MỞ ĐẦU Fluoroquilone là mô ̣t trong nhƣ̃ng nhóm kháng sinh tổ ng hơ ̣p hoá ho ̣c , có tác dụng diệt khuẩn rộng hiệu quả, có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn một cách nhanh chóng nên kháng sinh nhóm Fluoroquilone ngày càng đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng nhiề u trong phòng và điều trị bệnh trong chăn nuôi và thuỷ sản. Trƣớc thực trạng nguy cơ và kiểm soát dịch bệnh chƣa thật nghiêm ngặt, dƣ lƣợng của loại kháng sinh này thƣờng tìm thấy trong nhiều sản phẩm nông nghiệp nhƣ thịt, cá, trứng, sữa,.Trong quá trình nuôi dƣỡng, nếu không tuân thủ về thời gian dùng thuốc và thời gian sản xuất hoặc chế biến thì sẽ dẫn đến lƣợng Fluoroquilone còn lại trong thịt, sữa, gia cầm và thủy sản.Việc lạm dụng kháng sinh Fluoroquilone trong phòng bệnh, điều trị, kích thích sinh trƣởng hay bảo quản đối với ngành chăn nuôi dẫn đến sự tồn dƣ kháng sinh trong chăn nuôi, vì thế ảnh hƣởng nghiêm trọng đến môi trƣờng và sức khoẻ ngƣời tiêu dùng. Điều này gây nhiều mối nguy hiểm, hiện tƣợng kháng thuốc của một số vi khuẩn nhƣ: Salmonella, Campylobaccer spp, Escherichia coli,…hậu quả là giảm hiệu quả của kháng sinh nói chung, kháng sinh dòng Fluoroquilone nói riêng đối với các chủng vi khuẩn. Để bảo vệ ngƣời tiêu dùng ở châu Âu, tổ chức EU đã thiết lập giới hạn lớn nhất (MRLs) đối với dƣ lƣợng thuốc kháng sinh trong nguồn thực phẩm khi cung cấp cho con ngƣời vào năm 1990.
Theo sự kiểm tra và định lƣợng của các chuyên gia phòng thí nghiệm, EU đã công bố “Council directive 96/23/EU in 1996” [12], trong đó quy định rõ hàm lƣợng kháng sinh theo từng loại thực phẩm và từng loại thuốc, ví dụ nhƣ với Enrofloxacin trong cơ, gan, thận của bò, lợn, gia cầm (gà, vịt) là 30 µg/kg; trong sữa bò là 100 µg/kg; Ở châu Âu, Hoa kỳ và các nƣớc Bắc Mỹ đã cấm sử dụng kháng sinh họ Fluoroquinolon. Tồ n dƣ kháng sinh trong thƣ̣c phẩ m ảnh hƣởng xấ u đế n sƣ́c khoẻ cô ̣ng đồ ng và môi trƣờng. Đây là mô ̣t trong nhƣ̃ng nguyên nhân gây nên các bê ̣nh nan y , tăng nguy cơ di ̣ƣ́ng, tăng khả năng xuấ t hiê ̣n cá c nguồ n gen kháng thuố c ở các chủng vi Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn c 7 sinh vâ ̣t gây bê ̣nh. Viê ̣c tồ n dƣ kháng sinh trong thƣ̣c phẩ m (thịt, thuỷ hải sản , trƣ́ng, sƣ̃a,…) là rất phổ biến ở nƣớc ta.
Tình trạng trên không chỉ gây thiệt hại lớn về kinh tế mà quan trọng hơn là ảnh hƣởng đến uy tín các sản phẩ m nông nghiê ̣p nƣớc ta, ảnh hƣởng nghiêm trọng đế n sƣ́c khoẻ con ngƣời và môi trƣờng. Đã nhiều phƣơng pháp phân tích đƣợc nghiên cứu nhằm phát hiện dƣ lƣợng kháng sinh Fluoroquilone trong thực phẩm nhƣ HPLC, LC-MS, GC-MS, … với độ chính xác cao, bên cạnh các đặc điểm ƣu việt, phƣơng pháp trên yêu cầu cao về thiết bị, hóa chất, trình độ sử dụng. ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) là phƣơng pháp miễn dịch dựa trên phản ứng đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể đã có ứng dụng nhiều trong xác định dƣ lƣợng kháng sinh trong thực phẩm, môi trƣờng, y học… Mục đích của nghiên cứu này là dựa trên các kết quả nghiên cứu đã có chúng tôi xây dƣ̣ng phƣơng pháp ELISA gián tiế p xác đinh ̣ dƣ lƣơ ̣ng kháng sinh Levofloxacin trong sƣ̃a ở điề u kiê ̣n phòng thí nghiê ̣m. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn c 8 CHƢƠNG I.
TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 1. Kháng sinh nhóm Fluoroquilone 1. Nguồn gốc và sự phát triển của kháng sinh nhóm Fluoroquilone Quinolone (Flumequin, Norfloxacin, Enrofloxacin, Ciprofloxacin, Difloxacin, Marbofloxacin, Ofloxacin.) là nhóm kháng sinh nhân tạo gồm những dẫn xuất của quinolein. Quinolone đầu tiên (acid nalidixic) có phổ kháng khuẩn hẹp (tác dụng trên vi khuẩn Gram âm).
Kháng sinh đầu tiên trong nhóm là acid nalidixic đƣợc phát hiện vào năm 1962, đƣợc phân lập nhƣ một tạp chất trong sản xuất quinine sau đó một loạt các quinolon thế hệ I đƣợc tổng hợp nhƣ cinoxacin, oxolinic, pipermidic…Trong cấu trúc không gian không có nhân piperidin và không có nguyên tử Flour. Quinolon thế hệ I có phổ tác dụng hẹp, chỉ tác dụng trên vi khuẩn gram âm (trừ Pseudomonas aeruginosa) [1,10]. Hiện nay quinolon thế hệ I nhanh chóng bị kháng thuốc nên hạn chế đƣợc sử dụng [11]. Quinolone đƣợc fluor hóa gọi là Fluoroquinolone đã đƣợc đƣa vào sử dụng trong lâm sàng vào những năm 1970.
Fluoroquinolone có phổ kháng khuẩn rộng, tác dụng trên cả vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng. Kháng sinh nhóm này phân bố đồng đều cả trong dịch nội và ngoại bào, phân bố hầu hết các cơ quan: Phổi, gan, mật, xƣơng, tiền liệt tuyến, tử cung, dịch não tủy. và qua đƣợc hàng rào nhau thai. Fluoroquinolone bài thải chủ yếu qua đƣờng tiết niệu ở dạng còn nguyên hoạt chất và tái hấp thu thụ động ở thận.
Phân loại và cơ chế tác dụng Fluoroquilone là gốc thuốc kháng sinh hiệu quả, phổ rộng đƣợc sử dụng nhiều và phổ biến cả ở ngƣời và động vật (trong chăn nuôi gia súc, gia cầm và thủy sản…). Tuy nhiên tác dụng phụ của chúng đã đƣợc xác nhận. Sử dụng quá liều và Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn c 9 tồn dƣ các gốc thuốc này trong thực phẩm là vấn đề không chỉ ở nƣớc ta mà còn ở nhiều nƣớc trên thế giới. Fluroquinolone là một trong những nhóm kháng sinh tổng hợp hoá học có khả năng khuếch tán tốt trong mô bào, nhanh chóng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn thông qua sự ức chế tổng hợp ADN (Brown, 1996) do đó đƣợc sử dụng phổ biến và hiệu quả trong thú y.
Tuy nhiên, việc sử dụng nhóm kháng sinh này trong chăn nuôi thú y và thuỷ sản có tác dụng xấu đến môi trƣờng và sức khoẻ cộng đồng (WHO, 1998). Nhóm Fluroquinolones đƣợc sử dụng trong thú ý gồm các loại sau: Danofloxacin (Advocin, Advocid), Difloxacin (Dicural,Vetequinon), Enrofloxacin (Baytril), Ibafloxacin (Ibaflin), Marbofloxacin (Marbocyl, Zenequin), Orbifloxacin (Orbax, Victas), Sarafloxacin (Floxasol, Saraflox, Sarafin). Cấu trúc phân tử gốc Fluoroquinolone Công thức cấu tạo chung của nhóm quinolone là hợp chất vòng thơm có chứa N, vị trí thứ 4 có gắn nhóm ketone, vị trí thứ 3 có gắn nhóm carboxylic. Các dẫn xuất của quinolone gồm những hợp chất mà: Vị trí: Có gắn thêm nhóm alkyl hoặc aryl; Vị trí 6: Có thể gắn thêm F; vị trí 2,6,8 có thể gắn thêm một nguyên tử N [15].
Cơ chế tác động của Fluoroquinolone là ức chế tổng hợp acid nucleic. Gốc quinolone (acid nalidixic và các Fluoroquinolone) ức chế mạnh sự tổng hợp DNA trong giai đoạn nhân đôi do ức chế enzyme DNA gyrase. Cơ chế tác động này hiệu quả trên cả vi khuẩn gram dƣơng và gram âm. Các quinolon đều ức chế tổng hợp AND - gyrase, là enzym mở vòng xoắn AND, giúp cho sự sao chép và phiên mã, vì Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn c 10 vậy ngăn cản sự tổng hợp AND của vi khuẩn.
Ngoài ra còn tác dụng trên cả ARNm nên ức chế tổng hợp protein vi khuẩn. Các quinolon đều là kháng sinh diệt khuẩn [10]. Quinolon thế hệ 1: Acid nalidixic, acid oxolinic, cinocacin, flumequin, acid pipemidic, acid promidic…Quinolon thế hệ 1 chỉ ức chế AND- gyrase nên chỉ có tác dụng diệt vi khuẩn gram âm đƣờng tiết niệu và đƣờng tiêu hóa, không có tác dụng trên trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) [10,11]. Các Fluoroquinolon có tác dụng trên 2 enzym đích là AND gyrase và topoisomerase IV của vi khuẩn, nên phổ kháng khuẩn rộng hơn.
Hoạt tính kháng khuẩn mạnh so với quinolon thế hệ 1 từ 10 - 30 lần [10]. Phổ kháng khuẩn của các Fluoroquinolon gồm: E. coli, Salmonela, Shigella, Enterobacter, Neisseria spp, P. aeruginosa, Eterococi, Enterococcus faecalis, Klebsiella spp, Proteus mirabilis, Morganella morgani, Morganella catarrhalis, Haemophilus fluenzae, Bacteroides fragilis, Streptococus pneumonia, Streptococcus aureus kể cả loại đã kháng methicilin.
Các vi khuẩn trong tế bào cũng bị ức chế bởi nồng độ Fluoroquinolon trong huyết tƣơng nhƣ Chlamydia, Mycoplasma, Brucella, Mycobacterium [10]. Quinolon thế hệ 2: Rosoxacin, Norfloxacin, Lomefloxacin, Ofloxacin, Enrofloxacin, Ciprofloxacin, Enoxacin, có khác tƣơng đối về tác động gyrase và topoisomerase IV: Trên vi khuẩn gram âm hiệu lực kháng gyrase mạnh hơn, còn trên vi khuẩn gram dƣơng lại có hiệu lực kháng topoisomerase IV mạnh hơn thế hệ 1, đặc biệt là chúng có tác dụng trên Pseudomonas aeruginosa có tác dụng nhanh và mạnh hơn do khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn cao hơn. Ngoài gram âm chúng còn tác dụng trên cả gram dƣơng, trừ Pseudomonas aeruginosa [3,10,11]. Quinolon thế hệ 3: Amifloxacin, Levofloxacin, Lerofloxacin, Pefloxacin, Rufloxacin, Sparfloxacin, Temafloxacin, Tosufloxacin tác động cân bằng trên 2 enzym, vì vậy phổ kháng khuẩn phổ rộng trên gram dƣơng kể cả Streptococus pneuminiae nhƣng trên Pseudomonas aeruginosa tác dụng yếu hơn so với Ciprofloxacin.
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn c 11 Quinolon thế hệ 4: Moxifloxacin, Trovafloxacin, phổ tác dụng trên tất cả các loại vi khuẩn gram âm và gram dƣơng hiếu khí, trên Streptococus pneuminiae tác dụng gấp 10 lần so với Ciprofloxacin và mạnh gấp 2 lần so với Sparfloxacin [10], ngoài ra tất cả các kháng sinh trong nhóm còn có tác dụng trên vi khuẩn kỵ khí. Riêng moxifloxacin nhạy cảm trở lại với các vi khuẩn kháng với các kháng sinh nhóm quinolon [10,13,14]. Nhƣng cũng có thể do cơ chế ức chế tổng hợp acidnucleic này mà kháng sinh nhóm Fluoroquinolone đƣợc cho là có nguy cơ gây đột biến gene, gây sẩy thai khi sử dụng cho động vật mang thai và khuyến cáo là không nên sử dụng kháng sinh nhóm Fluoroquinolone cho động vật mang thai, động vật sinh sản và làm giống. Ngoài ra, sử dụng kháng sinh nhóm Fluoroquinolone có thể gây rối loạn phát triển xƣơng.
Nguyên nhân có thể do kháng sinh nhóm Fluoroquinolone có phản ứng các ion hóa trị II (Mg2+). Nghiên cứu của Jason et al. (2009) trên cừu non đã cho thấy kháng sinh nhóm Fluoroquinolone đã gây tác động lớn, làm cho hệ xƣơng, sụn hầu nhƣ không phát triển trong thời gian sử dụng kháng sinh nhóm này. Trƣớc đây, đã có các nghiên cứu về việc ảnh hƣởng đến sự phát triển xƣơng, sụn của thú non (chó, cừu) khi sử dụng kháng sinh nhóm Fluoroquinolone nhƣng do hiệu quả điều trị và mức độ cần thiết của các kháng sinh nhóm kháng sinh này mà ngƣời ta đã bỏ qua tác hại của nó.
Bên cạnh đó, sự tồn lƣu thời gian dài sau khi sử dụng thuốc kháng sinh nhóm Fluoroquinolone cũng là nguyên nhân dẫn đến việc hạn chế và cấm sử dụng những kháng sinh thuộc nhóm này. Cấu trúc, đặc điểm một số kháng sinh thuộc họ Fluoroquinolone - Danofloxacin: + Tên khoa học: (1S)-1-Cyclopropyl-6-fluoro-1,4-dihydro-7-(5-methyl-2,5- diazabicyclo[2.1]hept-2-yl)-4-oxo-3-quinoline cacboxylic axit methanesulphonate. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www. Cấu trúc phân tử Danofloxacin + Công thức phân tử: Danofloxacin - C19H20O3FN3 + Trọng lƣợng phân tử: 357,39 g/mol.