Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Khóa luận tốt nghiệp chuyên ngành Hóa hữu cơ của tác giả Nguyễn Thị Mỹ Anh (Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh, năm 2013) tập trung vào hướng nghiên cứu tổng hợp hữu cơ định hướng hóa dược. Trong lĩnh vực hóa học các hợp chất thiên nhiên và tổng hợp dược chất, khung dị vòng coumarin (benzo-$\alpha$-pyrone) cùng các dẫn xuất aminocoumarin giữ vị trí quan trọng do sở hữu phổ hoạt tính sinh học đa dạng như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chống đông máu, chống oxy hóa, giảm đau, hỗ trợ điều trị tim mạch, thoái hóa thần kinh và ức chế tế bào ung thư. Một số dẫn xuất của 3-aminocoumarin trong tự nhiên đã được phát triển thành các hoạt chất kháng sinh như novobiocin, chlorobiocin, coumermycin A1, simocyclinone D8 nhờ khả năng can thiệp trực tiếp vào quá trình sao chép và phân chia ADN của vi khuẩn.
Bên cạnh khung coumarin, nhóm chức amide ($\mathrm{-CO-NH-}$) là liên kết then chốt tạo nên cấu trúc peptide và protein trong cơ thể sống, đồng thời xuất hiện phổ biến trong nhiều dược phẩm thông dụng (melatonin, paracetamol, kháng sinh nhóm penicillin) và các chất ức chế protease điều trị HIV/AIDS (amprenavir, indinavir, nelfinavir, saquinavir, lopinavir). Việc kết hợp hệ dị vòng 3-aminocoumarin với các nhóm chức amide nhằm tạo ra các phân tử lai có hoạt tính sinh học mới là lý do chính để tác giả lựa chọn đề tài "Tổng hợp một số amide là dẫn xuất của 3-aminocoumarin".
Nhiệm vụ và mục tiêu nghiên cứu của đề tài bao gồm:
- Đi từ các chất đầu ban đầu là glycine và anhydride acetic để tổng hợp chất trung gian acetylglycine (1).
- Tổng hợp tiền chất 3-acetylaminocoumarin (2) thông qua phản ứng ngưng tụ giữa acetylglycine và salicylaldehyde.
- Thủy phân 3-acetylaminocoumarin trong môi trường acid để thu được hợp chất chìa khóa 3-aminocoumarin (3).
- Chuyển hóa 3-aminocoumarin thành dãy các dẫn xuất amide (4a-c) thông qua phản ứng với các chloride acid tương ứng.
- Đo đạc hằng số vật lý (nhiệt độ nóng chảy, hệ số sắc ký $R_f$) và xác định cấu trúc hóa học của các sản phẩm bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại: phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ($^1\text{H-NMR}$) và phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS).
- Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn in vitro của các dẫn xuất amide tổng hợp được đối với hai chủng vi khuẩn Escherichia coli và Bacillus subtilis.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Dị vòng 3-aminocoumarin, các chất trung gian tổng hợp và 3 dẫn xuất amide béo mới (ký hiệu 4a, 4b, 4c).
- Phạm vi thực nghiệm: Thực hiện tổng hợp hóa học, đo nhiệt độ nóng chảy, sắc ký bản mỏng và phổ IR tại Khoa Hóa học (Trường ĐH Sư phạm TP.HCM); đo phổ $^1\text{H-NMR}$ tại Viện Hóa học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội); đo phổ HR-MS tại Trường ĐH Khoa học Tự nhiên (ĐHQG TP.HCM); khảo sát hoạt tính vi sinh tại Phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa Sinh học (Trường ĐH Sư phạm TP.HCM).
Cơ sở lý thuyết và phương pháp thực nghiệm
Cơ sở lý thuyết và mô hình phản ứng
Khóa luận dựa trên lý thuyết cấu tạo và độ bền của dị vòng coumarin (2H-chromen-2-one, $\mathrm{C_9H_6O_2}$, phân tử khối $M = 146\text{ đvC}$). Dữ liệu tinh thể học tia X cho thấy phân tử coumarin có cấu trúc gần như phẳng, hấp thụ bức xạ cực tím ở bước sóng khoảng 320 nm. Về mặt tổng hợp hữu cơ, khóa luận tổng quan 3 phương pháp kinh điển hình thành vòng coumarin:
- Phương pháp Perkin: Phản ứng giữa salicylaldehyde và anhydride acetic ở nhiệt độ cao với xúc tác natri acetate.
- Phương pháp Pechmann: Phản ứng ngưng tụ giữa phenol và $\beta$-keto ester (như ethyl acetoacetate, methyl acetoacetate) dưới sự hiện diện của xúc tác acid dị thể ($\mathrm{HClO_4 \cdot SiO_2}$, Amberlyst IR 120, Nafion 417).
- Phương pháp Knoevenagel: Phản ứng giữa dẫn xuất salicylaldehyde và hợp chất methylene hoạt động khi có mặt xúc tác base amine hoặc zeolite.
Đối với phân nhóm aminocoumarin, phản ứng ngưng tụ theo Linch (cải tiến từ phản ứng Perkin bằng cách bổ sung xúc tác base piperidine) được chọn làm cơ sở để đóng vòng tạo dẫn xuất 3-acetylaminocoumarin từ acetylglycine và salicylaldehyde. Quá trình chuyển hóa tiếp theo dựa trên phản ứng thủy phân liên kết amide trong môi trường acid $\mathrm{HCl}$ vô cơ để giải phóng nhóm amine tự do tại vị trí C-3, tiếp nối bằng phản ứng thế ái nhân acyl ($S_N2(\text{CO})$) giữa 3-aminocoumarin và các chloride acid mạch béo có mặt $\mathrm{CH_3COONa}$ để tạo dãy amide mục tiêu.
Phương pháp nghiên cứu và thiết bị phân tích
- Phương pháp tổng hợp hữu cơ thực nghiệm: Quy trình phản ứng hồi lưu có kiểm soát nhiệt độ, kết tinh phân đoạn, tinh chế sản phẩm rắn bằng các dung môi hữu cơ (ethanol, diethyl ether, dioxane, nước cất).
- Sắc ký bản mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng Silica gel 60 $\mathrm{F_{254}}$ (Merck), hệ dung môi giải ly chloroform 100%, mẫu hòa tan trong dioxane để xác định độ tinh khiết và hệ số $R_f$.
- Đo nhiệt độ nóng chảy: Xác định trên máy đo điểm chảy SMP3 tại Phòng thí nghiệm Hóa đại cương, Khoa Hóa, Trường ĐH Sư phạm TP.HCM.
- Phổ hồng ngoại (FT-IR): Ghi trên máy Shimadzu 8400S bằng phương pháp ép viên nén $\mathrm{KBr}$ trong dải số sóng $4000 - 400\text{ cm}^{-1}$.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$): Đo trên máy Bruker Avance 500 MHz tại Viện Hóa học (Hà Nội), sử dụng dung môi $\mathrm{DMSO-}d_6$ và chất chuẩn nội tetramethylsilane (TMS).
- Phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS): Đo trên hệ thống Bruker micrOTOF-Q 10187 tại Trường ĐH Khoa học Tự nhiên (ĐHQG TP.HCM).
- Phương pháp thử nghiệm vi sinh: Thử hoạt tính kháng khuẩn bằng kỹ thuật khuếch tán giếng thạch trên môi trường MPA ($\mathrm{5\text{ g peptone}}$, $\mathrm{5\text{ g cao thịt}}$, $\mathrm{5\text{ g NaCl}}$, $\mathrm{20\text{ g agar}}$, $\mathrm{1000\text{ ml nước cất}}$). Khảo sát ở hai nồng độ 1% và 2% đối với vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli) và vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilis), xác định qua đường kính vòng vô khuẩn $D - d\text{ (mm)}$.
Nội dung chính theo từng chương
Tổng quan về coumarin, aminocoumarin và amide
Chương tổng quan hệ thống hóa các tư liệu lý thuyết và công trình đã công bố trong và ngoài nước liên quan đến đề tài:
- Khái quát cấu trúc, sự phân bố tự nhiên (chủ yếu trong các họ Umbelliferae, Rutaceae, Leguminosae) và các đồng phân tiêu biểu của coumarin như chromone (4H-chromen-4-one) và isocoumarin (1H-isochromen-1-one).
- Tổng hợp các công trình nghiên cứu về 3-aminocoumarin, phức chất kim loại của 3-aminocoumarin ($\mathrm{Cu^{2+}, Cr^{2+}, Cr^{3+}, Fe^{3+}, Mn^{2+}, Ni^{2+}}$) và hoạt tính kháng khuẩn của các phức chất này trên các chủng E. coli, Pseudomonas, Proteus vulgaris. Trích dẫn các số liệu hoạt tính kháng khuẩn (đường kính vòng vô khuẩn từ 6 đến 22 mm) và kháng nấm (Aspergillus cumer, Penicillium italicum, Fusarium oxysporum) của các dẫn xuất 3-aminocoumarin từ tài liệu tham khảo.
- Đánh giá tổng quan về các đồng phân aminocoumarin khác: 4-aminocoumarin (khó phản ứng thế do tính nucleophile yếu); 6-aminocoumarin (có hoạt tính kháng khuẩn từ 9 đến 20 mm); 7-aminocoumarin (đặc biệt là 7-amino-4-methylcoumarin dùng tạo phức với peptide và hạt nano làm cơ chất phát huỳnh quang theo dõi quá trình thủy phân của enzyme protease).
- Khái quát về cấu trúc, phân loại nhóm chức amide và các ứng dụng sinh học tiêu biểu của amide tự nhiên và tổng hợp trong dược phẩm.
Quy trình thực nghiệm tổng hợp các hợp chất
Chương thực nghiệm mô tả chi tiết quy trình hóa học 4 giai đoạn:
- Tổng hợp acetylglycine (1): Hòa tan $\mathrm{5,0\text{ g glycine}}$ ($\mathrm{0,06\text{ mol}}$) trong $\mathrm{75\text{ ml nước cất}}$, thêm $\mathrm{14,5\text{ g anhydride acetic}}$ ($\mathrm{0,14\text{ mol}}$), khuấy 20 phút ở nhiệt độ phòng, giữ trong ngăn mát tủ lạnh 24 giờ. Thu được sản phẩm bột trắng với khối lượng $\mathrm{5,53\text{ g}}$, hiệu suất đạt 78,8%.
- Tổng hợp 3-acetylaminocoumarin (2): Đun hồi lưu hỗn hợp $\mathrm{5,0\text{ g acetylglycine}}$ ($\mathrm{0,043\text{ mol}}$), $\mathrm{12,2\text{ g salicylaldehyde}}$ ($\mathrm{0,1\text{ mol}}$), $\mathrm{5,0\text{ ml anhydride acetic}}$ ($\mathrm{0,049\text{ mol}}$) và vài giọt piperidine ở nhiệt độ $\mathrm{140^\circ C}$ trong 6 giờ. Thêm $\mathrm{10\text{ ml nước cất}}$, đun tiếp 30 phút, rửa bằng diethyl ether và kết tinh lại trong ethanol. Thu được $\mathrm{2,67\text{ g}}$ tinh thể hình kim màu cam đỏ, nhiệt độ nóng chảy $\mathrm{201 - 203^\circ C}$, hiệu suất 30,6%, $R_f = 0,31$.
- Tổng hợp 3-aminocoumarin (3): Hòa tan $\mathrm{5,0\text{ g 3-acetylaminocoumarin}}$ ($\mathrm{0,024\text{ mol}}$) trong $\mathrm{25\text{ ml ethanol nóng}}$, thêm $\mathrm{5,0\text{ ml acid hydrochloric đặc}}$, đun hồi lưu 2 giờ. Trung hòa hỗn hợp bằng $\mathrm{NaHCO_3}$, để lạnh qua đêm, kết tinh lại bằng ethanol có dùng than hoạt tính. Thu được $\mathrm{2,15\text{ g}}$ tinh thể hình vảy màu trắng ngà óng ánh, nhiệt độ nóng chảy $\mathrm{126 - 127^\circ C}$, hiệu suất 55,6%, $R_f = 0,41$.
- Tổng hợp các amide của 3-aminocoumarin (4a-c): Nhỏ từ từ dung dịch $\mathrm{0,01\text{ mol}}$ chloride acid trong $\mathrm{10\text{ ml dioxane}}$ vào dung dịch gồm $\mathrm{1,61\text{ g 3-aminocoumarin}}$ ($\mathrm{0,01\text{ mol}}$) và $\mathrm{0,82\text{ g CH_3COONa khan}}$ ($\mathrm{0,01\text{ mol}}$) trong $\mathrm{20\text{ ml dioxane}}$ ở điều kiện lạnh. Lắc 1,0 giờ ở nhiệt độ phòng, đun nóng ở $\mathrm{70 - 80^\circ C}$ trong 1,0 giờ, đổ vào $\mathrm{100\text{ ml nước đá vụn}}$, lọc kết tủa và kết tinh lại bằng ethanol.
| Hợp chất | Nhóm thế R | Dạng tinh thể | Nhiệt độ nóng chảy ($^\circ\text{C}$) | Hiệu suất (%) | Hệ số $R_f$ |
|---|---|---|---|---|---|
| 4a | $\mathrm{-CH_2-Cl}$ | Hình kim nhỏ, màu vàng nhạt | 184 | 74,5 | 0,64 |
| 4b | $\mathrm{-CH_2-C(CH_3)_3}$ | Hình kim, màu trắng | 161 | 61,6 | 0,67 |
| 4c | $\mathrm{-CH(CH_3)_2}$ | Hình kim nhỏ, màu trắng | 157 | 57,9 | 0,68 |
Kết quả và thảo luận
Tác giả biện luận chi tiết cơ chế phản ứng và cấu trúc hóa học của các sản phẩm dựa trên số liệu phổ nghiệm:
-
Phân tích cơ chế và cấu trúc 3-acetylaminocoumarin (2):
- Cơ chế: Cặp electron tự do trên nguyên tử oxy của salicylaldehyde tấn công ái nhân vào nhóm carbonyl của acetylglycine. Dưới xúc tác piperidine, nhóm methylene hoạt hóa tấn công vào carbonyl của aldehyde để khép vòng và tách nước. Anhydride acetic đóng vai trò dung môi và tác nhân hút nước.
- Dữ liệu phổ IR: Xuất hiện dải hấp thụ $\mathrm{N-H}$ amide tại $\mathrm{3331\text{ cm}^{-1}}$, nhóm $\mathrm{C=O}$ amide tại $\mathrm{1682\text{ cm}^{-1}}$, nhóm $\mathrm{C=O}$ vòng lactone tại $\mathrm{1708\text{ cm}^{-1}}$, $\mathrm{C_{sp3}-H}$ tại $\mathrm{2950\text{ cm}^{-1}}$, $\mathrm{C_{sp2}-H}$ tại $\mathrm{3050\text{ cm}^{-1}}$, $\mathrm{C=C}$ thơm tại $\mathrm{1605\text{ cm}^{-1}}$ và liên kết $\mathrm{C-O}$ tại $\mathrm{1250\text{ cm}^{-1}}$.
- Dữ liệu phổ $^1\text{H-NMR}$: Ghi nhận đủ 9 proton: $\mathrm{H-9}$ ($\mathrm{-NH-}$) xuất hiện dạng singlet ở vùng trường rất yếu $\mathrm{9,75\text{ ppm}}$; $\mathrm{H-10}$ ($\mathrm{-CH_3}$) dạng singlet tại $\mathrm{2,17\text{ ppm}}$ ($3\text{H}$); $\mathrm{H-4}$ dạng singlet tại $\mathrm{8,61\text{ ppm}}$ do bị nhóm amide rút electron mạnh; $\mathrm{H-5}$ tại $\mathrm{7,70\text{ ppm}}$ ($dd, ^3J = 7,5\text{ Hz}, ^4J = 1,0\text{ Hz}$); $\mathrm{H-7}$ tại $\mathrm{7,50\text{ ppm}}$ ($ddd \approx td, ^3J_1 = 8,0\text{ Hz}, ^3J_2 = 7,5\text{ Hz}, ^4J = 1,0\text{ Hz}$); $\mathrm{H-8}$ tại $\mathrm{7,39\text{ ppm}}$ ($d, ^3J = 8,0\text{ Hz}$); $\mathrm{H-6}$ tại $\mathrm{7,33\text{ ppm}}$ ($t, ^3J = 7,5\text{ Hz}$).
-
Phân tích cơ chế và cấu trúc 3-aminocoumarin (3):
- Cơ chế: Phản ứng thủy phân liên kết amide xúc tác acid $\mathrm{HCl}$. Nhóm carbonyl bị proton hóa tạo điều kiện cho nước tấn công ái nhân. Sau khi tách phân tử acid acetic, nhóm amine sinh ra tiếp tục nhận proton thành cation $\mathrm{-NH_3^+}$, làm mất tính nucleophile và ngăn chặn các phản ứng phụ phá vòng.
- Dữ liệu phổ IR: Mất dải hấp thụ $\mathrm{C=O}$ amide, xuất hiện 2 dải hấp thụ đặc trưng của nhóm $\mathrm{-NH_2}$ tự do tại $\mathrm{3428\text{ cm}^{-1}}$ và $\mathrm{3329\text{ cm}^{-1}}$, dải $\mathrm{C=O}$ lactone tại $\mathrm{1709\text{ cm}^{-1}}$, $\mathrm{C=C}$ thơm tại $\mathrm{1639}$ và $\mathrm{1590\text{ cm}^{-1}}$, $\mathrm{C-O}$ tại $\mathrm{1227\text{ cm}^{-1}}$.
- Dữ liệu phổ $^1\text{H-NMR}$: Ghi nhận đủ 7 proton: 2 proton nhóm $\mathrm{-NH_2}$ cho tín hiệu singlet tại $\mathrm{5,70\text{ ppm}}$; proton $\mathrm{H-4}$ dịch chuyển mạnh về vùng trường cao $\mathrm{6,71\text{ ppm}}$ ($s, 1\text{H}$) do hiệu ứng cộng hưởng đẩy electron của nhóm amine vào vòng; $\mathrm{H-5}$ tại $\mathrm{7,41\text{ ppm}}$ ($dd, ^3J = 7,0\text{ Hz}, ^4J = 2,0\text{ Hz}$); $\mathrm{H-8}$ tại $\mathrm{7,27\text{ ppm}}$ ($dd, ^3J = 8,5\text{ Hz}, ^4J = 2,0\text{ Hz}$); $\mathrm{H-6}$ và $\mathrm{H-7}$ chồng chập thành multiplet tại $\mathrm{7,21\text{ ppm}}$ ($2\text{H}$).
-
Phân tích cơ chế và cấu trúc dãy dẫn xuất amide (4a-c):
- Cơ chế: Phản ứng thế ái nhân acyl $S_N2(\text{CO})$ trong môi trường dioxane khan. $\mathrm{CH_3COONa}$ đóng vai trò base nhẹ trung hòa $\mathrm{HCl}$ sinh ra, thúc đẩy cân bằng chuyển dịch theo chiều thuận mà không gây phản ứng thủy phân cạnh tranh lên chloride acid như các base mạnh ($\mathrm{NaOH, KOH}$).
- Dữ liệu phổ IR: Cả 3 hợp chất đều chuyển từ 2 dải $\mathrm{-NH_2}$ thành 1 dải $\mathrm{N-H}$ duy nhất tại $\mathrm{3308 - 3337\text{ cm}^{-1}}$, xuất hiện đồng thời dải $\mathrm{C=O}$ lactone tại $\mathrm{1709 - 1717\text{ cm}^{-1}}$ và dải $\mathrm{C=O}$ amide tại $\mathrm{1678 - 1682\text{ cm}^{-1}}$.
- Dữ liệu phổ $^1\text{H-NMR}$: Số lượng proton đo được của 4a, 4b, 4c lần lượt là 8, 17 và 13 proton, hoàn toàn trùng khớp với công thức phân tử. Tín hiệu $\mathrm{H-9}$ ($\mathrm{-NH-}$) xuất hiện ở vùng $\mathrm{9,53 - 10,12\text{ ppm}}$ ($s, 1\text{H}$); proton $\mathrm{H-4}$ chuyển dịch trở lại vùng trường yếu $\mathrm{8,63 - 8,65\text{ ppm}}$ ($s, 1\text{H}$). Vùng trường cao ghi nhận rõ các nhóm thế aliphatic:
- Hợp chất 4a ($\mathrm{R = -CH_2Cl}$): Tín hiệu singlet của $\mathrm{H-10}$ tại $\mathrm{4,48\text{ ppm}}$ ($2\text{H}$).
- Hợp chất 4b ($\mathrm{R = -CH_2-C(CH_3)_3}$): Tín hiệu singlet của $\mathrm{H-10}$ tại $\mathrm{3,32\text{ ppm}}$ ($2\text{H}$) và singlet của 3 nhóm methyl $\mathrm{H-11}$ tại $\mathrm{1,01\text{ ppm}}$ ($9\text{H}$).
- Hợp chất 4c ($\mathrm{R = -CH(CH_3)_2}$): Tín hiệu multiplet (septet) của proton $\mathrm{H-10}$ tại $\mathrm{2,94\text{ ppm}}$ ($1\text{H}, ^3J = 7,0\text{ Hz}$) và doublet của 2 nhóm methyl $\mathrm{H-11}$ tại $\mathrm{1,09\text{ ppm}}$ ($6\text{H}, ^3J = 7,0\text{ Hz}$).
- Dữ liệu phổ HR-MS:
- Hợp chất 4a ($\mathrm{C_{11}H_8ClNO_3}$, $M_{\text{lý thuyết}} = 237,0193$): Xuất hiện pic ion phân tử $[\mathrm{M+H}]^+$ tại $m/z = 238,0266$ ($100%$), $[\mathrm{(M+H)+1}]^+$ tại $239,0298$ ($12,48%$), $[\mathrm{(M+H)+2}]^+$ tại $240,0239$ ($33,29%$), $[\mathrm{(M+H)+3}]^+$ tại $241,0270$ ($4,09%$). Tỷ lệ cường độ giữa pic $[\mathrm{M+H}]^+$ và $[\mathrm{(M+H)+2}]^+$ xấp xỉ 3:1, phù hợp hoàn hảo với tỷ lệ phân bố tự nhiên của hai đồng vị $^{35}\text{Cl}$ và $^{37}\text{Cl}$.
- Hợp chất 4b ($\mathrm{C_{15}H_{17}NO_3}$, $M_{\text{lý thuyết}} = 259,1208$): Xuất hiện pic ion phân tử $[\mathrm{M+H}]^+$ tại $m/z = 260,1314$ ($100%$), $[\mathrm{(M+H)+1}]^+$ tại $261,1214$ ($16,91%$), $[\mathrm{(M+H)+2}]^+$ tại $262,1339$ ($1,96%$).
| Hợp chất | $\mathrm{\nu_{N-H}}$ ($\text{cm}^{-1}$) | $\mathrm{\nu_{C-H}}$ ($\text{cm}^{-1}$) | $\mathrm{\nu_{C=O\ (lactone)}}$ ($\text{cm}^{-1}$) | $\mathrm{\nu_{C=O\ (amide)}}$ ($\text{cm}^{-1}$) | $\mathrm{\nu_{C=C\ (thơm)}}$ ($\text{cm}^{-1}$) |
|---|---|---|---|---|---|
| 2 | 3331 | 2950 | 1708 | 1682 | 1605 |
| 3 | 3428, 3329 | 3100 | 1709 | — | 1639, 1590 |
| 4a | 3308 | 3080, 2960 | 1709 | 1682 | 1609 |
| 4b | 3337 | 2969, 2866 | 1709 | 1678 | 1624, 1603 |
| 4c | 3337 | 2950, 3050 | 1717 | 1682 | 1600 |
| Vị trí proton | Hợp chất 2 | Hợp chất 3 | Hợp chất 4a | Hợp chất 4b | Hợp chất 4c |
|---|---|---|---|---|---|
| H-4 | 8,61 ($s, 1\text{H}$) | 6,71 ($s, 1\text{H}$) | 8,65 ($s, 1\text{H}$) | 8,65 ($s, 1\text{H}$) | 8,63 ($s, 1\text{H}$) |
| H-5 | 7,70 ($dd, ^3J=7,5, ^4J=1,0$) | 7,41 ($dd, ^3J=7,0, ^4J=2,0$) | 7,75 ($dd, ^3J=8,0, ^4J=1,5$) | 7,71 ($dd, ^3J=8,0, ^4J=1,5$) | 7,69 ($dd, ^3J=8,0, ^4J=1,5$) |
| H-6 | 7,33 ($t, ^3J=7,5$) | 7,21 ($m, 2\text{H}$, cùng H-7) | 7,36 ($dd, ^3J_1=8,0, ^3J_2=7,0$) | 7,34 ($dd, ^3J_1=8,0, ^3J_2=7,0$) | 7,34 ($dd, ^3J_1=^3J_2=8,0$) |
| H-7 | 7,50 ($td, ^3J_1=8,0, ^3J_2=7,5, ^4J=1,0$) | 7,21 ($m, 2\text{H}$, cùng H-6) | 7,53 ($ddd, ^3J_1=7,0, ^3J_2=8,0, ^4J=1,5$) | 7,50 ($ddd, ^3J_1=7,0, ^3J_2=8,0, ^4J=1,5$) | 7,50 ($ddd, ^3J_1=^3J_2=8,0, ^4J=1,5$) |
| H-8 | 7,39 ($d, ^3J=8,0$) | 7,27 ($dd, ^3J=8,5, ^4J=2,0$) | 7,41 ($d, ^3J=8,0$) | 7,39 ($d, ^3J=8,0$) | 7,39 ($d, ^3J=8,0$) |
| H-9 (-NH-) | 9,75 ($s, 1\text{H}$) | 5,70 ($s, 2\text{H}$, $-\text{NH}_2$) | 10,12 ($s, 1\text{H}$) | 9,53 ($s, 1\text{H}$) | 9,61 ($s, 1\text{H}$) |
| H-10 | 2,17 ($s, 3\text{H}$) | — | 4,48 ($s, 2\text{H}$) | 3,32 ($s, 2\text{H}$) | 2,94 ($m, 1\text{H}, ^3J=7,0$) |
| H-11 | — | — | — | 1,01 ($s, 9\text{H}$) | 1,09 ($d, 6\text{H}, ^3J=7,0$) |
Kết quả và đóng góp
Khóa luận đã hoàn thành các mục tiêu nghiên cứu đề ra với các kết quả cụ thể:
- Thiết lập và thực hiện thành công quy trình tổng hợp 4 bước đi từ glycine và salicylaldehyde để điều chế 3 dẫn xuất amide mới của 3-aminocoumarin với hiệu suất tương đối cao: hợp chất 4a đạt 74,5%, hợp chất 4b đạt 61,6%, và hợp chất 4c đạt 57,9%.
- Cung cấp bộ dữ liệu thực nghiệm hoàn chỉnh về tính chất vật lý (màu sắc tinh thể, nhiệt độ nóng chảy, hệ số $R_f$) và phổ học (IR, $^1\text{H-NMR}$, HR-MS) của các chất trung gian (1, 2, 3) và 3 sản phẩm amide (4a, 4b, 4c).
- Đóng góp về mặt học thuật trong việc chứng minh và biện luận chi tiết sự dịch chuyển hóa học của các proton trên khung coumarin dưới ảnh hưởng của hiệu ứng cộng hưởng đẩy electron từ nhóm amine tự do ($\mathrm{-NH_2}$) và hiệu ứng hút electron liên hợp mạnh từ nhóm chức amide ($\mathrm{-NH-CO-R}$).
- Triển khai phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn in vitro bằng kỹ thuật khuếch tán giếng thạch đối với các sản phẩm tổng hợp trên hai chủng vi khuẩn tiêu chuẩn E. coli và B. subtilis.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Khóa luận ghi nhận một số hạn chế gắn liền với phạm vi thực nghiệm:
- Hiệu suất của phản ứng ngưng tụ Linch tạo tiền chất 3-acetylaminocoumarin (2) còn ở mức thấp (30,6%), do phản ứng ở nhiệt độ cao ($\mathrm{140^\circ C}$) sinh ra nhiều sản phẩm phụ và đòi hỏi quy trình tinh chế phức tạp.
- Dãy dẫn xuất amide điều chế được mới dừng lại ở 3 hợp chất mang gốc hydrocarbon no mạch béo ($\mathrm{-CH_2Cl}$, $\mathrm{-CH_2C(CH_3)_3}$, $\mathrm{-CH(CH_3)_2}$), chưa mở rộng sang các dẫn xuất amide thơm hoặc dị vòng.
- Thử nghiệm hoạt tính sinh học mới dừng ở bước khảo sát sơ bộ khả năng kháng hai chủng vi khuẩn thông thường bằng phương pháp đo đường kính vòng vô khuẩn ở hai nồng độ cố định (1% và 2%), chưa xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và chưa mở rộng sang thử nghiệm kháng nấm, kháng tế bào ung thư hoặc ức chế enzyme.
Hướng nghiên cứu tiếp theo:
- Nghiên cứu cải tiến điều kiện phản ứng ngưng tụ Linch (thay đổi dung môi, tỷ lệ chất phản ứng, sử dụng vi sóng hoặc các hệ xúc tác mới) nhằm cải thiện hiệu suất tạo vòng 3-acetylaminocoumarin.
- Mở rộng tổng hợp dãy amide của 3-aminocoumarin với các chloride acid thơm mang các nhóm thế có hoạt tính sinh học cao (như nhóm nitro, halogen, methoxy, hydroxy).
- Đánh giá toàn diện hoạt tính sinh học của các hợp chất tổng hợp được trên nhiều chủng vi sinh vật gây bệnh, nấm bệnh và khảo sát độc tính tế bào in vitro.
Giá trị tham khảo
Khóa luận có giá trị tham khảo thiết thực cho:
- Sinh viên và học viên cao học chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa dược và Dược học: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình điều chế các hợp chất dị vòng coumarin chứa nhóm chức amine và phản ứng acyl hóa nhóm amine thơm/dị vòng.
- Người nghiên cứu phổ nghiệm hữu cơ: Tài liệu cung cấp phương pháp luận chi tiết và chuẩn mực trong việc quy kết các tín hiệu phổ $^1\text{H-NMR}$ (phân tích hằng số tách $^3J, ^4J$, cấu trúc vạch singlet, doublet, triplet, doublet-doublet, doublet-doublet-doublet), phổ IR các nhóm chức carbonyl/amine/amide và phân tích mảnh phổ khối lượng phân giải cao HR-MS chứa đồng vị chlorine.
Câu hỏi thường gặp
1. Hợp chất chìa khóa 3-aminocoumarin được tổng hợp qua những giai đoạn trung gian nào?
Hợp chất 3-aminocoumarin được tổng hợp qua chuỗi phản ứng 3 giai đoạn: (1) Phản ứng acetyl hóa glycine bằng anhydride acetic trong nước tạo acetylglycine với hiệu suất 78,8%; (2) Phản ứng ngưng tụ giữa acetylglycine và salicylaldehyde có mặt anhydride acetic và xúc tác piperidine ở $\mathrm{140^\circ C}$ trong 6 giờ tạo 3-acetylaminocoumarin (hiệu suất 30,6%); (3) Phản ứng thủy phân liên kết amide của 3-acetylaminocoumarin bằng $\mathrm{HCl}$ đặc trong ethanol đun hồi lưu 2 giờ, sau đó trung hòa bằng $\mathrm{NaHCO_3}$ để thu 3-aminocoumarin tự do (hiệu suất 55,6%).
2. Tại sao trên phổ $^1\text{H-NMR}$, tín hiệu proton H-4 của 3-aminocoumarin lại dịch chuyển về vùng trường mạnh (6,71 ppm) trong khi ở 3-acetylaminocoumarin lại nằm ở vùng trường rất yếu (8,61 ppm)?
Ở 3-acetylaminocoumarin, nhóm chức amide ($\mathrm{-NH-CO-CH_3}$) liên hợp và rút electron rất mạnh khỏi vòng, làm giảm mật độ electron trên carbon C-4, dẫn đến việc proton $\mathrm{H-4}$ bị phản chắn mạnh và xuất hiện ở vùng trường yếu ($\mathrm{8,61\text{ ppm}}$). Ngược lại, ở 3-aminocoumarin, nhóm amine tự do ($\mathrm{-NH_2}$) có cặp electron tự do chưa liên kết trên nguyên tử nitơ cộng hưởng đẩy electron vào hệ liên hợp của vòng, làm tăng mật độ electron tại vị trí C-4, tạo hiệu ứng chắn mạnh khiến tín hiệu của $\mathrm{H-4}$ chuyển dịch rõ rệt về vùng trường cao hơn ($\mathrm{6,71\text{ ppm}}$).
3. Vai trò của $\mathrm{CH_3COONa}$ trong phản ứng tổng hợp các dẫn xuất amide (4a-c) là gì và vì sao không dùng base vô cơ mạnh như $\mathrm{NaOH}$ hay $\mathrm{KOH}$?
$\mathrm{CH_3COONa}$ đóng vai trò là một base yếu để trung hòa lượng acid $\mathrm{HCl}$ sinh ra trong quá trình phản ứng thế ái nhân giữa 3-aminocoumarin và chloride acid, giúp chuyển dịch cân bằng phản ứng sang phía tạo thành sản phẩm amide. Không sử dụng các base mạnh như $\mathrm{NaOH}$ hay $\mathrm{KOH}$ vì ion hydroxide ($\mathrm{OH^-}$) là tác nhân ái nhân mạnh, sẽ cạnh tranh tấn công trực tiếp vào chloride acid gây phản ứng thủy phân tạo lại acid carboxylic, làm tiêu hao tác nhân và giảm mạnh hiệu suất phản ứng.
4. Dữ liệu phổ HR-MS của hợp chất 4a xác nhận sự hiện diện của nguyên tử chlorine bằng cách nào?
Phổ HR-MS của hợp chất 4a ($\mathrm{C_{11}H_8ClNO_3}$) ghi nhận pic ion phân tử $[\mathrm{M+H}]^+$ tại $m/z = 238,0266$ (cường độ $100%$) và pic đồng vị $[\mathrm{(M+H)+2}]^+$ tại $m/z = 240,0239$ (cường độ $33,29%$). Tỷ lệ cường độ tương đối giữa pic $[\mathrm{M+H}]^+$ và $[\mathrm{(M+H)+2}]^+$ đạt xấp xỉ 3:1, hoàn toàn phù hợp với tỷ lệ phân bố tự nhiên của hai đồng vị bền $^{35}\text{Cl}$ ($75,77%$) và $^{37}\text{Cl}$ ($24,23%$), qua đó chứng minh chắc chắn sự có mặt của 1 nguyên tử chlorine trong cấu trúc phân tử.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Mỹ Anh đã hoàn thành toàn diện quy trình điều chế hợp chất chìa khóa 3-aminocoumarin từ các hóa chất cơ bản và tổng hợp thành công 3 dẫn xuất amide béo mới (4a-c) với hiệu suất phản ứng đạt từ 57,9% đến 74,5%. Cấu trúc hóa học và độ tinh khiết của các chất tổng hợp đã được xác định sáng tỏ thông qua hệ thống dữ liệu thực nghiệm nhiệt độ nóng chảy, sắc ký bản mỏng cùng các phương pháp phổ nghiệm IR, $^1\text{H-NMR}$ (500 MHz) và HR-MS. Đề tài cũng đã bước đầu thiết lập phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn in vitro trên hai chủng vi khuẩn kiểm nghiệm (E. coli và B. subtilis), đóng góp nguồn tư liệu khoa học hữu ích cho lĩnh vực nghiên cứu hóa học dị vòng coumarin và định hướng phát triển các hợp chất có hoạt tính sinh học.