ĐẶT VẤN ĐỀ Sắc ký lỏng tương tác thân nước (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography – HILIC) là kỹ thuật tách sử dụng pha tĩnh phân cực và pha động phân cực[14]. HILIC có khả năng lưu giữ tốt các chất phân cực. Các đặc điểm về cơ chế, sự lưu giữ và các yếu tố ảnh hưởng trong HILIC hiện vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu trên thế giới và các ứng dụng của HILIC ở Việt Nam chưa nhiều. Acid amin là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein, phân tử sinh học đóng vai trò chủ yếu trong sự hình thành, duy trì cấu trúc và chức năng của cơ thể sống.
Ngoài ra, các acid amin còn tham gia tổng hợp nên các hợp chất có hoạt tính sinh học và có vai trò quan trọng trong cơ thể [88]. Các chế phẩm chứa acid amin được sử dụng trong trường hợp cơ thể bị thiếu protein cần bổ sung nhanh trong thời gian ngắn [47], điều trị mất cân bằng về dẫn truyền thần kinh, chữa bệnh gan, tiểu đường, ngăn ngừa ung thư…[89] Đặc điểm làm cho việc phân tích acid amin khó khăn là do tính phân cực cao, kém lưu giữ trong sắc ký lỏng pha đảo, do đó chúng thường cần phải được dẫn xuất hoá. Với chế phẩm chứa acid amin và thành phần khác thường phải sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhau để định lượng. HILIC có thể khắc phục được nhược điểm kém lưu giữ của acid amin trong RPLC.
Bên cạnh đó, HILIC cũng có thể lưu giữ các chất có độ phân cực mạnh và trung bình khác nên có thể xây dựng phương pháp định lượng đồng thời acid amin với thành phần khác (phân cực, phân cực trung bình) trong chế phẩm đa thành phần, khắc phục nhược điểm cần sử dụng các phương pháp khác nhau cho loại chế phẩm này. Rối loạn chuyển hóa acid amin là một tình trạng bệnh tuy hiếm gặp nhưng lại có ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe của người bệnh. Trong rối loạn chuyển hóa acid amin, các enzym tham gia quá trình tổng hợp hoặc chuyển hóa acid amin bị thay đổi hoạt tính, dẫn đến nồng độ các acid amin trong cơ thể bị thay đổi đột biến, có thể nguy hiểm đến tính mạng [98]. Một nhóm rối loạn chuyển hoá hay gặp là rối loạn chuyển hoá acid amin thơm.
Bệnh thường có tiên lượng tốt nếu được phát hiện sớm nhưng lại có tỷ lệ tử vong cao nếu không được điều trị kịp thời [111]. Do đó việc xác định được các acid amin trong cơ thể là vô cùng quan trọng để phát hiện sớm các bất thường trong cơ thể, tăng cơ hội cải thiện sức khỏe cho người bệnh. Bên cạnh sàng lọc nhanh, phân tích acid amin trong máu và các dịch sinh học khác còn giúp đánh giá tình trạng bệnh nhân và theo dõi hiệu quả điều trị của phác đồ chữa bệnh. Nền mẫu dịch sinh học rất phức tạp, các nghiên cứu phân tích acid amin sử dụng kỹ thuật dẫn xuất hoá và phân tích bằng RPLC-UV thường gặp khó khăn về độ chọn lọc.
Do tính phân cực của các acid amin, các nghiên cứu sử dụng RPLC không dẫn xuất hoá kết nối với detector MS thường sử dụng pha 1 động có nhiều nước, do đó gặp vấn đề về tính tương thích của dung môi pha động với detector MS. Trong khi đó, pha động HILIC chứa tỷ lệ cao dung môi hữu cơ, thể hiện ưu điểm tương thích với detector MS. Để triển khai một kỹ thuật phân tích chưa được phổ biến nhiều ở nước ta và ứng dụng trong phân tích các acid amin, luận án “Phân tích một số acid amin bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước” được thực hiện với hai mục tiêu sau: 1. Xây dựng được phương pháp phân tích đồng thời một số acid amin cùng thành phần khác trong chế phẩm bằng HILIC-DAD và xác định được một số yếu tố ảnh hưởng đến sự lưu giữ và hình dáng pic trong HILIC.
Xây dựng được phương pháp phân tích một số acid amin thơm trong huyết tương bằng HILIC-MS/MS nhằm hỗ trợ theo dõi và điều trị bệnh rối loạn chuyển hoá các acid amin này. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC Sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC – hydrophillic interaction liquid chromatography) được định nghĩa bởi Alpert [14]. Kỹ thuật này sử dụng pha tĩnh (PT) phân cực và pha động (PĐ) phân cực, có khả năng lưu giữ tốt các chất phân cực. HILIC thể hiện ưu điểm so với sắc ký lỏng pha đảo ở khả năng lưu giữ các chất phân cực [14]; ưu điểm so với sắc ký lỏng pha thuận do sử dụng các dung môi hữu cơ an toàn, thân thiện hơn và có khả năng hoà tan các chất phân cực tốt hơn [23].
HILIC có PĐ tương thích với detector khối phổ. Để tách các hợp chất phân cực thân nước trong điều kiện thích hợp để liên kết với ESI thì HILIC là lựa chọn tốt nhất [58]. Đặc điểm các pha 1. Pha tĩnh * Phân loại pha tĩnh Pha tĩnh (PT) sử dụng trong phân tích HILIC là những bề mặt phân cực, phổ biến nhất là silica không dẫn xuất hoặc silica dẫn xuất hoá với nhiều nhóm chức phân cực khác nhau.
Ngoài ra, polyme [39], carbon graphit xốp (porous graphitic carbon), titan dioxid [82] cũng có thể được sử dụng làm vật liệu nền cho PT trong HILIC, tuy nhiên các PT trên nền silica được sử dụng nhiều hơn do hiệu lực tách tốt hơn, phổ biến hơn và ổn định hơn [60], [82]. Các PT được sử sụng đầu tiên có bản chất giống với PT trong sắc ký lỏng pha thuận. Năm 1975, Linden và Lawhead sử dụng PT amino tách các carbohydrat, sau đó, PT amid silica được dùng để tách các peptid [75], [114]. Hiện nay vật liệu chế tạo PT HILIC đa dạng và có những đặc điểm lưu giữ khác nhau [23], [39], [50], [60].
dưới đây trình bày cấu trúc một số PT thường gặp. Dựa trên cấu trúc và các tương tác với chất phân tích, các PT được chia thành PT có bề mặt không tích điện, PT tích điện dương, PT tích điện âm, PT lưỡng cực. - Pha tĩnh không tích điện Pha tĩnh này có bề mặt không tích điện trong khoảng pH từ 3-8, do đó không có tương tác trao đổi ion với các chất phân tích [39], [50]. Các PT thuộc nhóm này là các dẫn xuất của silica với các nhóm thế tạo thành pha liên kết chứa nhóm diol, cyano, amid….
Lưu ý với các PT pha liên kết chưa khoá nhóm silanol dư, ở pH PĐ trên 4, nhóm silanol tạo thành ion âm dẫn đến sự xuất hiện các tương tác tĩnh điện của PT với chất phân tích tương tự PT silica [50]. Cấu trúc của một số pha tĩnh dùng trong HILIC Vật liệu Cấu trúc của pha tĩnh Pha tĩnh không tích điện Diol Cyano Amid Pha tĩnh tích điện dương NH3+ Amino Pha tĩnh tích điện âm Silica trần Si – O – Si – O– Pha tĩnh lưỡng cực Sulfobetain Pha liên kết diol là PT đầu tiên được sử dụng trong HILIC. Các pha diol liên kết hóa học có chứa nhóm dihydroxypropyl liên kết với silica, thể hiện tính phân cực cao và có khả năng liên kết hydro, không chứa các nhóm ion khác ngoài các nhóm silanol chưa phản ứng [23]. Một dạng đặc biệt của pha liên kết diol là pha diol liên kết chéo, các 4 nhóm diol được liên kết thông qua các liên kết chéo và tạo lớp polyme trên bề mặt chứa oxyethylen và nhóm hydroxy [50].
Các PT chứa pha liên kết cyano, cụ thể là cyanopropyl có thể được sử dụng trong sắc ký pha thuận, pha đảo và HILIC, tuỳ thuộc vào PĐ. Do không có liên kết hydro nên PT này không lưu giữ quá mạnh các chất phân tích (CPT) khi áp dụng trong HILIC [39]. PT này cũng thể hiện sự không ổn định khi sử dụng dung môi phân cực [57]. Pha liên kết amid là PT thân nước có chứa nhóm aminocarbomoyl, gồm alkyl amid và pha liên kết amid.
Đây là PT có độ ổn định tốt, được ứng dụng rộng rãi trong HILIC. Bề mặt PT này rất thân nước, không tạo các liên kết hydro và tương tác ion nên tương tác với CPT ổn định, dễ kiểm soát, không phụ thuộc vào pH PĐ và ít xảy ra sự hấp phụ không thuận nghịch như PT silica [57]. PT này lưu giữ các chất phân cực không tích điện tốt hơn các PT tích điện và không tích điện khác [50]. Ngoài các PT kể trên, các PT khác thuộc nhóm không tích điện gồm hydroxy [39], silica gel loại C, polyethylen glycol, cyclodextrin, saccharid [57], poly(2-hydroxyethyl aspartamid [14].
PT cyclodextrin có thể ứng dụng trong phân tích đồng phân đối quang do có các cyclodextrin tạo phức lồng [57]. - Pha tĩnh tích điện dương PT này có nhóm tích điện dương trên bề mặt khi PĐ có pH phù hợp, do đó có tương tác tĩnh điện với CPT tích điện và tương tác hydro. Các PT thường gặp là aminopropyl silica và dẫn xuất amino trên nền polyme [57]. Với các CPT tích điện âm, tương tác hút tĩnh điện làm cho các chất này lưu giữ tốt.
Ngược lại với những chất tích điện dương, tương tác đẩy làm cho các chất này bị lưu giữ kém hơn [23], [39]. Một điểm chú ý là trong điều kiện PĐ chứa nhiều dung môi hữu cơ, lực tương tác thân nước có thể mạnh hơn so với lực tĩnh điện, làm cho các CPT mang điện tích âm cũng được lưu giữ đủ lâu trên PT trao đổi ion [15]. Nhược điểm của PT này là có thể xảy ra sự hấp phụ không thuận nghịch, đặc biệt với các CPT tích điện âm, thời gian cân bằng lâu khi dùng PĐ chứa đệm và kém ổn định trong PĐ chứa nhiều nước (giải phóng các phối tử, biến dạng hình dáng pic) [57]. Nhóm này còn có PT imidazol, triazol tuy nhiên có ít ứng dụng trong HILIC [83].
- Pha tĩnh tích điện âm PT thuộc loại này là các PT chứa hạt silica không dẫn xuất hay còn gọi là silica trần có chứa nhóm silanol (Si-OH) trên bề mặt làm cho bề mặt của PT có tính phân cực và có khả năng tạo liên kết hydro với các CPT. Ở pH thích hợp (>4), nhóm silanol có thể phân ly tạo thành nhóm tích điện âm Si-O–, làm cho bề mặt PT trở nên phân cực hơn và 5 có khả năng trao đổi cation với các CPT do đó tăng khả năng lưu giữ các CPT tích điện dương [39], [57]. Độ tinh khiết của hạt silica và quá trình chế tạo ảnh hưởng lớn tới khả năng tách và hình dáng pic sắc ký [57]. Silica gel loại A được kết tủa từ các dung dịch silicat, có tính acid, bị nhiễm các kim loại nên có thể tạo phức chelat với CPT, gây ra sự lưu giữ mạnh hoặc pic không đối xứng.
