Luận văn thạc sĩ phân lập hợp chất từ lá cáp Đồng Văn - Đại học Thái Nguyên

Nghiên cứu phân lập và đánh giá các hợp chất hoạt tính từ lá Capparis dongvanensis. Tìm hiểu về thành phần hóa học, tính chất sinh học và ứng dụng tiềm năng

• Tác giả: Sangkhy Keosavanh
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Văn Khang
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
• Đề tài: Phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất từ lá loài Cáp Đồng văn (Capparis dongvanensis)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thái Nguyên

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu hợp chất từ lá Capparis dongvanensis

Capparis dongvanensis là loài thực vật thuộc chi Capparis, họ Capparaceae, được tìm thấy chủ yếu tại khu vực Đồng Văn, Hà Giang. Loài cây này có tên gọi dân gian là cáp đồng văn, thuộc nhóm thực vật quý hiếm của vùng cao nguyên đá. Các nghiên cứu trước đó trên các loài cùng chi Capparis đã cho thấy nhiều hoạt tính sinh học giá trị. Cụ thể, các hợp chất phân lập được từ chi Capparis có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ. Chúng cũng thể hiện hoạt tính ức chế tế bào ung thư trên nhiều dòng tế bào khác nhau. Ngoài ra, các chiết xuất từ chi này còn có tác dụng kháng viêm hiệu quả. Việc nghiên cứu thành phần hóa học của C. dongvanensis giúp mở rộng kiến thức về đa dạng hóa học của loài này. Đồng thời, phát hiện các hợp chất mới có tiềm năng ứng dụng trong y học và dược phẩm.

1.1. Đặc điểm thực vật học của loài cáp đồng văn

Capparis dongvanensis là cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, phân bố tại vùng núi đá vôi ở độ cao từ 800 đến 1500 mét. Lá cây có hình trứng hoặc hình bầu dục, mọc so le, phiến lá bóng. Hoa mọc thành chùm ở nách lá, có màu trắng hoặc hồng nhạt. Quả dạng nang chứa nhiều hạt đen. Loài cây này được tìm thấy chủ yếu ở khu vực Công viên địa chất toàn cầu Cao nguyên đá Đồng Văn. Cây có khả năng chịu hạn tốt, phát triển trên đất đá vôi nghèo dinh dưỡng.

1.2. Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học của chi Capparis

Các loài trong chi Capparis đã được nghiên cứu rộng rãi về hoạt tính sinh học. Hoạt tính chống oxy hóa được chứng minh qua khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH và ức chế quá trình peroxy hóa lipid. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư được ghi nhận trên các dòng tế bào HepG-2, MCF-7 và HT29. Chiết xuất từ hạt và lá C. spinosa cho thấy tác dụng kháng viêm đáng kể. Ngoài ra, một số nghiên cứu còn phát hiện hoạt tính kháng khuẩn và chống ký sinh trùng ở các loài chi Capparis.

II. Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hợp chất từ lá

Quy trình nghiên cứu bắt đầu bằng việc thu hái mẫu lá Capparis dongvanensis từ Đồng Văn, Hà Giang. Mẫu thực vật được xử lý sạch, phơi khô ở nhiệt độ phòng và nghiền thành bột mịn. Bột lá được chiết xuất bằng dung môi ethanol ở nhiệt độ thường với nhiều lần chiết. Dung dịch chiết được cô đặc dưới áp suất giảm để thu dịch chiết thô. Dịch chiết thô được phân chia bằng phương pháp lỏng-lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần. Các phân đoạn được tinh chế bằng sắc ký cột silica gel và sắc ký gel Sephadex LH-20. Các hợp chất tinh khiết được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ hiện đại. Quy trình này đảm bảo thu được các hợp chất có độ tinh khiết cao phục vụ nghiên cứu hoạt tính sinh học.

2.1. Kỹ thuật sắc ký phân lập hợp chất thiên nhiên

Sắc ký cột silica gel là phương pháp chính để phân lập các hợp chất từ dịch chiết thô. Dung môi eluent sử dụng là hệ gradient từ hexane đến etyl acetat và methanol. Sắc ký gel Sephadex LH-20 được dùng để loại bỏ tạp chất có trọng lượng phân tử khác. Sắc ký pha nghịch đảo C18 áp dụng cho các hợp chất phân cực cao. Phương pháp sắc ký mỏng (TLC) được sử dụng để theo dõi quá trình phân lập. Các vết trên TLC được phát hiện bằng thuốc thử vanillin-H2SO4 và đèn UV.

2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất phân lập

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng phổ NMR 1D và 2D. Phổ 1H-NMR cung cấp thông tin về loại và vị trí các nguyên tử hiđrô trong phân tử. Phổ 13C-NMR và DEPT xác định số loại nguyên tử cacbon và tính chất của chúng. Phổ 2D như COSY, HSQC, HMBC giúp xác định liên kết giữa các nguyên tử. Phổ khối HR-ESI-MS cho biết khối lượng phân tử chính xác và công thức phân tử. Phổ hồng ngoại IR hỗ trợ nhận diện các nhóm chức đặc trưng trong phân tử.

III. Đánh giá hoạt tính sinh học của hợp chất từ lá Capparis dongvanensis

Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được đánh giá bằng nhiều phương pháp khác nhau. Thử nghiệm chống oxy hóa sử dụng phương pháp DPPH và β-caroten bleaching. Phương pháp MTT được áp dụng để đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên các dòng tế bào chuẩn. Các dòng tế bào thử nghiệm bao gồm HepG-2, MCF-7 và HeLa. Nồng độ ức chế IC50 được tính toán để so sánh hoạt tính giữa các hợp chất. Thử nghiệm kháng viêm thực hiện trên mô hình tế bào RAW 264.7 kích thích bằng LPS. Kết quả nghiên cứu cho thấy một số hợp chất có hoạt tính sinh học đáng kể. Các hợp chất thuộc nhóm flavonoid và alkaloid thể hiện hoạt tính mạnh nhất. Dữ liệu thu được cung cấp cơ sở khoa học cho ứng dụng dược phẩm trong tương lai.

3.1. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa và kháng viêm

Hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá bằng phương pháp loại bỏ gốc tự do DPPH. Nồng độ mẫu thử được chuẩn bị thành nhiều mức từ 12,5 đến 200 µg/mL. Acid ascorbic được sử dụng làm chất chuẩn dương để so sánh. Kết quả tính bằng phần trăm ức chế và giá trị IC50. Thử nghiệm kháng viêm đánh giá khả năng ức chế sản xuất NO trong tế bào RAW 264.7. Indomethacin được dùng làm chất chuẩn dương cho hoạt tính kháng viêm.

3.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro

Phương pháp MTT dựa trên khả năng chuyển hóa muối tetrazolium của tế bào sống. Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy trong môi trường RPMI-1640 bổ sung huyết thanh. Mẫu thử được hòa tan trong DMSO và pha loãng đến nồng độ cần thử. Tế bào được xử lý với mẫu trong 72 giờ ở điều kiện 37°C, 5% CO2. Giá trị IC50 được tính bằng phần mềm GraphPad Prism. Doxorubicin được sử dụng làm chất chuẩn dương cho hoạt tính gây độc tế bào.

IV. Kết luận và ứng dụng tiềm năng của hợp chất từ Capparis dongvanensis

Nghiên cứu đã phân lập và xác định cấu trúc thành công nhiều hợp chất từ lá Capparis dongvanensis. Các hợp chất thuộc nhóm flavonoid, steroid và alkaloid được phát hiện với độ tinh khiết cao. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm. Một số hợp chất thể hiện hoạt tính chống oxy hóa tương đương chuẩn dương. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư được ghi nhận ở mức trung bình đến mạnh. Phát hiện này mở ra hướng nghiên cứu mới cho việc khai thác tài nguyên thực vật Việt Nam. Cần thêm các nghiên cứu sâu về cơ chế tác động và độc tính cấp của các hợp chất này. Kết quả luận văn đóng góp giá trị vào kho tàng tri thức về hóa học thiên nhiên.

4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài luận văn thạc sĩ

Đề tài đóng góp dữ liệu mới về thành phần hóa học của loài C. dongvanensis. Kết quả bổ sung thông tin cho cơ sở dữ liệu hóa học thực vật Việt Nam. Phương pháp nghiên cứu được thiết lập có thể áp dụng cho các loài thực vật khác. Phát hiện các hợp chất có hoạt tính sinh học mở hướng nghiên cứu dược lý học. Nghiên cứu cũng góp phần bảo tồn và phát triển giá trị cây thuốc bản địa. Đóng góp này có ý nghĩa quan trọng trong đào tạo nguồn nhân lực nghiên cứu khoa học.

4.2. Hướng phát triển và ứng dụng trong tương lai

Cần tiến hành nghiên cứu cơ chế tác động của các hợp chất hoạt tính mạnh. Nghiên cứu độc tính cấp và bán trường diễn trên động vật thí nghiệm là cần thiết. Phát triển dạng bào chế phù hợp để nâng cao sinh khả dụng của hoạt chất. Nghiên cứu quy trình chiết xuất quy mô lớn phục vụ sản xuất dược phẩm. Tìm kiếm nguồn nguyên liệu bền vững để bảo tồn loài C. dongvanensis. Hợp tác quốc tế trong nghiên cứu hóa học thiên nhiên cần được đẩy mạnh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN 1. Khái quát về loài Cáp Đồng văn 1. Tên khoa học - Tên khoa học: Capparis dongvanensis. Chi: capparis - Tên Việt Nam: Cáp Đồng văn.

Họ: Màng Màng. Đặc điểm thực vật học Cáp Đồng văn (Capparis dongvanensis Sy.) được coi như một loài mới và được phát hiện từ huyện Đồng Văn tỉnh Hà Giang của Việt Nam. Chúng nó có hình thái loài tương tự Capparis lanceolaris và Capparis fengii, chỉ khác về số lượng bông hoa trên cuống hoa, chiều dài gân lá, cuống lá, đỉnh của lá, kiểu phát hoa, màu sắc của cánh hoa, bầu nhị có hình trụ , hình dạng quả và số lượng hạt trong mỗi quả. Các đặc điểm của hình thái, sinh thái môi trường và tình trạng bảo tồn được ra cùng với các ảnh SEM của phấn hoa và hạt của Cáp Đồng văn được mô tả ở hình 1.

Căp cánh hoa thấp Cành chứa hoa Nhị hoa Cành chứa quả. Cặp cánh hoa trên SEM của hạt giống. Noãn SEM của bề SEM của bề mặt mặt vỏ hạt phấn hoa. Mặt cắt ngang SEM của hạt phấn của lá hoa.

Hình ảnh của loài Cáp Đồng văn 3 A: Cành chứa hoa. C: Phần đỉnh của lá. F: Cặp cánh hoa thấp G: Cặp cánh hoa trên. J: Nhánh với quả.

Hình vẽ mô tả loài Cáp Đồng văn Loài Cáp Đồng văn (Capparis dongvanensis) có dạng sống là bụi lớn gần 10 m, thân leo hoặc trườn trên đất. Thân và cành có rãnh và gai nhỏ hướng xuống dưới đầu nhọn dài 1-2 mm, lá có hình giọt nước hay hình giáo mác có kích thước 9-16,5 x 3-4,5 cm và có 2 màu như màu xanh đậm khi tươi và chuyền màu và khi gần rụng lá, mũi nhọn của lá dài 7-10 mm, Cuống lá dài 5-8 mm. Hoa thường mọc thành chùm, thành cụm, một chùm gồm có 4 - 7 hoa, mọc ở nách lá hoặc ở đỉnh của cành. Nụ hoa ban đầu có màu xanh khi ban đầu nở ra có màu tím nhạt và nở ra xong sẽ có màu trắng.

Hoa của Cáp Đồng Văn bắt đầu mọc lên từ tháng 2 - tháng 3 và tháng 10 - tháng 11. Quả của Cáp Đồng văn có hình cầu, mỗi quả gồm có 2 - 6 hạt, hạt có hình bầu dục. Quả mọc bắt đầu tháng 6 - tháng 1(năm sau). Phân bố PGS.

Sỹ Danh Thường và các cộng sự đã tìm kiếm và phát hiện loài Cáp Đồng văn (Capparis dongvanensis) mới ở vùng cao núi đá Đồng Văn tỉnh Hà Giang của Việt Nam. Loài này được công bố vào năm 2017. Một số công dụng của loài Cáp Đồng văn Loài Cáp Đồng văn là một cây thuộc họ Màng Màng và chi Cáp. Ngày xưa các loài thuộc chi Cáp đã được sử dụng chữa bệnh đau lưng, viêm nhiễm.

Hiện nay bước đầu đã chứng minh dịch chiết cao tổng hợp và hợp chất hóa học được phân lập từ các loài thực vật thuộc chi Cáp này có khả năng ức chế tế bào ung thư, chống oxi hóa, chống viêm, nhiễm trùng và kháng vi sinh vật [32-60]. Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học của các loài chi Capparis 1. Hoạt tính sinh học chống oxi hóa Quá trình oxi hóa là quá trình liên quan trực tiếp đến phản ứng hóa học, sự chấp nhận electron bởi các hợp chất có electron được gọi là các tác nhân oxi hóa hoặc gốc tự do. Các hợp chất mới này ở trạng thái oxi hóa - khử thấp hơn hoặc nhiều hơn tình trạng oxi hóa so với các hợp chất trước khi nhận electron xảy ra.

Tuy nhiên các electron đặc biệt này không ổn định ở vị trí của các hợp chất, do các hợp chất oxi hóa này thì mới tìm ra các hợp chất khác để tặng hoặc loại bỏ các electron của nó. Do đó, các hợp chất mới này thì mới tìm được nhiều hợp chất hơn để tự giảm bớt các electron của chúng và quá trình này trở thành một loại quá trình phản hồi tích cực theo hướng oxy hóa hợp chất lớn hơn. Kết luận sự oxi hóa có quan trọng của chất chống oxi hóa để duy trì sức khỏe và chữa trị căn bệnh, thỉnh thoảng sự oxi hóa đã sử dùng trong y học và bác sĩ thông thái sẽ dùng nó để đạt được mục đích của mình. Một số ví dụ về các nghiên cứu về khả năng chống oxi hóa của Capparis như bảng dưới đây.

Quả, lá của Capparis spinosa Bảng 1. Hoạt tính sinh học chống oxi hóa của chi Capparis Phần của Tác giả và Tài liệu Tên cây Hoạt tính sinh học thực vật năm tham khảo Giảm độ số lượng đường Cao chiết glutathione, superoxide Dangi và Capparis methanol dismutase, catalase và Mishra [22] aphylla từ thân glutathione peroxidase (2011a) cây. trong gan, tim, thận của con chuột bị tiểu đường. Giảm số lượng chất béo peroxidation sinh ra từ alloxan trong hồng cầu, gan, Capparis Bột trong Yadav tim của con chuột.

Hoạt động chống oxi hóa Cao chiết mạnh trong ống nghiệm Capparis Germano 2+ spinosa MeOH của bằng vitamin C / Fe -chất (2002) [28] nụ béo peroxidn mực độ trung bình của gan chuột. Chiết xuất phân đoạn từ bột thô của quả bằng DPPH, Et Capparis Quả acetate > nước > n-butanol Yu (2011) [86] spinosa > chloroform > petroleum ether Quả, dung dich và Capparis Chống oxi hóa, thả ra DPPH cao chiết Yang (2010) [84] spinosa trong ống nhiệm. ethyl acetate Quả, cao Giảm sự căng thẳng oxi hóa Capparis chiết nguyên bào sợi da trong ống Cao (2010) [18] spinosa ethanolic nghiệm Tác động của chất chống oxi hóa làm biến thiên từ Capparis Bhoyar Lá trans khác nhau - Himalaya [12] spinosa (2011) sites bằng ABTS, DPPH và FRAP 7 Phần của Tác giả và Tài liệu Tên cây Hoạt tính sinh học thực vật năm tham khảo Trong con chuột bạch tạng, Capparis Satyanaraya Thân cây giảm tổn thương gan, giảm [62] spinosa na (2010) SGOT, SGPT, ALP, TB. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư Ung thư có nghĩa là nhóm căn bệnh biểu thị đặc trưng bởi sự phát triển của tế bào bất thường từ “neoplastic clone”, trong trường hợp ung thư rắn có thể sờ mó được và mô tả sự phát triển và bướu.

Trong trường hợp ung thư huyết học là nhóm tế bào lưu thông đã tìm thấy xem xét huyết bằng kính hiển vi. Căn bệnh học ung thư xuất hiện đa dạng và đa yếu tố nhưng có thể sự tiếp xúc với hóa chất gây ung thư hoặc sự phát xạ, xuất phát từ cảm xúc hoặc tâm lý. Như đã thảo luận trong trường hợp sự viêm mãn tính lâu dài có thể liên quan đến sự căng thẳng oxi hóa và các yếu tố gây bệnh khác. Dưới đây là một số nghiên cứu chứng minh khả năng ức chế tế bào ung thư của chi Capparis: Bảng 1.

Hoạt tính sinh học ức chế tế bào ung thư ở chi Capparis Tài liệu Phần của Tác giả và Tên cây Hoạt tính sinh học tham thực vật năm khảo Trong ống nghiệm thấy rằng nó có thể chống ung Capparis thư dạ dày, buồng trứng sikkimensis Rễ và mũi hỏng. Có thể làm Wu (2003) [79] var. thuốc gây độc tế bào và thuốc kháng dòng tế bào khối u của con người. Capparis Sự thí nghiệm bằng MTT, Tinh dầu Ji (2008a) [32] spinosa giảm tế bào ung thư gây ra.

8 Tài liệu Phần của Tác giả và Tên cây Hoạt tính sinh học tham thực vật năm khảo Trong quá trình SGC- 7901 làm chết rụng các tế Quả, tổng bào ung thư dạ dày của Capparis Wang cộng tinh con người liên quan đến [77] spinosa (2008) dầu hạt sự tăng lên của Ca và giảm màng tiềm năng của ti thế. Điều chỉnh sự tạo melanin trong tế bào khối Capparis Chiết u ác tính của con chuột Matsuyama [48] spinosa xuất từ lá B16, không gây độc tế (2009) bào và kích thích biểu hiện tyrosinase. Ức chế sự gia tăng của Cao chiết SKOV-3, Canpan-2, Capparis Yang n-BuOH HepG-2, SGC-7901 của [83] spinosa (2009) của quả dòng tế bào ung thư trong ống nghiệm. Giảm sự phát tán và tăng cơ chế gây chết tế bào Capparis Tinh dầu Ling theo chương trình của tế [45] spinosa hạt (2010b) bào ung thư dạ dạy của con người.

Capparis Ức chế sự phát tán của Lam và Ng Hạt [42] spinosa các độc tế bào HepG-2, tế (2009) 9 Tài liệu Phần của Tác giả và Tên cây Hoạt tính sinh học tham thực vật năm khảo bào ung thư ruột HT29 và tế ung thư vú MCF-7. Hoạt tính sinh học kháng viêm Viêm là căn bệnh nền tảng liên quan đến hầu hết tất cả các bệnh và rối loạn trong cơ thể. Hiện nay các bác sĩ và nhà khoa học đã thảo luận về vấn đề này. Việc ứng dụng Capparis điều trị viêm có nhiều cách khác nhau.

Các động vật bậc cao có phản ứng lại với tình trạng viêm đối với tác nhân gây sự căng thẳng như vậy theo sự bảo vệ của hệ thống bảo vệ, trong đó bao gồm cả miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thích ứng. - Miễn dịch bẩm sinh là cơ bản của hai loại miễn dịch, liên quan đến hệ thống bổ sung ở động vật và nó là cơ sở của phản ứng miễn dịch đối với các tác nhân gây sự căng thẳng của thực vật. - Miễn dịch thích ứng là mạng lưới nhận thức động vật phức tạp hơn, xác định các yếu tố gây sự căng thẳng từ sinh vật khác với cơ thể và sử dụng loại tế bào bạch cầu di động được gọi là tế bào lympho theo cách tương đồng với cách thức thần kinh hệ thống và não sử dụng tế bào thần kinh, nhận biết kẻ tấn công và gắn kết các phản ứng miễn dịch để tiêu diệt những nguy hiểm xâm nhập như vậy vào trong quá trình viêm. Vỏ cây và vỏ rễ cây Capparis spinosa trunk 11 Bảng 1.

Hoạt tính sinh học kháng viêm ở chi Capparis Phần của Tác giả và Tài liệu Tên cây Hoạt tính sinh học thực vật năm tham khảo Chống sự viêm Capparis Cao chiết Ageel trong con chuột trên [3] decidua EtOH (1986) phòng thí nghiệm. Thân cây tươi, sấy khô làm Chống giun sán, thành bột chống viêm gan, Capparis Garg hoặc làm cách điều trị và chống tiểu [27] decidua (2011) khác có khả đường và giảm chất năng hóa tan béo trong huyết được.