lan của virus.

II. Thách Thức Trong Việc Chẩn Đoán Virus Mumps Gây Bệnh Quai Bị

Việc chẩn đoán bệnh quai bị gặp nhiều khó khăn do các phương pháp truyền thống thường tốn thời gian và không chính xác. Các xét nghiệm như nuôi cấy virus hay huyết thanh học cần thời gian dài và không thể phát hiện virus ở nồng độ thấp. Điều này dẫn đến việc chẩn đoán muộn và tăng nguy cơ biến chứng cho bệnh nhân.

2.1. Hạn Chế Của Các Phương Pháp Chẩn Đoán Truyền Thống

Các phương pháp như nuôi cấy virus và xét nghiệm huyết thanh học thường yêu cầu thời gian dài và không thể phát hiện virus ở nồng độ thấp. Điều này làm giảm khả năng chẩn đoán sớm và chính xác.

2.2. Tác Động Của Việc Chẩn Đoán Chậm Đến Sức Khỏe Cộng Đồng

Chẩn đoán chậm có thể dẫn đến sự lây lan của virus trong cộng đồng, gây ra các đợt dịch lớn. Điều này không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe cá nhân mà còn tạo gánh nặng cho hệ thống y tế.

III. Phương Pháp Chẩn Đoán Nhanh Virus Mumps Bằng Real Time RT PCR

Kỹ thuật Real-Time RT-PCR đã được áp dụng rộng rãi trong việc phát hiện virus mumps. Phương pháp này cho phép phát hiện RNA virus một cách nhanh chóng và chính xác từ các mẫu lâm sàng. Đặc biệt, kỹ thuật này có thể phát hiện virus ở nồng độ thấp, giúp nâng cao khả năng chẩn đoán sớm.

3.1. Nguyên Tắc Hoạt Động Của Real Time RT PCR

Real-Time RT-PCR hoạt động dựa trên nguyên tắc khuếch đại RNA virus thành DNA và sau đó phát hiện thông qua các tín hiệu huỳnh quang. Phương pháp này cho phép theo dõi quá trình khuếch đại trong thời gian thực.

3.2. Lợi Ích Của Việc Sử Dụng Real Time RT PCR Trong Chẩn Đoán

Phương pháp Real-Time RT-PCR mang lại nhiều lợi ích như thời gian chẩn đoán nhanh, độ chính xác cao và khả năng phát hiện virus ở nồng độ thấp. Điều này giúp bác sĩ có thể đưa ra quyết định điều trị kịp thời.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Về Chẩn Đoán Virus Mumps Tại Việt Nam

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng kỹ thuật Real-Time RT-PCR có thể phát hiện virus mumps với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Các kết quả cho thấy phương pháp này có thể được áp dụng rộng rãi trong các cơ sở y tế để nâng cao khả năng chẩn đoán bệnh quai bị.

4.1. Đánh Giá Độ Nhạy và Độ Đặc Hiệu Của Phương Pháp

Nghiên cứu cho thấy độ nhạy của Real-Time RT-PCR đạt trên 90%, trong khi độ đặc hiệu đạt 100%. Điều này khẳng định tính hiệu quả của phương pháp trong việc phát hiện virus mumps.

4.2. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Real Time RT PCR Trong Chẩn Đoán

Phương pháp Real-Time RT-PCR đã được áp dụng thành công trong nhiều cơ sở y tế tại Việt Nam, giúp nâng cao khả năng chẩn đoán và điều trị bệnh quai bị. Điều này góp phần giảm thiểu sự lây lan của virus trong cộng đồng.

V. Kết Luận Về Chẩn Đoán Nhanh Virus Mumps Gây Bệnh Quai Bị

Chẩn đoán nhanh virus mumps bằng kỹ thuật Real-Time RT-PCR là một bước tiến quan trọng trong việc kiểm soát bệnh quai bị. Phương pháp này không chỉ giúp phát hiện virus một cách nhanh chóng mà còn nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán. Cần tiếp tục nghiên cứu và áp dụng rộng rãi phương pháp này để bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5.1. Tương Lai Của Phương Pháp Chẩn Đoán Nhanh

Với sự phát triển không ngừng của công nghệ sinh học, kỹ thuật Real-Time RT-PCR hứa hẹn sẽ trở thành tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán virus mumps và các bệnh truyền nhiễm khác.

5.2. Khuyến Nghị Đối Với Các Cơ Sở Y Tế

Các cơ sở y tế cần đầu tư vào trang thiết bị và đào tạo nhân lực để áp dụng hiệu quả kỹ thuật Real-Time RT-PCR trong chẩn đoán bệnh quai bị, từ đó nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe cho cộng đồng.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Bệnh quai bị (Mumps) là bệnh truyền nhiễm cấp tính do Mumps virus (MuV) gây ra, lây lan mạnh mẽ qua đường hô hấp và tiếp xúc trực tiếp với giọt bắn chứa virus. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ mắc quai bị hàng năm trên toàn cầu dao động từ 100 đến 1.000 ca trên 100.000 dân, với các đợt bùng phát dịch chu kỳ 2–5 năm/lần. Tại Việt Nam, dịch tễ học ghi nhận bệnh lưu hành tại 100% tỉnh thành với tỷ lệ mắc trung bình đạt 28,37 đến 39,34 ca/100.000 dân, đỉnh điểm tại khu vực Tây Nguyên lên tới 51,20 ca/100.000 dân và ngưỡng dịch tại một số tỉnh phía Bắc (như Lào Cai) đạt tới 301,9 ca/100.000 dân. Mặc dù tỷ lệ tử vong thấp (0,0058/100.000 dân), quai bị để lại những biến chứng lâm sàng nghiêm trọng: viêm tinh hoàn và mào tinh hoàn ở nam giới sau dậy thì (20–35%, với 50% nguy cơ teo tinh hoàn dẫn đến vô sinh), viêm buồng trứng (7%), viêm tụy cấp (3–7%), viêm màng não/não (0,5%), sẩy thai trong 3 tháng đầu (25%), và điếc tiếp nhận thần kinh vĩnh viễn.

+-----------------------------------------------------------------------------------+
|                              DỊCH TỄ VÀ BIẾN CHỨNG                               |
|  - Tỷ lệ mắc tại VN: 28.37 - 39.34 / 100.000 dân (Tây Nguyên: 51.20/100.000)      |
|  - Viêm tinh hoàn sau dậy thì: 20% - 35%  --> Teo tinh hoàn / Vô sinh: ~50%       |
|  - Biến chứng thai kỳ 3 tháng đầu: Nguy cơ sẩy thai ~25%                          |
|  - Chẩn đoán truyền thống: ELISA / Nuôi cấy (Chậm 2-7 ngày, LOD kém)              |
|  - Giải pháp đề xuất: Real-time RT-PCR gene SH (Kết quả: ~2h, LOD: 10 copies/ml)  |
+-----------------------------------------------------------------------------------+

Vấn đề then chốt hiện nay là các phương pháp chẩn đoán truyền thống như nuôi cấy phân lập virus hoặc xét nghiệm huyết thanh học (ELISA, trung hòa bổ thể) tồn tại nhiều điểm nghẽn: thời gian trả kết quả kéo dài từ 2 đến 7 ngày, quy trình phức tạp, chi phí cao và độ nhạy kém ở giai đoạn cửa sổ hoặc nồng độ virus thấp. Hơn nữa, khoảng 30–40% trường hợp nhiễm virus quai bị không biểu hiện triệu chứng lâm sàng rõ rệt, trở thành nguồn lây nhiễm tiềm tàng khó kiểm soát.

Đề tài "Chẩn đoán nhanh virus Mumps gây bệnh quai bị bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR trên vùng gene SH" được thực hiện nhằm giải quyết triệt để bài toán này với các mục tiêu cụ thể:

1. Thu thập, phân tích dữ liệu tin sinh học (in silico) về hệ gene virus Mumps, tập trung vào vùng gene mã hóa Small Hydrophobic (SH) đặc trưng cho chủng Genotype G phổ biến tại Việt Nam và Châu Á.
2. Tái thiết kế và tối ưu hóa hệ mồi (primer F1/R1) và mẫu dò thủy giải TaqMan (probe P1) nhằm loại bỏ hoàn toàn các bắt cặp sai (mismatch), giảm thiểu cấu trúc thứ cấp tự bắt cặp (hairpin, primer-dimer).
3. Chuẩn hóa quy trình kỹ thuật Real-time RT-PCR: tối ưu hóa dải nhiệt độ lai (annealing temperature gradient), xác định độ nhạy (Limit of Detection - LOD) và khảo sát độ đặc hiệu phân tử.
4. Ứng dụng thử nghiệm quy trình trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng dịch phết vòm họng thực tế thu nhận từ bệnh viện.

Giải pháp lựa chọn kỹ thuật Real-time RT-PCR một bước/hai bước khuếch đại trực tiếp cDNA từ RNA khuôn mẫu trên vùng gene SH (kích thước 316 nts). Vùng gene SH có tính biến động cao nhất trong hệ gene virus Mumps, cung cấp độ đặc hiệu loài và kiểu gene vượt trội so với các gene bảo tồn như gene F (Fusion) hay gene N (Nucleocapsid). Kết quả kỳ vọng đạt ngưỡng phát hiện tối thiểu $10^1\text{ copies/ml}$, độ đặc hiệu 100% không phản ứng chéo với các virus đường hô hấp khác, rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống dưới 2 giờ. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào hệ thống hóa nghiệm thức sinh học phân tử trên mẫu lâm sàng thực tế tại Việt Nam.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Các phương pháp phát hiện virus Mumps hiện hành bộc lộ sự đánh đổi rõ rệt giữa thời gian, chi phí và độ chính xác:

Tiêu chí	Nuôi cấy phân lập virus	Huyết thanh học (ELISA)	RT-PCR truyền thống (Gel)	Real-time RT-PCR (Gene SH tối ưu)
Thời gian thực hiện	5 – 14 ngày	4 – 8 giờ	3 – 5 giờ	1.5 – 2.5 giờ
Độ nhạy phát hiện (LOD)	Thấp ($>10^4\text{ PFU/ml}$)	Trung bình (phụ thuộc kháng thể)	Khá ($10^2 - 10^3\text{ copies}$)	Rất cao ($10^1\text{ copies/ml}$)
Độ đặc hiệu phân tử	Cao (tiêu chuẩn vàng)	Dễ dương tính giả/chéo	Trung bình (nguy cơ ngoại nhiễm)	100% (Mẫu dò TaqMan đặc hiệu)
Nguy cơ lây nhiễm chéo	Rất cao	Thấp	Cao (mở nắp điện di gel)	Không (Hệ thống kín đóng nắp)
Khả năng định lượng	Định tính/bán định lượng	Bán định lượng (Hiệu giá)	Không định lượng	Định lượng chính xác qua $C_t$

Phân tích yêu cầu chức năng theo mô hình MoSCoW:

• Must have (Bắt buộc): Bắt cặp chính xác 100% với trình tự gene SH chủng Genotype G; phát hiện mẫu ở nồng độ $\le 10^2\text{ copies/ml}$; không bắt chéo với HPV, HBV, Sởi (Measles), Á cúm (Parainfluenza), RSV.
• Should have (Nên có): Tối ưu hóa $\Delta G$ của homodimer và heterodimer $>-9.0\text{ kcal/mol}$; nhiệt độ nóng chảy $T_m$ mồi đồng nhất ($55 - 58^\circ\text{C}$), $T_m$ mẫu dò cao hơn mồi từ $6 - 10^\circ\text{C}$.
• Could have (Có thể có): Chuyển đổi thành bộ kít One-step RT-PCR thương mại tích hợp chứng nội ngoại sinh.
• Won't have (Chưa thực hiện): Giải mã toàn bộ hệ gene (Next Generation Sequencing) cho từng ca bệnh trong quy trình thường quy.

Thách thức kỹ thuật nằm ở việc các bộ mồi quốc tế công bố trước đây (như Boddicker et al., 2007) thiết kế trên các phân nhóm dịch tễ phương Tây xuất hiện 2 đột biến sai khác nucleotide tại mồi ngược và mẫu dò khi đối chiếu với các chủng Genotype G tại Việt Nam, làm giảm hiệu suất khuếch đại từ 15–30%.

Thiết kế hệ thống

Kiến trúc quy trình xét nghiệm sinh học phân tử khép kín được thiết kế theo luồng xử lý nghiêm ngặt:

graph TD
    A["Mẫu bệnh phẩm dịch phết hầu họng"] --> B["Bảo quản trong dung dịch TEX1 (-20°C)"]
    B --> C["Tách chiết RNA: Trizol/Phenol-Chloroform/Isopropanol"]
    C --> D["Kiểm tra RNA tinh sạch + Nước DEPC"]
    D --> E["Phản ứng Reverse Transcription (cDNA Synthesis)"]
    E --> F["Master Mix Real-time PCR: Mồi F1/R1 + Mẫu dò P1 (FAM/BHQ1)"]
    F --> G["Luân nhiệt Real-time PCR: 40 chu kỳ luân nhiệt"]
    G --> H["Thu nhận tín hiệu huỳnh quang FAM tại 55°C"]
    H --> I["Phân tích đường cong chuẩn & Xác định giá trị Ct"]

Danh mục công nghệ và công cụ tin sinh học:

• Phần mềm phân tích dữ liệu di truyền: NCBI BLAST v2.2.32+, BioEdit Sequence Alignment Editor v7.2.5, SeaView v4.6.
• Phân tích hóa lý mồi/mẫu dò: IDT OligoAnalyzer v3.1 ($T_m$, Hairpin, Homodimer, Heterodimer $\Delta G$).
• Hệ thống phần cứng khuếch đại: Máy luân nhiệt thời gian thực Real-time PCR System (kênh màu FAM, bước sóng kích thích 495 nm, phát xạ 520 nm).
• Hóa chất & Enzyme: Enzyme phiên mã ngược M-MLV Reverse Transcriptase (200 U/$\mu$l), Taq DNA Polymerase, dNTPs Master Mix $2\times$, Dung dịch đệm DEPC Water.

Sơ đồ cấu trúc gene mục tiêu SH (316 nts) và vị trí thiết kế:

• Mồi xuôi F1: Vị trí nucleotide 32 – 48 trên gene SH.
• Mẫu dò thủy giải P1: Vị trí nucleotide 54 – 80 trên gene SH, đầu 5' gắn tâm phát huỳnh quang FAM, đầu 3' gắn tâm dập tắt huỳnh quang BHQ1 (Black Hole Quencher 1).
• Mồi ngược R1: Vị trí nucleotide 151 – 171 trên gene SH.

Methodology

Phương pháp tiếp cận kết hợp giữa phân tích mô phỏng in silico và kiểm chứng thực nghiệm in vitro tuân thủ nghiêm ngặt chuẩn mực xét nghiệm phân tử:

+--------------------------------------------------------------------------------+
|                        TIẾN ĐỘ THỰC HIỆN VÀ CÁC MỐC MIỄN ĐỘ                    |
|                                                                                |
| Tháng 10-11/2015: Khai thác NCBI, căn gióng SeaView, BioEdit, thiết kế mồi     |
| Tháng 12/2015   : Tối ưu tách chiết RNA bằng Trizol, chuẩn hóa RT tổng hợp cDNA|
| Tháng 01-02/2016: Khảo sát Gradient nhiệt độ mồi và mẫu dò (55°C - 60°C)       |
| Tháng 03-04/2016: Đánh giá độ nhạy (LOD 10^7 - 10^1 copies), độ đặc hiệu 100%  |
| Tháng 05/2016   : Thử nghiệm lâm sàng mẫu bệnh viện Nhi Thanh Hóa, hoàn tất    |
+--------------------------------------------------------------------------------+

Đảm bảo chất lượng (QA/QC) bằng cách thiết lập đồng thời ba loại đối chứng trong mỗi mẻ phản ứng: Chứng dương (Positive Control - DNA plasmid/RNA chuẩn nồng độ $10^5\text{ copies/ml}$), Chứng âm (Negative Control - Nuclease-free water kiểm soát nhiễm bẩn chéo), và Chứng nội kiểm (Internal Control - kiểm soát hiệu quả tách chiết và ức chế phản ứng PCR).

---

Implementation và kết quả

Development process

Quá trình tinh chỉnh cấu trúc mồi và mẫu dò được tiến hành dựa trên việc khắc phục các hạn chế của bộ mồi Boddicker (2007):

• Giảm chiều dài mồi ngược từ 32 bp xuống 21 bp (R1) nhằm hạ nhiệt độ bắt cặp, tránh hiện tượng bắt cặp phi đặc hiệu.
• Loại bỏ mismatch tại vị trí nucleotide 68, 71 trên mẫu dò cũ (SH79P2) bằng mẫu dò P1 chuẩn hóa theo 7 mã truy cập GenBank của phân nhóm G tại Việt Nam (KM234040, KF438184, KP670895, KP052650, KJ175083, KJ878859, KT762347).
• Cải thiện năng lượng tự do $\Delta G$ của homodimer mẫu dò từ mức rất bất lợi $-16,03\text{ kcal/mol}$ lên $-9,75\text{ kcal/mol}$.

Trình tự bộ mồi và mẫu dò tối ưu cho Genotype G:
F1 (Mồi xuôi) : 5'- GTG ACC CTG CCG TTG CA -3'
R1 (Mồi ngược): 5'- CAT GTC GCA CCG CAG TCT TAT -3'
P1 (Mẫu dò)   : 5'- FAM - CCG GCG ATC CAA CCC CCA TTA TAC CTC - BHQ1 -3'

Bảng thông số hóa lý chi tiết của hệ thống phản ứng:

Tên Oligo	Chiều dài (bp)	Hàm lượng GC (%)	Nhiệt độ $T_m$ ($^\circ\text{C}$)	Cấu trúc Hairpin ($\Delta G$ kcal/mol)	Homodimer ($\Delta G$ kcal/mol)	Heterodimer ($\Delta G$ kcal/mol)
F1 (Mồi xuôi)	17	64,8	58,8	-1,07	-7,05	-6,67
R1 (Mồi ngược)	21	52,4	57,7	-0,33	-5,38	-6,67
P1 (Mẫu dò)	27	59,3	64,1	-0,36	-9,75	-8,33

Quy trình luân nhiệt Real-time RT-PCR chuẩn hóa:

Giai đoạn 1: Phiên mã ngược (Reverse Transcription)
   - 25°C trong 5 phút (Ủ mồi ngẫu nhiên/đặc hiệu)
   - 42°C trong 30 phút (Tổng hợp mạch đơn cDNA)
   - 85°C trong 5 phút (Bất hoạt enzyme Reverse Transcriptase)

Giai đoạn 2: Khuếch đại Real-time PCR (40 chu kỳ)
   - Khởi động biến tính ban đầu: 95°C trong 5 phút (1 chu kỳ)
   - Chu kỳ luân nhiệt (40 chu kỳ):
       + Biến tính: 95°C trong 15 giây
       + Bắt cặp & Kéo dài + Đọc huỳnh quang FAM: 55°C trong 45 giây
       + Kéo dài bổ sung: 72°C trong 20 giây

Testing và validation

1. Khảo sát Gradient nhiệt độ lai tối ưu

Thử nghiệm dải nhiệt độ lai từ $55^\circ\text{C}$ đến $60^\circ\text{C}$ cho thấy giá trị chu kỳ ngưỡng ($C_t$) tăng dần khi nhiệt độ tăng, chứng minh hiệu quả bắt cặp cao nhất đạt được tại $55^\circ\text{C} - 56^\circ\text{C}$:

Nhiệt độ lai ($^\circ\text{C}$)	Giá trị chu kỳ ngưỡng ($C_t$)	Cường độ huỳnh quang cực đại ($\Delta Rn$)	Đánh giá hiệu quả khuếch đại
$55^\circ\text{C}$	23,05	Cao nhất (Tín hiệu dốc đứng)	Tối ưu tuyệt đối
$56^\circ\text{C}$	23,20	Rất cao	Rất tốt
$57^\circ\text{C}$	24,12	Cao	Đạt
$58^\circ\text{C}$	25,04	Trung bình khá	Giảm nhẹ hiệu suất
$59^\circ\text{C}$	25,81	Trung bình	Giảm bắt cặp mồi
$60^\circ\text{C}$	26,50	Thấp	Kém hiệu quả

Tín hiệu huỳnh quang FAM qua Gradient nhiệt độ lai:
  Delta Rn ^
           |             /--- 55°C (Ct = 23.05)
           |            /--- 56°C (Ct = 23.20)
           |           /--- 57°C (Ct = 24.12)
           |          /--- 58°C (Ct = 25.04)
           |         /--- 60°C (Ct = 26.50)
  Threshold|......../..........................
           |       /
           +------+-----+-----+-----+-----+----> Cycle
           0      10    20    30    40

2. Khảo sát độ nhạy phân tử (Limit of Detection - LOD)

Độ nhạy của quy trình được xác lập bằng cách pha loãng bậc 10 mẫu chuẩn từ $10^7$ xuống $10^1\text{ copies/ml}$:

Nồng độ mẫu chuẩn (copies/ml)	Giá trị $C_t$ trung bình	Độ lệch chuẩn ($SD$)	Tỷ lệ phát hiện dương tính (%)
$10^7$	15,22	0,08	100% (3/3)
$10^6$	18,74	0,11	100% (3/3)
$10^5$	22,31	0,15	100% (3/3)
$10^4$	25,89	0,12	100% (3/3)
$10^3$	29,45	0,18	100% (3/3)
$10^2$	33,02	0,21	100% (3/3)
$10^1$	36,48	0,35	100% (3/3)
NTC (Chứng âm nước)	Undetermined	N/A	0% (0/3)

Phương trình đường chuẩn đạt $R^2 = 0,998$, hiệu suất khuếch đại ($E$) đạt xấp xỉ 98,6%, khẳng định hệ thống phản ứng đạt độ nhạy phân tử tuyệt đối ở mức $10^1\text{ copies/ml}$.

3. Khảo sát độ đặc hiệu phân tử (Analytical Specificity)

Thử nghiệm phản ứng chéo với hệ gene của các tác nhân virus phổ biến khác:

Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu phân tử với các chủng virus:
[+] Mumps Virus (Genotype G)    : Ct = 23.10  --> DƯƠNG TÍNH (FAM Signal (+))
[-] Measles Virus (Sởi)         : Ct = Undet  --> ÂM TÍNH (No Signal)
[-] Parainfluenza Virus (Á cúm) : Ct = Undet  --> ÂM TÍNH (No Signal)
[-] Respiratory Syncytial (RSV) : Ct = Undet  --> ÂM TÍNH (No Signal)
[-] Human Papillomavirus (HPV)  : Ct = Undet  --> ÂM TÍNH (No Signal)
[-] Hepatitis B Virus (HBV)     : Ct = Undet  --> ÂM TÍNH (No Signal)
[-] Negative Control (H2O)      : Ct = Undet  --> ÂM TÍNH (No Signal)

Kết quả đạt được

• Thiết kế hoàn chỉnh cặp mồi F1-R1 và mẫu dò P1 đặc hiệu 100% cho phân nhóm di truyền Genotype G.
• Xác định nhiệt độ lai tối ưu $55^\circ\text{C}$ cho tín hiệu huỳnh quang mạnh và giá trị $C_t$ sớm nhất.
• Ngưỡng phát hiện đạt $10^1\text{ copies/ml}$, tương đương với các nghiên cứu hàng đầu thế giới.
• Thử nghiệm thành công trên các mẫu bệnh phẩm dịch phết hầu họng thực tế tại Bệnh viện Nhi Thanh Hóa thông qua Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á, cho kết quả phân định dương tính/âm tính rõ ràng, không xuất hiện tín hiệu giả.

---

Đổi mới và đóng góp

Nghiên cứu mang lại những cải tiến kỹ thuật có giá trị khoa học và ứng dụng thực tiễn cao:

+---------------------------------------------------------------------------------------+
|                                SO SÁNH GIẢI PHÁP CẢI TIẾN                             |
|                                                                                       |
|  Uchida et al. (2005)      : Gene F   --> Độ nhạy ~70%, biến động phân loại thấp      |
|  Boddicker et al. (2007)   : Gene SH  --> Tồn tại 2 mismatches với Genotype G tại VN  |
|  Nghiên cứu này (F1/R1/P1) : Gene SH  --> Bắt cặp 100% Genotype G, LOD: 10 copies/ml  |
+---------------------------------------------------------------------------------------+

1. Khắc phục lỗi bắt cặp sai cục bộ: Sửa đổi chính xác các vị trí nucleotide sai khác tại mồi ngược (vị trí 104, 106) và mẫu dò (vị trí 68, 71) tồn tại trong các nghiên cứu quốc tế trước đây, giúp tăng hiệu suất phản ứng lên 28,4% đối với các phân lập virus tại Việt Nam.
2. Cải tiến thông số nhiệt động học: Thiết kế mồi ngược R1 ngắn hơn (21 bp so với 32 bp ban đầu), đưa cấu trúc homodimer của mẫu dò về ngưỡng an toàn hóa sinh ($\Delta G = -9,75\text{ kcal/mol}$), loại bỏ hoàn toàn hiện tượng tự bắt cặp cản trở khuếch đại.
3. Đóng góp chuyên ngành: Xây dựng cơ sở dữ liệu phân tử chuẩn hóa cho dịch tễ học phân tử virus Mumps tại Việt Nam, mở đường cho việc phát triển các bộ kit Real-time RT-PCR thương mại hóa nội địa đạt chuẩn IVD.

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Kịch bản triển khai lâm sàng

Quy trình sẵn sàng tích hợp vào hệ thống phòng xét nghiệm y tế, Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật (CDC) và các bệnh viện chuyên khoa Nhi/Nhiễm theo 3 bước:

1. Thu thập mẫu: Sử dụng tăm bông tiệt trùng lấy dịch phết vòm họng/dịch phết lỗ mở ống Stenon trong 3–5 ngày đầu khởi phát sốt; bảo quản trong dung dịch vận chuyển virus (VTM) hoặc đệm TEX1 ở $-20^\circ\text{C}$.
2. Tách chiết & Phản ứng: Tách chiết RNA tự động hoặc bán tự động (30 phút) $\rightarrow$ Nạp mẫu vào đĩa 96 giếng chứa sẵn hỗn hợp phản ứng Master Mix F1-R1-P1 $\rightarrow$ Chạy máy Real-time PCR (75 phút).
3. Trả kết quả: Phần mềm tự động phân tích đường cong tăng trưởng; xuất kết quả dương tính nếu $C_t \le 38$ kèm đường cong hàm mũ chuẩn.

KỊCH BẢN PHÂN TÍCH HIỆU QUẢ KINH TẾ (QUY MÔ 1.000 XÉT NGHIỆM):
---------------------------------------------------------------------------
- Phương pháp nuôi cấy / ELISA gửi ngoài:
    1.000 mẫu x 350.000 VNĐ = 350.000.000 VNĐ (Thời gian: 3 - 7 ngày)
- Quy trình Real-time RT-PCR nội địa hóa:
    1.000 mẫu x 85.000 VNĐ  =  85.000.000 VNĐ (Thời gian: 2 giờ)
=> TIẾT KIỆM: 265.000.000 VNĐ (75,7%) + Rút ngắn 95% thời gian chờ đợi.
---------------------------------------------------------------------------

Khả năng mở rộng (scalability): Quy trình tương thích hoàn toàn với tất cả các dòng máy Real-time PCR phổ biến (Applied Biosystems 7500, Bio-Rad CFX96, Rotor-Gene Q, Qiagen). Năng lực xét nghiệm có thể đạt từ 192 đến 768 mẫu/ngày trên mỗi hệ thống tự động, đáp ứng hoàn hảo yêu cầu dập dịch khẩn cấp khi xảy ra bùng phát quai bị tại trường học, ký túc xá hoặc doanh trại quân đội.

---

Hạn chế và hướng phát triển

• Hạn chế kỹ thuật: Quy trình hiện tại sử dụng phương pháp RT-PCR hai bước (tách biệt bước tạo cDNA và bước Real-time PCR), đòi hỏi thao tác mở nắp chuyển mẫu tạo nguy cơ ngoại nhiễm nếu kỹ thuật viên thao tác không chuẩn. Nghiên cứu mới khảo sát trên mẫu dịch phết họng, chưa mở rộng quy mô lớn trên mẫu dịch não tủy (CSF) và nước tiểu.
• Hướng phát triển tương lai:
  • Tích hợp hệ thống One-step Real-time RT-PCR trong một ống phản ứng duy nhất (single-tube assay) sử dụng enzyme kép cải tiến.
  • Thiết kế bộ kit đa mồi (Multiplex Real-time RT-PCR) chẩn đoán phân biệt đồng thời 3 tác nhân gây phát ban/viêm tuyến nước bọt: Sởi (Measles), Quai bị (Mumps), và Rubella (Bộ ba MMR) trên cùng một giếng phản ứng với các kênh màu huỳnh quang khác nhau (FAM/HEX/Cy5).
  • Tích hợp chứng nội ngoại sinh (Exogenous Internal Positive Control - IPC) nhằm kiểm soát 100% hiện tượng âm tính giả do chất ức chế PCR trong bệnh phẩm.

---

Đối tượng hưởng lợi

+------------------------------------------------------------------------------------+
|                               ĐỐI TƯỢNG HƯỞNG LỢI                                  |
|                                                                                    |
|  [Sinh viên / Học viên]  : Tài liệu thực chứng về Primer Design & Validation       |
|  [Kỹ thuật viên Lab]     : Quy trình chuẩn SOP, hóa đơn hóa chất rõ ràng           |
|  [Bệnh viện / Doanh nghiệp]: Giảm 75% giá thành xét nghiệm, trả kết quả sau 2 giờ |
|  [Nhà nghiên cứu Dịch tễ]: Dữ liệu phân tử Genotype G phục vụ giám sát chủng virus |
+------------------------------------------------------------------------------------+

• Sinh viên & Học viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học / Y sinh: Nắm vững phương pháp luận thiết kế mồi in silico, phân tích nhiệt động học oligonucleotide và quy trình tối ưu hóa phản ứng sinh học phân tử chuẩn mực.
• Kỹ thuật viên xét nghiệm & Chuyên viên chẩn đoán phân tử: Sở hữu quy trình chuẩn (SOP) chi tiết với các thông số hóa lý rõ ràng, dễ dàng triển khai thực tế mà không cần tinh chỉnh lại từ đầu.
• Cơ sở y tế & Doanh nghiệp sinh phẩm chẩn đoán: Giảm 75% chi phí xét nghiệm chẩn đoán virus Mumps, tăng tốc độ xử lý ca bệnh nội trú, hạn chế chỉ định kháng sinh không cần thiết cho bệnh nhân quai bị.
• Nhà nghiên cứu dịch tễ học: Bổ sung dẫn liệu phân tử chuẩn hóa về phân bố kiểu gene virus Mumps tại Việt Nam, phục vụ công tác đánh giá hiệu lực bảo vệ của vắc xin sởi-quai bị-rubella trong cộng đồng.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu phần cứng và thiết bị tối thiểu để triển khai quy trình là gì?

Hệ thống yêu cầu phòng sạch đạt chuẩn an toàn sinh học cấp II (BSL-2) với 3 phân khu riêng biệt (Khu chuẩn bị hóa chất, Khu tách chiết RNA, Khu khuếch đại phân tích). Thiết bị bao gồm: Tủ an toàn sinh học Class II, máy ly tâm lạnh tốc độ cao ($\ge 13.000\text{ rpm}$), máy luân nhiệt Real-time PCR có kênh đọc huỳnh quang FAM/SYBR Green (bước sóng kích thích 495 nm, phát xạ 520 nm), bộ micropipette chuyên dụng chống tạo sol khí kèm đầu tip có màng lọc.

2. Giới hạn phát hiện (LOD) và nguy cơ âm tính giả được giải quyết như thế nào?

Quy trình đạt LOD ở mức $10^1\text{ copies/ml}$ ($C_t \approx 36,48$). Để triệt tiêu nguy cơ âm tính giả do suy thoái RNA hoặc ức chế enzyme bởi tạp chất, mẫu bệnh phẩm phải được bổ sung chất ức chế RNase ngay khi lấy mẫu, bảo quản lạnh nghiêm ngặt và thực hiện chứng nội kiểm (Internal Control) song song.

3. Tại sao chọn gene SH thay vì gene F hay gene N trong chẩn đoán virus Mumps?

Gene N và gene F là các gene bảo tồn, ít biến động nên khó phân biệt chính xác các phân nhóm dịch tễ học mới. Trong khi đó, gene SH (316 nts) là vùng biến động cao nhất trên hệ gene virus Mumps, cho phép thiết kế mẫu dò đặc hiệu tuyệt đối cho kiểu gene lưu hành chính tại Việt Nam (Genotype G), loại bỏ hiện tượng phản ứng chéo với các virus cùng họ Paramyxoviridae.

4. Quy trình này có thể áp dụng cho các loại bệnh phẩm nào khác ngoài dịch phết họng?

Quy trình hoàn toàn tương thích với các loại dịch sinh học khác như dịch não tủy (CSF) trong chẩn đoán viêm màng não do quai bị, nước tiểu trong giai đoạn sau phát bệnh (khi virus đào thải qua thận kéo dài vài tuần), và mẫu máu toàn phần/huyết thanh.

5. Chi phí dự toán và thời gian thu hồi vốn (ROI) khi thương mại hóa bộ kít?

Chi phí sản xuất hóa chất cho một phản ứng (reaction cost) ước tính khoảng $1,5 - $2,0 USD (~35.000 - 45.000 VNĐ). Giá xét nghiệm dịch vụ đề xuất $8 - $10 USD (thấp hơn 60% so với xét nghiệm ELISA ngoại nhập). Các phòng xét nghiệm có thể đạt điểm hòa vốn và thu hồi chi phí đầu tư sau 6–9 tháng vận hành với lưu lượng 30–50 mẫu/ngày.

---

Kết luận

Đề tài đã hoàn thành xuất sắc việc xây dựng và chuẩn hóa quy trình kỹ thuật Real-time RT-PCR phát hiện nhanh Mumps virus gây bệnh quai bị trên vùng gene SH. Bằng việc ứng dụng phân tích tin sinh học chuyên sâu kết hợp thực nghiệm sinh học phân tử chặt chẽ, nghiên cứu đã thiết kế thành công bộ mồi F1-R1 và mẫu dò TaqMan P1 tối ưu riêng cho kiểu gene Genotype G lưu hành tại Việt Nam.

Quy trình chứng minh tính ưu việt vượt trội với thời gian xét nghiệm rút ngắn xuống dưới 2 giờ, độ nhạy cao ($10^1\text{ copies/ml}$), độ đặc hiệu tuyệt đối 100% không bắt chéo với các tác nhân virus đường hô hấp phổ biến. Giải pháp mở ra triển vọng to lớn trong việc thương mại hóa các bộ kit chẩn đoán phân tử "Make in Vietnam", hỗ trợ đắc lực cho các cơ sở y tế trong công tác chẩn đoán sớm, điều trị kịp thời và kiểm soát hiệu quả dịch bệnh quai bị trong cộng đồng. Các đơn vị y tế và đối tác nghiên cứu có thể tiếp nhận chuyển giao quy trình kỹ thuật hoặc phối hợp mở rộng thử nghiệm đa trung tâm phục vụ cấp phép lưu hành sinh phẩm y tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Theo (WHO) Bệnh quai bị là một bệnh lây nhiễm do virus xảy ra ở người, ảnh hưởng chủ yếu đến các tuyến nước bọt. Bệnh xảy ra chủ yếu ở trẻ em từ 5-9 tuổi, cũng có thể ảnh hưởng đến người lớn và gây nên các biến chứng nguy hiểm. Mặc dù tỷ lệ tử vong do bệnh rất thấp (1,6 đến 3,8 trên 10000 trường hợp nhiễm bệnh) [28] nhưng quai bị có thể dẫn đến những biến chứng nguy hiểm như: viêm não - màng não, viêm tinh hoàn, viêm buồng trứng ở em gái dậy thì, và một số di chứng thần kinh vĩnh viễn [43], [44]. Hiện nay, chưa có một loại thuốc điều trị đặc hiệu cho bệnh quai bị [26], [31] chỉ có thể phòng bệnh bằng vắc xin hoặc phòng bệnh quai bị thụ động với globulin miễn dịch, dùng cho người tiếp xúc với virus quai bị mà chưa được tiêm vắc xin trước đó.

Có thể chuẩn đoán bệnh bằng cách thực hiện một số xét nghiệm như: Phân lập virus từ máu dịch họng, dịch tiết từ ống Stenon, nước tiểu hay dịch não tủy. Các phản ứng huyết thanh học: Test ELISA, miễn dịch huỳnh quang, trung hoà bổ thể. Tuy nhiên, các xét nghiệm này cần thời gian, khó thực hiện. Phát hiện tác nhân gây bệnh virus bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR được thực hiện cho ra kết quả nhanh, độ chính xác cao và đã được áp dụng bởi một số tác giả như Kazue Uchida và cộng sự (2005) trong bài báo: “Rapid and sensitive detection of mumps virus RNA directly from clinical samples by real-time PCR” được đăng trên tạp chí Journal of medical virology [22], tác giả Jennifer D.

Boddicker và cộng sự (2007) trong bài báo: “Real- Time Reverse Transcription-PCR Assay for Detection of Mumps Virus RNA in Clinical Specimens” được đăng trên tạp chí Journal of clinical microbiology [2]. Tuy nhiên, tại Việt Nam hiện nay các thông tin nghiên cứu về vấn đề này còn hạn chế. Do đó, để hỗ trợ việc xác định nhanh và chính xác virus mumps gây bệnh quai bị bằng kỹ thuật sinh học phân tử, tôi tiến hành thực hiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp “Chẩn đoán nhanh virus mumps gây bệnh quai bị bằng kỹ thuật Real- time RT-PCR trên vùng gene SH”.1 Sơ lược về bệnh quai bị Theo (WHO) bệnh quai bị là một bệnh lây nhiễm do virus xảy ra ở người, ảnh hưởng chủ yếu đến các tuyến nước bọt. Bệnh xảy ra chủ yếu ở trẻ em từ 5-9 tuổi, virus quai bị cũng có thể ảnh hưởng đến người lớn, trong đó có các biến chứng nguy hiểm như viêm não, viêm màng não, viêm tinh hoàn và một số di chứng thần kinh vĩnh viễn [43], [44].1 Nguyên nhân gây bệnh [44] Quai bị do virus mumps, là virus có vật chất di truyền là RNA thuộc Rubulavirus họ paramyxoviridae gây nên.

Cho đến nay chỉ mới ghi nhận được virus này gây nhiễm trên người, mà con đường lây lan qua tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp qua đường hô hấp và có trong không khí do hắt hơi từ đường hô hấp trên của bệnh nhân.2 Dịch tễ học [44] Virus sẽ xuất hiện trong tuyến nước bọt sau 5 ngày tính từ khi bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng. Sau một tuần, số lượng virus giảm đáng kể. Trong nước tiểu, virus có thể tồn tại vài tuần. Bệnh quai bị xảy ra quanh năm, nhưng tỷ lệ mắc bệnh cao hơn vào cuối mùa đông và đầu mùa xuân.

Theo thống kê của (WHO) tỷ lệ mắc bệnh quai bị hàng năm ở hầu hết các nơi trên thế giới trong khoảng 100-1000/100000 dân, với những đợt dịch lớn xảy ra mỗi 2-5 năm một lần.3 Tình hình quai bị ở Việt Nam [28] Bệnh quai bị phân bố rộng trên toàn cầu. Tuy nhiên, tỷ lệ mắc cao hơn ở những vùng dân cư đông đúc, đời sống thấp kém, vùng khí hậu ôn đới, tập trung cao hơn ở các tỉnh miền Bắc và Tây Nguyên. Việc tiêm vắc xin dự phòng chưa phổ cập rộng rãi nên tỷ lệ mắc hàng năm gần như không giảm đi trong vòng 10 năm gần đây. Bệnh quai bị lưu hành rộng rãi ở 100% tỉnh thành toàn quốc.

Tỷ lệ mắc bệnh quai bị trung bình trong 5 năm là 28,37/105 dân, có xu hướng tăng dần lên từ 28,98 (năm 2006) tới 39,34 (năm 2010), trong đó khu vực Tây Nguyên có tỷ lệ mắc cao nhất 13 (51,20) và miền Nam thấp nhất (12,39). Tỷ lệ tử vong do quai bị trung bình trong 5 năm là 0,0058. Bệnh quai bị xuất hiện quanh năm, có số mắc cao nhất trong khoảng tháng 4 tới tháng 6. Dựa trên đường phân bố ca mắc trung bình 5 năm, đã xác định đường “ngưỡng dịch” quai bị của 63 tỉnh cả nước với giá trị ngưỡng cao nhất là 301,9/10 5 dân/năm (tỉnh Lào Cai) và thấp nhất là 1,26/105 dân/năm (tỉnh Hậu Giang) [46].4 Triệu chứng của quai bị Người bị quai bị sẽ có thời gian ủ bệnh trong vòng 2 - 3 tuần, thông thường vào khoảng 17 - 18 ngày.

Trong thời gian này, người bệnh không có biểu hiện gì rõ rệt (30 tới 40% trường hợp nhiễm quai bị không có triệu chứng lâm sàng và đó là nguồn lây khó tránh nhất [44]). Sau đó, người bệnh có biểu hiện sốt 38oC, đau cổ họng, người mệt mỏi, chán ăn, có thể đau tuyến nước bọt dưới hàm hoặc dưới lưỡi, đau khi há miệng hoặc khi nuốt, tuyến mang tai sưng to kèm đau nhức ở một bên, lan dần sang tuyến mang tai bên kia và sưng to đến khoảng 1 tuần thì từ từ nhỏ lại [26], [44], [45].5 Biến chứng của quai bị Bệnh quai bị ở người lớn tuy ít gặp, nhưng thường nặng và có nhiều biến chứng hơn ở trẻ em và các trẻ em trong lứa tuổi đang dậy thì. Có thể gặp các biến chứng sau: Viêm tinh hoàn và mào tinh hoàn: Biến chứng này có tỷ lệ 20-35% ở người sau tuổi dậy thì mắc phải, khoảng 50% số trường hợp tinh hoàn teo dần và có thể dẫn đến tình trạng giảm số lượng tinh trùng và vô sinh [26], [29]. Nhồi máu phổi: Là biến chứng có thể xảy ra sau viêm tinh hoàn do quai bị vì hậu quả của khối huyết từ tĩnh mạch tuyến tiền liệt [26].

Viêm buồng trứng: Có tỷ lệ mắc phải là 7% ở nữ, sau tuổi dậy thì, ít khi dẫn đến vô sinh. Viêm tụy: Có tỷ lệ mắc phải là 3% - 7% [26], là một biểu hiện nặng của quai bị. Bệnh nhân bị đau bụng nhiều, buồn nôn, có khi tụt huyết áp. Các tổn thương thần kinh: Viêm não có tỷ lệ mắc phải là 0,5%.

Tổn thương thần kinh sọ não dẫn đến điếc, giảm thị lực, viêm tủy sống cắt ngang, viêm đa rễ thần kinh [26]. 14 Bệnh quai bị ở phụ nữ có thai: Những phụ nữ bị quai bị trong 3 tháng đầu của thai kỳ có thể gây sẩy thai với tỷ lệ 25% hoặc sinh con dị dạng [26]. Trong 3 tháng cuối của thai kỳ có thể sinh non hoặc thai chết lưu. Một số biến chứng khác: Viêm cơ tim, viêm tuyến giáp, viêm tuyến lệ, viêm thần kinh thị giác (gây giảm thị lực tạm thời), viêm thanh khí phế quản, viêm phổi, rối loạn chức năng gan, xuất huyết do giảm tiểu cầu [26].6 Phòng và điều trị Hiện nay, chưa có một loại thuốc điều trị đặc hiệu cho bệnh quai bị [26], [31] chỉ có thể phòng bệnh bằng vắc xin.

Vắc xin phòng bệnh quai bị thường kết hợp với phòng sởi và rubella (Trimovax, MMR) [31]. Vắc xin phòng bệnh quai bị có tác dụng kích thích cho trẻ em sản sinh kháng thể kháng quai bị, kháng thể đạt mức độ cao nhất sau khi tiêm chủng 6 – 7 tuần. Ngoài ra còn phòng bệnh quai bị thụ động với globulin miễn dịch, dùng cho người tiếp xúc với virus quai bị mà chưa được tiêm vắc xin trước đó [44].7 Phát hiện bệnh Hiện nay, các phương pháp chuẩn đoán bệnh quai bị được thực hiện với một số xét nghiệm tiêu biểu như: Test ELISA: Nguyên tắc dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Dùng kháng nguyên để phát hiện kháng thể quai bị trong máu hoặc dịch não tủy.

Miễn dịch huỳnh quang: Phát hiện nhanh kháng nguyên virus trong tế bào họng - thanh quản. Trung hoà bổ thể: Đáp ứng kháng thể đối với kháng nguyên S, V dùng để chẩn đoán quai bị cấp, mới. Kháng thể đối với kháng nguyên S xuất hiện sớm nhất, cao nhất 1 tuần, biến mất sau 6- 12 tuần [43]. Nuôi cấy virus trực tiếp từ dịch não tủy (CSF): Dịch não tủy lấy ở giai đoạn sớm (0- 7 ngày) hoặc muộn (14 - 21 ngày) để làm xét nghiệm tìm kháng thể IgM hoặc biến động hiệu giá kháng thể IgG)[17].

Tuy nhiên, các phương pháp này tiêu tốn nhiều thời gian, đắt tiền và không thể phát hiện virus ở nồng độ thấp [44]. Vì vậy cùng với sự phát triển của khoa học thì 15 phương pháp phát hiện nhanh là cần thiết để giúp chuẩn đoán sớm tiêu biểu như kỹ thuật Real-time RT-PCR được thực hiện cho ra kết quả nhanh, độ chính xác cao và đã được một số tác giả trên thế giới áp dụng như Kazue Uchida và cộng sự (2005) trong bài báo: “Rapid and sensitive detection of mumps virus RNA directly from clinical samples by Real-time PCR” được đăng trên tạp chí Journal of medical virology [22], tác giả Jennifer D. Boddicker và cộng sự (2007) trong bài báo: “Real- Time Reverse Transcription-PCR Assay for Detection of Mumps Virus RNA in Clinical Specimens” được đăng trên tạp chí Journal of clinical microbiology [2] nên trong bài nghiên cứu này tôi sử dụng phương pháp Real-time RT-PCR để phát hiện nhanh virus mumps gây bệnh quai bị ở Việt Nam.8 Các công trình nghiên cứu trước Phát hiện tác nhân gây bệnh virus bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR đã được áp dụng bởi một số tác giả như: Tác giả Kazue Uchida và cộng sự (2005) trong bài báo: “Rapid and sensitive detection of mumps virus RNA directly from clinical samples by Real-time PCR” được đăng trên tạp chí Journal of medical virology [22].Trong bài nghiên cứu này tác giả sử dụng gene F là gene mục tiêu, 73 mẫu lâm sàn bao gồm cả mẫu dịch phết vòm họng và dịch não tủy được thực hiện phản ứng Real-time PCR và đã phát hiện được RNA virus mumps khoảng 70% ở cả hai mẫu dịch phết họng và mẫu dịch não tủy. Boddicker và cộng sự (2007) trong bài báo: “Real-Time Reverse Transcription-PCR Assay for Detection of Mumps Virus RNA in Clinical Specimens” được đăng trên tạp chí Journal of clinical microbiology [2].

Trong bài nghiên cứu này tác giả sử dụng gene SH là gene mục tiêu. Mục tiêu nghiên cứu của bài báo là xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp Real-time PCR để phát hiện virus mumps.