ĐẶT VẤN ĐỀ Cuộc sống thời hiện đại bận rộn, xã hội ngày càng phát triển, con người ta càng phải để ý tới sức khỏe bản thân. Việc chăm sóc cho sức khỏe bản thân ở mỗi người xuất phát ngay từ việc ăn uống, tiêu thụ, sử dụng các thực phẩm chất lượng, giàu dinh dưỡng và có nguồn gốc rõ ràng. Vì thế mà xu thế gần đây, việc lựa chọn bổ sung các loại hạt và sản phẩm từ hạt trong các bữa ăn hàng ngày như là hạt óc chó, hạt điều, hạt hạnh nhân, hạt bí, … càng trở nên phổ biến. Trong đó, hạt hạnh nhân đã được nhiều nghiên cứu chứng minh có nhiều tác dụng tới sức khỏe người dùng như tăng mức polyphenol và giảm đáng kể tác hại của quá trình oxy hóa tới cơ thể [40], cải thiện khả năng chống chọi với các bất thường liên quan đến hội chứng chuyển hóa [43], là thực phẩm hỗ trợ giảm cân [14], giúp làm tăng HDL cholesterol và cải thiện các dấu hiệu chuyển hóa lipid bất thường khác ở bệnh nhân Bệnh động mạch vành có cholesterol HDL ban đầu thấp [23].
Bên cạnh việc lựa chọn thực phẩm có nguồn gốc thiên nhiên, con người cũng có xu hướng sử dụng các nguồn nguyên liệu khác thay thế cho các nguyên liệu truyền thống. Bột hạnh nhân được cho rằng có nhiều lợi ích hơn bột mì truyền thống nên được sử dụng để thay thế cho nguyên liệu làm bánh. Tuy nhiên, trong hạnh nhân và các nguyên liệu từ hạnh nhân có chứa amygdalin – một cyanogenic glycoside. Khi vào đường tiêu hóa chất này sẽ được thủy phân tạo thành acid hydrocyanic, từ đấy dẫn đến ngộ độc cyanid.
Ngộ độc cyanid nhẹ khiến người bệnh từ buồn nôn, chóng mặt, ở mức độ nặng hơn có thể là co giật, tím, hôn mê sâu. Do vậy, người tiêu dùng hoàn toàn có nhiều nguy cơ tiếp xúc với amygdalin trong thực phẩm. Tuy có thể không bị gây ngộ độc cyanid cấp tính nhưng sử dụng dài ngày, thường xuyên cũng có thể làm người dùng bị nhiễm độc cyanid mạn tính. Hiện nay, Bộ Y tế chưa có những khuyến cáo về hàm lượng tối đa hàng ngày nên tiêu thụ với amygdalin trong thực phẩm và ở Việt Nam cũng chưa có phương pháp xác định amygdalin trong thực phẩm.
Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng amygdalin trong thực phẩm” nhằm xác định amygdalin và đánh giá nguy cơ tới sức khỏe. Mục tiêu mà đề tài nhắm tới: 1. Xây dựng phương pháp xác định amygdalin sử dụng kỹ thuật LC –MS/MS. Ứng dụng phương pháp để xác định amygdalin trong mẫu mua trên thị trường.
Giới thiệu về amygdalin 1. Giới thiệu chung Amygdalin là một trong những chất phổ biến nhất của nhóm cyanogenic glycosid. Cynogenic glycosid được định nghĩa là glycosid của các α-hydronitril. Trong tự nhiên, nhóm chất này được cho là có vai trò là một chất độc tự nhiên có khả năng tạo ra acid hydrocyanic, do đó bảo vệ thực vật chống lại côn trùng và động vật ăn cỏ [18].
Amygdalin được phân bố rộng rãi ở thực vật, có hàm lượng trong hạt của cây thuộc họ Rosacease đặc biệt là chi Prunus như là hạnh nhân, đào, mơ, anh đào, đào, lê, mận; các bộ phận ăn được của cây sắn[42] và còn được phát hiện trong quả chanh dây (loài Passiflora ) [11]. Amygdalin có công thức phân tử là C20H27NO11, công thức cấu tạo như hình 1.1, khối lượng mol là 457,431 g/mol. Amygdalin tan tốt trong nước nóng và cồn nóng, hòa tan nhẹ trong cồn, không tan trong ether và cloroform, nhiệt độ nóng chảy là 223 – 226oC. Amygdalin gồm một đơn vị acid hydrocyanic (HCN), một đơn vị benzaldehyd và hai đơn vị glucose.
Amygdalin hay còn có danh pháp là D-mandelonitril-β-D-gentiobiosid, được phân lập lần đầu tiên vào năm 1830 [6] bởi các nhà hóa sinh người Pháp Robiquet và Boutron – Chalard và được nghiên cứu chi tiết bởi nhà hóa học người Đức Emil Fisher. Vào năm 1920,tiến sĩ Ernst T., cho rằng amygdalin có thể là một loại thuốc hiệu quả chống lại bệnh ung thư, nhưng quá độc đối với con người. Bất chấp tuyên bố này, vào năm 1952, con trai ông đã tổng hợp một dẫn xuất amygdalin ít có hại hơn với một tiểu đơn vị của glucose và đặt tên là laetril [41]. Hỗn hợp của amygdalin và dạng biến đổi của nó được Krebs mô tả là “vitamin B17” [9] mặc dù thực chất cả amygdalin và laetril đều không phải là vitamin.
Cấu trúc hóa học của amygdalin Với các thí nghiệm trên tế bào in vitro, amygdalin đã được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học như ức chế xơ hóa thận , ức chế hình thành mạch , điều hòa nội tiết , 2 điều hòa miễn dịch , tác dụng bảo vệ dạ dày, chống xơ vữa động mạch, bảo vệ và sinh thần kinh[5], [12], [25], [20], [21], [29],[30]. Độc tính của amygdalin Trên thế giới đã cũng có những báo cáo về trường hợp sử dụng quá nhiều sản phẩm chứa amygdalin, dẫn đến ngộ độc cyanid. Rubino và Davidoff đã báo cáo về trường hợp một người phụ nữ 49 tuổi ngộ độc cyanid sau khi ăn 20 – 40 hạt mơ vào năm 1979 [34]. Đây được coi là trường hợp đầu tiên được báo cáo trong y văn.
Trong báo cáo, bênh nhận có triệu chứng nhức đầu, suy nhược, buồn nôn, nôn mửa và mất phương hướng trong vòng nửa giờ sau khi ăn và được điều trị thành công bằng amyl nitrite, natri nitrit và natri thiosulfat. Báo cáo kết thúc với cảnh báo về việc tiêu thụ và tiếp thị những loại thực phẩm chứa cyanogenic glycosid để ngăn ngừa những trường hợp ngộ độc, nhưng dù thế thì hạt mơ vẫn được bán trên thì trường vì những tác dụng được cho là có lợi cho sức khỏe [26]. Khoảng 20 năm sau đó, vào năm 1998 , Suchard và đồng nghiệp đã công bố báo cáo về trường hợp thứ hai [38]. Bệnh nhân là một phụ nữ 41 tuổi có các triệu chứng gần như tương tự sau khi ăn 30 hạt mơ.
Những năm gần đây cũng đã có thêm nhiều những báo cáo về những trường hợp ngộ độc cyanid do sử dụng sản phẩm chứa amygdalin (Bảng 1. Một số báo cáo về ngộ độc cyanide do sử dụng sản phẩm chứa amygdalin Bệnh nhân Sản phẩm chứa Biểu hiện TLTK Amygdalin Nữ - 73 tuổi 1500 mg – 3 viên Thay đổi trạng thái tâm thần, toát mồ [13] (2017) nén amygdalin hôi, nhịp tim nhanh, nôn, chóng mặt, (vitamin B17 500 đau bụng quặn thắt, mg ) Nữ - 80 tuổi 300 mL dịch chiết Khó thở, chóng mặt và nôn mửa [15] (2018) bao gồm hạt mơ xay Nữ - 60 tuổi 10 – 15 hạt mơ Nôn mửa, đau đầu và giảm mức độ ý [38] (2016) thức Trẻ em – 4 15 – 20 hạt mơ Nôn mửa, bất tỉnh, thang điểm hôn [16] tuổi (2019) mê Glasgow nhi khoa là 8 Trẻ em – 4 500 mg Tiêu chảy, hơi thở gấp gáp, nồng độ [35] tuổi (2015) cyanid huyết tương là 515μg/L 3 Sinh tổng hợp amygdalin bắt đầu bằng chuyển đổi L – phenylalanin thành mandelonitril được xúc tác bởi cytochrom P450 và CYP71AN24. Nhờ tác động của UDP glucosyltransferase, mandelonitril được chuyển thành prunasin. Glucosyl- transferase xúc tác quá trình chuyển đổi prunasin thành amygdalin [24].
Amygdalin không gây độc khi còn nguyên vẹn, nhưng có thể bị phân giải trong ruột non và gây ngộ độc cho người sử dụng. β – glucosidase được lưu trữ trong các khoang tế bào thực vật cũng có trong ruột non của con người [37] và phân giải amygdalin thành prunasin, mandelonitril, glucose, benzaldehyd và acid hydrocyanic (HCN). HCN, benzaldehyd, prunasin và mandelonitril có thể hấp thu vào bạch huyết và tuần hoàn cửa [10]. Ở người, HCN được hình thành do hệ vi khuẩn đường ruột có khả năng sản xuất β-glycosidase trong đường viền bàn chải của ruột non[24].
Khi được hấp thu, cyanid nhanh chóng được máu phân bố toàn cơ thể. Ở người, cyanid được giải độc chủ yếu qua trans-sulfuration để tạo thành thiocyanat nhưng cũng có thể được giải độc bằng phản ứng với hydroxycobalamin (Vitamin B12 ) để tạo thành cyanocobalamin. Thyocyant được thanh thải qua thận với thời gian khoảng 2,7 ngày với chức năng thận bình thường. Uống 500 mg amygdalin thì có thể thủy phân ra tới 30 mg cyanid [31].
Amygdalin đường uống được đánh giá có tác dụng mạnh hơn 40 lần so với dạng tiêm tĩnh mạch do sự chuyển hóa thành hydrogen cyanid bằng enzyme trong đường tiêu hóa [37]. Độc tính của cyanid gây tử vong cao do cản trở việc sử dụng oxy của ty thể dẫn đến chết tế bào, cyanid liên kết với ion sắt trên cytochrom oxidase và làm ngưng đột ngột chuỗi vận chuyển điện tử và chuyển hóa oxy hóa, dẫn đến thiếu oxy tế bào và nhiễm acid lactic. Sự hình thành HCN từ Amygdalin [24] Liều gây độc của acid hydrocyanic giải phóng từ thủy phân cyanogenic glycosid bằng enzyme trong tế bào thực vật được định nghĩa là liều vượt quá 20 mg acid hydrocyanic mỗi 100 g trọng lượng cơ thể [24]. Việc ăn quá nhiều hạt chứa cyanogenic glycosid có thể dẫn đến những tác hại đến cơ thể.
Trong trường hợp nhiễm độc cyanid nhẹ đến trung bình, triệu chứng có thể bao gồm nhịp tim nhanh, lú lẫn, buồn nôn, suy nhược. Các trường hợp nặng có thể là tím tái, hôn mê, co giật, rối loạn nhịp tim, ngừng tim và có thể là tử vong[28]. Liều gây tử vong ở người của amygdalin khi tiêm tĩnh mach là 5 g [33]. Người ta tin rằng việc ăn 50 hạt hạnh nhân đắng trong một thời gian 4 ngắn có thể là liều lượng gây tử vong đối với người lớn và liều lượng 5 đến 10 hạt hạnh nhân đắng có thể gây tử vong ở trẻ em.
Liều gây tử vong ở người lớn được ước tính là từ 0,5 – 3,5 mg/kg cân nặng [17]. Ngộ độc cyanid mãn tính sau khi ăn các loại thực vật chứa cyanogenic glycosid lâu ngày dẫn đến bệnh thần kinh và bệnh tủy, bao gồm Konzo, một bệnh lý tủy nhiệt đới cụ thể được quan sát thấy ở những quần thể ăn nhiều sắn, có chứa linamarin, một cyanogenic glycosid được chuyển hóa thành prunasin và sau đó thành HCN (HSDB 2017, COT 2006 ). Bệnh bướu cổ cũng có liên quan đến việc ăn các thực vật chứa cyanogenic glycosid dài ngày, vì thiocyanate cản trở sự hấp thu iod ở tuyến giáp (Speijers 1993 ). Tuy nhiên, những quần thể ăn nhiều thực vật chứa cyanogenic glycosid này cũng có tỷ lệ suy dinh dưỡng ca.
Sự thiếu hụt dinh dưỡng, đặc biệt là methionin và riboflavin, iod, kết hợp với phơi nhiễm cyanid mãn tính, có liên quan đến nguyên nhân của bệnh thần kinh, bệnh lý tủy và bệnh bướu cổ (Speijers 1993) [45].Việc sử dụng những sản phẩm chứa cynogenic glycosid, cụ thể ở đây là amygdalin với liệu lượng không phù hợp hoàn toàn có thể đem lại hậu quả đáng tiếc.