Luận văn thạc sĩ phân lập hợp chất từ lá cáp Đồng Văn - Đại học Thái Nguyên

• Tác giả: Sangkhy Keosavanh
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Văn Khang
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
• Đề tài: Phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất từ lá loài Cáp Đồng văn (Capparis dongvanensis)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thái Nguyên

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu hợp chất từ lá Capparis dongvanensis

Capparis dongvanensis là loài thực vật thuộc chi Capparis, họ Capparaceae, được tìm thấy chủ yếu tại khu vực Đồng Văn, Hà Giang. Loài cây này có tên gọi dân gian là cáp đồng văn, thuộc nhóm thực vật quý hiếm của vùng cao nguyên đá. Các nghiên cứu trước đó trên các loài cùng chi Capparis đã cho thấy nhiều hoạt tính sinh học giá trị. Cụ thể, các hợp chất phân lập được từ chi Capparis có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ. Chúng cũng thể hiện hoạt tính ức chế tế bào ung thư trên nhiều dòng tế bào khác nhau. Ngoài ra, các chiết xuất từ chi này còn có tác dụng kháng viêm hiệu quả. Việc nghiên cứu thành phần hóa học của C. dongvanensis giúp mở rộng kiến thức về đa dạng hóa học của loài này. Đồng thời, phát hiện các hợp chất mới có tiềm năng ứng dụng trong y học và dược phẩm.

1.1. Đặc điểm thực vật học của loài cáp đồng văn

Capparis dongvanensis là cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, phân bố tại vùng núi đá vôi ở độ cao từ 800 đến 1500 mét. Lá cây có hình trứng hoặc hình bầu dục, mọc so le, phiến lá bóng. Hoa mọc thành chùm ở nách lá, có màu trắng hoặc hồng nhạt. Quả dạng nang chứa nhiều hạt đen. Loài cây này được tìm thấy chủ yếu ở khu vực Công viên địa chất toàn cầu Cao nguyên đá Đồng Văn. Cây có khả năng chịu hạn tốt, phát triển trên đất đá vôi nghèo dinh dưỡng.

1.2. Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học của chi Capparis

Các loài trong chi Capparis đã được nghiên cứu rộng rãi về hoạt tính sinh học. Hoạt tính chống oxy hóa được chứng minh qua khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH và ức chế quá trình peroxy hóa lipid. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư được ghi nhận trên các dòng tế bào HepG-2, MCF-7 và HT29. Chiết xuất từ hạt và lá C. spinosa cho thấy tác dụng kháng viêm đáng kể. Ngoài ra, một số nghiên cứu còn phát hiện hoạt tính kháng khuẩn và chống ký sinh trùng ở các loài chi Capparis.

II. Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hợp chất từ lá

Quy trình nghiên cứu bắt đầu bằng việc thu hái mẫu lá Capparis dongvanensis từ Đồng Văn, Hà Giang. Mẫu thực vật được xử lý sạch, phơi khô ở nhiệt độ phòng và nghiền thành bột mịn. Bột lá được chiết xuất bằng dung môi ethanol ở nhiệt độ thường với nhiều lần chiết. Dung dịch chiết được cô đặc dưới áp suất giảm để thu dịch chiết thô. Dịch chiết thô được phân chia bằng phương pháp lỏng-lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần. Các phân đoạn được tinh chế bằng sắc ký cột silica gel và sắc ký gel Sephadex LH-20. Các hợp chất tinh khiết được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ hiện đại. Quy trình này đảm bảo thu được các hợp chất có độ tinh khiết cao phục vụ nghiên cứu hoạt tính sinh học.

2.1. Kỹ thuật sắc ký phân lập hợp chất thiên nhiên

Sắc ký cột silica gel là phương pháp chính để phân lập các hợp chất từ dịch chiết thô. Dung môi eluent sử dụng là hệ gradient từ hexane đến etyl acetat và methanol. Sắc ký gel Sephadex LH-20 được dùng để loại bỏ tạp chất có trọng lượng phân tử khác. Sắc ký pha nghịch đảo C18 áp dụng cho các hợp chất phân cực cao. Phương pháp sắc ký mỏng (TLC) được sử dụng để theo dõi quá trình phân lập. Các vết trên TLC được phát hiện bằng thuốc thử vanillin-H2SO4 và đèn UV.

2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất phân lập

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng phổ NMR 1D và 2D. Phổ 1H-NMR cung cấp thông tin về loại và vị trí các nguyên tử hiđrô trong phân tử. Phổ 13C-NMR và DEPT xác định số loại nguyên tử cacbon và tính chất của chúng. Phổ 2D như COSY, HSQC, HMBC giúp xác định liên kết giữa các nguyên tử. Phổ khối HR-ESI-MS cho biết khối lượng phân tử chính xác và công thức phân tử. Phổ hồng ngoại IR hỗ trợ nhận diện các nhóm chức đặc trưng trong phân tử.

III. Đánh giá hoạt tính sinh học của hợp chất từ lá Capparis dongvanensis

Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được đánh giá bằng nhiều phương pháp khác nhau. Thử nghiệm chống oxy hóa sử dụng phương pháp DPPH và β-caroten bleaching. Phương pháp MTT được áp dụng để đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên các dòng tế bào chuẩn. Các dòng tế bào thử nghiệm bao gồm HepG-2, MCF-7 và HeLa. Nồng độ ức chế IC50 được tính toán để so sánh hoạt tính giữa các hợp chất. Thử nghiệm kháng viêm thực hiện trên mô hình tế bào RAW 264.7 kích thích bằng LPS. Kết quả nghiên cứu cho thấy một số hợp chất có hoạt tính sinh học đáng kể. Các hợp chất thuộc nhóm flavonoid và alkaloid thể hiện hoạt tính mạnh nhất. Dữ liệu thu được cung cấp cơ sở khoa học cho ứng dụng dược phẩm trong tương lai.

3.1. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa và kháng viêm

Hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá bằng phương pháp loại bỏ gốc tự do DPPH. Nồng độ mẫu thử được chuẩn bị thành nhiều mức từ 12,5 đến 200 µg/mL. Acid ascorbic được sử dụng làm chất chuẩn dương để so sánh. Kết quả tính bằng phần trăm ức chế và giá trị IC50. Thử nghiệm kháng viêm đánh giá khả năng ức chế sản xuất NO trong tế bào RAW 264.7. Indomethacin được dùng làm chất chuẩn dương cho hoạt tính kháng viêm.

3.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro

Phương pháp MTT dựa trên khả năng chuyển hóa muối tetrazolium của tế bào sống. Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy trong môi trường RPMI-1640 bổ sung huyết thanh. Mẫu thử được hòa tan trong DMSO và pha loãng đến nồng độ cần thử. Tế bào được xử lý với mẫu trong 72 giờ ở điều kiện 37°C, 5% CO2. Giá trị IC50 được tính bằng phần mềm GraphPad Prism. Doxorubicin được sử dụng làm chất chuẩn dương cho hoạt tính gây độc tế bào.

IV. Kết luận và ứng dụng tiềm năng của hợp chất từ Capparis dongvanensis

Nghiên cứu đã phân lập và xác định cấu trúc thành công nhiều hợp chất từ lá Capparis dongvanensis. Các hợp chất thuộc nhóm flavonoid, steroid và alkaloid được phát hiện với độ tinh khiết cao. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm. Một số hợp chất thể hiện hoạt tính chống oxy hóa tương đương chuẩn dương. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư được ghi nhận ở mức trung bình đến mạnh. Phát hiện này mở ra hướng nghiên cứu mới cho việc khai thác tài nguyên thực vật Việt Nam. Cần thêm các nghiên cứu sâu về cơ chế tác động và độc tính cấp của các hợp chất này. Kết quả luận văn đóng góp giá trị vào kho tàng tri thức về hóa học thiên nhiên.

4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài luận văn thạc sĩ

Đề tài đóng góp dữ liệu mới về thành phần hóa học của loài C. dongvanensis. Kết quả bổ sung thông tin cho cơ sở dữ liệu hóa học thực vật Việt Nam. Phương pháp nghiên cứu được thiết lập có thể áp dụng cho các loài thực vật khác. Phát hiện các hợp chất có hoạt tính sinh học mở hướng nghiên cứu dược lý học. Nghiên cứu cũng góp phần bảo tồn và phát triển giá trị cây thuốc bản địa. Đóng góp này có ý nghĩa quan trọng trong đào tạo nguồn nhân lực nghiên cứu khoa học.

4.2. Hướng phát triển và ứng dụng trong tương lai

Cần tiến hành nghiên cứu cơ chế tác động của các hợp chất hoạt tính mạnh. Nghiên cứu độc tính cấp và bán trường diễn trên động vật thí nghiệm là cần thiết. Phát triển dạng bào chế phù hợp để nâng cao sinh khả dụng của hoạt chất. Nghiên cứu quy trình chiết xuất quy mô lớn phục vụ sản xuất dược phẩm. Tìm kiếm nguồn nguyên liệu bền vững để bảo tồn loài C. dongvanensis. Hợp tác quốc tế trong nghiên cứu hóa học thiên nhiên cần được đẩy mạnh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM SANGKHY KEOSAVANH PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC HỢP CHẤT TỪ LÁ LOÀI CÁP ĐỒNG VĂN (CAPPARIS DONGVANENSIS) LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC THÁI NGUYÊN - 2020 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM SANGKHY KEOSAVANH PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC HỢP CHẤT TỪ LÁ LOÀI CÁP ĐỒNG VĂN (CAPPARIS DONGVANENSIS) Ngành: Hóa hữu cơ Mã ngành: 8440114 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. PHẠM VĂN KHANG THÁI NGUYÊN- 2020 LỜI CAM ĐOAN Trải qua quá trình nghiên cứu các tài liệu cộng với nỗ lực của bản thân trong suất quá trình tiến hành thực nghiệm, công trình nghiên cứu của tôi đến nay đã hoàn thành. Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020 Học viên Sangkhy KEOSAVANH i LỜI CÁM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và lời cảm ơn sâu sắc của mình tới PGS. Phạm Văn Khang - Người thầy đã tin tưởng giao đề tài, tận tình hướng dẫn, động viên và tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn. Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo và các học viên cao học K26 trong phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ đã tạo môi trường nghiên cứu khoa học thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành các kế hoạch nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn các em sinh viên nghiên cứu đề tài khoa học hợp chất thiên nhiên đã cùng cộng tác với tôi trong trong việc tiến hành các thí nghiệm thuộc đề tài luận văn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban lãnh đạo khoa Hóa học và phòng Đào tạo (bộ phận sau đại học) - Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này. Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020 Học viên Sangkhy KEOSAVANH ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN. v DANH MỤC CÁC BẢNG. vii DANH MỤC CÁC HÌNH. viii MỞ ĐẦU. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu của đề tài. 2 Chương 1: TỔNG QUAN. Khái quát về loài Cáp Đồng văn. Tên khoa học. Đặc điểm thực vật học. Một số công dùng của loài Cáp Đồng văn. Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học của các loài chi Capparis. Hoạt tính sinh học chống oxi hóa. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư. Hoạt tính sinh học kháng viêm. Hoạt tính sinh học điều trị và chống khô miệng. Hoạt tính sinh học chống nhiễm trùng và nhiễm ký sinh. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học của các loài trong chi Capparis . Glucosinolates và Isothiocyanates. Proteins và Amino acids. Các hợp chất khác. 37 Chương 2: THỰC NHIỆM. Hóa chất và thiết bị phân lập. Hóa chất và tế bào dùng để thử hoạt tính sinh học. Phương pháp sử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các chất phân lập được. Mẫu nghiên cứu và xử lý mẫu thực vật. Xác định cấu trúc các chất. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư. Vật liệu và hóa chất. Phương pháp nuôi cấy tế bào trong ống nghiệm. Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư (cytotoxic assay). Phân lập, tinh chế các hợp chất 1, 2. 44 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất. Phân tích cấu trúc hợp chất 1. Phân tích cấu trúc hợp chất 2. Kết quả nghiên cứu hoạt tính độc tế bào trên dòng tế bào ung thư HeLa (cổ tử cung) và A549 (tế bào ung thư gan). 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 59 PHỤ LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN SEM : Scanning electron microscope : Kính hiển vi điện tử quét UV : Ultraviolet : Tia tử ngoại DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, hay 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl ABTS : 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid FRAP : Ferric reducing ability of plasma : Khả năng khử sắt của huyết tương SGOT : Serum glutamic oxaloacetic transaminase : Glutamic oxaloacetic transaminase trong huyết thanh SGPT : Serum glutamic pyruvate transaminase : Glutamic pyruvate transaminase trong huyết thanh ALP : Alkaline phosphatase TB : Total bilirubin : Tổng cộng sắc tố màu da cam MTT : 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide SGC-7901 : Stomach (Gastric) Cancer-7901 : Ung thư dạ dạy HepG-2 cell : Hepatoma G2 cell : Tế bào ung thư tế bào gan G2 HT29 cell : Colon cancer cell line : Tế bào ung thư rượt giả MCF-7 : Michigan Cancer Foundation-7 : Tổ chức Ung thư Michigan-7 HSV-2: Herpes simplex virus-2 : Bệnh Herpes mụn rộp v TLC 254F : Thin Layer Chlomotographic : Sắc ký lớp mỏng 254F FBS : Foetal bovine serum TCA : Tricloroacetic acid sRB : Sulforhodamine B LC-MS : Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer : Sắc ký lỏng hiệu năng cao-Khối phổ kế KHCN : Khoa học công nghệ OD : Optical Density : Mật độ quang DMEM : Dulbecco's Modified Eagle Medium : Môi trường DMEM HEPES : 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid TBUT : Tear Breakup Time 13C-NMR : 13C-Nucler Magnetic Resonance : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C 1H-NMR : 1H-Nucler Magnetic Resonance : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H HMBC : Heternuclear multiple - Bond Corelation : Phổ tương quan hai chiều H-C HSQC : Heternuclear Spectroscopy- Quantum Coherence : Phổ tương tác C-H MS : Mass spectrometry : Phổ khối lượng NOESY : Nuclear Overhauser effect Spectroscopy : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Hoạt tính sinh học chống oxi hóa của chi Capparis. Hoạt tính sinh học ức chế tế bào ung thư ở chi Capparis. Hoạt tính sinh học kháng viêm ở chi Capparis. Hoạt tính sinh học điều trị và chống khô miệng. Hoạt tính sinh học chống nhiễm trùng và nhiễm ký sinh. Một số phần hóa học của nhóm Fatty acids từ các loại chi Capparis . Một số phần hóa học của nhóm Glucosinolates và Isothiocyanates từ các loại chi Capparis 20 Bảng 1. Một số phần hóa học của nhóm Proteins từ các loại chi Capparis. Một số phần hóa học của nhóm dầu bay hơi (Volatile Oils) từ các loại chi Capparis 24 Bảng 1. Một số phần hóa học của nhóm Vitamin từ các loại chi Capparis. Một số phần hóa học của nhóm Alkaloids từ các loại chi Capparis . Một số phần hóa học của nhóm Flavonoid từ các loại chi Capparis . Một số phần hóa học của nhóm Steroid từ các loại chi Capparis . Một số phần hóa học của nhóm các hợp chất khác từ các loại chi Capparis 37 Bảng 2. Các hóa chất được sử dụng trong qua trình phân lập các chất. Hóa chất và tế bào dùng để thử hoạt tính sinh học. Các thiết bị sử dùng. Độ chuyển dịch hóa học 1H, 13C-NMR của 1. Tác động gây độc tế bào ung thư của 1. 57 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Hình ảnh của loài Capparis dongvanensis. Hình vẽ mô tả loài Cáp Đồng văn. Quả, lá của Capparis spinosa. Vỏ cây và vỏ rễ cây Capparis spinosa trunk. Hình ảnh cây Capparis jamaicensis. Rễ và vỏ cây Capparis spinosa. Quả Capparis sola. Cấu trúc hóa học trong nhóm Fatty acids. quả cây Capparis drypetes sp. Cấu trúc hóa học trong nhóm Glucosinolates and Isothiocyanates. Cấu trúc hóa học trong nhóm Proteins. Chồi cây ngâm. Cấu trúc hóa học trong nhóm Volatile Oils. Hoa và quả cây Capparis decidua. Cấu trúc hóa học trong nhóm Vitamin. Vỏ và rễ cây Capparis spinosa. Cấu trúc hóa học trong nhóm Alkaloids. Hoa cây Capparis spinosa . Quả cây Capparis spinosa. Cấu trúc hóa học trong nhóm Flavonoid. Cấu trúc hóa học trong nhóm Steroid. Cấu trúc hóa học trong nhóm các hợp chất khác. Sơ đồ phân lập chất 1, 2 từ cao chiết Ethyl acetate. Phổ 1H-NMR của chất 1. Phổ 13C-NMR của chất 1. Phổ HSQC của chất 1. Sự tương quan giữa H C của chất 1 (HMBC). Phổ NOESY của chất 1. Phổ MS của chất 1. Công thức cấu tạo của chất 1. Phổ 1H-NMR của chất 2. Phổ 13C-NMR của chất 2. Sự tương quan giữa H C của chất 2 (HMBC). Phổ MS của chất 2. Công thức cấu tạo của 2. 56 ix MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hóa học các hợp chất thiên nhiên nói chung và các hợp chất có hoạt tính sinh học nói riêng là một trong những lĩnh vực nghiên cứu đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Từ xa xưa con người đã khám phá sức mạnh của thiên nhiên và biết sử dụng nhiều loại thực vật nhằm mục đích chữa bệnh, đồng thời tránh được một số tác nhân có hại cho sức khỏe con người. Do vậy, việc nghiên cứu các chất mang hoạt tính sinh học cao có trong các loài cây, cỏ có tác dụng thiết thực trong đời sống hàng ngày là vấn đề quan tâm của toàn xã hội và được đặt lên hàng đầu. Như đã biết, động, thực vật là nguồn tài nguyên phong phú và là nguồn cung cấp các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học vô cùng quý giá. Việc khai thác và sử dụng các loài thực động, thực vật để làm thuốc và hỗ trợ chữa bệnh đã được thực hiện từ lâu. Hiện nay, xu hướng nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao từ các loài động, thực vật làm dược phẩm chữa bệnh ngày càng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học. Từ thực tế nhận thấy các hợp chất thiên nhiên thường có hoạt tính mạnh, độ ổn định cao và có độc tính thấp so với các hợp chất nguồn gốc tổng hợp. Loài Cáp Đồng văn là loài mới được phát hiện và phân loại, thuộc họ Màng Màng. Các loài thuộc chi Cáp đã được sử dụng từ lâu để chữa một số bênh như: viêm nhiễm, đau lưng. Gần đây, nhiều nghiên cứu đã chứng minh dịch chiết cao tổng số và hợp chất hóa học được phân lập từ loài thực vật này có khả năng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư và bảo vệ tế bào não dưới các tác động gây tổn thương của glutamat, hyperglycemia, beta-amyloid nhằm định hướng chữa bệnh Alzheimer và Parkinson. Ở Việt Nam, loài Cáp Đồng văn được nhóm nghiên cứu của PGS.TS Sỹ Danh Thường Phó trưởng phòng khảo thí và quản lý chất lượng trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên định danh và công bố tên khoa học năm 2017. 1 Hiện nay, loài thực vật này được phát hiện tại Hà Giang và Lào Cai. Đến nay chưa có nhiều công bố về thành phần hóa học của loài thực vật này. Dó đó chúng tôi đề xuất đề tài: Phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất từ lá loài Cáp Đồng văn (Capparis dongvanensis).