Xây dựng quy trình phát hiện cucumber mosaic virus tomato mosaic virus potato virus xvà potato virusy bằng kỹ thuật rtpcr phục vụ công tác tầm soát bệnh virus trên dưa leo cà chua và khoai tây

Tài liệu nghiên cứu Xây dựng quy trình phát hiện cucumber mosaic virus tomato mosaic virus potato virus xvà potato, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên sâu

• Tác giả: ThS. Nguyễn Xuân Dũng
• Trường học: Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Phát Hiện Virus Cucumber Mosaic, Tomato Mosaic, Potato Virus X và Y Bằng Kỹ Thuật RT-PCR
• Loại tài liệu: Báo Cáo Nghiệm Thu
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• 1.1. TÓM TẮT
• 1.2. THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Cucumber mosaic virus
• 1.1.1. Sơ lược về Cucumber mosaic virus
• 1.1.2. Triệu chứng của Cucumber mosaic virus
• 1.2. Tomato mosaic virus
• 1.2.1. Sơ lược về Tomato mosaic virus
• 1.2.2. Triệu chứng của Tomato mosaic virus
• 1.3. Sơ lược về Potato virus X
• 1.4. Triệu chứng của Potato virus X
• 1.5. Sơ lược về Potato virus Y
• 1.6. Triệu chứng của Potato virus Y
• 1.7. Giới thiệu về các phương pháp phát hiện virus
• 1.7.1. Phương pháp ELISA
• 1.7.2. Phương pháp RT-PCR
• 1.8. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 1.8.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 1.8.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2. Thu thập nguồn mẫu nhiễm virus
• 2.3. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho việc phát hiện virus
• 2.4. Ly trích virus (RNA virus) từ mẫu nhiễm bệnh
• 2.5. Thực hiện phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gen virus
• 2.6. Dòng hóa và kiểm tra trình tự của đoạn gen sau khi khuếch đại
• 2.7. Gắn đoạn gen mục tiêu vào vector nhân dòng
• 2.8. Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt
• 2.9. Tách plasmid từ tế bào vi khuẩn E.coli và giải trình tự
• 2.10. Tối ưu hóa phản ứng RT-PCR phát hiện virus
• 2.10.1. Tối ưu hóa các thành phần của phản ứng RT-PCR
• 2.10.2. Thiết lập phản ứng multiplex RT-PCR
• 2.10.3. Xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng PCR
• 2.10.4. Thiết lập phản ứng Real-time RT-PCR
• 2.10.5. Thực hiện phản ứng
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thu thập nguồn mẫu nhiễm virus
• 3.2. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu phát hiện virus
• 3.3. Ly trích RNA virus từ mẫu nhiễm bệnh
• 3.4. Khuếch đại đoạn gen virus bằng phản ứng RT-PCR
• 3.4.1. Chọn cặp mồi thích hợp
• 3.4.2. Xác định nhiệt độ bắt cặp mồi tối ưu
• 3.4.3. Trường hợp mồi phát hiện virus PVX
• 3.4.4. Trường hợp mồi phát hiện virus PVY
• 3.4.5. Trường hợp mồi phát hiện virus CMV
• 3.4.6. Trường hợp mồi phát hiện virus ToMV
• 3.5. Dòng hóa và kiểm tra trình tự gen sau khi khuếch đại
• 3.5.1. Kết quả chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp
• 3.6. Tối ưu hóa phản ứng RT-PCR phát hiện virus
• 3.6.1. Kết quả tối ưu hóa các thành phần của phản ứng RT-PCR
• 3.6.2. Kết quả phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời 2 và 3 loại virus trong cùng một 1 phản ứng
• 3.6.3. Kết quả xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng PCR thường, multiplex PCR
• 3.6.4. Kết quả phản ứng Real-time RT-PCR
• 3.6.4.1. Phản ứng Real-time
• 3.6.4.2. Phân tích Melt curve (điểm nóng chảy)
• 3.6.4.3. Xây dựng đường chuẩn
• 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. RT PCR Phát Hiện Virus CMV ToMV PVX PVY Tổng Quan

Cucumber mosaic virus (CMV), Tomato mosaic virus (ToMV), Potato virus X (PVX) và Potato virus Y (PVY) là những virus gây hại phổ biến trên dưa leo, cà chua và khoai tây. Đây là ba loại cây rau quả quan trọng của ngành trồng rau Việt Nam. Việc phát hiện nhanh chóng và chính xác các virus này có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc bảo vệ năng suất và chất lượng cây trồng. Kỹ thuật RT-PCR phát hiện virus trên cây trồng nổi lên như một giải pháp hiệu quả, độ nhạy cao để chẩn đoán bệnh virus thực vật bằng RT-PCR. Nghiên cứu này tập trung vào việc xây dựng quy trình phát hiện riêng lẻ hoặc đồng thời các loại virus này bằng kỹ thuật RT-PCR. Theo Quyết định số 46/QĐ-UBND của TP.HCM, việc xây dựng quy trình chẩn đoán virus gây bệnh chính trên rau màu là một mục tiêu quan trọng.

1.1. Giới thiệu chung về Cucumber Mosaic Virus CMV

Cucumber Mosaic Virus (CMV) được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1916 trên dưa leo. Nó thuộc giống Cucumovirus và gây bệnh cho nhiều loại cây trồng khác nhau. Bộ gen của CMV bao gồm 3 phần tử RNA mạch đơn. Virus này gây ra các triệu chứng như khảm lá, biến dạng lá và có thể gây tổn thất nghiêm trọng về kinh tế. Theo Zitter (2009), CMV gây bệnh trên nhiều loại cây trồng ở cả khu vực ôn đới và nhiệt đới. Triệu chứng bệnh có thể khác nhau tùy thuộc vào loài và tuổi của cây.

1.2. Giới thiệu chung về Tomato Mosaic Virus ToMV

Tomato Mosaic Virus (ToMV) là virus thuộc nhóm Tobamovirus, có hình que và chứa RNA mạch đơn. Nó gây bệnh trên nhiều loại cây trồng, bao gồm cà chua, khoai tây và thuốc lá. Bộ gen của ToMV mã hóa cho 4 protein quan trọng cho sự sao chép và di chuyển của virus. Theo Scholthof (2000), ToMV có kích thước khoảng 300 nm và gây bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau. Virus này có phổ ký chủ rất rộng, gây nhiễm trên nhiều loại cây trồng.

II. Thách Thức Phát Hiện Virus Phương Pháp RT PCR Giải Quyết

Việc phát hiện sớm và chính xác các loại virus gây bệnh trên cây trồng là một thách thức lớn. Các phương pháp truyền thống như quan sát triệu chứng thường không đủ tin cậy, đặc biệt khi nồng độ virus còn thấp hoặc cây trồng chưa biểu hiện rõ triệu chứng. Kỹ thuật RT-PCR nổi lên như một giải pháp vượt trội, có khả năng phát hiện virus ở giai đoạn sớm với độ nhạy cao. Trong khi ELISA có kết quả nhanh nhưng độ nhạy lại thấp, RT-PCR có thể phát hiện bệnh ngay cả trên các mẫu nhiễm không có biểu hiện triệu chứng rõ ràng. Đây là yếu tố then chốt để triển khai các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh hiệu quả.

2.1. Giới thiệu chung về Potato Virus X PVX và Potato Virus Y PVY

Potato Virus X (PVX) và Potato Virus Y (PVY) là hai loại virus quan trọng gây bệnh trên khoai tây. PVX có hình que và PVY có hình cầu. Cả hai loại virus này đều có thể gây ra các triệu chứng nghiêm trọng trên khoai tây, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng củ. Việc phát hiện sớm và chính xác PVX và PVY là rất quan trọng để quản lý bệnh hại. Theo Mecuria (2008), PVX có cấu trúc bộ gen đặc trưng và gây bệnh trên nhiều loại cây trồng.

2.2. Hạn chế của phương pháp phát hiện virus truyền thống

Các phương pháp phát hiện virus truyền thống như quan sát triệu chứng hoặc sử dụng kính hiển vi thường có độ nhạy thấp và không thể phát hiện virus ở giai đoạn sớm của bệnh. Điều này gây khó khăn cho việc kiểm soát dịch bệnh và có thể dẫn đến thiệt hại lớn cho người nông dân. Do đó, cần có các phương pháp phát hiện virus nhanh chóng, chính xác và có độ nhạy cao. Các phương pháp này phải phát hiện được bệnh ngay cả trên các mẫu nhiễm không có biểu hiện triệu chứng rõ ràng

III. Kỹ Thuật RT PCR Phương Pháp Phát Hiện Virus Ưu Việt Nhất

Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp sinh học phân tử có độ nhạy cao, được sử dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng RNA. Trong lĩnh vực nông nghiệp, RT-PCR được ứng dụng để phát hiện virus gây bệnh trên cây trồng, bao gồm CMV, ToMV, PVX và PVY. Ưu điểm vượt trội của RT-PCR so với các phương pháp truyền thống là khả năng phát hiện virus ở giai đoạn sớm, ngay cả khi nồng độ virus còn rất thấp. Điều này cho phép người nông dân và nhà khoa học can thiệp kịp thời, ngăn chặn sự lây lan của dịch bệnh và bảo vệ năng suất cây trồng.

3.1. Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật RT PCR

Kỹ thuật RT-PCR dựa trên nguyên lý chuyển đổi RNA thành cDNA (complementary DNA) bằng enzyme phiên mã ngược, sau đó sử dụng PCR để khuếch đại đoạn cDNA mục tiêu. Quá trình này cho phép khuếch đại số lượng lớn bản sao của đoạn gen virus, giúp dễ dàng phát hiện ngay cả khi số lượng virus ban đầu rất thấp. Kết quả phân tích RT-PCR virus thực vật có độ chính xác cao và có thể được sử dụng để định lượng virus trong mẫu bệnh.

3.2. Ưu điểm của RT PCR so với ELISA và các phương pháp khác

So với phương pháp ELISA, RT-PCR có độ nhạy cao hơn đáng kể, cho phép phát hiện virus ở giai đoạn sớm khi nồng độ virus còn thấp. RT-PCR cũng có độ đặc hiệu cao hơn, giảm thiểu nguy cơ dương tính giả. Ngoài ra, RT-PCR có thể được sử dụng để phát hiện nhiều loại virus cùng một lúc bằng kỹ thuật multiplex PCR, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí.

IV. Quy Trình RT PCR Chuẩn Phát Hiện CMV ToMV PVX PVY Hiệu Quả

Để đảm bảo hiệu quả và độ chính xác của việc phát hiện virus CMV, ToMV, PVX và PVY bằng kỹ thuật RT-PCR, cần tuân thủ một quy trình chuẩn. Quy trình này bao gồm các bước chính: thu thập mẫu bệnh, ly trích RNA virus, thiết kế và chọn cặp mồi đặc hiệu, thực hiện phản ứng RT-PCR, và phân tích kết quả. Việc tối ưu hóa các thành phần của phản ứng RT-PCR, như nồng độ enzyme, nhiệt độ ủ, và thời gian kéo dài, là rất quan trọng để đạt được độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất.

4.1. Thiết kế mồi đặc hiệu cho RT PCR phát hiện virus

Việc thiết kế mồi đặc hiệu là yếu tố then chốt để đảm bảo độ chính xác của phản ứng RT-PCR. Mồi cần phải có trình tự bổ sung với vùng gen đặc trưng của virus mục tiêu, tránh bắt cặp với các trình tự gen khác trong mẫu. Các phần mềm thiết kế mồi chuyên dụng có thể giúp lựa chọn các cặp mồi phù hợp, đảm bảo hiệu quả khuếch đại và giảm thiểu nguy cơ khuếch đại sai lệch.

4.2. Tối ưu hóa phản ứng RT PCR để tăng độ nhạy và đặc hiệu

Để tối ưu hóa phản ứng RT-PCR, cần điều chỉnh các thông số như nồng độ enzyme phiên mã ngược, nồng độ enzyme polymerase, nhiệt độ ủ, và thời gian kéo dài. Việc sử dụng các chất phụ gia như BSA (bovine serum albumin) hoặc DMSO (dimethyl sulfoxide) có thể giúp tăng hiệu quả khuếch đại. Ngoài ra, việc sử dụng máy PCR có chức năng gradient nhiệt độ có thể giúp xác định nhiệt độ ủ tối ưu cho từng cặp mồi.

4.3. Ly trích RNA virus từ mẫu bệnh hiệu quả nhất

Việc ly trích RNA virus chất lượng cao từ mẫu bệnh là bước quan trọng để đảm bảo thành công của phản ứng RT-PCR. Có nhiều phương pháp ly trích RNA khác nhau, bao gồm phương pháp sử dụng cột ly trích, phương pháp sử dụng phenol-chloroform, và phương pháp sử dụng hạt từ. Việc lựa chọn phương pháp ly trích phù hợp phụ thuộc vào loại mẫu bệnh và yêu cầu về độ tinh sạch của RNA.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Tầm Soát Bệnh Virus Trên Rau Màu

Quy trình RT-PCR phát hiện virus CMV, ToMV, PVX và PVY có thể được ứng dụng rộng rãi trong công tác tầm soát bệnh virus trên dưa leo, cà chua và khoai tây. Việc kiểm tra định kỳ các mẫu cây trồng tại các vùng trồng rau tập trung có thể giúp phát hiện sớm các trường hợp nhiễm virus, từ đó triển khai các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát kịp thời. Ứng dụng RT-PCR giúp phòng ngừa bệnh virus trên cây trồng và giảm thiểu thiệt hại kinh tế do bệnh virus gây ra.

5.1. Phát hiện virus trong mẫu cây trồng không triệu chứng

Một trong những ưu điểm lớn nhất của RT-PCR là khả năng phát hiện virus trong mẫu cây trồng không có triệu chứng rõ ràng. Điều này cho phép phát hiện sớm các trường hợp nhiễm virus tiềm ẩn, từ đó ngăn chặn sự lây lan của dịch bệnh trước khi gây ra thiệt hại lớn.

5.2. Giám sát dịch bệnh virus trên các vùng trồng rau

Quy trình RT-PCR có thể được sử dụng để giám sát dịch bệnh virus trên các vùng trồng rau, giúp theo dõi sự xuất hiện và lây lan của các loại virus gây bệnh. Thông tin này có thể được sử dụng để đưa ra các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh hiệu quả.

VI. Kết Luận Triển Vọng RT PCR Cho Nền Nông Nghiệp Bền Vững

Nghiên cứu này đã thành công trong việc xây dựng quy trình phát hiện Cucumber mosaic virus, Tomato mosaic virus, Potato virus X và Potato virus Y bằng kỹ thuật RT-PCR. Kết quả cho thấy RT-PCR là một công cụ mạnh mẽ và hiệu quả để phát hiện và kiểm soát các bệnh virus quan trọng trên cây trồng. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các kỹ thuật RT-PCR tiên tiến hơn, cũng như tích hợp RT-PCR vào các hệ thống giám sát dịch bệnh toàn diện để bảo vệ nền nông nghiệp Việt Nam khỏi các tác động tiêu cực của bệnh virus. Ứng dụng RT-PCR trong nông nghiệp góp phần quan trọng vào sự phát triển bền vững.

6.1. Phát triển các kỹ thuật RT PCR định lượng Real time RT PCR

Phát triển các kỹ thuật Real-time RT-PCR cho phép định lượng số lượng virus trong mẫu bệnh, cung cấp thông tin quan trọng về mức độ nhiễm bệnh và hiệu quả của các biện pháp kiểm soát. Theo báo cáo, phản ứng Real-time RT-PCR đã được sử dụng trong nghiên cứu này để định lượng virus.

6.2. Nghiên cứu tạo giống cây trồng kháng virus bằng công nghệ RNAi

Kết quả nghiên cứu này có thể được sử dụng làm tiền đề cho việc phân lập và dòng hóa gen của các virus gây bệnh trên rau tại Việt Nam. Nguồn gen phân lập được sẽ sử dụng làm vật liệu cho việc nghiên cứu thiết kế các vector chuyển gen phục vụ cho mục tiêu tạo ra các giống rau có khả năng kháng virus bằng công nghệ chuyển gen RNAi.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Dưa leo, cà chua và khoai tây là ba loại cây nằm trong số những loại cây rau chủ yếu có ảnh hưởng lớn đến sản xuất, chế biến, tiêu thụ, xuất khẩu và thu nhập của ngành trồng rau ở Việt Nam. Diện tích trồng các loại cây này không ngừng gia tăng trong nhiều năm qua nhằm đáp ứng cho nhu cầu tiêu thụ ngày càng tăng của thị trường trong nước cũng như xuất khẩu. Các vùng chuyên canh dưa leo, cà chua và khoai tây đã và đang được phát triển ở Việt Nam. Tuy nhiên, bên cạnh những thuận lợi có được, người trồng rau nói chung hay dưa leo, cà chua và khoai tây nói riêng luôn phải đối mặt với những thiệt hại do các loại sâu bệnh trên rau gây ra.

Trong đó, bệnh do virus gây ra được đánh giá là một trong những loại bệnh gây hại nghiêm trọng. Bệnh virus ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng phát triển cũng như năng suất và chất lượng của các loại cây rau và cho đến nay vẫn chưa có biện pháp điều trị hữu hiệu. Do vậy, việc nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật để kiểm soát bệnh virus trên cây rau hiện đang là vấn đề nhận được sự quan tâm rất lớn từ phía các nhà khoa học cũng như nhà quản lý. Một trong những kỹ thuật được sử dụng phổ biến hiện nay được dùng cho việc phát hiện virus là ELISA.

Kỹ thuật này cho kết quả nhanh, lại đơn giản, dễ sử dụng nhưng thường có độ nhạy thấp, không phát hiện được bệnh khi nồng độ virus trong mẫu không cao. Việc phát hiện bệnh nhanh, hiệu quả ngay cả trên các mẫu nhiễm không có biểu hiện triệu chứng rõ ràng, RT-PCR được xem là phương pháp hữu hiệu nhất cho phép phát hiện virus ở giai đoạn sớm với độ nhạy cao. Tại Thành phố Hồ chí Minh, sự quan tâm của lãnh đạo Thành phố về vấn đề này cũng đã được thể hiện rõ trong Quyết định số 46/QĐ-UBND ngày 27 tháng 01 năm 2011 về việc “Phê duyệt Chương trình ứng dụng và phát triển công nghệ sinh học phục vụ nông nghiệp – nông thôn trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh đến năm 2020 và tầm nhìn Trang 12 đến năm 2025”, với mục tiêu cụ thể trong giai đoạn 2011-2015 là “xây dựng quy trình chẩn đoán virus gây bệnh chính trên rau, hoa, cây kiểng và một số cây công nghiệp bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Với những lý do nêu trên, đề tài “ Xây dựng quy trình phát hiện Cucumber mosaic virus, Tomato mosaic virus, Potato virus X và Potato virus Y bằng kỹ thuật RT-PCR phục vụ công tác tầm soát bệnh virus trên dưa leo, cà chua và khoai tây” đã được triển khai thực hiện.

Đề tài là tiền đề cho việc phân lập và dòng hóa gen của các virus gây bệnh trên rau tại Việt Nam. Nguồn gen phân lập được sẽ sử dụng làm vật liệu cho việc nghiên cứu thiết kế các vector chuyển gen phục vụ cho mục tiêu tạo ra các giống rau có khả năng kháng virus bằng công nghệ chuyển gen RNAi. TỔNG QUAN TÀI LIỆU III. Cucumber mosaic virus III.

Sơ lược về Cucumber mosaic virus Cucumber mosaic virus (CMV) được mô tả đầu tiên vào năm 1916 trên dưa leo đồng thời bởi Doolittle và Jagger cũng như các cây thuộc họ bầu bí khác. Đến nay, CMV đã được biết đến trên phạm vi toàn thế giới ở cả khu vực ôn đới và nhiệt đới và gây nhiễm trên nhiều loại cây trồng khác nhau (Zitter, 2009). CMV là một loài thuộc giống Cucumovirus, họ Bromoviridae. Cấu trúc bao gồm 3 phần tử, mỗi phần tử có đường kính xấp xỉ 28 nm.

Bộ gen bao gồm 3 phần tử RNA mạch đơn đó là RNA 1 (~3.050 nucleotide) và RNA 3 (~2. Mỗi phân tử RNA được bao bọc trong một vỏ protein thành một phân tử hình cầu riêng biệt. Vì vậy, cấu trúc của một virus CMV trưởng thành bao gồm 3 phân tử hình cầu, một phân tử chứa RNA 1, một phân tử chứa RNA 2 và phần tử còn lại chứa RNA 3. Phần tử RNA 3 có thể chứa một phân tử RNA thứ 4, được xem là RNA 4 (~1.030 nucleotide), RNA này mã hóa cho gen protein vỏ và từ đó protein vỏ của CMV được tạo ra.

Kiểu dịch mã này của CMV, được gọi là RNA dưới bộ gen (subgenomic), sử dụng một mạch RNA tách biệt được tạo ra trong quá trình sao chép. Vì vậy, mặc dù RNA 3 chứa gen protein vỏ nhưng gen này chỉ được dịch mã để tạo ra protein vỏ từ mạch RNA dưới bộ gen của nó (Zitter, 2009). Hình dạng và cấu trúc bộ gen của virus CMV (Zitter, 2009). RNA 1 mã hóa cho protein 1a, cần thiết cho sự sao chép của bộ gen virus.

RNA 2 mã hóa cho 2 protein 2a và 2b. Protein 2a cần cho sự sao chép của virus và chứa các motif đặc trưng của RNA-dependent RNA polymerase trong khi protein 2b chống lại cơ chế im lặng gen sau phiên mã của kí chủ. RNA 3 mã hóa cho 2 protein đó là protein 3a và protein vỏ. Protein 3a (hay còn gọi là protein vận chuyển –MP) giữ vai trò quan trọng trong sự di chuyển của virus.

Protein vỏ được biểu hiện từ một phân tử RNA dưới bộ gen (sgRNA hay RNA 4), có vai trò trong sự lan truyền cũng như trong sự di chuyển của virus (Zitter, 2009). Bên cạnh RNA bộ gen và các loại RNA dưới bộ gen, một số chủng CMV còn hỗ trợ cho một RNA vệ tinh (được gọi là RNA 5 hay satRNA). SatRNA là một phân tử mạch đơn có chiều dài khoảng 332 – 342 nucleotide và phụ thuộc hoàn toàn vào CMV để sao chép. Hơn nữa satRNA cũng được bao bọc trong phân tử CMV, điều này cho phép chúng lan truyền cùng với CMV.

Tuy nhiên, satRNA không cung cấp cho CMV bất kỳ chức năng nào (Zitter, 2009). Triệu chứng của Cucumber mosaic virus CMV gây bệnh trên 1287 trong 518 giống thuộc 100 họ thực vật (Zitikaite, 2011) và có thể gây ra những tổn thất nghiêm trọng về mặt kinh tế với nhiều loại cây rau và hoa kiểng. CMV gây ra sự lây nhiễm hệ thống trong hầu hết các cây kí chủ nhưng có thể vẫn không biểu hiện triệu chứng trong một số cây trồng. Các triệu chứng biểu hiện của CMV có thể khác nhau rất lớn phụ thuộc vào loài và tuổi của cây bị nhiễm (Zitter, 2009).

Triệu chứng phổ biến nhất gây ra bởi CMV là thể khảm và biến dạng lá (hình 2), tuy nhiên tính nghiêm trọng có thể thay đổi từ sự không biểu hiện triệu chứng đến sự chết của kí chủ. Virus cũng gây ra dạng lá dương xỉ (fern leaf), sự còi cọc và biến dạng trái ở một số cây rau (Zitikaite, 2011). Triệu chứng nhiễm CMV trên lá và trái dưa leo (Zitter, 2009). CMV có thể được lan truyền bởi nhiều loài rệp thông qua nhựa cây, hạt và dây tơ hồng (Zitikaite, 2011).

Tomato mosaic virus III. Sơ lược về Tomato mosaic virus ToMV là virus thuộc nhóm Tobamovirus, có phần tử dạng hình que, dài 300 nm, rộng 15 nm (Scholthof, 2000), chứa RNA mạch đơn, sợi dương. Bộ gen mã hóa cho 4 protein đó là là protein 130K, protein 180K, protein 30K và protein vỏ (CP) (hình 3). Hai protein 130K và 180K được dịch mã từ bộ gen, trong khi protein 30K và CP được dịch mã từ các mRNA dưới bộ gen RNA (sgRNA).

Protein 130K, và protein 180K có vai trò trong sự sao chép RNA và được xem như là protein sao chép (Kubota và cs, 2003, Ishibashi, 2012). Protein 30K là một protein đa chức năng có khả năng tương tác với nhiều protein kí chủ cũng như các mạch kép RNA nhỏ để hoạt động như một nhân tố ức chế sự im lặng RNA. Protein 30K cần cho sự di chuyển của virus từ tế bào đến tế bào. CP chỉ là một protein cấu trúc cần thiết cho sự lan truyền của virus (Ishibashi, 2012).

Hình dạng (Scholthof, 2000) và cấu trúc bộ gen (Ishibashi, 2012) của CMV. Trang 15 Phổ ký chủ của virus này rất rộng, gây nhiễm trên nhiều loại cây trồng như cà tím, hồ tiêu, khoai tây, rau bina, cà chua, củ cải, táo, củ cải đường, thuốc lá cùng với nhiều loại cây trồng làm cảnh và cả cỏ dại. Có ít nhất 5 chủng ToMV đã được phát hiện, các chủng này chỉ có sự khác biệt di truyền rất nhỏ. Các chủng ToMV khác nhau có thể gây ra các triệu chứng khác nhau.

Mức độ biểu hiện triệu chứng ToMV phụ thuộc vào tính nhạy cảm của cây, tính độc của chủng virus, giai đoạn phát triển của cây và điều kiện môi trường (FAO, 2000). Triệu chứng của Tomato mosaic virus Các triệu chứng của ToMV đầu tiên xuất hiện khoảng 10 ngày sau khi cây bị nhiễm. Triệu chứng được thể hiện rõ nhất là cây, lá còi cọc, có những vết lốm đốm, biến dạng. Lá có những vùng xanh đậm và nhạt.

Vùng xanh đậm có xu hướng trở nên dày hơn vùng xanh nhạt. Triệu chứng đầu tiên thường xuất hiện ở các lá phía trên rồi lan dần xuống, lá trở nên thô, nhăn và có thể cuộn tròn xuống ở rìa lá (hình 4). Triệu chứng trên trái, thường ít xuất hiện, là những vết đốm màu đồng hoặc màu nâu. Cà chua bị nhiễm bởi những dòng ToMV gây hoại tử hay nhiễm ToMV cùng với những virus khác sẽ xuất hiện những vết hoại tử trên cây và cây chết từng phần.

Việc nhiễm ToMV sẽ làm cây giảm kích thước cũng như số lượng quả trên cây (Sicora, 2011). Triệu chứng nhiễm ToMV trên lá và trái cà chua (Scholthof, 2000). Potato virus X III. Sơ lược về Potato virus X Potato virus X (PVX) là virus phổ biến nhất trong tất cả các virus gây bệnh trên khoai tây.

PVX gây bệnh trên hơn 240 loài thực vật thuộc 16 họ; tuy nhiên phần lớn kí chủ của chúng thuộc họ cà (Solanaceae). Trang 16 Potato virus X (PVX), một thành viên của nhóm Potexvirus, có phần tử virus dạng sợi, dài 550 nm, rộng 11-18 nm (Verchot-Lubicz và cs, 2007), mang bộ gen RNA sợi đơn mạch dương dài 6435 nucleotide, chứa 5 khung đọc mở (ORF 1-5). ORF1 mã hóa cho protein replicase 165 (166) kDa, được dịch mã trực tiếp từ RNA bộ gen. Các khung đọc mở ORF 2, ORF 3 và ORF 4, được gọi là bộ ba gen ức chế (triple gene block-TGB), mã hóa cho 3 protein tương ứng là TGBp1 (25 kDa), TGBp2 (12 kDa) và TGBp3 (8kDa).

ORF5 mã hóa cho protein vỏ (25 kDa) (Huisman và cs, 1998; Atabekov và cs, 2001). Đầu tận cùng 5’ và 3’ của bộ gen virus chứa trình tự không dịch mã có kích thước lần lượt là 84 và 76 nucleotide, có vai trò trong sự điều hòa sao chép và dịch mã của virus (hình 5) (Huisman và cs, 1998). Hình dạng (Abbas, 2013) và cấu trúc bộ gen (Mecuria, 2008) của PVX.