Phân tích Định lượng Biểu hiện Gen Đáp ứng với Thay đổi Môi trường Vi mô Động

Luận án tiến sĩ phân tích định lượng biểu hiện gen đáp ứng với thay đổi môi trường vi mô động. Nghiên cứu chuyên sâu về sinh học và kỹ thuật sinh học.

• Tác giả: Wyming Lee Pang
• Người hướng dẫn: Professor Hasty, Chair
• Trường học: University Of California, San Diego
• Chuyên ngành: Bioengineering
• Đề tài: Quantitative Analysis Of Genetic Expression Responses To Dynamic Microenvironmental Perturbation
• Loại tài liệu: Dissertation
• Năm xuất bản: 2007
• Địa điểm: Ann Arbor

Tóm tắt

I. Tổng Quan Phân Tích Biểu Hiện Gen và Môi Trường Vi Mô

Các môi trường động rất phổ biến trong thế giới tự nhiên. Từ sự dao động của các nguồn dinh dưỡng kiểm soát quá trình trao đổi chất đến chu kỳ bức xạ điều khiển nhịp sinh học, và sự tái tạo cơ học của hệ mạch. Các hệ thống điều chỉnh có nhiệm vụ kiểm soát hành vi được điều chỉnh một cách linh hoạt để đáp ứng các điều kiện biến đổi như vậy một cách mạnh mẽ và thích hợp, bất chấp các nhiễu loạn tiềm ẩn. Việc cung cấp phân tích định lượng và tự nhiên nâng cao về hành vi các biểu hiện gen trong các nhiễu loạn động lực cao là rất quan trọng. Phần lớn xuất phát từ công nghệ cho phép điều này. Tuy nhiên, những tiến bộ trong các thiết bị vi lỏng được thiết kế để giải quyết các câu hỏi liên quan đến sinh học đầy hứa hẹn. Hơn nữa, kiến thức mới được khám phá gần đây về quá trình trao đổi chất và các con đường, có thể là các hệ thống nhớ cơ bản, củng cố nhu cầu kiểm tra sự điều chỉnh gen trong quá trình kích thích phức tạp và năng động.

1.1. Tầm quan trọng của Phân Tích Biểu Hiện Gen Định Lượng

Phân tích biểu hiện gen định lượng giúp chúng ta hiểu rõ hơn về cách tế bào phản ứng với các thay đổi trong môi trường vi mô. Việc đo lường chính xác mức độ biểu hiện gen cho phép xác định các gen quan trọng trong quá trình đáp ứng stress môi trường và thích nghi của tế bào. Phương pháp này rất quan trọng để khám phá các cơ chế điều hòa gen phức tạp. Một ví dụ trong tài liệu gốc là khám phá ra việc ghép nối giữa chuyển hóa galactose và glucose mang lại phản ứng mạnh mẽ trên toàn cầu, bất chấp sự suy giảm galactose. Điều này nhấn mạnh cả hình thức thiết bị vi lỏng sinh học định lượng và tầm quan trọng của các nghiên cứu được thực hiện trong môi trường tự nhiên hơn để đạt được sự hiểu biết chi tiết hơn về cách thức hoạt động của các hệ gen.

1.2. Môi Trường Vi Mô Động Thách Thức và Cơ Hội Nghiên Cứu

Môi trường vi mô động (Dynamic Microenvironment) tạo ra những thách thức độc đáo cho tế bào, đòi hỏi sự điều chỉnh liên tục để duy trì sự sống và chức năng. Các yếu tố như nồng độ oxy, pH, và áp lực cơ học có thể thay đổi nhanh chóng, ảnh hưởng đến biểu hiện gen và signal transduction. Nghiên cứu về môi trường vi mô đòi hỏi các công cụ và phương pháp phân tích phức tạp, bao gồm cả vi lỏng và phân tích định lượng biểu hiện gen. Thách thức là hiểu rõ cách các yếu tố môi trường tương tác với nhau và ảnh hưởng đến các con đường điều hòa gen. Việc này mở ra cơ hội để phát triển các liệu pháp điều trị mới nhắm vào các bệnh liên quan đến sự rối loạn chức năng của biểu hiện gen trong môi trường vi mô không ổn định.

II. Vấn Đề Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Thay Đổi Môi Trường Lên Gen

Mục tiêu chính của nghiên cứu này là phát triển một nền tảng để quan sát và thăm dò động lực học của các quần thể vi khuẩn mô hình. Các thiết bị được tạo ra duy trì các vi khuẩn trong điều kiện sinh trưởng, cũng như có được thời gian phân giải cao của biểu hiện gen trong thời gian dài. Hơn nữa, khả năng hình ảnh được kết hợp vào hệ thống vi lỏng để tạo ra dạng sóng nồng độ liên tục. Dạng vi lỏng sau đó được khám phá phản ứng động của con đường galactose trong các điều kiện dinh dưỡng dao động. Nghiên cứu thực nghiệm này cho thấy con đường cung cấp thông tin tần số thấp kết hợp với mô phỏng mô hình tính toán đã phát hiện ra sự kết hợp của quá trình trao đổi chất glucose cung cấp một phản ứng mạnh mẽ trên toàn cầu, bất chấp sự suy giảm galactose. Những điểm này nhấn mạnh cả hình thức thiết bị vi lỏng sinh học định lượng và tầm quan trọng của các nghiên cứu được thực hiện trong môi trường tự nhiên hơn để đạt được sự hiểu biết chi tiết hơn về cách thức hoạt động của các hệ gen.

2.1. Thách Thức Trong Phân Tích Biểu Hiện Gen Đáp Ứng Môi Trường Biến Động

Việc phân tích biểu hiện gen đáp ứng với thay đổi môi trường gặp nhiều thách thức do tính phức tạp và đa dạng của các yếu tố môi trường. Sự biến động trong môi trường vi mô có thể ảnh hưởng đến nhiều con đường gen khác nhau, làm cho việc xác định các gen và con đường quan trọng trở nên khó khăn. Ngoài ra, các kỹ thuật phân tích truyền thống thường không đủ nhạy để phát hiện các thay đổi nhỏ trong biểu hiện gen, đặc biệt là trong các điều kiện môi trường thay đổi nhanh chóng.

2.2. Các yếu tố Môi Trường Vi Mô Động Ảnh Hưởng Đến Biểu Hiện Gen

Nhiều yếu tố môi trường vi mô có thể ảnh hưởng đến biểu hiện gen, bao gồm nồng độ oxy, pH, nhiệt độ, và sự hiện diện của các chất dinh dưỡng hoặc chất độc. Các yếu tố này có thể tác động lên các con đường tín hiệu tế bào, dẫn đến thay đổi trong hoạt động của các yếu tố phiên mã và biểu hiện gen. Hiểu rõ tác động của từng yếu tố và sự tương tác giữa chúng là rất quan trọng để giải mã các cơ chế điều hòa gen trong môi trường vi mô động.

III. Phương Pháp Phân Tích Định Lượng Biểu Hiện Gen bằng RNA Seq

Các hệ thống mô hình cũng giống như cách chúng lấy cảm hứng từ những gì đã trải qua, những tiến bộ tiếp tục về sinh học định lượng và tổng hợp nghiên cứu các hệ thống gen mô hình. Hơn nữa, phân tích mạng lưới điều chỉnh gen là những hiện tượng được hiểu rõ hơn về 'hệ thống gen'. Ví dụ: galactose được hiểu là các con đường trao đổi chất có thể gây ra S. cerevisiae [120]. Cùng một chuyển đổi gen được thiết kế trang nhã [84] và vì những lý do này, nhiều động lực điều chỉnh gen / 47, 109]. Khi gặp môi trường galactose (và không có chất ức chế dị hóa), galactose được vận chuyển từ môi trường bên ngoài bằng Gal2p, chất vận chuyển hexose. Gal2p được biết là có hai chế độ hoạt động, nồng độ galactose dưới, và thụ động dưới nồng độ galactose [87].

3.1. Ưu điểm của RNA Seq trong Phân Tích Biểu Hiện Gen

RNA-Seq (RNA sequencing) là một phương pháp mạnh mẽ để phân tích biểu hiện gen toàn bộ hệ gen. So với các phương pháp truyền thống như microarray, RNA-Seq có độ nhạy cao hơn, phạm vi động rộng hơn, và khả năng phát hiện các gen mới chưa được biết đến. RNA-Seq cũng cho phép phân tích các biến thể splice và các dạng RNA khác, cung cấp cái nhìn toàn diện về hoạt động của bộ gen.

3.2. Quy Trình Phân Tích Dữ Liệu RNA Seq để Định Lượng Biểu Hiện Gen

Quy trình phân tích dữ liệu RNA-Seq bao gồm các bước chính sau: (1) thu thập và chuẩn bị mẫu RNA, (2) giải trình tự RNA bằng các nền tảng giải trình tự thế hệ mới, (3) ánh xạ các đoạn đọc (reads) lên bộ gen tham chiếu, (4) định lượng mức độ biểu hiện gen dựa trên số lượng reads ánh xạ, và (5) phân tích thống kê để xác định các gen có biểu hiện khác biệt giữa các điều kiện khác nhau. Các công cụ bioinformatics như Cufflinks, DESeq2, và edgeR được sử dụng để thực hiện các bước này.

IV. Ứng Dụng Giải Mã Cơ Chế Đáp Ứng Stress Môi Trường ở Vi Sinh Vật

Một hệ thống galactose trong cùng một thiết kế trang nhã chuyển đổi gen [84] và vì những lý do này, nhiều động lực điều chỉnh gen / 47, 109]. Khi gặp môi trường galactose (và không có chất ức chế dị hóa), galactose được vận chuyển từ môi trường bên ngoài bằng Gal2p, chất vận chuyển hexose. Gal2p được biết là có hai chế độ hoạt động, nồng độ galactose dưới và thụ động dưới nồng độ galactose [87]. Khi galactose liên kết và kích hoạt Gal3p, protein galactokinase bổ sung Gallp mà không có galactokinase cho phép liên kết Gal80p trong tế bào chất, chất ức chế phiên mã gen GAL di chuyển giữa nhân và Khi nhân, Gal8Op thường liên kết với Gal4p, quá trình che phủ phiên mã RNA polymerase tuyển dụng được tìm thấy trong miền liên kết không phải DNA Gal4p. Bằng cách liên kết Gal3p, Gal80p được cô lập cho phép RNA polymerase Gal4p liên kết một cách cấu tạo.

4.1. Xác Định Các Gen Đáp Ứng Stress Môi Trường bằng Phân Tích Biểu Hiện Gen

Phân tích biểu hiện gen giúp xác định các gen đáp ứng với các loại stress môi trường khác nhau, như stress nhiệt, stress oxy hóa, hoặc stress dinh dưỡng. Các gen này thường tham gia vào các con đường bảo vệ tế bào, sửa chữa tổn thương, hoặc điều chỉnh quá trình trao đổi chất. Việc xác định các gen đáp ứng stress có thể giúp phát triển các phương pháp can thiệp để tăng cường khả năng chịu đựng stress của tế bào.

4.2. Cơ Chế Thích Nghi của Vi Sinh Vật với Thay Đổi Môi Trường Vi Mô

Vi sinh vật có khả năng thích nghi với các thay đổi môi trường vi mô thông qua các cơ chế điều hòa gen phức tạp. Các cơ chế này bao gồm điều chỉnh biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình trao đổi chất, vận chuyển, và bảo vệ tế bào. Phân tích biểu hiện gen giúp chúng ta hiểu rõ hơn về cách vi sinh vật điều chỉnh hoạt động của bộ gen để tồn tại và phát triển trong môi trường biến động.

V. Kết Luận Tương Lai Nghiên Cứu Về Biểu Hiện Gen và Môi Trường

Cấu trúc galactose “chuyển đổi” xuất hiện hệ thống bộ nhớ thô Báo cáo làm việc gần đây Acar và Van Oudenaarden {1] thăm dò thông tin phản hồi bộ nhớ Redundancy làm cho con đường incredibly galactose. Tuy nhiên, một khi đã được gây ra, những thay đổi nhỏ hệ thống nồng độ galactose Vì vậy, hệ thống dạng bản địa xuất hiện thay đổi môi trường nhỏ mạnh mẽ Hơn số lượng dai dẳng tập trung bên trong Điều khiển nồng độ Giảm Gal80p gây ra tăng độ bền đã gây ra nơi đơn ổn định luôn đạt được. Cây galactose bản địa cùng với glucose ức chế, hệ thống nghiên cứu như nhau có thông tin nhiều phản hồi báo hiệu chuyển đổi [54].

5.1. Hướng Nghiên Cứu Tiềm Năng trong Lĩnh Vực Phân Tích Biểu Hiện Gen

Các hướng nghiên cứu tiềm năng trong lĩnh vực phân tích biểu hiện gen bao gồm phát triển các công cụ và phương pháp mới để phân tích biểu hiện gen ở mức đơn tế bào, khám phá vai trò của các yếu tố phiên mã và RNA không mã hóa trong điều hòa biểu hiện gen, và nghiên cứu tác động của môi trường vi mô lên biểu hiện gen trong các bệnh khác nhau.

5.2. Ứng Dụng của Phân Tích Biểu Hiện Gen trong Y Học và Công Nghệ Sinh Học

Phân tích biểu hiện gen có nhiều ứng dụng trong y học và công nghệ sinh học, bao gồm chẩn đoán bệnh, phát triển thuốc, và kỹ thuật di truyền. Phân tích biểu hiện gen có thể giúp xác định các dấu ấn sinh học (biomarkers) cho bệnh, đánh giá hiệu quả của thuốc, và điều chỉnh hoạt động của gen để tạo ra các sản phẩm sinh học mới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

UNIVERSITY OF CALIFORNIA, SAN DIEGO Quantitative analysis of genetic expression responses to dynamic microenvironmental perturbation A dissertation submitted in partial satisfaction of the requirements for the degree Doctor of Philosophy in Bioengineering by Wyming Lee Pang Committee in charge: Professor Jeff Hasty, Chair Professor Stuart Brody Professor David Gough Professor Alexander Hoffmann Professor Gabriel Silva 2007 UMI Number: 3245319 Copyright 2007 by Pang, Wyming Lee All rights reserved. INFORMATION TO USERS The quality of this reproduction is dependent upon the quality of the copy submitted. Broken or indistinct print, colored or poor quality illustrations and photographs, print bleed-through, substandard margins, and improper alignment can adversely affect reproduction. In the unlikely event that the author did not send a complete manuscript and there are missing pages, these will be noted.

Also, if unauthorized copyright material had to be removed, a note will indicate the deletion. ® UMI UMI Microform 3245319 Copyright 2007 by ProQuest Information and Learning Company. All rights reserved. This microform edition is protected against unauthorized copying under Title 17, United States Code.

ProQuest Information and Learning Company 300 North Zeeb Road P. Box 1346 Ann Arbor, MI 48106-1346 Copyright Wyming Lee Pang, 2007 All Rights Reserved The dissertation of Wyming Lee Pang is approved, and it is acceptable in quality and form for publication on microfilm. Chair University of California, San Diego 2007 ill For my wife Lisa Thanks for your patience 1V It is not the strongest of the species that survives, nor the most intelligent, but the one most responsive to change. Charles Robert Darwin (1809-1882) English Naturalist Table of Contents Signature Page 2.

oe V Table of Contents ằŠa da. T Ặä vì List of si “ốc ga aađa ẶỪẶỪỪD. ằAẼ a ix List of Tables 2. vàn xii Acknowledgments 2.

2 cà ki kg kg va xiii Curriculum Vite 2. A4 xvi Abstract 2 0 gà kg kg gà gà kg gà k v x k ng xviii 1 Introduction. g q g kg Tà gà và vàng 1 I5.3 Dynamic environments and living cells.4 Current techniques for monitoring gene expression .1 Modeling on-chip pressures and flows.3 Driving and controlling fluid flow. ee 21 2 Platform Development and Methodology.1 Cells, Constructs, and Culture Conditions .1 Parent and fluorescent variant strains .3 Steady-state expression characterization.

Confining microbial biofilms and microcolonies .3 A quantitative, long-duration imaging platform .4 Controllable dynamic microenvironments .3 Reduction of thermally induced drift in focal plane.5 Image processing and analysis. c Q Q Q Q HQ ng ng v kg và và 71 vì 3 Metabolic gene regulation in a dynamically changing environment .2 Materials and methods.1 Microfluidic device fabrication .2 Cell preparation and culture .3 Results and Discussion. ee ee ee 80 3.3 Computational and experimental analysis of response robustness. cà gà kg kg kg ky 88 3.

v k kg xa 88 4 Summary and Future Directions. ——— 92 A MOCA: Microfluidic Open Circuit Analyzer.1 Basic description, requirements, and concepts. gà kg vn 97 A.1 Channels in parallel .2 Channels in series 2. Q Q Q Q ng nu na và Là lv à va 101 A.

c c Q ng vn vn và Là là và va 101 A.4 MOCA models for devices used in this work. 2 vo 102 “` van ee 102 `9 “4.5_ Complete source code ÍOr moca. c c c r Q ng va 109 B IAISQT: IÀIage Segmentor, Quantifer, lTacker. cv ng gà k VN cv k k k VN va 120 B.5 Regions of [nteresE.

cv ng gà kg va 122 B.7 Saving and Loading IMSQT sessions. HQ nạ vn k k v kia 125 B.2 Xlanual segmentation using SEGBDIE.1 Tracking Validation with TRACKEDIT. Trajectory Viewing with TRACKVIEW .6 Complete source code for DISQT main window.7 Complete source code for SEGEDIT .8 Complete source code for TRACKEDIT .9 Complete source code for TRACKVIEW.10 Complete source code for segmentor modules .11 Complete source code for library functions. 00 00 2 ee k kg kia 277 C.1 Automated microscopy platform.

cv nu kg KV 277 C.2 Generalized light paths .2 Waveform generation platform 2. eee ee 282 D Microfluidic Devices 2. Q Q Q LH ng ng kg kg kg kg KV k kg 290 D.1 TC: Tesla miero-Chemosflat. uc cu cu Q .Ặ(ẼẰ CC aaaa.2 Device Schematic and Port Âssignments.2 T2uC: Temporal Tesla micro-Chemostat.

cu kg ki Và V V g V V Và 292 D.22_ Device Schematic and Port Àssignments.3 Glial Network Stimulator. Quy vẻ vn 303 D. cu kg Vy V V g V V Và 303 D.2 Device Schematic and Port Âssignments.4 DynaGrad: Dynamic Chemical Gradient Device. ng ng k kg k k k k Nà 305 D.2 Device Schematic and Port Assignments.

305 E Computational code for T?C data simulations and analysis. Model simulation code. 329 vill List of Figures Figure 1.1 Cartoon diagram of the galactose utilization pathway .2 Node/Segment schematie of a fuidie “t”-junetion.3 Node/Segment schematic of a fluidic cross-junction .4 Node/Segment schematic of a fluidic h-cross .5 Microfuidic device fabricatlon DFOC@SS. uc cv cv ru el 18 Figure 2.1 GAL2 expression in S.

cerevisiae YPH499, YPH500, and K699.2 Yeast transformation using pKT derived fluorescent fusion protein vectors.3 Steady-state galactose induction for S. cerevisiae YPH499 and K699 30 Figure 2.4 Steady-state glucose repression for S. cerevisiae YPH499 and K699 .5 Schematic diagram of the “Sticky-Pad” device.6 Patterning of “Sticky-Pads®, 2.7 Cellular growth on “Sticky-Pads” 2. ee ee ee 40 Figure 2.8 Colony comets on a “Sticky-Pad” 2.9 The XLC growth chamber array, 2.11 TuwCadvection/diffusion analysis schematic .12 1D representation oŸ the 'ÏuC with difusive and advective transport 47 Eigure 2.13 Comparison of model and experimental ˆ[C large molecule transport ol Eigure 2.14 Analytical of time evolved 1D concentration profiles under various advective velocities Ặ HH ÊäšẶỪ.15 Comparison of model and experimental TC small molecule transport .16 Nutrient transport in a fully confluent TwC microchamber .17 Advantages of monolayer imaging.

eee ee ees 55 Figure 2.18 A dynamically controlled gradient profile device .19 The T?uC oe 58 Figure 2.20 Cartoon depiction of laminar interface guidance .21 Linearly graded mixing output .22 Characterization of on-chip waveform generation .23 Nutrient transport in a confluent T?wC growth chamber.24 Loading of the T?uC. Quy ky àa 64 Figure 2.25 Autofocus pattern using dry air chambers and fluorescent illumination.1 Simulated and experimental expression trajectories in response to sinusoidal perturbation at varying frequencies.2 Schematic of coupled galactose and glucose regulatory networks used to derive the computational model.3 Induction/repression dynamic response of S. cerevisiae YPH499 and K699 86 Figure 3.4 Amplitude ratio and phase shift profiles from experimental and simulated 610 TT.I Node/Segment schematic of a fluidic h-cross .2 Graphical output of a MOCA simulation of an h-cross microfluidic system. The tooltip is displayed when hovering the mouse pointer over the node label.

Similar tooltips are available for the segment labels.3 Graphical results for MOCA simulation of the TuwC microfluidic device 103 Figure A.4 Graphical results for MOCA simulation of the T?C microfluidic device 105 Figure B.1 The IMSQT main window .2 Regions of interest definition panel in the DISQT main window.3 Channels definition panel in the MISQT main window.4 Segmentation panel in IMSQT main window .5 SEGEDIT manual segmentation editor.6 SEGEDIT subpanels: (a) morphological operations panel, (b) object editing, and (c) morphological filtering, 2. ee va 130 Figure B.7 Object quantification panel in IMSQT main window .8 Object tracking panel in IMSQT main window .9 TRACKEDIT object tracking validation viewer .10A sample of TRACKEDIT object display.11The TRACKEDIT display control panel.12Default graphical output using TRACKVIEW.13Data smoothing using TRACKVIEW.1 Imaging optical train and light paths .2 Waveform generation svstem configuration .1 Device schematic for TwC. Inset displays a magnified view of the growth chamber, 2.2 Device schematic for T?C. Insets display magnified views of the growth chamber and on-chip media switch.3 Device schematic for glial network stimulation device.

Insets display mag- nified views of the growth chamber and on-chip media switch.4 Device schematic for dynamic gradient device. Inset displays magnified views of the on-chip media switch. 305 Xi List of Tables Table 2.1 Yeast parent strains 2.2 Excitation and emission spectral maxima of fluorescent proteins. kg kg kg KT V va 25 Table B.1 A sample trajectory link table.

Q ky và y vàna 142 Table D.1 Master mold feature height specifications. ‘Photoresists are SU-8 unless otherwise specified. *These layers were patterned additively (e. no development step between this and the prior layer).

ch va 290 Table D.2 Port assignments for TC.3 Master mold feature height specifications. ‘Photoresists are SU-8 unless otherwise specified. *These layers were patterned additively (e. no development step between this and the prior layer) 2.4 Port assignments for T7uC.

Q Q Q ng va 293 Table D.5 Master mold feature height specifications. ‘Photoresists are SU-8 unless otherwise specified.6 Port assignments for the glial network stimulation device.7 Master mold feature height specifications. ‘Photoresists are SU-8 unless otherwise specified. * Bacterial and yeast devices require patterning the gradient outflow channel with adhesion molecules such as polylysine (bacterial) or Conavalin- A (yeast), gà ngà gà gà và v g k k k xxx va 305 Table D.8 Port assignments for the dynamic gradient device.

305 Xl Acknowledgments It’s been a long six years and I’ve been fortunate to have met so many interesting people and had more than my fair share of unique and great experiences. I’m not going to say that the journey was easy, and I’m sure that no one in their right mind would have guaranteed that. In fact, some of the most difficult times I’ve had to date were during my graduate career. These are moments spent wondering if the sum of who you already are and who you want to be is worth the next step in the plans you’ve made for yourself.

It’s cliché I know, but I couldn’t have made it here with out the unrelenting support of my colleagues, friends, and family. First, I owe immense gratitude to my professional colleagues, without whom this work would not have been possible. Hasty for providing financial support and valuable research advice throughout my doctoral studies, and having the patience to see everything through. In addition, I’m fortunate to have been a part of the integrative, collab- orative, and supportive environment provided by the members of the Systems Biodynamics Lab, and likewise, I am indebted to Jesse, Chris, Mike, and Ben who helped me edit and refine this dissertation.

Jennifer and Natalie, your skills at the bench are as good as your scientific savvy, and I'll be forever thankful for all your assistance with getting my yeast variants made. Matt and Dmitri, you guys work in numbers, theory, and code like artists in fine oils, and are the best computational model builders I know. Moreover, I would also xiii like to thank Dr. Schmid-Schoenbein, who has always been both kind and supportive, and the first of many bioengineering faculty to get me truly excited in research and the hunt for scientific answers.

Lastly, I would like to thank Dr. Groisman, even though our relation- ship wasn’t the best, he gave me a solid, and reliable foundation in microfluidic design and fabrication, for which I am sincerely grateful. More than anything I'd like to thank my friends who were always there to rejoice in the successes and help through the unavoidable setbacks be they professional or personal. Jennifer, Chris, Lauren, and Jessica, you were always available at a moments notice for coffee, be it at CUPs for a short break, Mandeville for a walk and a talk, the “triple-S” for a quick snack, or Expresso happy hour at the Grove.

There’s no need to explain how these moments have helped keep me sane (as well as thoroughly awake).