Đánh Giá Phương Pháp Phát Hiện Virus Hop Stunt và Virus Vết Đốm Vàng Liên Quan Đến Nho

Luận án tiến sĩ kỹ thuật phân tích kỹ thuật môi trường assessement of the method for the detection of hop stunt virus and yellow, xây dựng cơ sở lý luận, kiểm chứng thực nghiệm,

• Tác giả: Nguyen Phuc Thien
• Người hướng dẫn: Prof. Chen Yi-Ching
• Trường học: Da-Yeh University
• Chuyên ngành: Environmental Engineering
• Đề tài: Phương Pháp Phát Hiện Virus Hop Stunt và Virus Vết Đốm Vàng Trên Nho
• Loại tài liệu: Doctoral Dissertation
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Taiwan

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Virus Hop Stunt Vết Đốm Vàng Trên Nho

Virus và viroid ngày càng trở thành mối đe dọa lớn đối với sản xuất nông nghiệp bền vững. Biến đổi khí hậu đang làm tăng sự bất ổn trong hệ sinh thái virus-vật chủ. Virus Hop Stunt (HSVd) và virus vết đốm vàng (GYSVd-1) là hai trong số những tác nhân gây bệnh quan trọng trên cây nho. Các bệnh do viroid gây ra thường khó nhận biết so với bệnh do nấm, vi khuẩn hoặc tuyến trùng. Chúng có thể gây ra nhiều triệu chứng như còi cọc, hoại tử lá, vỏ cây sần sùi, cuộn lá và biến dạng quả. Nghiên cứu của Dayeh University (2017) đã sử dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR để phát hiện đồng thời các viroid trên cây nho. Kết quả cho thấy có sự hiện diện của cả HSVd và GYSVd-1 trong các mẫu bệnh thu thập được.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Việc Phát Hiện Sớm Bệnh Virus Nho

Phát hiện sớm bệnh virus nho là yếu tố then chốt để ngăn chặn sự lây lan và giảm thiểu thiệt hại kinh tế. Các biện pháp phòng ngừa và quản lý bệnh hiệu quả có thể được thực hiện nếu virus gây bệnh trên nho được xác định kịp thời. Phát hiện muộn có thể dẫn đến lây lan diện rộng, gây thiệt hại năng suất và chất lượng nho nghiêm trọng, ảnh hưởng đến thu nhập của người trồng nho.

1.2. Phân Bố Địa Lý Của Virus Hop Stunt và Vết Đốm Vàng Nho

Virus Hop Stunt và virus vết đốm vàng nho có phạm vi phân bố địa lý rộng khắp trên thế giới. Nghiên cứu cho thấy HSVd và GYSVd-1 được tìm thấy ở nhiều quốc gia trồng nho, bao gồm cả khu vực Châu Á. Sự phân bố của chúng có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như giống nho, điều kiện khí hậu và các biện pháp kiểm dịch thực vật.

II. Thách Thức Trong Việc Phát Hiện Virus Trên Cây Nho Hiện Nay

Việc phát hiện virus trên cây nho gặp nhiều thách thức do sự đa dạng của các chủng virus, triệu chứng bệnh không điển hình và sự phức tạp trong quá trình xét nghiệm. Các triệu chứng của bệnh virus nho có thể dễ dàng bị nhầm lẫn với các bệnh do nấm, vi khuẩn hoặc thiếu dinh dưỡng. Một số chủng virus có thể gây ra các triệu chứng rất nhẹ hoặc không gây ra triệu chứng nào, gây khó khăn cho việc phát hiện bằng mắt thường. Các phương pháp xét nghiệm virus cây trồng truyền thống thường tốn thời gian và chi phí, đòi hỏi trang thiết bị và kỹ thuật viên có trình độ cao.

2.1. Triệu Chứng Bệnh Virus Nho Không Rõ Rệt và Dễ Nhầm Lẫn

Các triệu chứng của bệnh virus trên nho rất đa dạng và thường không đặc trưng. Chúng có thể bao gồm lá bị đốm vàng, mosaic, biến dạng, còi cọc cây, giảm năng suất và chất lượng quả. Các triệu chứng này có thể bị ảnh hưởng bởi giống nho, chủng virus, điều kiện môi trường và giai đoạn phát triển của cây, gây khó khăn cho việc chẩn đoán chính xác.

2.2. Sự Đa Dạng Di Truyền Của Các Chủng Virus Gây Hại Nho

Sự đa dạng di truyền của các chủng virus gây hại nho là một thách thức lớn trong việc phát triển các phương pháp phát hiện và kiểm soát bệnh hiệu quả. Các chủng virus khác nhau có thể có các đặc điểm sinh học và khả năng gây bệnh khác nhau, đòi hỏi các phương pháp xét nghiệm và quản lý bệnh khác nhau.

III. Phương Pháp RT PCR Phát Hiện Virus Hop Stunt Trên Nho Hiệu Quả

RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp xét nghiệm virus cây trồng hiện đại, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện virus Hop Stunt (HSVd) trong cây nho. RT-PCR cho phép khuếch đại và phát hiện các đoạn RNA đặc trưng của virus, ngay cả khi virus có nồng độ rất thấp trong mẫu bệnh. Theo nghiên cứu của Dayeh University, việc sử dụng mRT-PCR (multiplex RT-PCR) còn giúp phát hiện đồng thời nhiều loại viroid khác nhau trong cùng một mẫu.

3.1. Quy Trình Xét Nghiệm PCR Virus Nho Chi Tiết

Quy trình xét nghiệm PCR virus nho bao gồm các bước chính: thu thập mẫu, chiết xuất RNA, phiên mã ngược RNA thành cDNA, khuếch đại cDNA bằng PCR và phát hiện sản phẩm PCR. Việc lựa chọn mồi (primer) đặc hiệu cho từng loại virus là yếu tố quan trọng để đảm bảo tính chính xác của xét nghiệm. Kỹ thuật multiplex RT-PCR sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau để phát hiện đồng thời nhiều loại virus trong cùng một phản ứng.

3.2. Ưu Điểm Vượt Trội Của RT PCR So Với Các Phương Pháp Khác

So với các phương pháp phát hiện virus truyền thống như ELISA, RT-PCR có nhiều ưu điểm vượt trội, bao gồm độ nhạy cao hơn, thời gian xét nghiệm ngắn hơn và khả năng phát hiện đồng thời nhiều loại virus. RT-PCR cũng có thể được sử dụng để định lượng virus, giúp đánh giá mức độ nhiễm bệnh và hiệu quả của các biện pháp kiểm soát bệnh.

IV. Kỹ Thuật ELISA Phát Hiện Virus Vết Đốm Vàng Trên Cây Nho Nhanh Chóng

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) là một kỹ thuật miễn dịch học được sử dụng để phát hiện và định lượng các kháng nguyên, bao gồm cả virus gây bệnh trên nho. ELISA dựa trên sự tương tác đặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên. Kỹ thuật này thường được sử dụng để phát hiện virus vết đốm vàng (GYSVd-1) trên cây nho. ELISA có ưu điểm là đơn giản, nhanh chóng và có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn. Tuy nhiên, độ nhạy của ELISA thường thấp hơn so với RT-PCR.

4.1. Quy Trình ELISA Virus Nho Từng Bước

Quy trình ELISA virus nho bao gồm các bước chính: phủ kháng thể lên bề mặt giếng, thêm mẫu bệnh, thêm kháng thể thứ cấp gắn enzyme, thêm cơ chất và đo độ hấp thụ quang. Độ hấp thụ quang tỷ lệ thuận với nồng độ virus trong mẫu. Kết quả ELISA được so sánh với mẫu chứng dương và mẫu chứng âm để xác định xem mẫu bệnh có chứa virus hay không.

4.2. Ứng Dụng ELISA Trong Quản Lý Dịch Bệnh Nho

ELISA được sử dụng rộng rãi trong các chương trình giám sát và quản lý dịch bệnh nho. Kỹ thuật này giúp phát hiện nhanh chóng các cây nho bị nhiễm virus, cho phép thực hiện các biện pháp kiểm soát bệnh kịp thời như loại bỏ cây bệnh và kiểm soát côn trùng truyền bệnh. ELISA cũng có thể được sử dụng để kiểm tra giống nho sạch bệnh trước khi nhân giống.

V. Ứng Dụng Phân Tích Cây Phả Hệ Trong Nghiên Cứu Virus Trên Nho

Phân tích cây phả hệ là một phương pháp thống kê để nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa giữa các loài hoặc các chủng virus khác nhau. Trong nghiên cứu về virus gây bệnh trên nho, phân tích cây phả hệ được sử dụng để xác định nguồn gốc và sự lan truyền của các chủng virus khác nhau, bao gồm virus Hop Stunt và virus vết đốm vàng. Kết quả phân tích cây phả hệ có thể cung cấp thông tin quan trọng về sự tiến hóa của virus và giúp phát triển các biện pháp kiểm soát bệnh hiệu quả hơn.

5.1. Xây Dựng Cây Phả Hệ Từ Trình Tự Gen Virus Nho

Việc xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự gen của các chủng virus nho. Trình tự gen của các chủng virus khác nhau được so sánh và phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng. Cây phả hệ được xây dựng dựa trên sự tương đồng về trình tự gen, với các chủng virus có trình tự gen tương đồng hơn thì nằm gần nhau hơn trên cây.

5.2. Ý Nghĩa Của Cây Phả Hệ Trong Nghiên Cứu Nguồn Gốc Virus

Cây phả hệ cho phép các nhà khoa học truy tìm nguồn gốc của các chủng virus gây bệnh trên nho. Bằng cách so sánh trình tự gen của các chủng virus khác nhau, có thể xác định chủng virus nào là tổ tiên của các chủng virus còn lại. Thông tin này có thể giúp hiểu rõ hơn về cách thức virus lây lan và phát triển, từ đó đưa ra các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát bệnh hiệu quả.

VI. Kết Luận và Triển Vọng Phát Triển Các Phương Pháp Phát Hiện Virus

Việc phát hiện và quản lý bệnh virus nho là một thách thức lớn đối với ngành trồng nho. Các phương pháp phát hiện virus hiện đại như RT-PCR và ELISA đã mang lại những tiến bộ đáng kể trong việc chẩn đoán và kiểm soát bệnh. Nghiên cứu của Dayeh University đã chứng minh hiệu quả của multiplex RT-PCR trong việc phát hiện đồng thời nhiều loại viroid trên cây nho. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp phát hiện virus nhanh chóng, chính xác và hiệu quả hơn, cũng như các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát bệnh bền vững.

6.1. Nâng Cao Năng Lực Chẩn Đoán Bệnh Virus Nho Tại Việt Nam

Việc nâng cao năng lực chẩn đoán bệnh virus nho tại Việt Nam là rất quan trọng để bảo vệ ngành trồng nho. Cần đầu tư vào trang thiết bị và đào tạo kỹ thuật viên có trình độ cao để thực hiện các xét nghiệm virus hiện đại. Cũng cần tăng cường hợp tác quốc tế để trao đổi kinh nghiệm và tiếp cận các công nghệ mới.

6.2. Nghiên Cứu Phát Triển Các Giống Nho Kháng Virus

Nghiên cứu phát triển các giống nho kháng virus là một giải pháp lâu dài và bền vững để kiểm soát bệnh virus nho. Cần tập trung vào việc xác định và khai thác các gen kháng virus trong các giống nho bản địa hoặc trong các loài nho hoang dại. Ứng dụng các công nghệ sinh học hiện đại như chỉnh sửa gen có thể giúp đẩy nhanh quá trình tạo ra các giống nho kháng virus.

Trích đoạn nội dung tài liệu

DAYEH UNIVERSITY ENVIRONMENTAL ENGINEERING DEPARTMENT COLLEGE OF ENGINEERING DOCTORAL DISSERTATION Assessment of the Methods for the Detection of Hop Stunt Virus and Yellow Speckle Virus Related Grapevine Student: Nguyen Phuc Thien Advisor: Chen Yi Ching TAIWAN 106 - 6 - 30 ABSTRACT In this study a multiplexreverse-transcription polymerase chain reaction (mRT- PCR) technique is used simultaneously to detect viroids in grapevine. Fifty grapevine leaf samples with yellowing or mosaic symptoms were collected from difference vineyards at Changhua County, Taiwan during May to June, 2015-2016. Specific primer pairs for the detection of Hop stunt viroid (HSVd), Australian grapevine viroid (AGVd), Grapevine yellow speckle viroid-1 (GYSVd-1), Grapevine yellow speckle viroid-2 (GYSVd-2) and Citrus exocortis viroid (CEVd) were selected from previous reports or primers were newly designed according to the sequences obtained from NCBI Genbank. Comparison of the sequence identity of HSVd-DY with other HSVd from GenBank ranged from 37.

While the sequence identity between GYSVd-1-DY with others ranged from 82. A phylogenetic tree derived from the HSVd sequence indicated that HSVd-DY was closer to an Iran isolate (KF916041), while GYSVd-1-DY was close related to a China isolate (JF746188). Keywords: Multiplex RT-PCR, Grapevine viroids, phylogenetic tree, GYSVd-1, HSVd -iii- 中文摘要 在本研究中，多重逆轉錄聚合酶鏈反應（mRT-PCR）技術同時 被使用在檢測葡萄中的病毒。 在 2015 年及 2016 年的 5 月至 6 月期 間，從台灣彰化縣不同的葡萄園收集了五十個具有黃化或馬賽克症 狀的葡萄葉樣品。根據從 NCBI 基因庫獲得的序列，新設計的特殊 引子對被用於檢測啤酒花矮化類病毒（HSVd）､澳大利亞葡萄樹病 毒（AGVd）､葡萄黃斑類病毒-1（GYSVd-1）､葡萄黃斑類病毒-2 （GYSVd-2）及柑橘裂皮病類病毒。在比較了序列識別方面，樣品 啤酒花矮化類病毒（HSVd-DY）與基因庫的啤酒花矮化類病毒 （HSVd）之類同的範圍為 37.7％。而樣品葡萄黃斑類病毒- 1（GYSVd-1-DY）則類同範圍可達 82.7％。從啤酒花矮化 類病毒（HSVd）序列之演化樹推衍出樣品葡萄黃斑類病毒-1 （GYSVd-1-DY）更接近伊朗分離物（KF916041），樣品葡萄黃斑 類病毒-1（GYSVd-1-DY）則與中國分離物（JF746188）更密切相 關。 關鍵詞：多重逆轉錄聚合酶鏈式反應 ､葡萄類病毒､演化樹､葡萄 黃斑類病毒-1､啤酒花矮化類病毒 -iv- ACKNOWLEDGEMENTS I would like gratefully acknowledge to Prof. Chen Yi-Ching (陳宜清) in the Department of Environmental Engineering, Da-Yeh University, for his unlimited support, instruction, and encouragement.

Chen had directed me to be thorough and offering his knowledge and experience during my research. This thesis can not be completed without a great deal of help and encouragement from Prof. Several professors have contributed their time graciously on my behalf, and I would like to express my gratitude. It is a pleasure to thank the oral defense committee, Prof.

Shih Ing-Lung , Prof. Yu Shih-Chung , Prof. Yeh Philip, Prof. Lai Chi-Yung for their time and recommendations.

I would like to thank the staffs of the Department of Environmental Engineering, Da-Yeh University especially Ms Huang (馨嬅) for their help and support. I also would like to thank the Dr. Doan Quang Tri (段光智) in National Center for Hydro- Meteorological Forecasting (NCHMF). I would like to express my gratitude towards them.

Their advice and suggestions with insight throughout my work have evidently supported the consistency of my dissertation. And special thanks to all my Vietnamese and Taiwanese friends in Da-yeh for me to live a happy life during the study. Finally, I would like to desire great thanks to my family. Especially, I am indebted to my parents and my wife, who have been an inspiration throughout my entire life.

Without their constant support and understanding, I would not have had the persistence to finish this work. Nguyen Phuc Thien June 2017, Da-Yeh University -v- CONTENTS ABSTRACT. iii 中文摘要. vi LIST OF FIGURES.

iv LIST OF TABLES. x LIST OF ABBREVIATION. Background of Research. Purposes of Research.

Goals to Reach .4 Framework of Research .1 Structure and Classification of Viroid .2 Generation of Populations from Individual Viroid Variants .3 Origin and Evolution of Viroids.4 The Viroid Species Infect Grapevine .1 Hop Stunt Viroid .2 Grapevine Yellow Speckle 1, 2.3 Australian Grapevine Viroid .4 Citrus Excortis Viroid .5 The Detection Techniques in Viroid Disease .6 Elimination of Viroids from Plants .1 Source of Plant Materials .2 Extraction of RNA .3 Designation of Viroid-Specific Primer .4 The Single RT-PCR Reaction .5 Multiplex RT-PCR (mRT-PCR) .6 DNA Elution and Cloning .7 Phylogenetic Tree Construction. RESULTS AND DISCUSSION. Yield and quality of RNA extract. Primers Design for Detection Viroids.

Detection of Grapevine viroids by single RT-PCR reaction…….4 Development of multiplex RT-PCR reaction……………………….5 T&A cloning and HindIII enzyme…………………………………….6 Phylogenetic tree analysis……………………………………………….7 Nucleotide sequence identity.2 Brief Discussion of Results. CONCLUSIONS AND SUGGESTIONS. 52 APPENDIX A: The rod like secondary structure of Potato Spindle tuber viroid showing the five domains chacrateristic of members of the family Pospiviroidae: the terminal left (TL), pathogenicity (P), central (C), variable (V), and terminal right. 60 APPENDIX B: Map and Sequence reference points of T&A Cloning Vector.

61 -vii- LIST OF FIGURES Figure 1: Research framework. 4 Figure 2: Possible evolutionary relationships between viroids and ribozymes. 10 Figure 3-1: Grapevine leaves collected from Changhua County, Taiwan in June 2015. 21 Figure 3-1 (cont): Grapevine leaves collected from Changhua County, Taiwan in June 2015.

22 Figure 3-2: UV Spectrophotometer. 23 Figure 3-3: Multiple sequence alignment of HSVd by CLUSTAL-W program for primer designing. Complete sequence Hop stunt viroid was obtained from GenBank. The asterisk indicated conserved nucleotide.

Highline showed the position of the primers. 25 Figure 3-4: Multiple sequence alignment of GYSVd-1 by CLUSTAL-W program for primer designing. Complete sequence GYSVd-1 were obtained from GenBank. The asterisk indicated conserved nucleotide.

Highline shown the position of the primers. 27 Figure 3-5: RT-PCR Machine. 29 Figure 3-6: Cloning Plants. 31 Figure 4-1: Agarose gel electrophoresis analyse of single and multiplex RT-PCR reaction.

Lane 1, with specific primers for GYSVd-1; Lane 2, with specific primers for HSVd; Lane 3, with mixed primers for the detection of both GYSVd- 1 and HSVd. Lane M, molecular weight markers (GENMARK, GM100). 35 -viii- Figure 4-2: Agarose gel electrophoresis analyze T&A cloning vector kit insert DNA, Lane 1,2,4,5 with specific primers for GYSVd-1, Lane 3,6 with specific primers for HSVd. Lane M, molecular weight markers (GENMARK, GM100).

36 Figure 4-3: Restriction enzyme sites of yT&A® cloning vector…………………….38 Figure 4-4: Agarose gel electrophoresis analyzes T&A cloning vector kit insert DNA and HindIII enzyme. Lane 1,2,4,5 with specific primers for GYSVd-1, Lane 3,6 with specific primers for HSVd. Lane M, molecular weight markers (GENMARK, GM100). 39 Figure 4-5: Phylogenetic analysis of the complete sequence of HSVd-DY with other 17 HSVd retrieved from GenBank.

In the phylogenetic tree constructed using the PHYLIP software package (Felsenstein, 2005), the values adjacent to the nodes indicate the bootstrap confidence values for 1000 replicates using neighbor- joining (NJ) analyses. Values below 75% are not given. The units of the scale bar represent the nucleotide substitutions per site. 40 Figure 4-6: Phylogenetic analysis of the complete sequence of GYSVd-1-DY with other 17 HSVd retrieved from GenBank.

In the phylogenetic tree constructed using the PHYLIP software package (Felsenstein, 2005), the values adjacent to the nodes indicate the bootstrap confidence values for 1000 replicates using neighbor-joining (NJ) analyses. Values below 75% are not given. The units of the scale bar represent the nucleotide substitutions per site. 41 -ix- LIST OF TABLES Table 3-1: Primers in this work.

25 Table 4-1: Results of HSVd & GYSVd-1 analysis from Changhua County, Taiwan by mRT-PCR (MP) and single RT-PCR (SP) from 2015-2016. 34 Table 4-2: The comparison of sequence identity between HSVd-DY and other HSVd from GenBank. The accession number, infected host and isolated country are indicated. 43 Table 4-3: The comparison of sequence identity between GYSVd-1-DY and other GYSVd-1 from GenBank.

The accession number, infected host and isolated country are indicated. 44 -x- LIST OF ABBREVIATION ACRONYMS AGVd Australian grapevine viroid BMYV Beet mild yellowing virus CCR Central conserved region CEVd Citrus exocortis viroid CTV Citrus trizteza virus CPsV Citrus psorosis virus CVV Citrus infectious variegation virus CYCVD Corky vein disease of citrus PAGE Poly-acrylamide gel electrophoresis PLMVd Peach latent mosaic viroid PSTVd Potato spindle tuber viroid GYSVd-1 Grapevine yellow speckle viroid-1 GYSVd-2 Grapevine yellow speckle viroid-2 RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction HSVd Hop stunt viroid MAbs Monoclonal antibodies RYMV Rice yellow mottle virus -xi- SCIENTIFIC TERMS m3/s Cubic meters per second l/s Liters per second mg/l Milligrams per liter kg/d Kilograms per day m Meters mm Millimeters -xii- Chapter 1.1 Background of Research Viroids are the smallest known agents of infectious disease – small, highly structured, single-stranded, circular RNA molecules that lack detectable messenger RNA activity. Whereas viruses supply some or most of the genetic information required for their replication, viroids are regarded as “obligate parasites of the cell‟s transcriptional machinery” and infect only plants. Four of the nearly 30 species of viroids described to date contain hammerhead ribozymes, and phylogenetic analysis suggests that viroids may share a common origin with hepatitis delta virus and several other viroid-like satellite RNAs.

Replication proceeds via a rolling-circle mechanism, and strand exchange can result in a variety of insertion/deletion events. The terminal domains of potato spindle tuber and related viroids, in particular, appear to have undergone repeated sequence exchange and/or rearrangement. Viroid populations often contain a complex mixture of sequence variants, and environmental stress (including transfer to different hosts) has been shown to result in a significant increase in sequence heterogeneity. The new field of synthetic biology offers exciting opportunities to determine the minimal size of a fully functional viroid genome.

Much of the preliminary structural and functional information necessary is already available, but formidable obstacles still remain. Sequences of viroids and viroid-like satellite RNAs were aligned separately using CLUSTAL-X and then manually edited to preserve local similarities; these partial alignments were then manually aligned before CLUSTAL-X was used to realign dissimilar regions and maximize overall similarity. -1- Virus and viroid diseases have become increasingly important constrain to sustainable crop production in the tropical countries. The climatic changes that are occurring throughout the world have an impact on plants, vectors, and viruses causing increasing instability within virus-host ecosystems.

Viroid diseases are inconspicuous compared with disease caused by fungi, bacteria and nematodes, and loss identified in comparative trials on their effects do not necessarily translate to global estimates of loss. Their effects also extend beyond direct and indirect damage associated with plant virus infection largely also applies to viroids. Some of the threatening and economically important virus diseases in tropical zone which affect the food production are tungro, yellow mottle, and hoja blanca in rice; mosaic in sugarcane, mosaic in cassava; tristeza in citrus; swollen shoot in cacao; sterility mosaic in pigeonpea; rosette, clump, and bud necrosis in peanut; necrosis in sunflower and legumes, vegetables, and ornamental crops; yellow mosaic in legumes; leaf curl in cotton and tomato; and ring spot in papaya. Key factors for emergence of new plant virus and virus-like disease include the intensification of agricultural trade (globalization), changes in cropping systems (crop diversification), and climate change.2 Purposes of Research In Taiwan, grape cultivation is a remunerative agri-business for the highly popular grape berries among local consumers in addition to the added values with the processed products.

The annual production of grapes was 102831 metric tons in 2010, and 99.5% was produced in Taichung City, Miaoli, Changhua and Nantou Counties in central Taiwan(Chiou-Chu 2013). RT-PCR has become crucial tools for detecting viroids. Simultaneous detection and identification of viruses and viroids using -2- conserved primers are possible through RT-PCR, which has a higher sensitivity than that of molecular hybridization. Our aim of this research is to isolate and identify the causal agents of the suspected disease in grapevines in Taiwan and to determine their phylogenetic relatedness to the other HSVd and GYSVd-1 strains from different geographical regions 1.3 Goals to Reach The objectives of this study were as follows:  RT-PCR technique detect hop stunt viroid in grapevine (HSVd)  RT-PCR technique detect grapevine yellow speckle viroid 1 in grapevine (GYSVd-1)  Multiplex RT-PCR technique simultaneously detect viroids in grapevine 1.4 Framework of Research The framework of this research is shown as Figure 1-1.

HSVd and GYSVd-1 viroid are analyzed by Clustal-W solfware. Also a conserved region is found to design primers, then transferring to tube by using RT-PCR machine. Finally gel electrophoresis will be run.1 Framework of research -4- Chapter 2.1 Structure and Classification of Viroid 2.1 Structure Like many RNA viruses that infect plants or animals, individual viroids exist as complex populations of often closely related sequence variants in vivo.