Luận văn tốt nghiệp: Nghiên cứu điều chế và đánh giá hoạt tính sinh học của dẫn xuất 2-pyrrolidinone

Luận văn nghiên cứu điều chế và đánh giá hoạt tính sinh học của các dẫn xuất 2 pyrrolidinone, góp phần vào phát triển dược phẩm mới.

• Tác giả: Lê Phước Thảo Nguyên
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Trần Nguyên
• Trường học: Đại học Đà Nẵng
• Chuyên ngành: Sư phạm
• Đề tài: Nghiên Cứu Điều Chế Và Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học Của Một Số Dẫn Xuất 2-Pyrrolidinone
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Đà Nẵng

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• MỞ ĐẦU
• 0.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 0.2. Đối tượng và mục đích nghiên cứu
• 0.3. Phương pháp nghiên cứu
• 0.4. Nội dung nghiên cứu
• 0.5. Bố cục luận văn
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. SƠ LƯỢC VỀ 2-PYRROLIDINONE VÀ DẪN XUẤT CỦA NÓ
• 1.1.1. Sơ lược về 2-pyrrolidinone
• 1.1.2. Một số dẫn xuất của 2-pyrrolidinone
• 1.2. PHẢN ỨNG NHIỀU THÀNH PHẦN
• 1.2.1. Sơ lược về phản ứng nhiều thành phần
• 1.2.2. Một số phản ứng nhiều thành phần
• 1.2.2.1. Phản ứng Strecker
• 1.2.2.2. Phản ứng Ugi
• 1.2.2.3. Phản ứng Gewald
• 2. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT
• 2.2. QUY TRÌNH TỔNG HỢP
• 2.3. KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG
• 2.3.1. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng và thể tích dung môi
• 2.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng
• 2.3.3. Ảnh hưởng của độ mạnh acid
• 2.4. TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN XUẤT 2-PYRROLIDINONE
• 2.4.1. Tổng hợp dẫn xuất 2-pyrrolidinone từ benzaldehyde và aniline
• 2.4.2. Tổng hợp dẫn xuất 2-pyrrolidinone từ benzaldehyde và benzylamine
• 2.4.3. Tổng hợp dẫn xuất 2-pyrrolidinone từ p-tolualdehyde và aniline
• 2.5. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DẪN XUẤT 2-PYRROLIDINONE ĐÃ TỔNG HỢP
• 2.5.1. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng
• 2.5.1.2. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)
• 2.5.1.3. Phương pháp phổ khối (MS)
• 2.5.1.4. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
• 2.5.1.5. Phương pháp khuếch tán đĩa thạch
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. SO SÁNH HIỆU SUẤT KHI THAY ĐỔI ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG
• 3.1.1. Thay đổi thời gian phản ứng và thể tích dung môi
• 3.1.2. Thay đổi nhiệt độ phản ứng
• 3.1.3. Thay đổi acid
• 3.2. TỔNG HỢP DẪN XUẤT 2-PYRROLIDINONE TỪ BENZALDEHYDE VÀ ANILINE
• 3.2.1. Phổ hồng ngoại
• 3.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR
• 3.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR
• 3.3. TỔNG HỢP DẪN XUẤT 2-PYRROLIDINONE TỪ BENZALDEHYDE VÀ BENZYLAMINE
• 3.3.1. Phổ hồng ngoại
• 3.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR
• 3.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR
• 3.4. TỔNG HỢP DẪN XUẤT 2-PYRROLIDINONE TỪ P-TOLUALDEHYDE VÀ ANILINE
• 3.4.1. Phổ hồng ngoại
• 3.4.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR
• 3.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR
• 3.5. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DẪN XUẤT 2-PYRROLIDINONE ĐÃ TỔNG HỢP
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về 2 pyrrolidinone

2-pyrrolidinone là một hợp chất lactam có cấu trúc vòng 5 cạnh, bao gồm bốn nguyên tử carbon và một nguyên tử nitơ. Hợp chất này có công thức phân tử C4H7NO và khối lượng phân tử 85.11 g/mol. 2-pyrrolidinone được biết đến với nhiều tính chất hóa học và vật lý đặc biệt, như tỷ trọng 1.116 g/cm3 và nhiệt độ sôi 245°C. Hợp chất này có ứng dụng rộng rãi trong ngành dược phẩm và hóa nông nghiệp. Các dẫn xuất của 2-pyrrolidinone đã được nghiên cứu và chứng minh có hoạt tính sinh học mạnh, bao gồm khả năng chống vi khuẩn và kháng viêm. Việc tổng hợp các dẫn xuất này thông qua phản ứng nhiều thành phần (MCRs) đã mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu và phát triển dược phẩm.

1.1. Tính chất và ứng dụng

2-pyrrolidinone có nhiều tính chất hóa học quan trọng, như khả năng hòa tan tốt trong nước và các dung môi hữu cơ. Hợp chất này thường được sử dụng làm dung môi trong các phản ứng hóa học và là nguyên liệu trong tổng hợp các hợp chất hữu cơ khác. Các dẫn xuất của 2-pyrrolidinone đã được phát hiện có khả năng kháng khuẩn, chống ung thư và nhiều ứng dụng khác trong y học. Việc nghiên cứu và phát triển các dẫn xuất này không chỉ giúp mở rộng ứng dụng trong dược phẩm mà còn góp phần vào việc phát triển các phương pháp điều trị mới cho nhiều bệnh lý.

II. Phản ứng nhiều thành phần trong tổng hợp 2 pyrrolidinone

Phản ứng nhiều thành phần (MCRs) là một phương pháp tổng hợp hữu ích trong hóa học hữu cơ, cho phép tổng hợp nhiều sản phẩm từ một số lượng nguyên liệu hạn chế. Phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi trong tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học, bao gồm các dẫn xuất của 2-pyrrolidinone. Một trong những ưu điểm nổi bật của MCRs là khả năng tiết kiệm thời gian và chi phí, đồng thời giảm thiểu các phản ứng phụ không mong muốn. Các phản ứng như phản ứng Strecker, Ugi và Gewald đã được nghiên cứu và áp dụng để tổng hợp các dẫn xuất 2-pyrrolidinone, mở ra nhiều hướng đi mới trong nghiên cứu hóa học.

2.1. Lợi ích của phản ứng nhiều thành phần

Phản ứng nhiều thành phần mang lại nhiều lợi ích cho quá trình tổng hợp hóa học. Đầu tiên, phương pháp này giúp giảm thiểu số bước trong quy trình tổng hợp, từ đó tiết kiệm thời gian và chi phí. Thứ hai, MCRs cho phép tạo ra các hợp chất phức tạp từ các nguyên liệu đơn giản, giúp tăng cường tính đa dạng của các sản phẩm. Cuối cùng, phương pháp này thường sử dụng các nguyên liệu thân thiện với môi trường, góp phần vào sự phát triển bền vững trong hóa học. Việc áp dụng MCRs trong tổng hợp 2-pyrrolidinone và các dẫn xuất của nó đã chứng minh tính khả thi và hiệu quả của phương pháp này.

III. Đánh giá hoạt tính sinh học của các dẫn xuất 2 pyrrolidinone

Hoạt tính sinh học của các dẫn xuất 2-pyrrolidinone đã được đánh giá thông qua các thử nghiệm kháng khuẩn. Các dẫn xuất này đã cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn như Escherichia coli và Salmonella sp. Kết quả thử nghiệm cho thấy rằng một số dẫn xuất có hoạt tính kháng khuẩn mạnh, mở ra tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm. Việc đánh giá hoạt tính sinh học không chỉ giúp xác định hiệu quả của các dẫn xuất mà còn cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển các sản phẩm mới trong tương lai.

3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

Phương pháp khuếch tán đĩa thạch là một trong những phương pháp phổ biến được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các dẫn xuất 2-pyrrolidinone. Trong phương pháp này, các mẫu dẫn xuất được đặt trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn và quan sát sự hình thành vòng ức chế xung quanh mẫu. Đường kính vòng ức chế cho thấy mức độ hiệu quả của các dẫn xuất trong việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Kết quả từ các thử nghiệm này cung cấp thông tin quý giá cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm mới có khả năng kháng khuẩn cao.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1. SƠ LƯỢC VỀ 2-PYRROLIDINONE VÀ DẪN XUẤT CỦA NÓ 1. Sơ lược về 2-pyrrolidinone 1. Cấu tạo phân tử 2-pyrrolidinone là một loại hợp chất lactam có vòng 5 cạnh với bốn nguyên tử C và một dị tố N.

- CTPT : C4H7NO - Khối lượng phân tử : 85.11 g/mol - Tên gọi IUPAC : 2-pyrrolidin - Tên gọi khác : 2-pyrrolidone hoặc 2-pyrrolidinone [5], [21] Hình 1. Cấu trúc phân tử 2-pyrrolidinone 1. Tính chất - Tỷ trọng : 1.116 g/cm3 - Nhiệt độ sôi : 245°C - Nhiệt độ nóng chảy : 25°C - Chất lỏng không màu hoặc màu vàng, có mùi nhẹ, có độ tan thấp. - Là một dung môi phân cực được sử dụng khá rộng rãi.

Điều chế Trong công nghiệp, 2-pyrrolidinone được tạo thành qua 4 giai đoạn: acetylene tác dụng với formaldehyde tạo ra 2-butyne-1,4-diol; sau đó hiđro hóa sản phẩm thu được 1,4-butanediol; chất này được chuyển thành -butyrolactone và cuối cùng phản ứng với ammonia để thu 2-pyrrolidinone [6]. Luan van 5 Ngoài ra, 2-pyrrolidinone còn có thể được điều chế bằng phản ứng hiđro hóa succinimide với sự có mặt của ammonia nhằm ổn định succinimide và ức chế các phản ứng phụ [6]. Một số dẫn xuất của 2-pyrrolidinone Dẫn xuất của 2-pyrrolidinone là những hợp chất quan trọng được tìm thấy trong nhiều loại dược phẩm (Hình 1. Một số dẫn xuất của 2-pyrrolidinone trong dược phẩm Luan van 6 Bảng 1.

Một số dẫn xuất của 2-pyrrolidinone trong dược phẩm CTPT Tên IUPAC Ứng dụng Cotinine, một alkaloid có trong thuốc lá, là chất chuyển hóa chủ yếu (S)-1-methyl-5- Cotinine C10H12N2O thành nicotine [7]. Doxapram kích thích sự gia tăng 1-ethyl-4-(2- khối lượng hồng cầu và tỷ lệ hô morpholin-4- Doxapram C24H30N2O2 hấp. Doxapram hydrochloride ethyl)-3,3- (2) [23] (được tạo thành từ doxapram) là diphenylpyrrolidi chất kích thích đường hô hấp, none-2 [23] tiêm tĩnh mạch [8]. dione [26] Bên cạnh đó, một vài sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên chứa 2- pyrrolidinone mang hoạt tính sinh học mạnh (Hình 1.

Luan van 7 Hình 1. Một số hợp chất chứa 2-pyrrolidinone có nguồn gốc thiên nhiên Lactacystin (5) là một hợp chất hữu cơ tự nhiên được tổng hợp do vi khuẩn thuộc giống Streptomyces [10]. 2-pyrrolidinone và các dẫn xuất của nó còn có nhiều ứng dụng quan trọng khác như tác nhân chống ung thư, chất ức chế integrase, chống vi khuẩn và kháng viêm … [13]. PHẢN ỨNG NHIỀU THÀNH PHẦN 1.

Sơ lược về phản ứng nhiều thành phần Phản ứng nhiều thành phần (MCRs) đã được biết đến hơn 150 năm trước. Phản ứng đầu tiên là sự tổng hợp α-amino cyanides của Strecker vào năm 1850. Tuy nhiên, ở thời điểm này, phản ứng nhiều thành phần ít thu hút sự chú ý của các nhà hóa học. Sự phổ biến của nó chỉ tăng lên nhanh chóng từ năm 1959, sau sự xuất hiện của phản ứng bốn thành phần (giữa ketone hoặc aldehyde với amine, isocyanide và acid carboxylic để hình thành bis-amide) được thực hiện bởi Ugi và các đồng nghiệp.

Từ đây, MCRs được áp dụng rộng rãi trong tổng hợp hữu cơ, đặc Luan van 8 biệt là với những chất có hoạt tính sinh học và những phân tử có nhóm chức [14], [15], [18]. Phản ứng nhiều thành phần là loại phản ứng hóa học, trong đó ba hay nhiều chất ban đầu phản ứng với nhau để tạo thành sản phẩm. Phản ứng phụ thuộc vào các điều kiện: dung môi, nhiệt độ, chất xúc tác và nồng độ các chất ban đầu [14]. Trong quá trình này, những phân tử mục tiêu có độ chọn lọc cao sẽ được tổng hợp và tinh chế nhằm tạo các hợp chất có tính ứng dụng.

Một số thuận lợi của phản ứng nhiều thành phần là cách tiến hành thí nghiệm đơn giản, sử dụng nguyên liệu giá thành thấp, khá phổ biến và thân thiện với môi trường. Ngoài ra, phản ứng này cho phép sự thay đổi có hệ thống và có khả năng tự động hóa. Với tất cả các lý do trên, phản ứng nhiều thành phần nhanh chóng trở thành một trong những con đường tổng hợp lý tưởng trong hóa học hữu cơ và hóa dược [4], [16]. Sơ đồ minh họa phản ứng nhiều thành phần 1.

Một số phản ứng nhiều thành phần 1. Phản ứng Strecker [17] Đây là phản ứng tổng hợp amino acid từ aldehyde hoặc ketone, được tìm ra bởi nhà hóa học người Đức Adolph Strecker. Phản ứng Strecker tổng quát đầu tiên Luan van 9 Hình 1. Cơ chế phản ứng Strecker 1.

Phản ứng Ugi [18] Phản ứng Ugi là một phản ứng đa thành phần giữa aldehyde hoặc ketone với amine, isocyanide và acid carboxylic để tạo thành một bis amide. Phản ứng Ugi tổng quát Hình 1. Cơ chế phản ứng Ugi Luan van 10 1. Phản ứng Gewald [19] Đây là phản ứng giữa một ketone và α-cyanoeste với xúc tác lưu huỳnh trong môi trường base để tạo thành một 2-amino-thiophene.

Phản ứng Gewald tổng quát Hình 1. Cơ chế phản ứng Gewald Luan van 11 CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 2. Dụng cụ - Bình cầu 25ml, bình cầu 15ml, phễu chiết, phễu lọc.

- Các pipet loại 5ml và 1ml. - Nhiệt kế, ống sinh hàn, giấy lọc. - Cốc thủy tinh 100ml, 500ml. Thiết bị - Máy khuấy từ gia nhiệt, máy cô quay chân không, máy đo nhiệt độ nóng chảy.

- Máy đo phổ NMR, IR, MS. - Cân phân tích. Hóa chất Các hóa chất của hãng Merck (Đức) được sử dụng gồm: - Benzylamine - Aniline - Diethyl acetylenedicarboxylate - Benzaldehyde - p-Tolualdehyde - Acid citric - Acid acetic - Acid formic - Ethanol - n-Hexane - Ethyl acetate - Dimethyl sulfoxide - Sodium chloride Các hóa chất Trung Quốc được sử dụng gồm: cao nấm men, peptone. Hóa chất Việt Nam: agar.

QUY TRÌNH TỔNG HỢP Hỗn hợp gồm amine (1 mmol), aldehyde (1 mmol) và acid citric (2 mmol) trong ethanol (dung môi) được cho vào bình cầu và tiến hành khuấy từ trong 15 phút. Sau đó, diethyl acetylenedicarboxylate (1 mmol) được thêm vào, khuấy hỗn hợp ở nhiệt độ phòng. Kiểm tra quá trình phản ứng bằng sắc ký bản mỏng với dung môi n-hexane : ethyl acetate = 5 : 3. Sau khi phản ứng kết thúc, lọc lấy chất rắn và kết tinh lại trong dung môi ethanol nóng (80°C) [4].

Phản ứng tổng quát điều chế dẫn xuất 2-pyrrolidinone Hình 2. Cơ chế phản ứng tạo dẫn xuất 2-pyrrolidinone bằng MCRs [4] 2. KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG Để tìm điều kiện tối ưu cho quá trình tổng hợp các dẫn xuất của 2- pyrrolidinone bằng phản ứng nhiều thành phần, các yếu tố như thời gian phản ứng, thể tích dung môi, nhiệt độ phản ứng, thay đổi acid sẽ được khảo sát. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng và thể tích dung môi Tiến hành thí nghiệm: aniline (0.09 ml, 1 mmol), benzaldehyde (0.10 ml, 1 mmol), acid citric (0.42 g, 2 mmol) và diethyl acetylenedicarboxylate (0.16 ml, 1 mmol) được phản ứng trong dung môi ethanol ở nhiệt độ phòng trong những khoảng thời gian và thể tích dung môi khác nhau để so sánh hiệu suất phản ứng (Bảng 2.

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng và thể tích dung môi STT Thể tích dung môi, ml Thời gian phản ứng, giờ 1 2 8 2 2 10 3 2 14 4 4 10 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng Tiến hành thí nghiệm: aniline (0.09 ml, 1 mmol), benzaldehyde (0.10 ml, 1 mmol), acid citric (0.42 g, 2 mmol) và diethyl acetylenedicarboxylate (0.16 ml, 1 mmol) được phản ứng trong 2 ml ethanol trong 10 giờ lần lượt tại nhiệt độ phòng, 40°C và 60°C. Phản ứng giữa anilin và benzaldehyde ở 60°C 2. Ảnh hưởng của độ mạnh acid Tiến hành thí nghiệm: aniline (0.09 ml, 1 mmol), benzaldehyde (0.10 ml, 1 mmol) và diethyl acetylenedicarboxylate (0.16 ml, 1 mmol) được phản ứng trong 2 ml ethanol ở nhiệt độ phòng lần lượt với acid citric, acid acetic và acid formic làm chất xúc tác.

TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN XUẤT 2-PYRROLIDINONE Sau khi đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp dẫn xuất 2- pyrrolidinone bằng phản ứng nhiều thành phần, một số dẫn xuất 2-pyrrolidinone đã được điều chế dựa vào qui trình tối ưu nhất. Tổng hợp dẫn xuất 2-pyrrolidinone từ benzaldehyde và aniline Lần lượt cho vào bình cầu 2 ml ethanol, 0.42 gam (2 mmol) acid citric và khuấy hỗn hợp ở nhiệt độ phòng. Kiểm tra quá trình tạo imine bằng sắc ký bản mỏng. Khi đã có sự hình thành imine, cho vào hỗn hợp 0.16 ml (1 mmol) diethyl acetylenedicarboxylate.

Quá trình phản ứng được kiểm tra bởi sắc ký bản mỏng với hệ dung môi n-hexane : ethylacetate = 5 : 3. Sau khi phản ứng kết thúc, lọc lấy chất rắn và kết tinh lại trong ethanol ở 80°C [4]. Ethanol, benzaldehyde, Khuấy Kiểm tra TLC Khuấy Thêm diethyl aniline, acid citric (tạo imine) acetylenedicarboxylat e Khuấy Kết tinh lại sản phẩm Lọc sản phẩm, rửa Kết thúc phản ứng trong ethanol (80°C) bằng ethanol lạnh Cô quay Sản phẩm tinh khiết 2. Tổng hợp dẫn xuất 2-pyrrolidinone từ benzaldehyde và benzylamine Lần lượt cho vào bình cầu 2 ml ethanol, 0.42 gam (2 mmol) acid citric và khuấy hỗn hợp ở nhiệt độ phòng.

Kiểm tra quá trình tạo imine bằng sắc ký bản mỏng. Khi đã có sự hình thành imine, cho vào hỗn hợp 0.16 ml (1 mmol) diethyl acetylenedicarboxylate. Quá trình phản ứng được kiểm tra bởi sắc ký bản mỏng với hệ dung môi n-hexane : ethylacetate = 5 : 3. Sau khi phản ứng kết thúc, lọc lấy chất rắn và kết tinh lại trong ethanol ở 80°C [4].

Luan van 15 Ethanol, benzaldehyde, Khuấy Kiểm tra TLC Khuấy Thêm diethyl benzylamine, acid citric (tạo imine) acetylenedicarboxylat e Khuấy Kết tinh lại sản phẩm Lọc sản phẩm, rửa Kết thúc phản ứng trong ethanol (80°C) bằng ethanol lạnh Cô quay Sản phẩm tinh khiết 2. Tổng hợp dẫn xuất 2-pyrrolidinone từ p-tolualdehyde và aniline Lần lượt cho vào bình cầu 2 ml ethanol, 0.42 gam (2 mmol) acid citric và khuấy hỗn hợp ở nhiệt độ phòng. Kiểm tra quá trình tạo imine bằng sắc ký bản mỏng. Khi đã có sự hình thành imine, cho vào hỗn hợp 0.16 ml (1 mmol) diethyl acetylenedicarboxylate.

Quá trình phản ứng được kiểm tra bởi sắc ký bản mỏng với hệ dung môi n-hexane : ethylacetate = 5 : 3. Sau khi phản ứng kết thúc, lọc lấy chất rắn và kết tinh lại trong ethanol ở 80°C [4]. Ethanol, p-tolualdehyde, Khuấy Kiểm tra TLC Khuấy Thêm diethyl aniline, acid citric (tạo imine) acetylenedicarboxylat e Khuấy Kết tinh lại sản phẩm Lọc sản phẩm, rửa Kết thúc phản ứng trong ethanol (80°C) bằng ethanol lạnh Cô quay Sản phẩm tinh khiết 2. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DẪN XUẤT 2- PYRROLIDINONE ĐÃ TỔNG HỢP Chuẩn bị các dung dịch vi sinh: - Dịch khuẩn: hòa tan 5 gam cao nấm men, 5 gam NaCl và 10 gam peptone vào 1 lít nước cất, chuẩn độ pH = 7; sau đó cấy vi khuẩn và hoạt hóa trong 24 giờ.