Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ dược học "Phân tích một số acid amin bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Vũ Ngân Bình dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Phạm Thị Thanh Hà tại Trường Đại học Dược Hà Nội (năm 2022), thuộc chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất (mã số: 9720210).

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Acid amin (AA) là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein và là tiền chất tổng hợp nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học trong cơ thể sống. Các chế phẩm chứa acid amin được sử dụng phổ biến trong điều trị suy dinh dưỡng, hồi phục chức năng gan, cân bằng dẫn truyền thần kinh hoặc phối hợp với các hoạt chất khác. Bên cạnh đó, các bệnh rối loạn chuyển hóa acid amin bẩm sinh, đặc biệt là rối loạn chuyển hóa acid amin thơm (như Phenylketon niệu - PKU, tăng phenylalanin huyết không do PKU - HPA, Tyrosin huyết - TYR), đòi hỏi phải giám sát nồng độ acid amin trong dịch sinh học để chẩn đoán và theo dõi điều trị.

Tuy nhiên, việc phân tích acid amin gặp nhiều trở ngại do đặc tính phân cực cao, kém lưu giữ trên sắc ký lỏng pha đảo (RPLC), dẫn đến việc thường phải thực hiện dẫn xuất hóa trước hoặc sau cột. Trong phân tích dược phẩm phối hợp đa thành phần, các tiêu chuẩn cơ sở hiện hành thường phải sử dụng 2 đến 3 quy trình phân tích độc lập cho từng hoạt chất. Trong phân tích dịch sinh học, các phương pháp RPLC-MS không dẫn xuất hóa đòi hỏi pha động chứa tỷ lệ nước cao làm giảm tính tương thích với đầu dò khối phổ, hoặc quy trình xử lý mẫu tủa protein bằng dung môi hữu cơ phải trải qua bước bay hơi dung môi và hoàn nguyên phức tạp. Sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC) sử dụng pha tĩnh phân cực và pha động chứa tỷ lệ cao dung môi hữu cơ đồng tan với nước, cho phép lưu giữ tốt các hợp chất phân cực mà không cần dẫn xuất hóa và tương thích trực tiếp với detector MS. Tại Việt Nam, các nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật HILIC trong kiểm nghiệm thuốc và phân tích dịch sinh học còn hạn chế.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định 2 mục tiêu cụ thể:

  1. Xây dựng được phương pháp phân tích đồng thời một số acid amin cùng thành phần khác trong chế phẩm bằng HILIC-DAD và xác định được một số yếu tố ảnh hưởng đến sự lưu giữ và hình dáng pic trong HILIC.
  2. Xây dựng được phương pháp phân tích một số acid amin thơm trong huyết tương bằng HILIC-MS/MS nhằm hỗ trợ theo dõi và điều trị bệnh rối loạn chuyển hoá các acid amin này.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng phân tích: Các acid amin bao gồm Phenylalanin (Phe), Tryptophan (Trp), Tyrosin (Tyr), Cystein (Cys), Glycin (Gly), Cystin, Methionin (Met); các hoạt chất phối hợp gồm Amoni glycyrrhizinat (AG), Vitamin B6 (pyridoxin hydroclorid), Paracetamol (Par); chuẩn nội đồng vị Phe-d5.
  • Đối tượng mẫu:
    • Chế phẩm thuốc tiêm truyền đa acid amin: Dung dịch tiêm truyền Kidmin (17 acid amin), Dung dịch tiêm truyền Nephosteril (15 acid amin).
    • Chế phẩm thuốc phối hợp: Dung dịch tiêm truyền Amiphargen (AG, Cys, Gly), Viên nén bao phim Cystine B6 Bailleul (Cystin, Vitamin B6), Viên nang Pasafe (Par, Met).
    • Mẫu dịch sinh học: Huyết tương người (HT), các nền mẫu giả lập (BSA, HSA, PBS, NaCl, Glucose, Ringer lactat).
  • Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất (Trường Đại học Dược Hà Nội) và Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, hoàn thành và nghiệm thu năm 2022.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước đây

  1. Lý thuyết và cơ chế sắc ký tương tác thân nước (HILIC):

    • Khái niệm HILIC được Alpert đề xuất năm 1990 để tách các phân tử phân cực cao dựa trên sự phân bố giữa lớp nước cố định trên pha tĩnh và pha động hữu cơ.
    • Linden và Lawhead (1975) đã sớm sử dụng pha tĩnh amino để phân tích carbohydrat.
    • McCalley và Neue, cùng với Melnikov và cộng sự đã chứng minh và mô hình hóa cấu trúc 3 lớp dung môi trên bề mặt tiếp xúc của silica với hỗn hợp acetonitril - nước: lớp tĩnh sát bề mặt giàu nước, lớp chuyển tiếp và lớp động.
    • Craven và cộng sự khảo sát ảnh hưởng của chuỗi muối điện ly (chaotropic/kosmotropic: $Na^+PF_6^- \approx Na^+ClO_4^- > Na^+TFA^- > Na^+Cl^-$) đến tương tác tĩnh điện và thời gian lưu của chất tan mang điện tích.

  2. Phân tích acid amin trong chế phẩm:

    • Các dược điển (Dược điển Châu Âu, Dược điển Mỹ) quy định phương pháp sắc ký trao đổi ion kết hợp dẫn xuất hóa sau cột với ninhydrin hoặc o-phthalaldehyd (OPA), hoặc phân tích pha đảo sau khi dẫn xuất hóa trước cột bằng PITC, AQC, FMOC, dansyl clorid.
    • Tại Việt Nam: Trịnh Văn Lẩu và cộng sự định lượng 8 acid amin trong viên nang Astymin forte bằng hệ thống AminoQuant 1090 dẫn xuất OPA phát hiện ở 338 nm; Trần Diễm Phúc và cộng sự phân tích acid amin trong viên nang Doragon dẫn xuất với dansyl clorid; Nguyễn Thị Diệu và cộng sự định lượng acid amin trong viên nang nhung hươu dẫn xuất dabsyl clorid; Lê Thị Hồng Hảo định lượng 17 acid amin trong thực phẩm dẫn xuất bằng AQC.
    • Đối với các thuốc phối hợp (Amiphargen, Cystine B6 Bailleul, Pasafe), các tiêu chuẩn nhà sản xuất và Dược điển Việt Nam V áp dụng nhiều kỹ thuật riêng rẽ: kết hợp sắc ký pha đảo với đo quang, hoặc chuẩn độ thừa trừ với iod cho từng hoạt chất.

  3. Phân tích acid amin thơm trong dịch sinh học bằng LC-MS:

    • Marcos và cộng sự phân tích Trp, Phe, Tyr và các acid amin chuỗi nhánh trong huyết tương trên cột Acquity BEH C18, nhưng quy trình đòi hỏi tủa protein bằng acetonitril, ly tâm, thổi khô dung môi và hòa tan lại trong nước.
    • Sun và cộng sự sử dụng cột Syncronis HILIC (silica) phân tích Phe, Tyr và các acid amin nhánh trong huyết thanh với pha động acetonitril - đệm amoni acetat 120 mM.
    • Peat và Garg định lượng Phe và Tyr trên cột Supelcosil C18 với chất tạo cặp ion acid heptafluorobutyric (HFBA) và nền chuẩn albumin huyết thanh bò 7%.
    • Virag và cộng sự phân tích Trp, Phe, Tyr trên cột C18 với pha động chứa acid trifluoroacetic (TFA) trên nền albumin huyết thanh người 4% trong PBS.

Khoảng trống luận án giải quyết

  • Thay thế các quy trình dẫn xuất hóa phức tạp hoặc việc phải tách riêng nhiều phép thử khác nhau trong kiểm nghiệm chế phẩm thuốc chứa acid amin và hoạt chất phối hợp bằng một phương pháp HILIC-DAD duy nhất.
  • Khắc phục nhược điểm của RPLC-MS/MS đối với dịch sinh học (tránh bước bay hơi dung môi hoàn nguyên sau khi tủa protein bằng dung môi hữu cơ) bằng cách phát triển quy trình HILIC-MS/MS tiêm trực tiếp dịch nổi sau tủa protein, tối ưu hóa độ tương thích ion hóa ESI.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

  • Phân loại pha tĩnh HILIC: Pha tĩnh không tích điện (Diol, Cyano, Amid); Pha tĩnh tích điện dương (Amino); Pha tĩnh tích điện âm (Silica trần chứa nhóm silanol $Si-OH / Si-O^-$); Pha tĩnh lưỡng cực (Zwitterionic - Sulfobetain, Phosphorylcholin, Polysulfoethyl A).
  • Cơ chế lưu giữ trong HILIC: Tổ hợp của cơ chế phân bố lỏng - lỏng giữa lớp nước hấp phụ bề mặt pha tĩnh và dòng pha động hữu cơ; cơ chế hấp phụ tĩnh điện (hút/đẩy giữa pha tĩnh và chất phân tích mang điện); cơ chế liên kết hydro và tương tác lưỡng cực.
  • Tính chất hóa lý của 20 acid amin: Phân tử lưỡng tính với các hằng số phân ly acid ($pK_{a1}$ nhóm $\alpha\text{-COOH}$, $pK_{a2}$ nhóm $\alpha\text{-NH}3^+$, $pK{a3}$ nhóm mạch nhánh R) và điểm đẳng điện ($pI$).

Bảng tổng hợp đặc tính hóa lý của một số acid amin và hoạt chất trong luận án:

Hợp chất Ký hiệu Khối lượng phân tử ($M$) $pK_{a1}$ $pK_{a2}$ $pK_{a3}$ / Đặc tính Điểm đẳng điện ($pI$)
Phenylalanin Phe 165 1,83 9,13 R kỵ nước 5,48
Tryptophan Trp 204 2,38 9,39 R kỵ nước 5,89
Tyrosin Tyr 181 2,20 9,11 10,07 (OH phenol) 5,66
Cystein Cys 121 1,71 8,33 10,78 (-SH) 5,02
Glycin Gly 75 2,34 9,60 R không phân cực 5,97
Methionin Met 149 2,28 9,21 R kỵ nước 5,74
Amoni glycyrrhizinat AG 839,97 - - Saponin phân cực -
Vitamin B6 (Pyridoxin HCl) B6 205,64 - - Tan trong nước -
Paracetamol Par 151,16 9,38 - Phân cực trung bình -
  • Ý nghĩa marker chẩn đoán bệnh rối loạn chuyển hóa acid amin thơm:
    • Phenylketon niệu (PKU): Nồng độ Phe trong máu $> 120\ \mu\text{M}$ hoặc tỷ lệ $Phe/Tyr > 3,7$ (khoảng tham chiếu bình thường: Phe $21\text{--}93\ \mu\text{M}$, Tyr $14\text{--}160\ \mu\text{M}$). Mục tiêu điều trị duy trì Phe $120\text{--}360\ \mu\text{M}$ (trẻ $< 2$ tuổi), $< 600\ \mu\text{M}$ (trẻ $> 2$ tuổi), $120\text{--}250\ \mu\text{M}$ (phụ nữ mang thai).
    • Tyrosin huyết typ II và typ III: Marker Tyr tăng cao trong máu (typ II: $1000\text{--}3000\ \mu\text{M}$, typ III: $300\text{--}1000\ \mu\text{M}$). Mục tiêu điều trị duy trì $\text{Tyr} < 600\ \mu\text{M}$ (ngưỡng an toàn $200\text{--}500\ \mu\text{M}$).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  1. Thiết bị và cột sắc ký:
    • Hệ thống HPLC đầu dò mảng diod (DAD) và hệ thống sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần (LC-MS/MS) đầu ion hóa phun điện tử (ESI) vận hành ở chế độ theo dõi đa phản ứng (MRM).
    • Các cột sắc ký HILIC: Zorbax $NH_2$ ($150 \times 4,6\text{ mm}; 5\ \mu\text{m}$), Zorbax Rx-Sil ($150 \times 4,6\text{ mm}; 5\ \mu\text{m}$), Inertsil Amide ($150 \times 4,6\text{ mm}; 5\ \mu\text{m}$), Ascentis Silica ($250 \times 4,6\text{ mm}; 5\ \mu\text{m}$), Zorbax SB-CN.
  2. Khảo sát điều kiện phân tích:
    • Đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ pha hữu cơ (Acetonitril: 65% đến 95%), loại và nồng độ muối đệm (amoni acetat, amoni format, diethylamin - DEA từ 2 mM đến 125 mM), pH pha động, nhiệt độ cột ($26^\circ\text{C}$ đến $30^\circ\text{C}$), tốc độ dòng và dung môi pha mẫu.
  3. Quy trình xử lý mẫu:
    • Mẫu thuốc tiêm truyền/viên nén/viên nang: Hòa tan, chiết siêu âm, lắc xoáy, pha loãng bằng pha động hoặc dung môi thích hợp.
    • Mẫu huyết tương: Khảo sát các nền mẫu giả lập (BSA, HSA, PBS, NaCl, Glucose, Ringer lactat); xử lý mẫu bằng phương pháp kết tủa protein trực tiếp bằng acetonitril chứa chuẩn nội đồng vị $Phe\text{-}d_5$, ly tâm lấy dịch trong tiêm thẳng vào hệ thống HILIC-MS/MS.
  4. Thẩm định phương pháp:
    • Thẩm định đầy đủ theo hướng dẫn quốc tế (ICH / US-FDA): Tính chọn lọc/độ đặc hiệu, độ phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính (đánh giá phương sai đồng nhất và phương pháp bình phương tối thiểu có trọng số qua $%RE$), độ đúng (tỷ lệ thu hồi), độ chính xác (độ lặp lại trong ngày và khác ngày), độ ổn định (dung dịch thử, chu kỳ đông - rã đông, bảo quản ở $-20^\circ\text{C}$), và hiệu ứng nền mẫu (matrix effect).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan về sắc ký lỏng tương tác thân nước, cấu trúc - chuyển hóa acid amin và phương pháp phân tích

  • Lý thuyết HILIC: Hệ thống hóa cơ sở phân loại pha tĩnh HILIC (bề mặt không tích điện diol/amid/cyano, tích điện âm silica trần, tích điện dương amino, và lưỡng cực zwitterion), cơ chế tạo lớp nước solvat hóa và các yếu tố ảnh hưởng đến độ chọn lọc, độ phân giải và hình dáng pic (hiện tượng kéo đuôi, đổ đầu).
  • Hóa sinh và chuyển hóa acid amin: Cấu trúc phân tử 20 acid amin tiêu chuẩn; các con đường chuyển hóa Phe, Tyr, Trp và cơ chế bệnh sinh của các rối loạn chuyển hóa acid amin thơm bẩm sinh (PKU, HPA, Tyrosin huyết các typ I, II, III).
  • Thực trạng phân tích: Đánh giá ưu nhược điểm của các phương pháp phân tích acid amin hiện hành trên thế giới và tại Việt Nam trong nền mẫu dược phẩm và dịch sinh học (RPLC dẫn xuất hóa trước/sau cột, sắc ký trao đổi ion, sắc ký khí GC-MS, điện di mao quản CE, RPLC-MS/MS và HILIC-MS/MS).

Chương 2. Nguyên liệu, trang thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu

  • Mô tả chi tiết hóa chất, chất chuẩn đối chiếu (Phe, Trp, Tyr, Cys, Gly, Cystin, Met, AG, Vitamin B6, Par, Phe-d5), thuốc thử đệm và dung môi đạt tiêu chuẩn phân tích/sắc ký.
  • Thiết lập quy trình khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện sắc ký trên các pha tĩnh HILIC khác nhau (Zorbax $NH_2$, Zorbax Rx-Sil, Inertsil Amide, Ascentis Silica, Zorbax SB-CN).
  • Thiết kế quy trình xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích HILIC-DAD cho 4 nhóm chế phẩm dược phẩm.
  • Thiết kế quy trình phân tích và thẩm định HILIC-MS/MS định lượng đồng thời Trp, Phe và Tyr trong huyết tương, bao gồm đánh giá ảnh hưởng nền và lựa chọn mô hình hồi quy đường chuẩn.

Chương 3. Kết quả nghiên cứu

  • Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng:
    • Trên cột Zorbax $NH_2$ và Zorbax Rx-Sil: Khảo sát thời gian lưu ($t_R$) và hệ số chọn lọc ($\alpha_{Trp}$) của 19 acid amin theo pH và nồng độ đệm amoni acetat.
    • Tỷ lệ acetonitril tăng làm tăng thời gian lưu của các acid amin, phù hợp với cơ chế HILIC.
  • Xây dựng phương pháp HILIC-DAD cho chế phẩm:
    • Chế phẩm tiêm truyền đa acid amin (Kidmin, Nephosteril): Tách đồng thời Trp, Phe và Tyr trên cột Inertsil Amide ($150 \times 4,6\text{ mm}; 5\ \mu\text{m}$), pha động acetonitril - $CH_3COONH_4\ 125\text{ mM}$ (80:20, tt/tt), tốc độ dòng $0,8\text{ mL/phút}$, bước sóng phát hiện 210 nm (Phe) và 230 nm (Trp, Tyr). Phương pháp đạt độ phù hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ chính xác và độ đúng cao.
    • Chế phẩm Amiphargen: Định lượng đồng thời AG, Cys và Gly; khảo sát ảnh hưởng của pH (2,5 đến 6,5) và nồng độ đệm đến độ cân xứng pic; phát hiện đồng thời ở bước sóng 200 nm và 254 nm.
    • Viên nén Cystine B6 Bailleul: Khảo sát dung môi pha mẫu, thời gian siêu âm/lắc xoáy; tối ưu hóa pha động đệm $CH_3COONH_4\ 50\text{ mM}$ - ACN; phát hiện ở bước sóng 250 nm và 286 nm.
    • Viên nang Pasafe: Tách đồng thời Par và Met trên cột Zorbax SB-CN và Zorbax Rx-Sil; bổ sung phụ gia Diethylamin (DEA) $5\text{--}10\text{ mM}$ trong pha động giúp cải thiện độ cân xứng pic Met và thay đổi thứ tự rửa giải giữa Par và Met; phát hiện ở bước sóng 210 nm (Met) và 254 nm (Par).
  • Xây dựng phương pháp HILIC-MS/MS trong huyết tương:
    • Thiết lập điều kiện MS/MS chế độ MRM cho Trp, Phe, Tyr và chuẩn nội Phe-d5.
    • Khảo sát các nền mẫu giả lập (BSA, HSA, PBS, Ringer lactat...); quy trình tủa protein trực tiếp bằng ACN tỷ lệ tối ưu $400/1$ và $200/1$.
    • Tối ưu hóa pha tĩnh HILIC (amid, silica, diol) và pha động đệm amoni acetat - ACN.
    • Đánh giá đường chuẩn sử dụng các mô hình trọng số hồi quy ($1/x$, $1/x^2$) dựa trên tổng $%RE$; thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày ($n=15$), độ ổn định qua 3 chu kỳ đông - rã đông và sau 5 ngày ở $-20^\circ\text{C}$.

Bảng tổng hợp kết quả thẩm định phương pháp phân tích trên các đối tượng:

Đối tượng phân tích Nền mẫu / Chế phẩm Kỹ thuật & Pha tĩnh Pha động & Điều kiện Bước sóng / MRM Khoảng tuyến tính / Đánh giá
Trp, Phe, Tyr Thuốc tiêm Kidmin, Nephosteril HILIC-DAD (Inertsil Amide) $\text{ACN} : CH_3COONH_4\ 125\text{ mM}$ (80:20); $0,8\text{ mL/phút}$ 210 nm (Phe), 230 nm (Trp, Tyr) Độ thu hồi đạt yêu cầu; hệ số tương quan $R^2 > 0,999$
AG, Cys, Gly Thuốc tiêm Amiphargen HILIC-DAD $\text{ACN} - \text{Đệm muối}$; khảo sát nhiệt độ, pH 200 nm, 254 nm Pic cân xứng; lặp lại trong ngày và khác ngày đạt chuẩn
Cystin, Vitamin B6 Viên nén Cystine B6 Bailleul HILIC-DAD $\text{ACN} : CH_3COONH_4\ 50\text{ mM}$ (70:30 & 65:35) 250 nm, 286 nm Độ ổn định dung dịch thử/chuẩn tốt; độ đúng cao
Par, Met Viên nang Pasafe HILIC-DAD (Zorbax SB-CN / Rx-Sil) $\text{ACN} - \text{Đệm/acid} + \text{DEA}\ 5\text{--}10\text{ mM}$ 210 nm (Met), 254 nm (Par) DEA cải thiện đối xứng pic Met; tách hoàn toàn 2 hoạt chất
Trp, Phe, Tyr Huyết tương người HILIC-MS/MS (Pha tĩnh Amid / Silica) $\text{ACN} - \text{Đệm amoni acetat}$; ESI(+) MRM; IS: Phe-d5 MRM từng cặp ion CPT và IS Mô hình trọng số tối ưu tổng $%RE$; ổn định 3 chu kỳ đông - rã

Chương 4. Bàn luận

  • Phân tích chế phẩm bằng HILIC-DAD: Phân tích cơ chế tách và tương tác phân tử giữa các acid amin và các hoạt chất phân cực trung bình/mạnh (AG, B6, Par) trên các pha tĩnh HILIC; so sánh hiệu quả tách của HILIC-DAD với các phương pháp đa bước truyền thống.
  • Phân tích huyết tương bằng HILIC-MS/MS: Đánh giá việc lựa chọn nền mẫu pha chuẩn nhân tạo, phân tích ảnh hưởng nền (matrix effect), lợi thế của dịch tiêm giàu dung môi hữu cơ trực tiếp từ bước tủa protein đối với độ nhạy và hiệu quả ion hóa phun điện tử ESI.
  • Quy luật lưu giữ và hình dáng pic: Bàn luận về vai trò của bản chất pha tĩnh (silica trần, liên kết amid, amino, cyano), tỷ lệ dung môi hữu cơ, pH pha động, nồng độ muối đệm và sự tương tác của dung môi pha mẫu đối với hiệu lực cột và độ đối xứng pic.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

  1. Làm sáng tỏ quy luật lưu giữ và biến đổi hình dáng pic của các acid amin trên nhiều loại pha tĩnh HILIC khác nhau (silica trần, amid, amino, cyano) dưới ảnh hưởng của pH pha động, nồng độ và loại muối đệm, nồng độ phụ gia (diethylamin) và thành phần dung môi hòa tan mẫu.
  2. Chứng minh cơ chế kết hợp giữa phân bố lỏng - lỏng và trao đổi ion/liên kết hydro trong việc điều khiển độ chọn lọc đối với các phân tử acid amin mang điện tích khác nhau trong môi trường pha động giàu dung môi hữu cơ.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn ứng dụng

  1. Xây dựng và thẩm định thành công phương pháp HILIC-DAD định lượng đồng thời các acid amin thơm trong thuốc tiêm truyền đa acid amin (Kidmin, Nephosteril) và định lượng đồng thời acid amin cùng hoạt chất phối hợp trong các dạng thuốc phức tạp (Amiphargen, Cystine B6 Bailleul, Pasafe) trong cùng một quy trình phân tích mà không cần dẫn xuất hóa, rút ngắn thời gian và thay thế cho việc áp dụng nhiều quy trình phân tích riêng lẻ trong tiêu chuẩn cơ sở.
  2. Xây dựng và thẩm định hoàn chỉnh phương pháp HILIC-MS/MS định lượng đồng thời 3 acid amin thơm (Trp, Phe, Tyr) trong huyết tương người với quy trình xử lý mẫu tủa protein đơn giản bằng acetonitril, tiêm trực tiếp dịch trong vào hệ thống sắc ký, đáp ứng yêu cầu phân tích phục vụ chẩn đoán và giám sát điều trị các bệnh rối loạn chuyển hóa acid amin thơm (PKU, HPA, TYR).

Kiến nghị và đề xuất

  • Đưa các quy trình HILIC-DAD đã xây dựng vào tiêu chuẩn kiểm nghiệm chất lượng thuốc tại các cơ sở sản xuất và kiểm nghiệm dược phẩm.
  • Triển khai ứng dụng quy trình HILIC-MS/MS tại các bệnh viện và trung tâm y khoa để phục vụ giám sát điều trị và theo dõi nồng độ acid amin huyết tương ở bệnh nhân rối loạn chuyển hóa bẩm sinh.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Luận án tập trung khảo sát trên một nhóm các acid amin đại diện (Phe, Trp, Tyr, Cys, Gly, Cystin, Met) và một số chế phẩm phối hợp cụ thể có trên thị trường; phương pháp HILIC-MS/MS trên dịch sinh học mới áp dụng trên nền huyết tương và tập trung vào 3 acid amin thơm.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Mở rộng khảo sát và xây dựng quy trình HILIC phân tích đồng thời toàn bộ 20 acid amin tiêu chuẩn và các acid amin biến đổi không cần dẫn xuất hóa.
    • Ứng dụng HILIC-MS/MS trên các loại dịch sinh học khác như nước tiểu, dịch não tủy, giọt máu khô để phục vụ sàng lọc sơ sinh trên diện rộng.

Giá trị tham khảo

  • Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên ngành Dược học/Hóa phân tích: Cung cấp tài liệu tham khảo thực nghiệm về cơ chế tách HILIC, cách tối ưu hóa pha động, khắc phục hiện tượng biến dạng pic và phương pháp thẩm định quy trình phân tích trên thiết bị HPLC-DAD và LC-MS/MS.
  • Đối với kiểm nghiệm viên và nhà sản xuất dược phẩm: Cung cấp quy trình phân tích trực tiếp, định lượng đồng thời các chế phẩm phối hợp acid amin đa thành phần mà không cần qua phản ứng tạo dẫn xuất.
  • Đối với các bác sĩ lâm sàng và chuyên viên xét nghiệm y sinh: Cung cấp phương pháp định lượng nhanh, chính xác nồng độ Phe, Tyr, Trp trong huyết tương nhằm hỗ trợ chẩn đoán và theo dõi phác đồ ăn kiêng/điều trị bệnh PKU, HPA và Tyrosin huyết.

Câu hỏi thường gặp

1. Kỹ thuật HILIC mang lại ưu thế gì so với RPLC trong phân tích acid amin?

Acid amin là các hợp chất có tính phân cực rất cao, kém lưu giữ trên cột sắc ký pha đảo (RPLC), do đó RPLC thường bắt buộc phải dẫn xuất hóa mẫu (trước hoặc sau cột) để tăng tính kỵ nước. HILIC sử dụng pha tĩnh phân cực và pha động giàu dung môi hữu cơ nên lưu giữ tốt acid amin mà không cần dẫn xuất hóa. Ngoài ra, pha động HILIC chứa tỷ lệ cao acetonitril giúp giảm áp suất cột và tăng độ tương thích ion hóa khi kết nối với detector khối phổ (MS).

2. Phương pháp HILIC-DAD giải quyết khó khăn gì trong kiểm nghiệm thuốc phối hợp (như Amiphargen, Pasafe)?

Trong các thuốc phối hợp giữa acid amin và các hoạt chất khác, do tính chất hóa lý giữa các thành phần khác nhau, tiêu chuẩn cơ sở trước đây phải dùng 2 đến 3 phương pháp độc lập (như đo quang, chuẩn độ iod, RPLC riêng). HILIC-DAD cho phép phân tích và định lượng đồng thời cả acid amin và hoạt chất phối hợp (như Cys, Gly cùng AG; hoặc Met cùng Paracetamol) trong một lần tiêm mẫu duy nhất mà không cần dẫn xuất hóa.

3. Quy trình xử lý mẫu huyết tương trong HILIC-MS/MS của luận án có ưu điểm gì so với RPLC-MS thông thường?

Trong RPLC-MS không dẫn xuất hóa, mẫu sau khi tủa protein bằng dung môi hữu cơ (như ACN) thường phải qua bước thổi khô dung môi và hòa tan lại trong pha nước để tránh hiện tượng dung môi hữu cơ làm biến dạng pic trên RPLC. Trong HILIC-MS/MS, do pha động vốn chứa tỷ lệ lớn dung môi hữu cơ (khoảng 80% ACN), dịch nổi sau khi tủa protein bằng ACN được tiêm trực tiếp vào hệ thống sắc ký, giúp tinh giản quy trình xử lý mẫu và hạn chế sai số.

4. Các ngưỡng nồng độ nào của Phenylalanin và Tyrosin trong máu có giá trị chẩn đoán bệnh PKU và Tyrosin huyết?

Theo số liệu tổng quan trong luận án:

  • Đối với bệnh Phenylketon niệu (PKU): Nồng độ Phe trong máu $> 120\ \mu\text{M}$ (khoảng tham chiếu bình thường: $21\text{--}93\ \mu\text{M}$) hoặc tỷ lệ nồng độ $Phe/Tyr > 3,7$ có giá trị chẩn đoán bệnh.
  • Đối với bệnh Tyrosin huyết (TYR): Nồng độ Tyr tăng rất cao trong huyết tương có giá trị chẩn đoán (ở TYR typ II: $1000\text{--}3000\ \mu\text{M}$; TYR typ III: $300\text{--}1000\ \mu\text{M}$; so với khoảng tham chiếu bình thường là $14\text{--}160\ \mu\text{M}$).

5. Sự thay đổi nồng độ muối đệm trong pha động HILIC ảnh hưởng như thế nào đến thời gian lưu của chất phân tích?

Nồng độ muối đệm làm thay đổi độ dày lớp nước hấp phụ bề mặt pha tĩnh và lực ion trong pha động. Khi tăng nồng độ muối đệm, tương tác tĩnh điện giữa chất phân tích và pha tĩnh bị suy giảm: làm giảm thời gian lưu của các chất tan tích điện trái dấu với pha tĩnh (giảm lực hút tĩnh điện) và làm tăng thời gian lưu của các chất tan tích điện cùng dấu với pha tĩnh (giảm lực đẩy tĩnh điện). Ngoài ra, nồng độ muối tăng giúp hòa tan nhiều ion vào lớp nước trên bề mặt hạt pha tĩnh (hiệu ứng "salting-in"), làm tăng thể tích lớp nước và tăng khả năng lưu giữ các chất không tích điện.

Kết luận

Luận án của tác giả Vũ Ngân Bình đã nghiên cứu một cách hệ thống cơ chế lưu giữ và các yếu tố ảnh hưởng trong sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC) đối với nhóm hợp chất phân cực acid amin. Tác giả đã phát triển thành công phương pháp HILIC-DAD định lượng đồng thời acid amin và hoạt chất phối hợp trong các chế phẩm dược phẩm đa thành phần, loại bỏ yêu cầu tạo dẫn xuất phức tạp của các quy trình truyền thống. Đồng thời, luận án đã xây dựng và thẩm định hoàn chỉnh phương pháp HILIC-MS/MS định lượng đồng thời 3 acid amin thơm trong huyết tương người với quy trình xử lý mẫu đơn giản, trực tiếp, có giá trị ứng dụng thực tế cao trong kiểm nghiệm thuốc và hỗ trợ chẩn đoán, giám sát điều trị các bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh.