MỞ ĐẦU 1. Đ t v n ề Cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) là những vị thuốc quý, được dùng phổ biến trong y dược học cổ truyền phương Đông. Củ Ô đầu chứa nhiều loại dược chất quý, trong đó có flavonoid. Flavonoid là chất chuyển hóa thứ cấp liên quan đến một số khía cạnh của sự phát triển và bảo vệ thực vật.
Chúng tạo màu cho hoa và quả, tạo điều kiện cho hạt và phấn phát tán, đồng thời góp phần giúp cây trồng thích nghi với các điều kiện môi trường như áp lực lạnh ho c tia cực tím, và sự tấn công của mầm bệnh. Flavonoid là chất quan trọng có tác dụng chống oxy hóa, chống tăng sinh tế bào và đ c biệt là chống ung thư. Những năm gần đây các nhà khoa học trên thế giới quan tâm tới nhóm chất flavonoid trong chi Aconitum nhằm phát triển các dược phẩm theo hướng hiện đại, nâng cao hiệu quả sử dụng một số loài thuộc chi này trong phòng và điều trị bệnh. Tuy nhiên, hàm lượng flavonoid trong Ô đầu lại rất thấp, do vậy, việc lựa chọn công nghệ làm tăng hàm lượng flavonoid trong củ Ô đầu là vấn đề đ t ra cho nghiên cứu dược chất từ Ô đầu.
Con đường sinh tổng hợp flavonoid, có nhiều loại enzyme tham gia. Trong đó, có hai loại enzyme monooxygenase thuộc họ P450 tham gia, đó là flavonoid 3’- hydroxylase (F3’H) và flavonoid 3' 5' hydroxylase (F3’5’H). Enzyme F3’5’H giữ vai trò đ c biệt quan trọng trong việc tạo thành sản phẩm cuối của con đường sinh tổng hợp flavonoid ở thực vật. Vì vậy, khi tăng hàm lượng và hoạt tính của enzyme F3’5’H sẽ làm tăng tổng hợp và tích lũy hàm lượng flavonoid.
Cây thuốc lá là thực vật 2 lá mầm, có thời gian phân hóa từ mô đến cây hoàn chỉnh tương đối ngắn. Thuốc lá cũng được lựa chọn làm cây mô hình để chuyển nhiều gen có giá trị với cây trồng. Chính vì vậy, nghiên cứu chuyển gen mã hóa flavonoid 3' 5' hydroxylase (F3’5’H) phân lập từ cây Ô đầu vào cây thuốc lá làm cơ sở để tạo cây Ô đầu chuyển gen có hàm lượng flavonoid cao là rất cần thiết. Xuất phát từ lý do trên chúng tôi chọn đề tài “Biến nạp và bước đầu phân tích biểu hiện gen AcF3'5'H từ cây Ô đầu ở cây thuốc lá”.
Mục tiêu nghiên cứu Biến nạp và phân tích được sự biểu hiện gen AcF3'5'H ở mô lá cây thuốc lá biến nạp. Nội dung nghiên cứu 3. Nghiên cứu đ c điểm của cấu trúc vector pCB301_AcF3’5’H; 3.2 Nghiên cứu biến nạp cấu trúc mang gen chuyển AcF3'5'H vào mô lá thuốc lá thông qua Agrobacterium tumefaciens; 3. Nghiên cứu xác định sự có m t của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR 3.
Nghiên cứu sự biểu hiện hiện gen bằng kỹ thuật RT-PCR. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung về cây thuốc lá 1. Phân loại cây thuốc lá Theo Reed S.
Một số loài trong họ Cà được trồng rộng rãi như khoai tây (Solanum), cà chua (Lycopersium), ớt (Capsium), cà độc dược (Datura) và thuốc lá (Nicotiana). Đ c trưng của các loài trong họ này là trong thân và quả thường chứa alcaloid như solanin, atropin, scopalamin, nicotine. Trong họ này cũng có những loài có tầm quan trọng với toàn cầu, ví dụ như khoai tây (Solanum tuberosum). Củ khoai tây là nơi chứa lượng cacbohydrat rất lớn rất có giá trị không chỉ với chính bản thân cây này mà con người cũng sử dụng để thu nạp thêm năng lượng.
Tuy nhiên, củ khoai tây có thể trở thành chứa chất độc nếu nó đang nảy mầm. Các vùng vỏ có màu xanh chỉ ra rằng củ khoai tây đang chuẩn bị nảy mầm, đồng thời nó cũng là chỉ thị của sự có m t của các chất như chaconin hay solanin. Các hợp chất glycoside này khi tích lũy nhiều trong củ có thể gây ngộ độc cho con người. Một số chi thì quả là nguồn cung cấp dinh dưỡng đáng kể ví dụ như cà chua, cà tím (cà dái dê) hay cà bát, cà pháo ho c ớt là nguồn thực phẩm khá quen thuộc của người dân Việt Nam [38].
Chi Nicotiana có 50-70 loài, đa số là dạng thân cỏ, một số dạng thân đứng, hầu hết là các dạng dại phụ. Căn cứ vào hình thái, màu sắc của hoa người ta phân chia thành 4 loại chính. Theo đó, loài Nicotiana tabacum L. có hoa màu hồng hay đỏ tươi.
Đây là loại phổ biến nhất chiếm 90 diện tích thuốc lá trên thế giới. Loài thứ 2 có tên là Nicotiana rustica L. có hoa màu vàng, chiếm khoảng 10 diện tích thuốc lá trên thế giới. Loài Nicotiana petunioide L.
có hoa màu trắng, phớt hồng hay tím. Thường chỉ có trong vườn thực vật phục vụ nguồn dư trữ gen cho lai tạo, ít được dùng trong sản xuất. Loài thứ 3 Nicotiana polidiede L. có hoa màu trắng.
Loài này cũng ít được dùng trong sản xuất, chủ yếu chỉ có trong vườn thực vật học của một số quốc gia. Cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) (Nguồn: https://amp.com/vithuoc/thuocla.htm) [38] Trên thế giới, cây thuốc lá được trồng chủ yếu ở Châu Á với diện tích canh tác khoảng 2.000 ha, Châu Mĩ là 1.000 ha và Châu Phi khoảng 326.000ha với nhiều loại thuốc lá khác nhau. Trong đó, giống thuốc lá sợi vàng phổ biến nhất.Vùng trồng thuốc lá cho chất lượng cao tập trung chủ yếu ở một số bang của nước Mĩ, Cu Ba, Ấn Độ [37]. Tại Việt Nam cây thuốc lá được canh tác từ Bắc đến Nam.
Tuy nhiên cũng có nhiều ở các vùng trọng điểm như: Cao Bằng và Lạng Sơn (khu vực phía Bắc), Đà Nẵng, Gia Lai và Đắc Lắc (khu vực miền Trung), Ninh Thuận (khu vực Tây nguyên) và Tây Ninh (khu vực phía Nam) [37]. Chi Nicotiana được chia làm 3 chi phụ, 14 nhóm với tổng số tới 66 loài trong đó 45 loài có nguồn gốc ở Bắc và Nam Mỹ, 20 loài ở Australia và 1 loài ở Châu Phi. Phần lớn những loài này là cây thân bụi hàng năm, một số là cây lâu năm và 2 loài là cây bụi thân gỗ. Trong số 66 loài thuốc lá, có 2 loài chưa tìm thấy ở dạng hoang dại nhưng lại được trồng phổ biến làm thuốc lá là Nicotiana tabacum (N.
Vai trò của cây thuốc lá Thuốc lá (Nicotiana tabacum L) là loại cây công nghiệp ngắn ngày có tầm quan trọng bậc nhất về kinh tế trên thị trường thế giới không chỉ đối với trên 33 triệu nông dân của trên 120 quốc gia, mà còn cho cả toàn bộ nền công nghiệp - từ các nhà máy chế biến, cuốn điếu, sản xuất phụ gia, phụ liệu đến cả hệ thống phân phối tiêu thụ, thậm chí cả một phần ngành sản xuất các vật tư nông nghiệp phục vụ cho cây thuốc lá như phân bón, thuốc bảo vệ thực vật [9], [11]. Với tổng diện tích trồng trọt khoảng 4,0-5,5 triệu ha trải khắp từ 60o vĩ Bắc đến 40o vĩ Nam và tổng sản lượng nguyên liệu thu được khoảng 6,5-8,5 triệu tấn(trong đó khoảng 3,5-4,5 triệu tấn thuốc lá vàng; khoảng 0,6-1,0 triệu tấn thuốc lá burley; trên 0,5 triệu tấn thuốc lá oriental; còn lại là các loại khác để sản xuất khoảng 6.000 tỷ điếu hàng năm [12], [32]. tabacum có số lượng nhiễm sắc thể lưỡng lưỡng bội (Dihaploid = 4n), có biến động lớn về kích thước lá, dạng ngọn lá, góc đóng lá so với thân, kiểu tai cuống lá, mầu sắc lá. Hoa tự chùm lưỡng tính mọc trên đỉnh sinh trưởng, hoa dài khoảng 5 cm, có 5 cánh với mầu từ hồng đến đỏ (N.
tabacum) hay màu vàng đến vàng hơi xanh (N. Hoa thường tự thụ phấn trước khi nở và tỷ lệ tự thụ phấn đến 95%. Mỗi cây có thể cho 200-400 quả và mỗi quả có khả năng cho khoảng 2000 -4000 hạt. Trong hạt chứa 32-42% dầu (chủ yếu là linoleic acid và oleic acid), 20- 30% protein.
Trong 1 gam hạt có từ 10.000 hạt và hạt có khả năng sống rất lâu [9], [11], [12]. Thuốc lá là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Sản phẩm chính là lá thuốc lá, sử dụng làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thuốc lá trên toàn thế giới. Ngoài ra, thuốc lá còn được sử dụng vào một số mục đích khác như: Trồng nhóm Nicotiana rustica để chiết xuất từ lá hàm lượng nicotin từ 4-5 để sản xuất thuốc trừ sâu Sulfat nicotin.
Từ thân và lá thuốc lá chiết xuất được sclareol và 13 epi- sclareol chống bệnh gỉ sắt cây họ đậu. Từ lá thuốc lá chiết xuất axit nicotineic dùng cho công nghiệp dược phẩm. Hạt thuốc lá chiết xuất 34-40 dầu phục vụ trong công nghiệp, sử dụng trong thực phẩm. Thân chế tạo các loại giấy có chất lượng cao.
Hoa chiết xuất tinh dầu sản xuất nước hoa thuốc lá. Một số phát hiện mới hiện nay, các nhà nghiên cứu đã kết luận thuốc lá giàu protein, hydratcacbon, chất béo và vitamin. 5 Protein thuốc lá chứa nhiều amino acid quan trọng, tính chất bổ dưỡng vượt cả phomat, protein trong sữa [1]. Cây thuốc lá có thời gian phân hóa từ mô đến cây hoàn chỉnh tương đối ngắn.
Vì vậy ở nhiều phòng thí nghiệm, cây thuốc lá thường được dùng làm cây mô hình để chuyển gen trước khi chuyển gen vào cây đích. Lịch sử hình thành - phát triển thuốc lá Trong lịch sử, cây thuốc lá được trồng đầu tiên ở châu Mỹ từ hơn 6000 năm trước công nguyên và được sử dụng trong các nghi lễ tôn giáo, làm thuốc chữa bệnh [9], [12]. Thuốc lá là loài cây trồng có nguồn gốc Nhiệt đới và Á nhiệt đới, hương vị đ c biệt của nó đã được biết đến ở vùng Trung Mỹ có lẽ cách đây trên hai nghìn năm và trở nên phổ biến từ thế kỷ 15 [9], [11]. Lịch sử viết về cây thuốc lá bắt đầu vào ngày 12 tháng 10 năm 1492, khi Christopher Columbus đ t chân lên bãi biển San Salvado ở Tây Ấn Độ Dương.
Các thổ dân ở đó đã mang tới hoa quả và cả những nắm lá khô cho mùi thơm quyến rũ khi chúng được châm hút để mời đoàn thám hiểm [9], [11]. Người Tây Ban Nha bắt đầu trồng thuốc lá ở Haiti vào năm 1531 với nguồn hạt giống từ Mexico và sau đó việc trồng thuốc lá lan rộng tới các hòn đảo lân cận khác. Trồng trọt thuốc lá bắt đầu ở Cu Ba vào năm 1580, sau đó phát triển sang Guiana, Brazil [11]. Và dần dần phát triển trên các châu lục khác.
Một số tài liệu đáng tin cậy cho rằng thuốc lá được trồng từ thời vua Lê Thần Tông (1660) bằng nguồn hạt giống của các thương nhân Tây Ban Nha. Năm 1876, nghề trồng thuốc lá ở Việt Nam chính thức khởi sự tại Gia Định, tiếp theo là Tuyên Quang (1899) và thuốc lá điếu bắt đầu được sản xuất tại Hà Nội cùng thời gian này.