Luận án tiến sĩ tuyển chọn chủng bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà

Luận án tiến sĩ nghiên cứu tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng hiệu quả trong phòng và điều trị bệnh đường tiêu hóa trên gà.

• Tác giả: Lê Thị Hải Yến
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Đức Hiền
• Trường học: Đại học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi
• Đề tài: Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Cần Thơ

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM KẾT KẾT QUẢ
• DANH SÁCH BẢNG
• DANH SÁCH HÌNH
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
• 1.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.2. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 1.3. Những đóng góp mới của luận án
• 1.4. Ý nghĩa thực tiễn của luận án
• 1.5. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.5.1. Tổng quan về probiotic
• 1.5.2. Lịch sử probiotic
• 1.5.3. Các định nghĩa về probiotic
• 1.5.4. Xu hướng sử dụng probiotic
• 1.5.5. Vai trò và cơ chế tác động của probiotic
• 1.5.6. Cơ chế tác động của probiotic ở gia cầm
• 1.5.7. Các chủng vi khuẩn thường dùng làm probiotic
• 1.5.8. Các chỉ tiêu để chọn một vi sinh vật làm probiotic
• 1.5.9. Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic
• 1.5.10. Tổng quan về Bacillus subtilis
• 1.5.11. Đặc điểm chung của giống Bacillus
• 1.5.12. Đặc điểm loài Bacillus subtilis
• 1.5.13. Dinh dưỡng và tăng trưởng
• 1.5.14. Tính đối kháng của B.
• 1.5.15. Một số phương pháp nghiên cứu tính đối kháng của B. subtilis và vi sinh vật gây bệnh
• 1.5.16. Hệ tiêu hóa và vi sinh vật đường ruột
• 1.5.17. Hệ tiêu hóa gia cầm và sự khác biệt so với động vật hữu nhũ
• 1.5.18. Vi sinh vật đường ruột và tác động của chúng đến vật nuôi
• 1.5.19. Một số vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa thường gặp trên gà
• 1.5.20. Một số nghiên cứu về probiotic trên thế giới và tại Việt Nam
• 1.5.20.1. Trên thế giới
• 1.5.20.2. Tại Việt Nam
• 1.5.21. Một số nghiên cứu ứng dụng B. subtilis ứng dụng cho người và vật nuôi
• 1.5.21.1. subtilis sử dụng cho gia cầm
• 1.6. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.6.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 1.6.2. Phương tiện nghiên cứu
• 1.6.3. Hóa chất và môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn
• 1.6.4. Nội dung nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu
• 1.6.4.1. Nội dung nghiên cứu
• 1.6.4.2. Phân lập các chủng Bacillus subtilis
• 1.6.4.3. Tuyển chọn các chủng B. subtilis có đặc tính probiotic
• 1.6.4.4. Đánh giá tính an toàn và tác dụng của chế phẩm trên gà
• 1.6.5. Xử lý số liệu
• 1.7. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 1.7.1. Phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus subtilis
• 1.7.2. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus spp.
• 1.7.3. Kết quả định danh Bacillus spp.
• 1.7.4. Kết quả khảo sát các đặc tính probiotic
• 1.7.4.1. Kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt độ cao
• 1.7.4.2. Khả năng nhạy/ kháng kháng sinh
• 1.7.4.3. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào
• 1.7.4.4. Khả năng đối kháng với các chủng vi sinh vật gây bệnh
• 1.7.4.5. Khả năng chịu acid dạ dày và muối mật
• 1.7.4.6. Khả năng bám dính
• 1.7.4.7. Khả năng sống của vi khuẩn trong đường ruột gà
• 1.7.5. Kết quả thí nghiệm, đánh giá tác dụng của chế phẩm trên gà
• 1.7.5.1. Kết quả thí nghiệm 1
• 1.7.5.2. Kết quả thí nghiệm 2
• 1.7.5.3. Kết quả thí nghiệm 3
• 1.7.6. Đăng ký trình tự B. subtilis trên Genbank
• 1.8. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về ứng dụng Bacillus Subtilis trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà

Bacillus Subtilis là một vi khuẩn có lợi được nghiên cứu rộng rãi trong lĩnh vực chăn nuôi gà nhờ khả năng phòng bệnh và trị bệnh hiệu quả. Nghiên cứu này tập trung vào việc tuyển chọn chủng vi khuẩn phù hợp để thay thế kháng sinh trong chăn nuôi gà công nghiệp, nhằm giảm thiểu nguy cơ kháng kháng sinh và nâng cao sức khỏe gia cầm. Bacillus Subtilis được chọn lọc từ đất và phân gà tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long, với mục tiêu tìm ra chủng có tiềm năng probiotic cao nhất.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu nhằm phân lập và định danh các chủng Bacillus Subtilis có khả năng sinh enzyme tiêu hóa, chịu được dịch tiêu hóa, và đối kháng với vi khuẩn gây bệnh. Mục tiêu cuối cùng là tìm ra chủng probiotic hiệu quả để phòng bệnh đường tiêu hóa trên gà, đặc biệt là các bệnh do E. coli và Salmonella gây ra.

1.2. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung vào các chủng Bacillus Subtilis được phân lập từ đất và phân gà tại 7 tỉnh thuộc Đồng bằng sông Cửu Long. Các chủng này được đánh giá dựa trên các tiêu chí sinh lý, sinh hóa, và khả năng probiotic để chọn ra chủng phù hợp nhất.

II. Phương pháp nghiên cứu và kết quả

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp phân lập, định danh, và đánh giá các đặc tính probiotic của Bacillus Subtilis. Kết quả cho thấy, từ 296 chủng vi khuẩn ban đầu, 21 chủng đáp ứng các tiêu chí sinh lý và sinh hóa. Trong đó, chủng Bacillus Subtilis VL28 được chọn làm probiotic nhờ khả năng sinh enzyme, chịu acid dạ dày, và đối kháng với vi khuẩn gây bệnh.

2.1. Phân lập và định danh Bacillus Subtilis

Các chủng Bacillus Subtilis được phân lập từ đất và phân gà và định danh bằng kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA. Kết quả cho thấy 21 chủng có mức độ tương đồng gen cao (≥ 99%) với Bacillus Subtilis.

2.2. Đánh giá đặc tính probiotic

Các chủng được đánh giá dựa trên khả năng sinh enzyme, chịu acid dạ dày, chịu muối mật, và đối kháng với vi khuẩn gây bệnh. Chủng Bacillus Subtilis VL28 thể hiện tiềm năng probiotic vượt trội, đặc biệt là khả năng ức chế E. coli và Salmonella.

III. Ứng dụng thực tiễn và kết luận

Chủng Bacillus Subtilis VL28 được bổ sung vào thức ăn gà với liều lượng 5 g/kg, cho thấy hiệu quả tăng trọng 11,7% và giảm lượng thức ăn 16,8% so với đối chứng. Ngoài ra, chủng này còn có khả năng phòng bệnh đường tiêu hóa tương đương với kháng sinh. Kết quả này khẳng định tiềm năng ứng dụng của Bacillus Subtilis trong chăn nuôi hiệu quả và bảo vệ sức khỏe gia cầm.

3.1. Hiệu quả trong phòng và trị bệnh

Thí nghiệm trên gà nhiễm E. coli và Salmonella cho thấy, Bacillus Subtilis VL28 giúp tăng tỷ lệ sống và tăng trọng tương đương với nhóm sử dụng kháng sinh. Điều này chứng minh khả năng thay thế kháng sinh của chủng này.

3.2. Đăng ký và ứng dụng thực tiễn

Trình tự gen 16S rRNA của Bacillus Subtilis VL28 đã được đăng ký trên ngân hàng gen NCBI với mã số KY346980. Chủng này có tiềm năng lớn trong việc cải thiện tiêu hóa và phòng bệnh đường tiêu hóa trên gà, góp phần nâng cao hiệu quả chăn nuôi.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Sự phát triển của ngành chăn nuôi gà theo phương thức công nghiệp đã đóng góp lớn vào nguồn cung cấp thực phẩm và tăng trưởng kinh tế - xã hội. Tuy nhiên, việc sử dụng phổ biến các loại thuốc kháng sinh trong khẩu phần ăn nhằm mục đích phòng bệnh và kích thích tăng trưởng đã dẫn đến nguy cơ gia tăng các dòng vi khuẩn đề kháng kháng sinh trong tự nhiên, từ đó ảnh hưởng tiêu cực đến hiệu quả điều trị bệnh nhiễm khuẩn ở người. Trước xu hướng hạn chế và cấm sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi tại nhiều quốc gia, việc tìm kiếm các giải pháp sinh học thay thế trở nên cấp thiết. Trong đó, sử dụng probiotic—các vi sinh vật sống có lợi—được đánh giá là hướng tiếp cận phù hợp.

Loài vi khuẩn Bacillus subtilis có phân bố rộng trong tự nhiên, sức đề kháng cao với các tác nhân lý hóa nhờ khả năng tạo nội bào tử, an toàn cho người và động vật, đồng thời được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận thuộc nhóm GRAS (Generally Regarded As Safe). Mặc dù vậy, các đặc tính sinh học của các chủng B. subtilis rất đa dạng và tính hiệu quả phụ thuộc chặt chẽ vào vật chủ sử dụng. Do đó, việc phân lập và tuyển chọn chủng B. subtilis bản địa có hoạt tính sinh học phù hợp với điều kiện chăn nuôi gia cầm tại Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là vấn đề nghiên cứu then chốt mà luận án giải quyết.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định cụ thể như sau:

1. Phân lập được ít nhất 01 chủng Bacillus subtilis tại một số tỉnh ĐBSCL có các đặc tính probiotic như: khả năng sinh enzyme tiêu hóa (amylase, protease, lipase); chịu được tác động của dịch tiêu hóa (dịch vị, muối mật), khả năng bám dính vào niêm mạc ruột và đối kháng với một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột (Salmonella enterica, Escherichia coli, Staphylococcus spp., Streptococcus spp.).
2. Xác định được liều dùng hiệu quả của chủng probiotic phân lập được trong phòng bệnh đường ruột ở gà do Escherichia coli và Salmonella enterica gây ra.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn thuộc loài Bacillus subtilis.
• Phạm vi nghiên cứu: 70 mẫu đất và 70 mẫu phân gà (tổng cộng 140 mẫu) được thu thập tại các chuồng trại chăn nuôi gà thuộc 7 tỉnh, thành phố khu vực Đồng bằng sông Cửu Long, bao gồm: Cần Thơ, Hậu Giang, An Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp, Sóc Trăng và Kiên Giang.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa lịch sử phát triển, định nghĩa, cơ chế tác động của probiotic cũng như đặc điểm sinh học của chi Bacillus và loài Bacillus subtilis:

1. Lịch sử và định nghĩa probiotic: Các nghiên cứu nền tảng bắt đầu từ Tisser (1900) khi quan sát hệ vi khuẩn đường ruột ở trẻ tiêu chảy, tiếp nối bởi Metchnikoff (1907) về tác dụng của vi khuẩn Lactobacillus trong việc ức chế độc tố đường ruột và kéo dài tuổi thọ. Năm 1930, Shirota phân lập vi khuẩn lactic từ phân trẻ khỏe mạnh, cùng năm các nhà khoa học Hoa Kỳ chứng minh Lactobacillus acidophilus làm giảm táo bón. Về mặt thuật ngữ, Lilley và Stillwell (1965) sử dụng thuật ngữ probiotic đầu tiên; sau đó các định nghĩa được hoàn thiện bởi Marteau et al. (1990), Verschuere et al. (2000) và định nghĩa chuẩn hóa của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc phối hợp cùng Tổ chức Y tế Thế giới (FAO/WHO, 2002): probiotic là những vi sinh vật sống được kiểm soát chặt chẽ, khi bổ sung với lượng thích hợp sẽ mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ.

2. Cơ chế tác động của probiotic trên gia cầm: Tác giả tổng hợp các công trình của Patterson và Burkholder (2003), Kabir (2009), Otutumi et al. (2012), Everlon (2012) và Revolledo et al. (2006). Probiotic bảo vệ vật chủ qua các cơ chế:

   • Ức chế vi khuẩn gây bệnh trực tiếp: Tiết các chất kháng khuẩn sinh học gồm bacteriocin, acid hữu cơ (acetic, lactic, propionic) làm hạ pH đường ruột, và hydrogen peroxide (H₂O₂).
   • Cạnh tranh sinh học: Cạnh tranh vị trí bám dính trên thụ thể biểu mô ruột (Czerucka and Rampal, 2002) và cạnh tranh cơ chất dinh dưỡng như đường đơn (Peter, 2006).
   • Tác động lên mô biểu bì và miễn dịch: Tăng cường liên kết tế bào biểu mô, kích thích sản sinh chất nhầy mucin (Mattar et al., 2002; Gupta and Garg, 2009), kích hoạt lympho bào trong biểu mô ruột (IEL), lympho bào đệm niêm mạc (LPL), kích thích tế bào B và tương bào tăng tiết kháng thể bề mặt SIgA (Szajewska et al., 2001; Revolledo et al., 2006).

3. Đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis: Theo Todar (2015), giống Bacillus gồm 226 loài (Euzéby, 1997). Loài B. subtilis lần đầu được Ehrenberg (1835) mô tả dưới tên Vibrio subtilis và được Cohen (1872) định danh lại. Hệ gen của B. subtilis được Kunst et al. (1997) giải mã có kích thước khoảng 4.215 kbp (4.814 cặp base), chứa khoảng 4.100 gen mã hóa protein. Quá trình biệt hóa tế bào tạo ra 4 dạng: tế bào khả biến (competent cells), tế bào sinh chất nền tạo màng sinh học (matrix-producing cells), tế bào di động (motile cells) và bào tử miên trạng (sporulating cells) (Lopez et al., 2009). B. subtilis tiết nhiều enzyme ngoại bào có giá trị (α-amylase, protease, β-glucanase, xylanase, lipase - Oyeleke et al., 2010) và hơn 20 loại peptide/kháng sinh kháng khuẩn như subtilin, subtilosin A, TasA, sublancin, surfactin, bacilysocin, mycosubtilin (Stein, 2005; Klein et al., 1992; Stöver and Driks, 1999; Bais et al., 2004).

4. Bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa ở gia cầm: Hai tác nhân phổ biến gây bệnh đường ruột được điểm luận gồm Salmonella enterica (các serotype chính: S. enteritidis, S. typhimurium, S. gallinarum, S. pullorum) và Escherichia coli. Salmonella sở hữu nội độc tố lipopolysaccharide (LPS), độc tố đường ruột và các yếu tố bám dính, xâm nhập mô biểu mô ruột, gây tổn thương gan, lách và tiêu chảy mất nước (Mead et al., 1999).

Khoảng trống nghiên cứu: Các probiotic truyền thống thuộc nhóm vi khuẩn lactic (Lactobacillus, Bifidobacterium) thường có nhược điểm là kém bền với nhiệt độ cao trong quá trình ép viên thức ăn chăn nuôi và dễ bị suy giảm mật số khi đi qua dịch vị dạ dày, muối mật (Fernandes et al., 1987). Mặc dù B. subtilis đã được nghiên cứu trên thế giới, nhưng các chủng bản địa tại vùng ĐBSCL có khả năng thích ứng cao với điều kiện sinh thái, vừa có hoạt tính enzyme mạnh, vừa có khả năng đối kháng kép với S. enterica và E. coli trên gà thịt chưa được phân lập, định danh và đánh giá hiệu quả in vivo một cách toàn diện.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

Nghiên cứu được xây dựng trên cơ sở lý thuyết về cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, lý thuyết loại trừ cạnh tranh (Competitive Exclusion - CE) và hướng dẫn chuẩn hóa tuyển chọn vi sinh vật probiotic dùng trong thức ăn chăn nuôi của FAO/WHO (2002) và Ủy ban Khoa học về Dinh dưỡng Động vật Châu Âu (SCAN, 2000).

Bậc phân loại	Tên Latin	Tên tiếng Việt
Giới (Kingdom)	Bacteria	Vi khuẩn
Ngành (Division)	Firmicutes	Ngành vi khuẩn bắt màu Gram dương
Lớp (Class)	Bacilli	Lớp trực khuẩn
Bộ (Order)	Bacillales	Bộ trực khuẩn
Họ (Family)	Bacillaceae	Họ trực khuẩn
Chi (Genus)	Bacillus	Chi trực khuẩn
Loài (Species)	Bacillus subtilis	Trực khuẩn cỏ khô / subtilis

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Quá trình nghiên cứu thực hiện qua các bước kỹ thuật chuẩn hóa:

1. Phân lập và tuyển chọn sơ bộ:

   • Xử lý 140 mẫu phân và đất chuồng gà qua sốc nhiệt 80°C trong 15 phút để loại bỏ tế bào sinh dưỡng và chọn lọc vi khuẩn tạo nội bào tử.
   • Cấy gạt trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA), thạch TSA, ủ ở 37°C trong 24 giờ.
   • Kiểm tra hình thái khuẩn lạc, nhuộm Gram, soi kính hiển vi.
   • Đánh giá các chỉ tiêu sinh lý - sinh hóa: phản ứng catalase, khả năng thủy phân tinh bột (amylase), phân giải cellulose (cellulase), phản ứng Voges-Proskauer (VP), khả năng phát triển ở 50°C và phản ứng lecithinase trên thạch lòng đỏ trứng (yêu cầu âm tính để loại bỏ nhóm Bacillus cereus gây ngộ độc).

2. Định danh phân tử và sinh hóa chuyên sâu:

   • Sử dụng bộ kit sinh hóa API 50 CHB (bioMérieux, Pháp) để kiểm tra khả năng lên men 49 loại carbohydrate.
   • Chiết tách DNA tổng số, thực hiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mã hóa 16S rRNA bằng cặp mồi phổ biến.
   • Giải trình tự đoạn gen 16S rRNA và đối chiếu độ tương đồng bằng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI).

3. Khảo sát các đặc tính probiotic in vitro (trên 21 chủng được chọn):

   • Kháng sinh đồ: Phương pháp khuếch tán đĩa giấy theo tiêu chuẩn CLSI đối với 9 kháng sinh: erythromycin, gentamycin, neomycin, oxytetracyclin, doxycyclin, colistin, sulfadimidin - trimethoprim, norfloxacin, enrofloxacin.
   • Khả năng chịu nhiệt: Nuôi cấy ở các dải nhiệt độ 50°C, 55°C và 60°C.
   • Hoạt lực enzyme ngoại bào: Đo đường kính vòng phân giải và định lượng hoạt tính amylase (đơn vị BAU), protease (phương pháp Anson cải tiến với cơ chất casein) và lipase.
   • Khả năng đối kháng vi sinh vật gây bệnh: Thử nghiệm với Escherichia coli, Salmonella enterica, Staphylococcus spp., Streptococcus spp. bằng phương pháp cấy đường thẳng góc (kẻ vạch vuông góc) và phương pháp đục lỗ khuếch tán thạch (dùng dịch chiết không tế bào).
   • Khả năng chịu acid và muối mật: Đánh giá tỷ lệ sống sót của vi khuẩn sau khi ủ trong môi trường có pH 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 và môi trường bổ sung muối mật nồng độ 0,3% ở các mốc thời gian 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ.
   • Khả năng bám dính: Đánh giá khả năng tự kết cụm (autoaggregation), kết cụm với vi khuẩn gây bệnh (coaggregation) và bám dính trên tế bào biểu mô ruột gà in vitro.
   • Khả năng sống sót trong đường tiêu hóa gà: Xác định mật độ bào tử/vi khuẩn tại các đoạn ruột non, manh tràng và ruột già.

4. Thử nghiệm in vivo trên gà:

   • Thí nghiệm 1: Đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm bổ sung B. subtilis VL28 (mật độ $10^7\text{ CFU/g}$, liều $5\text{ g/kg}$ thức ăn) lên sinh trưởng, tỷ lệ nuôi sống và hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR) ở gà từ 1 đến 56 ngày tuổi.
   • Thí nghiệm 2: Đánh giá hiệu quả bảo hộ của B. subtilis VL28 trên đàn gà 18 ngày tuổi bị gây nhiễm thực nghiệm vi khuẩn Salmonella enterica (liều $7,5 \times 10^4\text{ CFU/mL/con}$), so sánh đối chứng với phác đồ điều trị kháng sinh enrofloxacin và oxytetracyclin.
   • Thí nghiệm 3: Đánh giá hiệu quả bảo hộ của B. subtilis VL28 trên đàn gà 18 ngày tuổi bị gây nhiễm thực nghiệm vi khuẩn Escherichia coli (liều $5,0 \times 10^6\text{ CFU/mL/con}$), so sánh đối chứng với điều trị kháng sinh.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu

Chương 1 xác định tính cấp thiết của việc nghiên cứu chất thay thế kháng sinh trong chăn nuôi gia cầm, chỉ rõ mục tiêu phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn B. subtilis bản địa đạt tiêu chuẩn probiotic và xác định liều dùng tối ưu trong phòng bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa do E. coli và S. enterica. Chương này đồng thời nêu rõ phạm vi thu mẫu tại 7 tỉnh ĐBSCL và tóm tắt những đóng góp mới về mặt học thuật và thực tiễn của đề tài.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Tác giả trình bày bức tranh tổng thể về lý thuyết probiotic, lịch sử nghiên cứu từ năm 1900 đến nay, các chỉ tiêu kỹ thuật lựa chọn chủng probiotic theo tiêu chuẩn quốc tế của FAO/WHO và SCAN. Chương 2 phân tích sâu cấu trúc tế bào, đặc điểm bộ gen, cơ chế hình thành bào tử, sinh hóa học các enzyme ngoại bào và hơn 20 loại bacteriocin của B. subtilis. Bên cạnh đó, các đặc điểm giải phẫu - sinh lý đường tiêu hóa gia cầm (tốc độ vận chuyển thức ăn 30–42 cm/giờ, biến thiên pH từ 1,15–4,4 ở dạ dày đến 7,42 ở ruột non), cơ chế miễn dịch niêm mạc (SIgA, tế bào M, đại thực bào APC) và bệnh học do Salmonella enterica, Escherichia coli cũng được phân tích chi tiết làm cơ sở cho nghiên cứu thực nghiệm.

Chương 3: Phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết toàn bộ vật liệu, hóa chất, môi trường nuôi cấy (TSA, TSB, NA, DSM, MacConkey, EMB, SS agar), trang thiết bị và quy trình thực nghiệm từ phân lập, định danh (kit API 50 CHB, PCR 16S rRNA) đến các thử nghiệm kiểm tra tính chất probiotic in vitro. Chương này cũng mô tả chi tiết sơ đồ bố trí 3 thí nghiệm in vivo trên gà (chia lô thí nghiệm, lô đối chứng, lô gây nhiễm dùng probiotic và lô gây nhiễm dùng kháng sinh), các chỉ tiêu theo dõi (tăng trọng, FCR, tỷ lệ chết, bệnh tích đại thể, vi thể) và phương pháp xử lý thống kê số liệu.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 cung cấp toàn bộ các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình phân lập, sàng lọc và thử nghiệm:

1. Kết quả phân lập và định danh:
   • Từ 140 mẫu (70 mẫu đất, 70 mẫu phân), phân lập được 296 chủng vi khuẩn dạng hình que, Gram dương, có khả năng sinh nội bào tử.
   • Qua các thử nghiệm sàng lọc sinh hóa (catalase dương tính, amylase dương tính, cellulase dương tính, VP dương tính, lecithinase âm tính, mọc được ở 50°C), chọn được 29 chủng vi khuẩn nghi ngờ.
   • Kết quả định danh bằng bộ kit API 50 CHB kết hợp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA đã xác định chính xác 21 chủng đạt độ tương đồng $\ge 99%$ với loài Bacillus subtilis.

Chỉ tiêu sinh lý - sinh hóa sàng lọc	Kết quả yêu cầu đối với B. subtilis
Nhuộm Gram và hình thái	Trực khuẩn Gram dương (+), có nội bào tử
Phản ứng Catalase	Dương tính (+)
Khả năng sinh Amylase	Dương tính (+)
Khả năng sinh Cellulase	Dương tính (+)
Phản ứng Voges-Proskauer (VP)	Dương tính (+)
Khả năng phát triển ở 50°C	Dương tính (+)
Phản ứng Lecithinase	Âm tính (-)

2. Đặc tính probiotic của 21 chủng B. subtilis tuyển chọn:
   • Kháng sinh đồ: Cả 21 chủng đều nhạy cảm với hầu hết các kháng sinh thông dụng; chủng VL28 không mang gen kháng thuốc truyền ngang nguy hại.
   • Khả năng chịu nhiệt: Các chủng duy trì sức sống tốt ở 50–60°C.
   • Khả năng sinh enzyme: Xác định 10 chủng có hoạt lực cao; trong đó các chủng AG27, AG60, VL05 và VL28 có hoạt lực phân giải tinh bột, protein và lipid vượt trội.
   • Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh: Chủng B. subtilis VL28 thể hiện hoạt tính đối kháng trực tiếp và gián tiếp mạnh nhất đối với cả 4 chủng vi sinh vật chỉ thị: Escherichia coli, Salmonella enterica, Staphylococcus spp. và Streptococcus spp.
   • Khả năng chịu acid và muối mật: Chủng VL28 có tỷ lệ sống sót cao ở môi trường pH 2,0; 3,0 và nồng độ muối mật 0,3% sau 3 giờ ủ.
   • Khả năng bám dính và sống trong ống tiêu hóa: Chủng VL28 có tỷ lệ tự kết cụm, bám dính tế bào biểu mô ruột và khả năng tồn tại ở ruột non, manh tràng và ruột già cao nhất trong số các chủng khảo sát. Do đó, chủng B. subtilis VL28 được lựa chọn để sản xuất chế phẩm thử nghiệm trên gia cầm.

Đặc tính probiotic khảo sát in vitro	Kết quả thể hiện trên chủng B. subtilis VL28
Kháng sinh đồ (CLSI)	Nhạy cảm với erythromycin, gentamycin, neomycin, oxytetracyclin, norfloxacin, enrofloxacin...
Chịu nhiệt độ cao	Tồn tại và phát triển tốt ở 50°C đến 60°C
Hoạt lực enzyme ngoại bào	Sinh mạnh cả 3 loại enzyme: amylase, protease và lipase
Phổ đối kháng vi khuẩn	Ức chế mạnh E. coli, S. enterica, Staphylococcus spp., Streptococcus spp.
Chịu acid dịch vị và muối mật	Sống sót tốt ở pH 2,0 và muối mật 0,3% sau 3 giờ
Khả năng bám dính	Tự kết cụm cao, kết cụm với mầm bệnh và bám dính biểu mô ruột tốt
Cư trú đường ruột gà	Tồn tại ổn định tại ruột non, manh tràng và ruột già

3. Kết quả thử nghiệm in vivo trên đàn gà:
   • Thí nghiệm 1 (Gà nuôi thịt 1–56 ngày tuổi): Bổ sung chế phẩm B. subtilis VL28 ($10^7\text{ CFU/g}$, liều $5\text{ g/kg}$ thức ăn) giúp khối lượng tăng trọng của gà đạt cao hơn 11,7% so với lô đối chứng không bổ sung. Đồng thời, lượng thức ăn tiêu thụ trên mỗi kg tăng trọng giảm 16,8% (giảm FCR).
   • Thí nghiệm 2 (Gây nhiễm thực nghiệm S. enterica): Đàn gà 18 ngày tuổi gây nhiễm S. enterica ($7,5 \times 10^4\text{ CFU/mL/con}$) khi được cho ăn thức ăn bổ sung B. subtilis VL28 đạt mức tăng trọng và tỷ lệ sống tương đương với lô gà điều trị bằng thuốc kháng sinh enrofloxacin và oxytetracyclin.
   • Thí nghiệm 3 (Gây nhiễm thực nghiệm E. coli): Gà 18 ngày tuổi gây nhiễm E. coli ($5,0 \times 10^6\text{ CFU/mL/con}$) khi sử dụng thức ăn bổ sung B. subtilis VL28 có tỷ lệ chết thấp, cải thiện tăng trọng và kiểm soát bệnh tích gan, ruột tương đương lô điều trị bằng kháng sinh.
   • Đăng ký dữ liệu NCBI: Đoạn trình tự gen 16S rRNA của chủng B. subtilis VL28 được Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia Hoa Kỳ (NCBI) phê duyệt và cấp mã số truy cập quốc tế KY346980.

Chương 5: Kết luận và đề nghị

Đưa ra kết luận tổng hợp về việc phân lập, tuyển chọn thành công chủng B. subtilis VL28, khẳng định tiềm năng thay thế kháng sinh trong chăn nuôi gà thịt và đề xuất các bước triển khai sản xuất chế phẩm sinh học ở quy mô công nghiệp.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

• Luận án là công trình nghiên cứu hệ thống đầu tiên tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long thực hiện phân lập, tuyển chọn và giám định vi khuẩn Bacillus subtilis có tiềm năng probiotic theo đúng các tiêu chuẩn và hướng dẫn quốc tế của FAO/WHO.
• Đã xác định chính xác đặc tính sinh học, hoạt lực sinh enzyme tiêu hóa ngoại bào, cơ chế ức chế mầm bệnh đường ruột và khả năng sống sót qua rào cản dịch vị - muối mật của các chủng vi khuẩn bản địa.
• Đóng góp vào cơ sở dữ liệu di truyền vi sinh vật quốc tế đoạn trình tự gen 16S rRNA của chủng Bacillus subtilis VL28 với mã số GenBank KY346980.

Những đóng góp mới về mặt thực tiễn

• Phân lập và tuyển chọn được chủng vi khuẩn bản địa Bacillus subtilis VL28 có các đặc tính sinh học ưu việt, thích nghi hoàn toàn với điều kiện sinh thái vùng ĐBSCL.
• Chứng minh bằng thực nghiệm khoa học rằng việc bổ sung B. subtilis VL28 ở mật độ $10^7\text{ CFU/g}$ với liều lượng $5\text{ g/kg}$ thức ăn có khả năng thay thế kháng sinh trong việc phòng ngừa và kiểm soát bệnh viêm nhiễm đường ruột do Salmonella enterica và Escherichia coli trên gà thịt.
• Ứng dụng chế phẩm giúp nâng cao năng suất chăn nuôi gà: tăng 11,7% khối lượng tăng trọng và giảm 16,8% lượng thức ăn tiêu thụ trên mỗi đơn vị tăng trọng so với đối chứng.
• Tạo tiền đề khoa học và thực tiễn vững chắc cho việc hạn chế sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi, góp phần cung cấp sản phẩm thịt gà sạch, không tồn dư kháng sinh và giảm thiểu phát tán các dòng vi khuẩn kháng thuốc ra môi trường.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Cần ứng dụng chủng B. subtilis VL28 vào quy trình sản xuất men vi sinh probiotic quy mô công nghiệp để phục vụ chăn nuôi gia cầm tại các tỉnh phía Nam.
• Tiếp tục nghiên cứu công nghệ lên men và bào tử hóa nhằm nâng cao hơn nữa mật độ bào tử, độ bền bảo quản và kéo dài hạn sử dụng của sản phẩm thương mại.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Luận án tập trung khảo sát nguồn mẫu phân lập trong phạm vi địa lý thuộc 7 tỉnh vùng ĐBSCL và đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh chủ yếu trên đối tượng gà thịt đối với hai tác nhân vi khuẩn gây bệnh đường ruột phổ biến nhất là Salmonella enterica và Escherichia coli.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Nghiên cứu mở rộng ứng dụng chủng B. subtilis VL28 trên các đối tượng gia cầm khác như gà đẻ trứng, vịt, chim cút.
  • Tối ưu hóa môi trường lên men công nghiệp giá thành thấp từ phụ phẩm nông nghiệp và hoàn thiện công nghệ sấy tạo hạt chứa nội bào tử.
  • Đánh giá khả năng phối hợp giữa B. subtilis VL28 với các chủng vi sinh vật hữu ích khác (như nấm men Saccharomyces hoặc vi khuẩn lactic Lactobacillus) để tạo chế phẩm probiotic đa chủng.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn cao cho nhiều đối tượng:

• Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành: Là tài liệu tham khảo chuẩn mực về quy trình phân lập, sàng lọc sinh lý - sinh hóa, định danh phân tử 16S rRNA và các phương pháp đánh giá hoạt tính probiotic in vitro (đo hoạt lực enzyme, kháng sinh đồ theo CLSI, đối kháng vi sinh vật, thử thách acid - muối mật, bám dính biểu mô).
• Đối với giảng viên và cán bộ nghiên cứu Thú y, Chăn nuôi, Công nghệ sinh học: Cung cấp tư liệu chi tiết về giải phẫu - sinh lý tiêu hóa gia cầm, cơ chế tương tác giữa probiotic với hệ miễn dịch đường ruột (SIgA, tế bào biểu mô, đại thực bào) và bệnh học Salmonella, E. coli.
• Đối với các doanh nghiệp sản xuất thuốc thú y và thức ăn chăn nuôi: Cung cấp thông số kỹ thuật, liều lượng sử dụng ($5\text{ g/kg}$ thức ăn ở mật độ $10^7\text{ CFU/g}$) và cơ sở khoa học để phát triển sản phẩm chế phẩm sinh học thay thế kháng sinh trong chăn nuôi gà công nghiệp.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng vi khuẩn nào thể hiện đặc tính probiotic tốt nhất và đã được cấp mã số định danh quốc tế là gì?

Qua khảo sát toàn diện 21 chủng Bacillus subtilis, chủng Bacillus subtilis VL28 được xác định là chủng ưu việt nhất về mọi chỉ tiêu sinh học (chịu nhiệt, hoạt tính enzyme amylase, protease, lipase, ức chế vi khuẩn gây bệnh, chịu acid dạ dày pH 2,0, muối mật 0,3% và bám dính niêm mạc). Trình tự gen 16S rRNA của chủng này đã được đăng ký và phê duyệt trên Ngân hàng gen NCBI với mã số truy cập quốc tế KY346980.

2. Quy mô mẫu thu thập và kết quả sàng lọc ban đầu của luận án diễn ra như thế nào?

Nghiên cứu đã thu thập tổng cộng 140 mẫu gồm 70 mẫu đất và 70 mẫu phân gà từ các trại gà thuộc 7 tỉnh vùng ĐBSCL (Cần Thơ, Hậu Giang, An Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp, Sóc Trăng, Kiên Giang). Từ các mẫu này đã phân lập được 296 chủng vi khuẩn dạng Bacillus. Qua các bước kiểm định sinh lý - sinh hóa sàng lọc, đã chọn được 29 chủng và cuối cùng định danh chính xác 21 chủng B. subtilis có độ tương đồng gen 16S rRNA $\ge 99%$.

3. Việc bổ sung chế phẩm B. subtilis VL28 mang lại hiệu quả tăng trưởng và tiêu tốn thức ăn như thế nào trên gà thịt?

Khi bổ sung B. subtilis VL28 mật độ $10^7\text{ CFU/g}$ vào khẩu phần ăn với liều lượng $5\text{ g/kg}$ thức ăn cho gà nuôi từ 1 đến 56 ngày tuổi, khối lượng tăng trọng của gà tăng 11,7% và lượng thức ăn tiêu thụ trên mỗi kg tăng trọng giảm 16,8% (cải thiện rõ rệt hệ số FCR) so với lô đối chứng không bổ sung vi khuẩn.

4. Hiệu quả phòng chống bệnh đường ruột của B. subtilis VL28 khi gây nhiễm thực nghiệm Salmonella enterica và Escherichia coli đạt mức độ nào?

Ở đàn gà 18 ngày tuổi bị gây nhiễm thực nghiệm với Salmonella enterica (liều $7,5 \times 10^4\text{ CFU/mL/con}$) hoặc Escherichia coli (liều $5,0 \times 10^6\text{ CFU/mL/con}$), việc nuôi bằng thức ăn bổ sung B. subtilis VL28 (liều $5\text{ g/kg}$) cho kết quả tăng trọng, kiểm soát bệnh tích và tỷ lệ nuôi sống tương đương với việc sử dụng các loại thuốc kháng sinh điều trị là enrofloxacin và oxytetracyclin.

5. Những chỉ tiêu sinh hóa bắt buộc nào được sử dụng để sàng lọc sơ bộ B. subtilis trước khi định danh phân tử?

Các chủng vi khuẩn phân lập được chọn lọc qua các chỉ tiêu: nhuộm Gram (trực khuẩn Gram dương tạo nội bào tử), dương tính với catalase, dương tính với amylase, dương tính với cellulase, dương tính với phản ứng Voges-Proskauer (VP), phát triển được ở nhiệt độ cao 50°C, và bắt buộc phải âm tính với phản ứng lecithinase trên môi trường thạch lòng đỏ trứng để loại trừ các dòng vi khuẩn có độc tố.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Lê Thị Hải Yến đã thực hiện thành công quy trình phân lập, sàng lọc và tuyển chọn có hệ thống chủng vi khuẩn bản địa Bacillus subtilis VL28 từ 140 mẫu đất và phân gà tại 7 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. Chủng B. subtilis VL28 (mã số GenBank KY346980) sở hữu đầy đủ các đặc tính probiotic ưu việt gồm khả năng chịu nhiệt độ cao, chịu acid dạ dày pH 2,0, chịu muối mật 0,3%, sinh enzyme tiêu hóa mạnh và đối kháng trực tiếp các vi khuẩn gây bệnh đường ruột. Kết quả thử nghiệm in vivo chứng minh liều bổ sung $5\text{ g/kg}$ thức ăn (mật độ $10^7\text{ CFU/g}$) giúp gà tăng trọng 11,7%, giảm tiêu tốn thức ăn 16,8% và có khả năng bảo hộ tương đương kháng sinh enrofloxacin, oxytetracyclin khi bị gây nhiễm thực nghiệm S. enterica và E. coli. Công trình cung cấp luận cứ khoa học vững chắc và giải pháp sinh học thiết thực nhằm thay thế kháng sinh trong chăn nuôi gia cầm, nâng cao năng suất và đảm bảo an toàn thực phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THỊ HẢI YẾN TUYỂN CHỌN CHỦNG BACILLUS SUBTILIS ỨNG DỤNG TRONG PHÕNG BỆNH NHIỄM KHUẨN ĐƯỜNG TIÊU HÓA TRÊN GÀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI MÃ SỐ: 62 64 01 02 CẦN THƠ, 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THỊ HẢI YẾN TUYỂN CHỌN CHỦNG BACILLUS SUBTILIS ỨNG DỤNG TRONG PHÕNG BỆNH NHIỄM KHUẨN ĐƢỜNG TIÊU HÓA TRÊN GÀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI MÃ SỐ: 62 64 01 02 HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. NGUYỄN ĐỨC HIỀN Cần Thơ, 2018 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành các nội dung trong luận văn tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng học hỏi của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều từ quý thầy cô, bạn bè. Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: PGS. TS Nguyễn Đức Hiền đã động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Quí thầy cô Bộ môn Thú y, khoa Nông nghiêp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Ban lãnh đạo Vemedim Corporation, Trung tâm nghiên cứu và phát triển Vemedim đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi học tập, nghiên cứu và nâng cao trình độ trong thời gian qua. Cty TNHH chăn nuôi một thành viên Vemedim đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được thực hiện các thí nghiệm. Xin chân thành cảm ơn tất cả bạn bè, các bạn đồng nghiệp, các anh, chị, em phòng Sản phẩm sinh học, Trung Tâm nghiên cứu và phát triển Vemedim đã hỗ trợ, chia sẻ và cung cấp thông tin giúp tôi hoàn thành luận án.

Cảm ơn gia đình và những người thân đã động viên, chia sẻ và luôn sát cánh bên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài. ii TÓM LƢỢC Đề tài “Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà” được thực hiện với mục đích phân lập chủng vi khuẩn B. subtilis có tiềm năng probiotic thích hợp cho gia cầm từ đất và phân của trại gà. Nghiên cứu này nhằm tìm biện pháp mới thay thế kháng sinh trong phòng và trị bệnh, nâng cao năng suất, hiệu quả trong chăn nuôi gà công nghiệp, giảm bớt nguy cơ lan rộng các dòng vi khuẩn kháng kháng sinh trong tự nhiên.

Đề tài đã phân lập được 296 chủng vi khuẩn từ 70 mẫu đất và 70 mẫu phân gà thu thập tại các trại gà thuộc 7 tỉnh, thành vùng ĐBSCL. Các chủng vi khuẩn này được chọn lọc qua kiểm định sinh lý, sinh hóa với các chỉ tiêu như: âm tính với lecithinase, dương tính với catalase, amylase, cellulase, VP (Voges- Proskauer), và chịu nhiệt cao (phát triển được ở 50oC); và được định danh bằng bộ kít API CH50B (Biomerieux-France) kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16S rRNA (sử dụng phần mềm BLAST so sánh trình tự gen trên cơ sở dữ liệu NCBI). Kết quả phân tích cho thấy đã chọn ra được 21 chủng vi khuẩn đạt chỉ tiêu về mặt sinh lý, sinh hóa theo yêu cầu và về mặt định danh có mức độ tương đồng của gene 16S rRNA cao (≥ 99%) với B. Nhằm tuyển chọn chủng vi khuẩn có tiềm năng probiotic, 21 chủng B.

subtilis tuyển chọn đã được khảo sát các đặc điểm đặc trưng cho vi khuẩn probiotic như: tính nhạy cảm kháng sinh (erythromycin, gentamycin, neomycin, oxytetracyclin, doxycyclin, colistin, sulfadimidin - trimethoprim, norfloxacin, enrofloxacin), tính chịu nhiệt (phát triển ở nhiệt độ từ 50-60oC), khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, lipase), khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh (E. enterica, Staphylococcus spp.), khả năng chịu pH acid dạ dày (pH 2,0), khả năng chịu muối mật 0,3%, khả năng bám dính (tự bám dính, bám dính với vi khuẩn gây bệnh, bám dính tế bào biểu mô ruột) và khả năng sống được trong đường tiêu hóa gà. Kết quả cho thấy trong 21 chủng vi khuẩn khảo sát, B. subtilis VL28 thể hiện tốt nhất các đặc tính probiotic, do vậy chủng này được chọn để sử dụng trong thử nghiệm thức ăn bổ sung probiotic cho gà.

subtilis VL28 mật độ 107 CFU/g với liều lượng 5 g/kg thức ăn được bổ sung vào thức ăn cho gà ở độ tuổi 1-56 ngày cho thấy hiệu quả tăng trọng của gà đạt 11,7%, đồng thời lượng thức ăn sử dụng giảm 16,8% so với đối chứng nuôi bằng thức ăn không bổ sung vi khuẩn. Bên cạnh đó, gà 18 ngày tuổi lây nhiễm với S. coli (liều 5,0x106 CFU/mL/gà), được nuôi với thức ăn có bổ sung B. subtilis VL28 với liều như trên có khả năng tăng trọng và tỉ lệ sống tương đương với điều trị bằng kháng sinh enrofloxacin và iii oxytetracyclin.

Các kết quả này cho thấy chủng B. subtilis VL28 phân lập và tuyển chọn được trong đề tài này có tiềm năng probiotic rất lớn, chủng này có thể sử dụng để thay cho kháng sinh trong việc phòng và trị bệnh đường tiêu hóa ở gia cầm. Trình tự gen 16S rRNA của B. subtilis VL28 đã được đăng ký trên ngân hàng gen của NCBI với mã số truy cập là KY346980.

subtilis, gà, phân lập, định danh, probiotic iv ABSTRACT The dissertation “Isolation of Bacillus subtilis and its application on the prevention of intestinal diseases in chicken” was carried out to isolate the B. subtilis strains with probiotic potential from soil and fecal samples at intensive chicken farms. This study aimed to find out alternatives for antibiotics in the prevention and treatment of intestinal diseases as well as to increase productivity and effectiveness in poultry industry and also to reduce the risks of spreading antibiotic resistant bacteria in nature. From 70 soil samples and 70 fecal samples of chicken farms from 7 provinces in the Mekong Delta, 296 similarly B.

subtilis bacteria were isolated. These isolates were analyzed further for B. subtilis characteristics by physio- biological tests with the following criteria such as: negative in lecithinase, positive in catalase, amylase, cellulase, VP (Voges-Proskauer), and temperature tolerance (being able to grow at 50oC); and identified by the API CH50B kit (Biomerieux-France) in combination with the bio-molecular technique namely partial sequencing of 16S rRNA (using BLAST alignment with the known sequences on the NCBI genbank). The results showed that there were 21 isolates which satisfied the required physio-biochemical criteria, and the strain identification revealed that the similarity of gene 16S rRNA was high (≥ 99%) with B.

In order to select the B. subtilis strain with probiotic capabilities, 21 selected B. subtilis isolates were investigated further on the susceptibility to antibiotics (erythromycin, gentamycin, neomycin, oxytetracyclin, doxycyclin, colistin, sulfadimidin - trimethoprim, norfloxacin, enrofloxacin), temperature tolerance (being able to grow at 50-60oC), extracellular enzyme production (amylase, protease, lipase), bacterial pathogen inhibition properties (E. enterica, Staphylococcus spp.), tolerance to acidity of the gastric juice (pH 2,0) and 0.3% bile salts, adherence ability (autoaggregation, coaggregation, adherence to epithelial cells) and survival rate in gastro- intestinal environment.

The results showed that among 21 isolates observed, the strain B. subtilis VL28 exposed the best probiotic capabilities. Consequently, this strain was chosen to use as a supplement for chicken feed. subtilis VL28 (the density of 107 CFU/g and the dosage at 5 g/kg of feed) was supplemented in feed for the 1-56 day old chicken.

The results showed that chicken growth increased by 11,7% and feed usage decreased by 16,8%, compared with the control groups without supplementing B. Furthermore, the 18 day old chicken, infected by S. enterica (with the dosage of 7,5x104CFU/mL/chicken) and by E. coli (with the dosage of 5,0x106 CFU/mL/chicken), then fed with v B.

subtilis VL28 (supplemented in feed with the above described dosage), had growth ability and mortality rate equivalent to control groups treated with enrofloxacin and oxytetracyclin. These results showed that the selected B. subtilis VL28 strain in our study has great probiotic potential and could be used to replace antibiotics for prevention and treatment of intestinal diseases in poultry. The 16S rRNA partial sequence of the new B.

subtilis VL28 was registered in the Genbank of NCBI with the access code KY346980. subtilis, chicken, isolation, identification, probiotic vi MỤC LỤC Lời cam kết kết quả. v Danh sách bảng. x Danh sách hình.

xii Danh mục từ viết tắt. xv CHƢƠNG 1. Tính cấp thiết của đề tài. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.

Những đóng góp mới của luận án. Ý nghĩa thực tiễn của luận án. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Tổng quan về probiotic.

Lịch sử probiotic. Các định nghĩa về probiotic. Xu hướng sử dụng probiotic. Vai trò và cơ chế tác động của probiotic.

Cơ chế tác động của probiotic ở gia cầm. Các chủng vi khuẩn thường dùng làm probiotic. Các chỉ tiêu để chọn một vi sinh vật làm probiotic. Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic.

Tổng quan về Bacillus subtilis. Đặc điểm chung của giống Bacillus. Đặc điểm loài Bacillus subtilis. Dinh dưỡng và tăng trưởng.

subtilis sinh ra. Tính đối kháng của B. Một số phương pháp nghiên cứu tính đối kháng của B. subtilis và vi sinh vật gây bệnh.

Hệ tiêu hóa và vi sinh vật đƣờng ruột. Hệ tiêu hóa gia cầm và sự khác biệt so với động vật hữu nhũ. Vi sinh vật đường ruột và tác động của chúng đến vật nuôi. Một số vi khuẩn gây bệnh đƣờng tiêu hóa thƣờng gặp trên gà.

Một số nghiên cứu về probiotic trên thế giới và tại Việt Nam. Trên thế giới. Tại Việt Nam. Một số nghiên cứu ứng dụng B.

subtilis ứng dụng cho người và vật nuôi. subtilis sử dụng cho gia cầm. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.

Phƣơng tiện nghiên cứu. Hóa chất và môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn. Nội dung nghiên cứu và phƣơng pháp nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.

Phân lập các chủng Bacillus subtilis. Tuyển chọn các chủng B. subtilis có đặc tính probiotic. Đánh giá tính an toàn và tác dụng của chế phẩm trên gà.

Xử lý số liệu. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus subtilis. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus spp.

Kết quả định danh Bacillus spp. Kết quả khảo sát các đặc tính probiotic. Kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt độ cao. Khả năng nhạy/ kháng kháng sinh.

Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào. Khả năng đối kháng với các chủng vi sinh vật gây bệnh. Khả năng chịu acid dạ dày và muối mật. Khả năng bám dính.

Khả năng sống của vi khuẩn trong đường ruột gà. Kết quả thí nghiệm, đánh giá tác dụng của chế phẩm trên gà. Kết quả thí nghiệm 1…. Kết quả thí nghiệm 2.

Kết quả thí nghiệm 3. Đăng ký trình tự B. subtilis trên Genbank……………………. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.

134 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ. 135 TÀI LIỆU THAM KHẢO .