Xây dựng quy trình phát hiện cucumber mosaic virus tomato mosaic virus potato virus xvà potato virusy bằng kỹ thuật rtpcr phục vụ công tác tầm soát bệnh virus trên dưa leo cà chua và khoai tây

Tài liệu nghiên cứu Xây dựng quy trình phát hiện cucumber mosaic virus tomato mosaic virus potato virus xvà potato, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên sâu

• Tác giả: ThS. Nguyễn Xuân Dũng
• Trường học: Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Phát Hiện Virus Cucumber Mosaic, Tomato Mosaic, Potato Virus X và Y Bằng Kỹ Thuật RT-PCR
• Loại tài liệu: Báo Cáo Nghiệm Thu
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• 1.1. TÓM TẮT
• 1.2. THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Cucumber mosaic virus
• 1.1.1. Sơ lược về Cucumber mosaic virus
• 1.1.2. Triệu chứng của Cucumber mosaic virus
• 1.2. Tomato mosaic virus
• 1.2.1. Sơ lược về Tomato mosaic virus
• 1.2.2. Triệu chứng của Tomato mosaic virus
• 1.3. Sơ lược về Potato virus X
• 1.4. Triệu chứng của Potato virus X
• 1.5. Sơ lược về Potato virus Y
• 1.6. Triệu chứng của Potato virus Y
• 1.7. Giới thiệu về các phương pháp phát hiện virus
• 1.7.1. Phương pháp ELISA
• 1.7.2. Phương pháp RT-PCR
• 1.8. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 1.8.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 1.8.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2. Thu thập nguồn mẫu nhiễm virus
• 2.3. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho việc phát hiện virus
• 2.4. Ly trích virus (RNA virus) từ mẫu nhiễm bệnh
• 2.5. Thực hiện phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gen virus
• 2.6. Dòng hóa và kiểm tra trình tự của đoạn gen sau khi khuếch đại
• 2.7. Gắn đoạn gen mục tiêu vào vector nhân dòng
• 2.8. Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt
• 2.9. Tách plasmid từ tế bào vi khuẩn E.coli và giải trình tự
• 2.10. Tối ưu hóa phản ứng RT-PCR phát hiện virus
• 2.10.1. Tối ưu hóa các thành phần của phản ứng RT-PCR
• 2.10.2. Thiết lập phản ứng multiplex RT-PCR
• 2.10.3. Xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng PCR
• 2.10.4. Thiết lập phản ứng Real-time RT-PCR
• 2.10.5. Thực hiện phản ứng
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thu thập nguồn mẫu nhiễm virus
• 3.2. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu phát hiện virus
• 3.3. Ly trích RNA virus từ mẫu nhiễm bệnh
• 3.4. Khuếch đại đoạn gen virus bằng phản ứng RT-PCR
• 3.4.1. Chọn cặp mồi thích hợp
• 3.4.2. Xác định nhiệt độ bắt cặp mồi tối ưu
• 3.4.3. Trường hợp mồi phát hiện virus PVX
• 3.4.4. Trường hợp mồi phát hiện virus PVY
• 3.4.5. Trường hợp mồi phát hiện virus CMV
• 3.4.6. Trường hợp mồi phát hiện virus ToMV
• 3.5. Dòng hóa và kiểm tra trình tự gen sau khi khuếch đại
• 3.5.1. Kết quả chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp
• 3.6. Tối ưu hóa phản ứng RT-PCR phát hiện virus
• 3.6.1. Kết quả tối ưu hóa các thành phần của phản ứng RT-PCR
• 3.6.2. Kết quả phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời 2 và 3 loại virus trong cùng một 1 phản ứng
• 3.6.3. Kết quả xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng PCR thường, multiplex PCR
• 3.6.4. Kết quả phản ứng Real-time RT-PCR
• 3.6.4.1. Phản ứng Real-time
• 3.6.4.2. Phân tích Melt curve (điểm nóng chảy)
• 3.6.4.3. Xây dựng đường chuẩn
• 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. RT PCR Phát Hiện Virus CMV ToMV PVX PVY Tổng Quan

Cucumber mosaic virus (CMV), Tomato mosaic virus (ToMV), Potato virus X (PVX) và Potato virus Y (PVY) là những virus gây hại phổ biến trên dưa leo, cà chua và khoai tây. Đây là ba loại cây rau quả quan trọng của ngành trồng rau Việt Nam. Việc phát hiện nhanh chóng và chính xác các virus này có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc bảo vệ năng suất và chất lượng cây trồng. Kỹ thuật RT-PCR phát hiện virus trên cây trồng nổi lên như một giải pháp hiệu quả, độ nhạy cao để chẩn đoán bệnh virus thực vật bằng RT-PCR. Nghiên cứu này tập trung vào việc xây dựng quy trình phát hiện riêng lẻ hoặc đồng thời các loại virus này bằng kỹ thuật RT-PCR. Theo Quyết định số 46/QĐ-UBND của TP.HCM, việc xây dựng quy trình chẩn đoán virus gây bệnh chính trên rau màu là một mục tiêu quan trọng.

1.1. Giới thiệu chung về Cucumber Mosaic Virus CMV

Cucumber Mosaic Virus (CMV) được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1916 trên dưa leo. Nó thuộc giống Cucumovirus và gây bệnh cho nhiều loại cây trồng khác nhau. Bộ gen của CMV bao gồm 3 phần tử RNA mạch đơn. Virus này gây ra các triệu chứng như khảm lá, biến dạng lá và có thể gây tổn thất nghiêm trọng về kinh tế. Theo Zitter (2009), CMV gây bệnh trên nhiều loại cây trồng ở cả khu vực ôn đới và nhiệt đới. Triệu chứng bệnh có thể khác nhau tùy thuộc vào loài và tuổi của cây.

1.2. Giới thiệu chung về Tomato Mosaic Virus ToMV

Tomato Mosaic Virus (ToMV) là virus thuộc nhóm Tobamovirus, có hình que và chứa RNA mạch đơn. Nó gây bệnh trên nhiều loại cây trồng, bao gồm cà chua, khoai tây và thuốc lá. Bộ gen của ToMV mã hóa cho 4 protein quan trọng cho sự sao chép và di chuyển của virus. Theo Scholthof (2000), ToMV có kích thước khoảng 300 nm và gây bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau. Virus này có phổ ký chủ rất rộng, gây nhiễm trên nhiều loại cây trồng.

II. Thách Thức Phát Hiện Virus Phương Pháp RT PCR Giải Quyết

Việc phát hiện sớm và chính xác các loại virus gây bệnh trên cây trồng là một thách thức lớn. Các phương pháp truyền thống như quan sát triệu chứng thường không đủ tin cậy, đặc biệt khi nồng độ virus còn thấp hoặc cây trồng chưa biểu hiện rõ triệu chứng. Kỹ thuật RT-PCR nổi lên như một giải pháp vượt trội, có khả năng phát hiện virus ở giai đoạn sớm với độ nhạy cao. Trong khi ELISA có kết quả nhanh nhưng độ nhạy lại thấp, RT-PCR có thể phát hiện bệnh ngay cả trên các mẫu nhiễm không có biểu hiện triệu chứng rõ ràng. Đây là yếu tố then chốt để triển khai các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh hiệu quả.

2.1. Giới thiệu chung về Potato Virus X PVX và Potato Virus Y PVY

Potato Virus X (PVX) và Potato Virus Y (PVY) là hai loại virus quan trọng gây bệnh trên khoai tây. PVX có hình que và PVY có hình cầu. Cả hai loại virus này đều có thể gây ra các triệu chứng nghiêm trọng trên khoai tây, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng củ. Việc phát hiện sớm và chính xác PVX và PVY là rất quan trọng để quản lý bệnh hại. Theo Mecuria (2008), PVX có cấu trúc bộ gen đặc trưng và gây bệnh trên nhiều loại cây trồng.

2.2. Hạn chế của phương pháp phát hiện virus truyền thống

Các phương pháp phát hiện virus truyền thống như quan sát triệu chứng hoặc sử dụng kính hiển vi thường có độ nhạy thấp và không thể phát hiện virus ở giai đoạn sớm của bệnh. Điều này gây khó khăn cho việc kiểm soát dịch bệnh và có thể dẫn đến thiệt hại lớn cho người nông dân. Do đó, cần có các phương pháp phát hiện virus nhanh chóng, chính xác và có độ nhạy cao. Các phương pháp này phải phát hiện được bệnh ngay cả trên các mẫu nhiễm không có biểu hiện triệu chứng rõ ràng

III. Kỹ Thuật RT PCR Phương Pháp Phát Hiện Virus Ưu Việt Nhất

Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp sinh học phân tử có độ nhạy cao, được sử dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng RNA. Trong lĩnh vực nông nghiệp, RT-PCR được ứng dụng để phát hiện virus gây bệnh trên cây trồng, bao gồm CMV, ToMV, PVX và PVY. Ưu điểm vượt trội của RT-PCR so với các phương pháp truyền thống là khả năng phát hiện virus ở giai đoạn sớm, ngay cả khi nồng độ virus còn rất thấp. Điều này cho phép người nông dân và nhà khoa học can thiệp kịp thời, ngăn chặn sự lây lan của dịch bệnh và bảo vệ năng suất cây trồng.

3.1. Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật RT PCR

Kỹ thuật RT-PCR dựa trên nguyên lý chuyển đổi RNA thành cDNA (complementary DNA) bằng enzyme phiên mã ngược, sau đó sử dụng PCR để khuếch đại đoạn cDNA mục tiêu. Quá trình này cho phép khuếch đại số lượng lớn bản sao của đoạn gen virus, giúp dễ dàng phát hiện ngay cả khi số lượng virus ban đầu rất thấp. Kết quả phân tích RT-PCR virus thực vật có độ chính xác cao và có thể được sử dụng để định lượng virus trong mẫu bệnh.

3.2. Ưu điểm của RT PCR so với ELISA và các phương pháp khác

So với phương pháp ELISA, RT-PCR có độ nhạy cao hơn đáng kể, cho phép phát hiện virus ở giai đoạn sớm khi nồng độ virus còn thấp. RT-PCR cũng có độ đặc hiệu cao hơn, giảm thiểu nguy cơ dương tính giả. Ngoài ra, RT-PCR có thể được sử dụng để phát hiện nhiều loại virus cùng một lúc bằng kỹ thuật multiplex PCR, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí.

IV. Quy Trình RT PCR Chuẩn Phát Hiện CMV ToMV PVX PVY Hiệu Quả

Để đảm bảo hiệu quả và độ chính xác của việc phát hiện virus CMV, ToMV, PVX và PVY bằng kỹ thuật RT-PCR, cần tuân thủ một quy trình chuẩn. Quy trình này bao gồm các bước chính: thu thập mẫu bệnh, ly trích RNA virus, thiết kế và chọn cặp mồi đặc hiệu, thực hiện phản ứng RT-PCR, và phân tích kết quả. Việc tối ưu hóa các thành phần của phản ứng RT-PCR, như nồng độ enzyme, nhiệt độ ủ, và thời gian kéo dài, là rất quan trọng để đạt được độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất.

4.1. Thiết kế mồi đặc hiệu cho RT PCR phát hiện virus

Việc thiết kế mồi đặc hiệu là yếu tố then chốt để đảm bảo độ chính xác của phản ứng RT-PCR. Mồi cần phải có trình tự bổ sung với vùng gen đặc trưng của virus mục tiêu, tránh bắt cặp với các trình tự gen khác trong mẫu. Các phần mềm thiết kế mồi chuyên dụng có thể giúp lựa chọn các cặp mồi phù hợp, đảm bảo hiệu quả khuếch đại và giảm thiểu nguy cơ khuếch đại sai lệch.

4.2. Tối ưu hóa phản ứng RT PCR để tăng độ nhạy và đặc hiệu

Để tối ưu hóa phản ứng RT-PCR, cần điều chỉnh các thông số như nồng độ enzyme phiên mã ngược, nồng độ enzyme polymerase, nhiệt độ ủ, và thời gian kéo dài. Việc sử dụng các chất phụ gia như BSA (bovine serum albumin) hoặc DMSO (dimethyl sulfoxide) có thể giúp tăng hiệu quả khuếch đại. Ngoài ra, việc sử dụng máy PCR có chức năng gradient nhiệt độ có thể giúp xác định nhiệt độ ủ tối ưu cho từng cặp mồi.

4.3. Ly trích RNA virus từ mẫu bệnh hiệu quả nhất

Việc ly trích RNA virus chất lượng cao từ mẫu bệnh là bước quan trọng để đảm bảo thành công của phản ứng RT-PCR. Có nhiều phương pháp ly trích RNA khác nhau, bao gồm phương pháp sử dụng cột ly trích, phương pháp sử dụng phenol-chloroform, và phương pháp sử dụng hạt từ. Việc lựa chọn phương pháp ly trích phù hợp phụ thuộc vào loại mẫu bệnh và yêu cầu về độ tinh sạch của RNA.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Tầm Soát Bệnh Virus Trên Rau Màu

Quy trình RT-PCR phát hiện virus CMV, ToMV, PVX và PVY có thể được ứng dụng rộng rãi trong công tác tầm soát bệnh virus trên dưa leo, cà chua và khoai tây. Việc kiểm tra định kỳ các mẫu cây trồng tại các vùng trồng rau tập trung có thể giúp phát hiện sớm các trường hợp nhiễm virus, từ đó triển khai các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát kịp thời. Ứng dụng RT-PCR giúp phòng ngừa bệnh virus trên cây trồng và giảm thiểu thiệt hại kinh tế do bệnh virus gây ra.

5.1. Phát hiện virus trong mẫu cây trồng không triệu chứng

Một trong những ưu điểm lớn nhất của RT-PCR là khả năng phát hiện virus trong mẫu cây trồng không có triệu chứng rõ ràng. Điều này cho phép phát hiện sớm các trường hợp nhiễm virus tiềm ẩn, từ đó ngăn chặn sự lây lan của dịch bệnh trước khi gây ra thiệt hại lớn.

5.2. Giám sát dịch bệnh virus trên các vùng trồng rau

Quy trình RT-PCR có thể được sử dụng để giám sát dịch bệnh virus trên các vùng trồng rau, giúp theo dõi sự xuất hiện và lây lan của các loại virus gây bệnh. Thông tin này có thể được sử dụng để đưa ra các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh hiệu quả.

VI. Kết Luận Triển Vọng RT PCR Cho Nền Nông Nghiệp Bền Vững

Nghiên cứu này đã thành công trong việc xây dựng quy trình phát hiện Cucumber mosaic virus, Tomato mosaic virus, Potato virus X và Potato virus Y bằng kỹ thuật RT-PCR. Kết quả cho thấy RT-PCR là một công cụ mạnh mẽ và hiệu quả để phát hiện và kiểm soát các bệnh virus quan trọng trên cây trồng. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các kỹ thuật RT-PCR tiên tiến hơn, cũng như tích hợp RT-PCR vào các hệ thống giám sát dịch bệnh toàn diện để bảo vệ nền nông nghiệp Việt Nam khỏi các tác động tiêu cực của bệnh virus. Ứng dụng RT-PCR trong nông nghiệp góp phần quan trọng vào sự phát triển bền vững.

6.1. Phát triển các kỹ thuật RT PCR định lượng Real time RT PCR

Phát triển các kỹ thuật Real-time RT-PCR cho phép định lượng số lượng virus trong mẫu bệnh, cung cấp thông tin quan trọng về mức độ nhiễm bệnh và hiệu quả của các biện pháp kiểm soát. Theo báo cáo, phản ứng Real-time RT-PCR đã được sử dụng trong nghiên cứu này để định lượng virus.

6.2. Nghiên cứu tạo giống cây trồng kháng virus bằng công nghệ RNAi

Kết quả nghiên cứu này có thể được sử dụng làm tiền đề cho việc phân lập và dòng hóa gen của các virus gây bệnh trên rau tại Việt Nam. Nguồn gen phân lập được sẽ sử dụng làm vật liệu cho việc nghiên cứu thiết kế các vector chuyển gen phục vụ cho mục tiêu tạo ra các giống rau có khả năng kháng virus bằng công nghệ chuyển gen RNAi.

Nội dung chính

Xây Dựng Quy Trình RT-PCR Phát Hiện CMV, ToMV, PVX và PVY: Giải Pháp Tầm Soát Bệnh Virus Trên Dưa Leo, Cà Chua và Khoai Tây

Tóm tắt nghiên cứu

Bệnh virus trên rau màu là nhóm dịch hại chưa có thuốc điều trị đặc hiệu, và câu hỏi nghiên cứu trung tâm của đề tài TV02/14-15 là: có thể xây dựng được một quy trình sinh học phân tử hoàn chỉnh, đủ nhạy và đủ kinh tế để tầm soát đồng thời bốn tác nhân virus quan trọng nhất trên ba cây rau chủ lực của Việt Nam hay không? Bốn đối tượng được chọn là Cucumber mosaic virus (CMV) trên dưa leo, Tomato mosaic virus (ToMV) trên cà chua, Potato virus X (PVX) và Potato virus Y (PVY) trên khoai tây.

Nhóm nghiên cứu tại Phòng Công nghệ Sinh học Thực vật – Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh, do ThS. Nguyễn Xuân Dũng chủ nhiệm, đã triển khai trong 24 tháng (01/2014 – 12/2015) với kinh phí 250 triệu đồng. Phương pháp luận đi theo trục: thu mẫu bệnh thực địa tại TP.HCM, Bình Dương, Tây Ninh, Long An và Lâm Đồng → thiết kế 8 cặp mồi đặc hiệu từ dữ liệu NCBI → ly trích RNA virus theo hai con đường song song (kit thương mại và phương pháp Sucrose) → khuếch đại RT-PCR → dòng hóa vào vector pJET1.2/blunt và giải trình tự xác nhận → tối ưu hóa thành phần phản ứng → mở rộng sang multiplex và Real-time RT-PCR.

Kết quả chính: bốn cặp mồi được xác nhận hoạt động ổn định với nhiệt độ bắt cặp tối ưu riêng (49–52 °C); trình tự sản phẩm khuếch đại tương đồng 94–99% với dữ liệu ngân hàng gen quốc tế; ngưỡng phát hiện đạt 100 bản sao (monoplex), 1.000 bản sao (doubleplex) và 10.000 bản sao (triplex). Quy trình Real-time RT-PCR với phân tích melt curve và đường chuẩn cho PVY, ToMV mở đường cho định lượng virus.

Ý nghĩa thực tiễn: một bộ công cụ chẩn đoán nội địa hóa, chi phí thấp hơn kit nhập khẩu, phát hiện được cây nhiễm chưa biểu hiện triệu chứng — điều mà ELISA truyền thống không làm được.

---

Bối cảnh và tầm quan trọng

Dưa leo, cà chua và khoai tây nằm trong nhóm cây rau chi phối sản xuất, chế biến, tiêu thụ và xuất khẩu của ngành trồng rau Việt Nam. Diện tích canh tác các cây này liên tục mở rộng, hình thành các vùng chuyên canh tại Lâm Đồng, Tây Ninh, Long An và vành đai TP.HCM. Nhưng chính mô hình chuyên canh mật độ cao lại tạo điều kiện lý tưởng cho virus tích lũy và lan truyền — qua rệp môi giới, qua nhựa cây trong thao tác canh tác, qua hạt giống và qua củ giống.

Hiện trạng tri thức. Trên thế giới, RT-PCR đã trở thành chuẩn mực cho chẩn đoán virus thực vật, với hàng loạt công bố cho CMV (Singh 1995; Hu 1995; Raj 1998; Zitikaite 2006, 2011), ToMV (Castello 1999; Kumar 2011), PVX (Peiman & Xie 2006; Mortimer-Jones 2009) và PVY (Lorenzen 2006; Ghosh & Bapat 2006; Gawande 2011). Trong nước, bức tranh trái ngược: phần lớn nghiên cứu dừng ở ELISA để khảo sát tỷ lệ nhiễm — CMV, TMV, TSWV trên cà chua (Lâm Ngọc Hạnh, 2005), TSWV trên ớt (Nguyễn Đình Trường, 2005). Một vài thử nghiệm RT-PCR với PVX, PVY, PLRV (Vương Hồ Vũ, 2005) mới ở mức sơ khởi.

Khoảng trống nghiên cứu. Chưa có công bố trong nước đưa ra một quy trình hoàn chỉnh — nghĩa là vừa chuẩn hóa được về mặt kỹ thuật (mồi đặc hiệu đã xác thực trình tự, nhiệt độ bắt cặp tối ưu, nồng độ enzyme tối ưu, ngưỡng phát hiện định lượng), vừa khả thi về mặt kinh tế (phản ứng tự pha thay vì mastermix thương mại, multiplex để giảm số phản ứng trên mỗi mẫu). Đây chính là khoảng trống mà đề tài nhắm tới.

Tính thời sự. Đề tài trực tiếp đáp ứng Quyết định 46/QĐ-UBND ngày 27/01/2011 của UBND TP.HCM về "Phê duyệt Chương trình ứng dụng và phát triển công nghệ sinh học phục vụ nông nghiệp – nông thôn đến năm 2020, tầm nhìn 2025", với mục tiêu giai đoạn 2011–2015 là xây dựng quy trình chẩn đoán virus gây bệnh chính trên rau, hoa, cây kiểng bằng kỹ thuật sinh học phân tử.

Tác động tiềm năng. Ngoài giá trị chẩn đoán, các đoạn gen virus được phân lập và dòng hóa trở thành nguyên liệu di truyền cho hướng nghiên cứu tiếp theo: thiết kế vector chuyển gen tạo giống rau kháng virus bằng công nghệ RNAi.

---

Methodology và approach

Thiết kế nghiên cứu. Đề tài theo mô hình phát triển và xác nhận phương pháp (method development & validation), gồm sáu hợp phần nối tiếp, mỗi hợp phần có tiêu chí "Đạt" rõ ràng so với đề cương đăng ký.

Thu thập mẫu. Mẫu lá, trái và củ có triệu chứng được thu tại vườn, đồng ruộng và chợ rau củ ở năm địa phương, chỉ tiêu 50 mẫu/loại virus. Điểm đáng chú ý về mặt thiết kế: nhóm nghiên cứu chủ động thu thêm các mẫu chưa biểu hiện triệu chứng rõ ràng — đây là nhóm mẫu then chốt để chứng minh ưu thế độ nhạy của RT-PCR so với ELISA. Cây khoai tây in vitro nhiễm PVX do Học viện Nông nghiệp Việt Nam cung cấp được dùng làm đối chứng dương. Mẫu bảo quản ở –80 °C.

Thiết kế mồi. Trình tự bộ gen bốn virus được thu thập từ NCBI, so sánh đa trình tự bằng Clustal W2 để định vị vùng bảo tồn giữa các chủng đã công bố. Mồi thiết kế bằng Primer 3, kiểm tra tự bắt cặp và cấu trúc kẹp tóc bằng Anhyb, với tiêu chí: dài 18–28 nt, %GC 50–60, Tm 55–65 °C, đầu 3' không quá 3 base G/C liên tiếp. Mỗi virus có hai cặp mồi trên hai vùng gen khác nhau — chiến lược dự phòng quan trọng: CMV (gen CP và MP), PVX (gen CP và RdRp), PVY (gen CP và Polyprotein), ToMV (hai vị trí trên gen CP). Tổng cộng 8 cặp mồi, tổng hợp tại IDT (Hoa Kỳ).

Ly trích RNA. Hai quy trình chạy song song để đối chứng: kit EZ-10 Spin Column Plant RNA Minipreps (Biobasic) và phương pháp Sucrose (Bendenzen, 2005) — nghiền mẫu trong sucrose, đun 100 °C/15 phút, làm lạnh nhanh trên đá 5 phút, ly tâm 13.000 vòng/phút thu dịch trích.

Khuếch đại và xác thực. RT-PCR với MyTaq One-Step kit (Bioline), chu trình bốn giai đoạn (tổng hợp cDNA 50 °C/10 phút → biến tính 95 °C/5 phút → 35 chu kỳ → kéo dài cuối 72 °C). Nhiệt độ bắt cặp tối ưu xác định bằng gradient nhiệt 6–10 điểm. Sản phẩm điện di trên agarose 1,5%, 100 V/30 phút.

Kiểm chứng tính đúng (validity). Đây là điểm mạnh phương pháp luận nổi bật: nhóm không dừng ở việc "băng điện di đúng kích thước", mà dòng hóa sản phẩm vào vector pJET1.2/blunt, biến nạp vào E. coli bằng sốc nhiệt 42 °C/90 giây, sàng lọc trên LB + ampicillin, PCR khuẩn lạc bằng cặp mồi pJET1.2, tách plasmid và giải trình tự tại Macrogen (Hàn Quốc), rồi BLAST đối chiếu NCBI. Việc dùng mồi vector thay vì mồi virus khi PCR khuẩn lạc là một quyết định kỹ thuật tinh tế nhằm loại trừ dương tính giả do DNA dư thừa còn sót quanh khuẩn lạc.

Độ tin cậy (reliability). Tối ưu hóa từng biến số một: reverse transcriptase 1–2,5 U; Taq polymerase 1–2 U; RNase inhibitor 4–12 U. Ngưỡng phát hiện xác định bằng pha loãng bậc 10 plasmid đã tính số bản sao theo công thức khối lượng DNA × 6,022×10²³ / (chiều dài × 10⁹ × 650).

---

Phát hiện chính

1. Chỉ 6/8 cặp mồi hoạt động — và điều đó xác nhận giá trị của thiết kế dự phòng. Bốn cặp mồi CP (FPxCP/RPxCP, FPyCP/RPyCP, FCMVCP/RCMVCP, FTCP/RTCP) phát hiện thành công virus tương ứng ngay từ vòng sàng lọc. Trong bốn cặp còn lại, FPxRd/RPxRd (PVX, vùng RdRp) và FPyPP/RPyPP (PVY, vùng polyprotein) cho sản phẩm đúng kích thước 201 bp và 245 bp. Nhưng FCMVMP/RCMVMP và FTCP1/RTCP1 hoàn toàn không cho sản phẩm dù đạt mọi tiêu chí thiết kế in silico. Đây là một phát hiện âm tính có giá trị: nó cho thấy dự đoán bằng phần mềm không thay thế được thực nghiệm, và việc thiết kế dư hai cặp mồi mỗi virus là quyết định đã cứu tiến độ đề tài.

2. Nhiệt độ bắt cặp tối ưu hội tụ trong dải hẹp 49–52 °C. Gradient nhiệt cho kết quả: FPxCP/RPxCP tối ưu ở 50 °C (dải hoạt động 46–54 °C), FPxRd/RPxRd ở 49 °C, FPyCP/RPyCP ở 50 °C, FPyPP/RPyPP ở 52 °C, FCMVCP/RCMVCP ở 52 °C, FTCP/RTCP ở 52 °C. Ý nghĩa vận hành rất lớn: dải hẹp này là điều kiện tiên quyết cho multiplex — bốn phản ứng đơn có thể gộp vào một chu trình nhiệt chung mà không phải hy sinh hiệu quả của cặp mồi nào.

3. Xác thực trình tự đạt tương đồng 94–99% với NCBI. Kết quả BLAST: PVX và PVY tương đồng 98%, ToMV 99%, CMV 94–95%. Kích thước sản phẩm PCR khuẩn lạc khớp chính xác dự đoán lý thuyết (kích thước gen + 118 bp của vector): PVX 450 bp, PVY 587 bp, CMV 404 bp, ToMV 319 bp. Mức tương đồng thấp hơn của CMV phù hợp với đặc điểm sinh học đã biết của loài này — CMV có phổ ký chủ cực rộng (1.287 loài thuộc 100 họ thực vật) và độ đa dạng chủng cao, nên biến dị trình tự giữa chủng Việt Nam và các chủng công bố là điều dự đoán được, không phải lỗi kỹ thuật.

4. Ngưỡng phát hiện suy giảm có quy luật khi tăng số đích trong một phản ứng. Monoplex đạt 100 bản sao; doubleplex (PVX + PVY) đạt 1.000 bản sao; triplex (PVX + PVY + ToMV) đạt 10.000 bản sao. Nhóm nghiên cứu đã thử bù bằng cách nâng số chu kỳ từ 35 lên 39 cho phản ứng multiplex. Đây là đánh đổi kinh điển của multiplex PCR — cạnh tranh cơ chất và tương tác mồi làm giảm độ nhạy mỗi bậc 10 khi thêm một đích. Kết quả này cho phép người sử dụng ra quyết định có cơ sở: dùng triplex để sàng lọc nhanh diện rộng, chuyển sang monoplex khi cần khẳng định mẫu nghi ngờ hoặc mẫu tiềm ẩn.

5. Phát hiện ngoài kế hoạch: quy trình Real-time RT-PCR định lượng. Không nằm trong đề cương đăng ký, nhóm bổ sung Real-time RT-PCR với SensiFAST SYBR & Fluorescein One-Step Kit (Bioline). Cả bốn virus đều cho biểu đồ khuếch đại và melt curve với đỉnh nhiệt độ nóng chảy đặc trưng riêng — nghĩa là có thể phân biệt sản phẩm đặc hiệu mà không cần bước điện di agarose, rút ngắn đáng kể thời gian trả kết quả. Đường chuẩn Ct – log(độ pha loãng) đã hoàn thành cho PVY và ToMV, dải chuẩn 10⁰–10⁶ bản sao/µl.

6. Hai quy trình ly trích cho kết quả tương đương. Cả kit thương mại lẫn phương pháp Sucrose đều cho băng khuếch đại đúng kích thước với PVX. Phát hiện này có giá trị kinh tế trực tiếp: phương pháp Sucrose chỉ cần sucrose, nhiệt và ly tâm, chi phí thấp hơn kit nhập khẩu nhiều lần.

7. Nồng độ enzyme tối thiểu là đủ. Reverse transcriptase từ 1 U đến 2,5 U cho kết quả không khác biệt → chọn 1 U. Taq polymerase 1–1,75 U tương đương nhau, riêng ở 2 U sản phẩm giảm độ sáng → chọn 1 U. RNase inhibitor: 4 U cho băng mờ, từ 6 U trở lên ổn định và không cải thiện thêm → chọn 6 U. Kết luận thực dụng: tăng enzyme không tăng hiệu quả, thậm chí gây ức chế — tiết kiệm được phần chi phí đắt nhất của phản ứng.

---

Đóng góp khoa học

Đóng góp về mặt phương pháp luận. Đây là công bố trong nước đầu tiên hoàn chỉnh chuỗi thiết kế mồi → xác thực bằng dòng hóa và giải trình tự → tối ưu hóa từng thành phần → xác định ngưỡng phát hiện định lượng → mở rộng multiplex và Real-time cho bốn virus rau cùng lúc. Nhiều nghiên cứu chẩn đoán dừng ở bước "có băng đúng kích thước"; việc đề tài đi tới giải trình tự và BLAST nâng độ tin cậy của kết luận lên một bậc, biến quy trình từ khả dụng thành có thể chuyển giao.

Đóng góp về tài nguyên di truyền. Bốn dòng E. coli mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen CMV, ToMV, PVX, PVY đã được lưu trữ trong glycerol 25% ở –80 °C. Đây là ngân hàng đối chứng dương chuẩn hóa — tài sản hạ tầng cho mọi phòng thí nghiệm muốn triển khai chẩn đoán mà không có sẵn nguồn mẫu bệnh, đồng thời là nguyên liệu cho thiết kế cấu trúc RNAi tạo giống kháng virus.

Ứng dụng thực tiễn. Sản phẩm cuối là bộ kit RT-PCR phát hiện virus có thể nội địa hóa. Ba tình huống sử dụng rõ rệt: kiểm định củ giống khoai tây và hạt giống trước khi phân phối; giám sát vùng chuyên canh để phát hiện sớm ổ dịch tiềm ẩn; kiểm tra cây giống in vitro trong hệ thống nhân giống sạch bệnh.

Hàm ý chính sách. Đề tài hoàn thành đúng chỉ tiêu Quyết định 46/QĐ-UBND, cung cấp một mô hình để nhân rộng sang các nhóm virus khác trên hoa, cây kiểng và cây công nghiệp. Ở tầm quản lý, việc có công cụ chẩn đoán phân tử nội địa là điều kiện cần để xây dựng tiêu chuẩn kiểm dịch giống rau — một mắt xích mà ngành trồng rau xuất khẩu Việt Nam còn thiếu.

---

Đối tượng quan tâm

Nhà nghiên cứu bệnh cây và công nghệ sinh học thực vật. Tài liệu cung cấp trọn bộ tham số tái lập được: trình tự 8 cặp mồi kèm Tm và kích thước sản phẩm dự kiến, vị trí thiết kế trên các trình tự NCBI cụ thể (JF682237.1, HQ343232.1, HQ541820.1, HQ433256.1, HM586935.1, HQ395772.1, HQ593625), thành phần và chu trình nhiệt của cả RT-PCR lẫn Real-time. Bao gồm cả hai cặp mồi thất bại — thông tin hiếm khi được công bố nhưng giúp người sau tránh lặp lại.

Kỹ thuật viên phòng chẩn đoán và trung tâm kiểm định giống. Phần tối ưu hóa nồng độ enzyme và phương pháp ly trích Sucrose có giá trị vận hành trực tiếp: giảm chi phí trên mỗi phản ứng mà không mất độ nhạy. Bảng ngưỡng phát hiện theo monoplex/doubleplex/triplex là cơ sở để thiết kế quy trình sàng lọc hai bước.

Doanh nghiệp giống và hợp tác xã sản xuất rau. Với củ giống khoai tây — con đường lan truyền chính của PVX và PVY qua các vụ — khả năng phát hiện virus trên mẫu củ và trên cây chưa biểu hiện triệu chứng là công cụ kiểm soát rủi ro trực tiếp, giảm thiệt hại năng suất trước khi trồng thay vì sau khi bùng phát.

Nhà quản lý và hoạch định chính sách nông nghiệp. Đề tài là bằng chứng cho thấy một chương trình công nghệ sinh học cấp thành phố với kinh phí 250 triệu đồng có thể tạo ra năng lực chẩn đoán thay thế nhập khẩu, và cung cấp mẫu hình để lập kế hoạch cho các đối tượng dịch hại tiếp theo.

Sinh viên và học viên cao học ngành công nghệ sinh học, bảo vệ thực vật: đây là một case study đầy đủ về quy trình dòng hóa gen — từ tạo đầu bằng, nối vector, biến nạp sốc nhiệt, sàng lọc kháng sinh, PCR khuẩn lạc đến giải trình tự.

---

FAQ

1. Phát hiện quan trọng nhất của nghiên cứu là gì? Là việc xác lập được bộ 6 cặp mồi đã xác thực bằng giải trình tự (tương đồng 94–99% với NCBI) cùng ngưỡng phát hiện định lượng cụ thể: 100 bản sao cho monoplex, 1.000 cho doubleplex, 10.000 cho triplex. Con số ngưỡng phát hiện chính là thứ biến quy trình từ "chạy được" thành "dùng được", vì nó cho phép người sử dụng biết chính xác khi nào kết quả âm tính là đáng tin.

2. Methodology có gì đặc biệt so với các nghiên cứu chẩn đoán khác? Ba điểm. Thứ nhất, thiết kế hai cặp mồi trên hai vùng gen khác nhau cho mỗi virus — và thực tế đã có hai cặp thất bại, chứng minh dự phòng này là cần thiết. Thứ hai, xác thực bằng dòng hóa và giải trình tự thay vì chỉ dựa vào kích thước băng điện di. Thứ ba, dùng mồi vector pJET1.2 thay vì mồi virus khi PCR khuẩn lạc, loại trừ dương tính giả từ DNA dư thừa quanh khuẩn lạc — một chi tiết nhỏ nhưng quyết định tính đúng của kết luận nhân dòng.

3. Kết quả có thể khái quát hóa không? Có, trong phạm vi cần nêu rõ. Mồi được thiết kế trên vùng bảo tồn giữa nhiều chủng công bố nên có khả năng bắt được đa số chủng lưu hành. Tuy nhiên mẫu thu ở năm địa phương phía Nam (TP.HCM, Bình Dương, Tây Ninh, Long An, Lâm Đồng); độ tương đồng CMV chỉ 94–95% gợi ý biến dị chủng đáng kể, nên khi áp dụng ở vùng sinh thái khác — đặc biệt với CMV — cần kiểm chứng lại trên mẫu địa phương. Ngưỡng phát hiện được xác định trên plasmid chuẩn, tức là ngưỡng lý tưởng; trên nền mẫu thực vật thực tế có chất ức chế, độ nhạy có thể thấp hơn.

4. Bước tiếp theo của hướng nghiên cứu này là gì? Theo chính báo cáo: hoàn thiện đường chuẩn định lượng cho hai virus còn lại (PVX và CMV — hiện mới có PVY và ToMV), và xác định số bản sao virus trong mẫu thực dựa trên đường chuẩn. Xa hơn, các đoạn gen đã dòng hóa sẽ được dùng làm nguyên liệu thiết kế vector chuyển gen tạo giống rau kháng virus bằng công nghệ RNAi. Ngoài ra còn dư địa cho việc hoàn thiện phản ứng tetraplex phát hiện đồng thời cả bốn virus và đánh giá hiệu năng trên bộ mẫu đồng ruộng quy mô lớn.

5. Ứng dụng thực tế cụ thể là gì? Kiểm định củ giống khoai tây và cây giống in vitro trước khi đưa vào sản xuất; tầm soát định kỳ vùng chuyên canh dưa leo, cà chua, khoai tây để phát hiện ổ dịch khi cây còn chưa biểu hiện triệu chứng; hỗ trợ chọn lọc vật liệu sạch bệnh cho chương trình nhân giống. Vì bệnh virus không có thuốc điều trị, toàn bộ giá trị nằm ở phòng ngừa — mà phòng ngừa lại phụ thuộc hoàn toàn vào năng lực phát hiện sớm.

---

Kết luận

Đề tài TV02/14-15 đã hoàn thành toàn bộ nội dung đăng ký và bổ sung thêm hợp phần Real-time RT-PCR ngoài kế hoạch. Đóng góp cốt lõi gồm ba phần: một quy trình RT-PCR đã xác thực bằng giải trình tự cho bốn virus CMV, ToMV, PVX, PVY; bộ tham số vận hành tối ưu hóa theo hướng tiết kiệm chi phí (enzyme nồng độ tối thiểu, ly trích Sucrose thay kit nhập); và một ngân hàng plasmid đối chứng dương làm hạ tầng cho nghiên cứu tiếp theo.

Hướng phát triển đã được xác định rõ: hoàn thiện định lượng cho PVX và CMV, mở rộng lên phản ứng đa đích bốn virus, và chuyển hóa nguồn gen phân lập thành cấu trúc RNAi phục vụ tạo giống kháng virus.

Với các phòng thí nghiệm, trung tâm kiểm định giống và doanh nghiệp sản xuất rau đang tìm giải pháp chẩn đoán virus chủ động thay vì phụ thuộc kit nhập khẩu, báo cáo này cung cấp đủ chi tiết kỹ thuật để triển khai lại. Hãy tham khảo toàn văn để tiếp cận trình tự mồi, chu trình nhiệt và các thông số tối ưu hóa đầy đủ.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Dưa leo, cà chua và khoai tây là ba loại cây nằm trong số những loại cây rau chủ yếu có ảnh hưởng lớn đến sản xuất, chế biến, tiêu thụ, xuất khẩu và thu nhập của ngành trồng rau ở Việt Nam. Diện tích trồng các loại cây này không ngừng gia tăng trong nhiều năm qua nhằm đáp ứng cho nhu cầu tiêu thụ ngày càng tăng của thị trường trong nước cũng như xuất khẩu. Các vùng chuyên canh dưa leo, cà chua và khoai tây đã và đang được phát triển ở Việt Nam. Tuy nhiên, bên cạnh những thuận lợi có được, người trồng rau nói chung hay dưa leo, cà chua và khoai tây nói riêng luôn phải đối mặt với những thiệt hại do các loại sâu bệnh trên rau gây ra.

Trong đó, bệnh do virus gây ra được đánh giá là một trong những loại bệnh gây hại nghiêm trọng. Bệnh virus ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng phát triển cũng như năng suất và chất lượng của các loại cây rau và cho đến nay vẫn chưa có biện pháp điều trị hữu hiệu. Do vậy, việc nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật để kiểm soát bệnh virus trên cây rau hiện đang là vấn đề nhận được sự quan tâm rất lớn từ phía các nhà khoa học cũng như nhà quản lý. Một trong những kỹ thuật được sử dụng phổ biến hiện nay được dùng cho việc phát hiện virus là ELISA.

Kỹ thuật này cho kết quả nhanh, lại đơn giản, dễ sử dụng nhưng thường có độ nhạy thấp, không phát hiện được bệnh khi nồng độ virus trong mẫu không cao. Việc phát hiện bệnh nhanh, hiệu quả ngay cả trên các mẫu nhiễm không có biểu hiện triệu chứng rõ ràng, RT-PCR được xem là phương pháp hữu hiệu nhất cho phép phát hiện virus ở giai đoạn sớm với độ nhạy cao. Tại Thành phố Hồ chí Minh, sự quan tâm của lãnh đạo Thành phố về vấn đề này cũng đã được thể hiện rõ trong Quyết định số 46/QĐ-UBND ngày 27 tháng 01 năm 2011 về việc “Phê duyệt Chương trình ứng dụng và phát triển công nghệ sinh học phục vụ nông nghiệp – nông thôn trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh đến năm 2020 và tầm nhìn Trang 12 đến năm 2025”, với mục tiêu cụ thể trong giai đoạn 2011-2015 là “xây dựng quy trình chẩn đoán virus gây bệnh chính trên rau, hoa, cây kiểng và một số cây công nghiệp bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Với những lý do nêu trên, đề tài “ Xây dựng quy trình phát hiện Cucumber mosaic virus, Tomato mosaic virus, Potato virus X và Potato virus Y bằng kỹ thuật RT-PCR phục vụ công tác tầm soát bệnh virus trên dưa leo, cà chua và khoai tây” đã được triển khai thực hiện.

Đề tài là tiền đề cho việc phân lập và dòng hóa gen của các virus gây bệnh trên rau tại Việt Nam. Nguồn gen phân lập được sẽ sử dụng làm vật liệu cho việc nghiên cứu thiết kế các vector chuyển gen phục vụ cho mục tiêu tạo ra các giống rau có khả năng kháng virus bằng công nghệ chuyển gen RNAi. TỔNG QUAN TÀI LIỆU III. Cucumber mosaic virus III.

Sơ lược về Cucumber mosaic virus Cucumber mosaic virus (CMV) được mô tả đầu tiên vào năm 1916 trên dưa leo đồng thời bởi Doolittle và Jagger cũng như các cây thuộc họ bầu bí khác. Đến nay, CMV đã được biết đến trên phạm vi toàn thế giới ở cả khu vực ôn đới và nhiệt đới và gây nhiễm trên nhiều loại cây trồng khác nhau (Zitter, 2009). CMV là một loài thuộc giống Cucumovirus, họ Bromoviridae. Cấu trúc bao gồm 3 phần tử, mỗi phần tử có đường kính xấp xỉ 28 nm.

Bộ gen bao gồm 3 phần tử RNA mạch đơn đó là RNA 1 (~3.050 nucleotide) và RNA 3 (~2. Mỗi phân tử RNA được bao bọc trong một vỏ protein thành một phân tử hình cầu riêng biệt. Vì vậy, cấu trúc của một virus CMV trưởng thành bao gồm 3 phân tử hình cầu, một phân tử chứa RNA 1, một phân tử chứa RNA 2 và phần tử còn lại chứa RNA 3. Phần tử RNA 3 có thể chứa một phân tử RNA thứ 4, được xem là RNA 4 (~1.030 nucleotide), RNA này mã hóa cho gen protein vỏ và từ đó protein vỏ của CMV được tạo ra.

Kiểu dịch mã này của CMV, được gọi là RNA dưới bộ gen (subgenomic), sử dụng một mạch RNA tách biệt được tạo ra trong quá trình sao chép. Vì vậy, mặc dù RNA 3 chứa gen protein vỏ nhưng gen này chỉ được dịch mã để tạo ra protein vỏ từ mạch RNA dưới bộ gen của nó (Zitter, 2009). Hình dạng và cấu trúc bộ gen của virus CMV (Zitter, 2009). RNA 1 mã hóa cho protein 1a, cần thiết cho sự sao chép của bộ gen virus.

RNA 2 mã hóa cho 2 protein 2a và 2b. Protein 2a cần cho sự sao chép của virus và chứa các motif đặc trưng của RNA-dependent RNA polymerase trong khi protein 2b chống lại cơ chế im lặng gen sau phiên mã của kí chủ. RNA 3 mã hóa cho 2 protein đó là protein 3a và protein vỏ. Protein 3a (hay còn gọi là protein vận chuyển –MP) giữ vai trò quan trọng trong sự di chuyển của virus.

Protein vỏ được biểu hiện từ một phân tử RNA dưới bộ gen (sgRNA hay RNA 4), có vai trò trong sự lan truyền cũng như trong sự di chuyển của virus (Zitter, 2009). Bên cạnh RNA bộ gen và các loại RNA dưới bộ gen, một số chủng CMV còn hỗ trợ cho một RNA vệ tinh (được gọi là RNA 5 hay satRNA). SatRNA là một phân tử mạch đơn có chiều dài khoảng 332 – 342 nucleotide và phụ thuộc hoàn toàn vào CMV để sao chép. Hơn nữa satRNA cũng được bao bọc trong phân tử CMV, điều này cho phép chúng lan truyền cùng với CMV.

Tuy nhiên, satRNA không cung cấp cho CMV bất kỳ chức năng nào (Zitter, 2009). Triệu chứng của Cucumber mosaic virus CMV gây bệnh trên 1287 trong 518 giống thuộc 100 họ thực vật (Zitikaite, 2011) và có thể gây ra những tổn thất nghiêm trọng về mặt kinh tế với nhiều loại cây rau và hoa kiểng. CMV gây ra sự lây nhiễm hệ thống trong hầu hết các cây kí chủ nhưng có thể vẫn không biểu hiện triệu chứng trong một số cây trồng. Các triệu chứng biểu hiện của CMV có thể khác nhau rất lớn phụ thuộc vào loài và tuổi của cây bị nhiễm (Zitter, 2009).

Triệu chứng phổ biến nhất gây ra bởi CMV là thể khảm và biến dạng lá (hình 2), tuy nhiên tính nghiêm trọng có thể thay đổi từ sự không biểu hiện triệu chứng đến sự chết của kí chủ. Virus cũng gây ra dạng lá dương xỉ (fern leaf), sự còi cọc và biến dạng trái ở một số cây rau (Zitikaite, 2011). Triệu chứng nhiễm CMV trên lá và trái dưa leo (Zitter, 2009). CMV có thể được lan truyền bởi nhiều loài rệp thông qua nhựa cây, hạt và dây tơ hồng (Zitikaite, 2011).

Tomato mosaic virus III. Sơ lược về Tomato mosaic virus ToMV là virus thuộc nhóm Tobamovirus, có phần tử dạng hình que, dài 300 nm, rộng 15 nm (Scholthof, 2000), chứa RNA mạch đơn, sợi dương. Bộ gen mã hóa cho 4 protein đó là là protein 130K, protein 180K, protein 30K và protein vỏ (CP) (hình 3). Hai protein 130K và 180K được dịch mã từ bộ gen, trong khi protein 30K và CP được dịch mã từ các mRNA dưới bộ gen RNA (sgRNA).

Protein 130K, và protein 180K có vai trò trong sự sao chép RNA và được xem như là protein sao chép (Kubota và cs, 2003, Ishibashi, 2012). Protein 30K là một protein đa chức năng có khả năng tương tác với nhiều protein kí chủ cũng như các mạch kép RNA nhỏ để hoạt động như một nhân tố ức chế sự im lặng RNA. Protein 30K cần cho sự di chuyển của virus từ tế bào đến tế bào. CP chỉ là một protein cấu trúc cần thiết cho sự lan truyền của virus (Ishibashi, 2012).

Hình dạng (Scholthof, 2000) và cấu trúc bộ gen (Ishibashi, 2012) của CMV. Trang 15 Phổ ký chủ của virus này rất rộng, gây nhiễm trên nhiều loại cây trồng như cà tím, hồ tiêu, khoai tây, rau bina, cà chua, củ cải, táo, củ cải đường, thuốc lá cùng với nhiều loại cây trồng làm cảnh và cả cỏ dại. Có ít nhất 5 chủng ToMV đã được phát hiện, các chủng này chỉ có sự khác biệt di truyền rất nhỏ. Các chủng ToMV khác nhau có thể gây ra các triệu chứng khác nhau.

Mức độ biểu hiện triệu chứng ToMV phụ thuộc vào tính nhạy cảm của cây, tính độc của chủng virus, giai đoạn phát triển của cây và điều kiện môi trường (FAO, 2000). Triệu chứng của Tomato mosaic virus Các triệu chứng của ToMV đầu tiên xuất hiện khoảng 10 ngày sau khi cây bị nhiễm. Triệu chứng được thể hiện rõ nhất là cây, lá còi cọc, có những vết lốm đốm, biến dạng. Lá có những vùng xanh đậm và nhạt.

Vùng xanh đậm có xu hướng trở nên dày hơn vùng xanh nhạt. Triệu chứng đầu tiên thường xuất hiện ở các lá phía trên rồi lan dần xuống, lá trở nên thô, nhăn và có thể cuộn tròn xuống ở rìa lá (hình 4). Triệu chứng trên trái, thường ít xuất hiện, là những vết đốm màu đồng hoặc màu nâu. Cà chua bị nhiễm bởi những dòng ToMV gây hoại tử hay nhiễm ToMV cùng với những virus khác sẽ xuất hiện những vết hoại tử trên cây và cây chết từng phần.

Việc nhiễm ToMV sẽ làm cây giảm kích thước cũng như số lượng quả trên cây (Sicora, 2011). Triệu chứng nhiễm ToMV trên lá và trái cà chua (Scholthof, 2000). Potato virus X III. Sơ lược về Potato virus X Potato virus X (PVX) là virus phổ biến nhất trong tất cả các virus gây bệnh trên khoai tây.

PVX gây bệnh trên hơn 240 loài thực vật thuộc 16 họ; tuy nhiên phần lớn kí chủ của chúng thuộc họ cà (Solanaceae). Trang 16 Potato virus X (PVX), một thành viên của nhóm Potexvirus, có phần tử virus dạng sợi, dài 550 nm, rộng 11-18 nm (Verchot-Lubicz và cs, 2007), mang bộ gen RNA sợi đơn mạch dương dài 6435 nucleotide, chứa 5 khung đọc mở (ORF 1-5). ORF1 mã hóa cho protein replicase 165 (166) kDa, được dịch mã trực tiếp từ RNA bộ gen. Các khung đọc mở ORF 2, ORF 3 và ORF 4, được gọi là bộ ba gen ức chế (triple gene block-TGB), mã hóa cho 3 protein tương ứng là TGBp1 (25 kDa), TGBp2 (12 kDa) và TGBp3 (8kDa).

ORF5 mã hóa cho protein vỏ (25 kDa) (Huisman và cs, 1998; Atabekov và cs, 2001). Đầu tận cùng 5’ và 3’ của bộ gen virus chứa trình tự không dịch mã có kích thước lần lượt là 84 và 76 nucleotide, có vai trò trong sự điều hòa sao chép và dịch mã của virus (hình 5) (Huisman và cs, 1998). Hình dạng (Abbas, 2013) và cấu trúc bộ gen (Mecuria, 2008) của PVX.