Đặt vấn đề Thalassemia là bệnh Hemoglobin (Hb) di truyền đơn gen theo kiểu Mendel phổ biến nhất. Bệnh do đột biến (ĐB) trên gen globin gây ra. 71% quốc gia trên thế giới có bệnh lưu hành với 7% dân số thế giới mang gen bệnh. Bệnh phân bố rộng từ Địa Trung Hải qua Trung Cận Đông, châu Á đến Đông Nam Á,… thường là ở những nước có nguồn lực thấp và tạo ra một gánh nặng lên hệ thống y tế của các nước này (Harper, P.
Tổ chức Y tế Thế giới đã xác định thalassemia là vấn đề sức khỏe nghiêm trọng và khuyến cáo các nước Đông Nam Á nên chọn thalassemia là một trong những ưu tiên về di truyền người (Laosombat, V., 2001; Dương Bá Trực và ctv, 2002; Eleftheriou, A. Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ mắc bệnh và mang gen bệnh cao. Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành cho thấy tần suất mang gen bệnh β- Thal khoảng 1,7-25% tùy từng vùng miền và dân tộc. Theo hiệp hội Tan huyết Việt Nam, hiện có khoảng hơn 20.000 bệnh nhân nặng cần điều trị, mỗi năm có khoảng gần 2.000 trẻ sinh ra bị bệnh.
Và theo báo cáo của Chi hội Tan máu bẩm sinh khu vực Tây Nam Bộ, năm 2015, Đồng bằng sông Cửu Long có khoảng 2.105 người bị Thalassemia được các bệnh viện chẩn đoán. Trẻ mắc bệnh -Thal sẽ gặp những hậu quả nghiêm trọng về phát triển cơ thể, tuổi thọ bởi sự tan máu và các biến chứng của nó. Việc điều trị chủ yếu là truyền máu, thải sắt rất tốn kém, ít hiệu quả và chỉ để duy trì sự sống tạm thời nên trẻ thường tử vong sớm trong những năm đầu của cuộc sống. Ghép tuỷ xương giúp cải thiện bệnh nhưng chỉ hạn chế ở một vài trường hợp.
Đây là lý do khiến bệnh thalassemia trở thành gánh nặng cho gia đình và xã hội. Vì vậy, việc phòng bệnh được đặt ra như một giải pháp nhằm ngăn chặn sự lan tràn của bệnh di truyền này (Cai, S. Liên đoàn thalassemia thế giới (TIF) đã đưa ra chương trình quản lý bệnh bao gồm việc phòng ngừa các trường hợp bệnh mới, điều trị và quản lý lâu dài bệnh nhân đã có. Tuy nhiên, cải thiện kết quả điều trị cũng như quản lý lâu dài lại đòi hỏi rất nhiều nguồn lực.
Một số ít quốc gia có tần suất bệnh thalassemia cao như Síp, Ý, Hy Lạp, Thái Lan, Hồng Kông đã xây dựng các Chuyên ngành Công nghệ sinh học 1 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHCT chương trình phòng chống bệnh rất thành công thông qua việc nghiên cứu về tầm soát bệnh và chẩn đoán trước sinh (Cao, A. et al, 1996; Shu-Rern Chern and Chih-Ping Chen, 2000; Moghaddam, Z. Với tỷ lệ thalassemia lưu hành cao, Việt Nam cũng rất cần một chương trình quản lý và phòng chống thalassemia. Do vậy, nghiên cứu ứng d ng các k thuật sinh học phân tử để tìm hiểu r các đột biến gây bệnh; sự di truyền bệnh trong các gia đình là hết sức cần thiết.
Ngoài ra, tư vấn cho người mang gen bệnh sẽ góp phần giúp nâng cao ý thức về căn bệnh. Người mang gen có thể chủ động tìm tư vấn, lựa chọn tiền hôn nhân, chẩn đoán trước sinh trong trường hợp cần thiết. Đây là giải pháp quan trọng nhất để phòng bệnh, làm giảm tỷ lệ mắc bệnh β-Thal ở trẻ em. Đề tài “Nghiên cứu sự di truyền các đột biến gây bệnh ở bệnh nhân Beta thalassemia ng Đồng bằng sông Cửu Long bằng kỹ thuật sinh học phân tử” được thực hiện nhằm có thêm thông tin về bệnh β-Thal trong khu vực.
Mục tiêu đề tài (1 ác định tỷ lệ các kiểu đột biến gen β-globin gây bệnh và các thể bệnh ở các bệnh nhân β-Thal vùng Đồng bằng sông Cửu Long bằng các k thuật sinh học phân tử. (2) ây dựng phả hệ di truyền 3 thế hệ của một số bệnh nhân β-thal và xác định tỷ lệ người mang gen bệnh, các kiểu đột biến, các thể bệnh và kiểu hình huyết học của các thể bệnh ở người mang gen bệnh β-thal trong phả hệ. (3 Đánh giá kết quả can thiệp bằng tư vấn về di truyền cho những người mang gen bệnh được phát hiện trong các phả hệ nghiên cứu. Ý nghĩa của luận án * Ý nghĩa về mặt khoa học, phục vụ công tác đào tạo: - Có thêm số liệu khoa học về tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh β- Thal; sự di truyền bệnh trong phả hệ của một số gia đình bệnh nhân (bệnh nhân ) khu vực Đồng bằng sông Cửu Long.
- Làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo. * Ý nghĩa về mặt xã hội: - Nâng cao hiểu biết của người mang gen về bệnh -Thal từ đó góp phần làm giảm tỷ lệ mắc bệnh và nâng cao chất lượng sống, kéo dài tuổi thọ cho người bị bệnh thalassemia. - Sàng lọc và chẩn đoán trước sinh hạn chế chào đời các bé thể nặng, giảm gánh nặng cho gia đình và xã hội. Chuyên ngành Công nghệ sinh học 2 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHCT 1.
Tính mới của luận án - Nghiên cứu về bệnh -Thal trên cả 4 nhóm dân tộc: Kinh, Chăm, Khmer, Hoa ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long. - Nghiên cứu thực hiện theo định hướng mới: + Phối hợp nhiều k thuật sinh học phân tử khác nhau để xác định nhiều nhất các đột biến gây bệnh trên bệnh nhân -Thal một cách hiệu quả, nhanh chóng. + Nghiên cứu khá toàn diện về bệnh -Thal: nguyên nhân gây bệnh (kiểu đột biến , sự di truyền bệnh qua các thế hệ, tư vấn di truyền kết hợp chẩn đoán trước sinh cho người mang gen. Chuyên ngành Công nghệ sinh học 3 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHCT Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.
Bệnh Beta thalassemia Bệnh β-Thal là một loại bệnh Hb xảy ra do các đột biến gen làm giảm hoặc không tổng hợp được chuỗi β-globin của phân tử Hb. Kết quả tạo nên các Hb bất thường dẫn đến giảm hoặc không thực hiện được chức năng vận chuyển khí cho cơ thể. Nếu ĐB gen làm chuỗi -globin giảm hay không được tạo thành gọi là bệnh -Thal. Cũng có trường hợp cả hai chuỗi β và α bị thiếu h t hơn bình thường, trường hợp này gọi là thể phối hợp α/β thalassemia.
Bệnh hemoglobin E (HbE do ĐB sai nghĩa tại vị trí nucleotide 129 của chuỗi -globin (bộ ba mã hoá thứ 26 trên exon 1 : GAG bị thay bằng AAG, làm cho acid amin vị trí thứ 26 là Glutamic acid bị thay bằng Lysine, dẫn đến giảm số lượng chuỗi -globin. Như vậy, HbE cũng là -Thal thể nhẹ. Đặc điểm phân tử của bệnh Beta thalassemia C m gen β-globin nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể (NST) số 11 (11p15.5 , với đoạn DNA dài 73.308 cặp base, mã số trên ngân hàng gen là U01317, bao gồm các gen có trật tự: 5’– epsilon – gamma – G – gamma – A – delta – beta – 3’. Gen β-globin dài 1606 cặp base, nằm ở vị trí nucleotide 5203272- 5204877 của NST số 11, tương ứng với nucleotide 62137-63742 của c m gen β-globin và đoạn khởi động sát đầu 5’ ở vị trí các nucleotide thứ 62061, 62106 và 62144.
Gen β-globin có 3 exon và 2 intron mã hoá cho chuỗi -globin dài 146 acid amin. Exon 1 ở nucleotide 1-142 và mã hoá các acid amin 1-30, acid amin thứ nhất bắt đầu từ vị trí nucleotide 50. Exon 2 ở nucleotide 273-495 và mã hoá các acid amin 31-104. Exon 3 bắt đầu từ nucleotide 1346-1606 và mã hoá các acid amin 105-146.
Các exon này tương ứng với 3 vùng cấu trúc và chức năng của chuỗi -globin. Exon 1 và exon 3 nằm phía ngoài chủ yếu là các acid amin ưa nước. Exon 2 nằm bên trong phân tử tạo bởi các acid amin kỵ nước. Khi có ĐB gen xảy ra thì trình tự các acid amin sẽ thay đổi.
Các acid amin ở bề mặt bị thay bằng các acid amin kỵ nước và tạo ra các thay đổi hoá học dẫn đến giảm đàn hồi, gây mất ổn định của phân tử protein, tạo ra các chuỗi β-globin bị lỗi (Wochenschr, S., 1983; Quách Thị Hoàng Oanh, 2009; Fettah, A. Chuyên ngành Công nghệ sinh học 4 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHCT Hình 2. Cấu trúc gen -Thal (Chanane Wanapirak et al, 2009) 2. Di truyền bệnh Beta thalassemia Beta thalassemia là bệnh di truyền lặn trên NST thường, theo quy luật di truyền Mendel.
Khi chỉ có cha hoặc mẹ mang gen bệnh, 50% khả năng con sinh ra là thalassemia dị hợp tử và không có trẻ đồng hợp tử bị bệnh. Nếu cả cha và mẹ đều bị thalassemia dị hợp tử thì 25% khả năng sinh con bình thường, 50% khả năng con dị hợp tử và 25% khả năng con đồng hợp tử (Nguyễn Công Khanh, 1985; Wochenschr, S. Di truyền bệnh -Thal 2. Cơ chế gây mất chức năng sinh học của các kiểu đột biến gen beta-globin Khi các ĐB xuất hiện trên gen β-globin tùy theo vị trí mà ĐB này sẽ làm thay đổi cấu trúc và số lượng của phân tử Hb và tạo ra các hồng cầu với nhiều biến đổi khác nhau.
Thông thường các ĐB đều làm giảm hoặc không tổng hợp loại Hb bình thường nên hồng cầu có biểu hiện nhược sắc và tăng sinh các hồng cầu non trong tủy. Đột biến gây thiếu h t chuỗi dẫn đến dư thừa chuỗi . Các chuỗi dư thừa tạo thành các hạt tủa xuống màng hồng cầu và nguyên sinh chất của hồng cầu. Với hồng cầu ở máu ngoại vi, những hạt tủa này làm cho màng hồng cầu mất độ mềm dẻo, hồng cầu trở thành tế bào cứng nên khó vượt qua các “màng lọc” ở lách (Maria-Domenica Cappellini et al, 2008; Srisupundit K, 2013).
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 5 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHCT Bình thường α-Thal β-Thal Hình 2. Hình dạng hồng cầu bất thường của bệnh nhân -Thal (Gelehrter, T. et al, 2000) Mặt khác, các hạt tủa cũng làm cho màng hồng cầu tăng diện tiếp xúc, dễ bị các tác nhân oxy hóa phá hủy. Đồng thời tính thấm của màng thay đổi nên kali ở bên trong tế bào thoát ra ngoài huyết tương.
Những tác hại trên của các hạt tủa làm hồng cầu bị vỡ sớm gây nên hiện tượng tan máu. Cơ chế sinh bệnh do thừa chuỗi ở bệnh nhân β-Thal (Olivieri,N.