Tổng quan luận án

Đề tài "Nghiên cứu chế tạo và đặc trưng tính chất của tổ hợp carrageenan/collagen (từ vảy cá) mang dược chất allopurinol" do nghiên cứu sinh Vi Quốc Mạnh thực hiện tại Phòng Hoá lý vật liệu phi kim loại thuộc Viện Kỹ thuật nhiệt đới – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. Thái Hoàng và PGS. Vũ Quốc Trung. Luận án thuộc chuyên ngành Hoá Hữu cơ (mã số: 9440114), được bảo vệ vào năm 2024 tại Học viện Khoa học và Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với sự tài trợ kinh phí từ Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) qua đề tài mã số 104.326 giai đoạn 2018–2021.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Trong lĩnh vực vật liệu polyme y sinh phục vụ phân phối và truyền dẫn thuốc, hệ hydrogel từ polyme thiên nhiên nhận được sự quan tâm lớn nhờ tính tương thích sinh học, khả năng phân hủy sinh học tự nhiên và tính an toàn cao đối với cơ thể người. Carrageenan là polysaccarid sunfat hóa chiết xuất từ rong đỏ, có khả năng tạo hydrogel khi tương tác với các cation như K+ hoặc Ca2+, đóng vai trò làm giá mang thuốc nhạy nhiệt độ và pH. Trong khi đó, collagen là một loại protein cấu trúc có chức năng bảo vệ dược chất khỏi các tác nhân gây thoái hóa như ánh sáng và oxy. Tuy nhiên, nguồn collagen thương mại truyền thống chủ yếu khai thác từ da và xương động vật trên cạn (bò, lợn), tiềm ẩn rủi ro lây truyền các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm như bệnh bò điên (BSE) hay lở mồm long móng.

Nhằm khắc phục nhược điểm này, việc trích ly collagen từ phụ phẩm công nghiệp chế biến thủy sản—đặc biệt là vảy cá—được xác định là giải pháp thay thế an toàn và có giá trị kinh tế. Tại Việt Nam, nguồn phế phẩm vảy cá nước ngọt thuộc họ cá Chép (Cyprinidae) rất dồi dào nhưng chưa có công trình nào nghiên cứu trích ly và tinh chế một cách hệ thống, cũng như chưa có nghiên cứu nào kết hợp collagen vảy cá với carrageenan để tạo thành hệ vật liệu tổ hợp mang và giải phóng có kiểm soát dược chất allopurinol—một hoạt chất ức chế enzym xanthine oxidase dùng trong điều trị bệnh gút và hội chứng tăng acid uric máu.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định 3 mục tiêu cụ thể:

  1. Xây dựng được quá trình trích ly collagen từ vảy cá nước ngọt Việt Nam (bao gồm: cá chép - Cyprinus carpio, cá trôi - Labeo rohita, cá trắm cỏ - Ctenopharyngodon idella, và cá rô phi - Oreochromis niloticus).
  2. Chế tạo được tổ hợp polyme thiên nhiên carrageenan/collagen (từ vảy cá) chứa allopurinol ở dạng màng và dạng hạt bằng phương pháp dung dịch và phương pháp gel – ion hóa.
  3. Đánh giá được khả năng làm giảm acid uric trong máu từ việc sử dụng tổ hợp polyme thiên nhiên carrageenan/collagen (từ vảy cá) chứa allopurinol trên mô hình động vật thực nghiệm.

Nội dung và nhiệm vụ nghiên cứu

Để thực hiện các mục tiêu trên, tác giả triển khai 4 nội dung nghiên cứu chính:

  1. Nghiên cứu điều kiện trích ly collagen từ vảy các loài cá nước ngọt Việt Nam (Cyprinus carpio, Labeo rohita, Ctenopharyngodon idella, Oreochromis niloticus).
  2. Nghiên cứu điều kiện chế tạo và tỷ lệ phối trộn thành phần giữa carrageenan và collagen (từ vảy cá) mang allopurinol để thu được tổ hợp dạng màng và dạng hạt bằng phương pháp dung dịch và phương pháp gel – ion hóa.
  3. Nghiên cứu quá trình và động học giải phóng dược chất allopurinol từ các hệ vật liệu tổ hợp Car/C/ALP trong các môi trường pH khác nhau.
  4. Thử nghiệm in vivo trên chuột (chuột bình thường và chuột gây tăng acid uric máu bằng tiêm phúc mạc potassium oxalate) để đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và hiệu quả làm giảm nồng độ acid uric trong máu.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Polyme carrageenan (Car); collagen (C) trích ly từ hỗn hợp vảy cá nước ngọt họ cá Chép; dược chất allopurinol (ALP); màng tổ hợp carrageenan/collagen/allopurinol (CCA); hạt tổ hợp nano carrageenan/collagen/allopurinol (ACC); chuột nhắt trắng thử nghiệm độc tính và hoạt tính sinh học.
  • Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát quy trình xử lý hóa học vảy cá ở quy mô phòng thí nghiệm; đánh giá cấu trúc hóa lý và đặc trưng nhiệt của vật liệu; khảo sát giải phóng thuốc in vitro ở môi trường đệm mô phỏng dạ dày (pH 2,0) và ruột/sinh lý (pH 7,4); thử nghiệm tiền lâm sàng in vivo trên chuột trong thời gian tối đa 28 ngày.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam

Tác giả đã tiến hành tổng quan hệ thống các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến ba mảng kiến thức chính: trích ly collagen từ thủy sản, chiết xuất và ứng dụng carrageenan, cùng các hệ polyme mang dược chất:

  1. Nghiên cứu trích ly collagen từ phụ phẩm cá:

    • Theo thống kê của Caruso và cộng sự, hơn 50% khối lượng cá (vây, đầu, da, nội tạng, vảy) bị thải bỏ dưới dạng phế phẩm, tương đương trên 20 triệu tấn mỗi năm trên toàn cầu.
    • Huang và cộng sự áp dụng áp suất cao để tách collagen từ vảy cá rô phi, đạt hiệu suất 7,5–12,3%, cao gấp 2–3 lần phương pháp acid acetic thông thường.
    • Tan và cộng sự so sánh các loại acid (acetic, HCl, citric, lactic) để chiết collagen da cá da trơn, ghi nhận phương pháp đồng nhất hóa kết hợp pepsin và HCl ở pH 2,4 cho hiệu suất thu hồi protein cao nhất đạt 64,19%. Arumugam và cộng sự chỉ ra nồng độ acetic acid 0,6 M cho lượng collagen cực đại là 15,968 mg/g.
    • Senaratne và cộng sự trích ly collagen từ da cá nóc (Lagocephalus gloveri) bằng cách khử protein phi collagen với NaOH 0,1 N trong 3 ngày, tẩy béo bằng butyl alcohol 10% trong 24 giờ, ngâm acetic acid 0,5 M kết hợp pepsin trong 48 giờ, thu được collagen có cấu trúc 3 chuỗi alpha1, alpha2, alpha3 với hiệu suất 54,3% và nhiệt độ biến tính 28°C.
    • Lin Wang và cộng sự chiết collagen từ da, vảy và xương cá đỏ (Sebastes mentella) sử dụng NaOH 1 M, EDTA 0,5 M, hexan và acetic acid 0,5 M, đạt hiệu suất lần lượt là 47,5%, 6,8% và 10,3%.
    • Chun Yung Huang áp dụng phương pháp đùn – thủy phân – chiết (EHE) để phá vỡ liên kết giữa collagen và hydroxyapatite trong vảy cá rô phi.
    • Bhagwat và cộng sự xử lý khử khoáng vảy cá chép bằng NaCl 1 M, Tris-HCl 0,05 M, EDTA 20 mM trong 48 giờ rồi chiết bằng CH3COOH 0,5 M; Oktarlina và cộng sự thu nhận micro-collagen vảy cá chép (Cyprinus carpio) kích thước 668–1581 nm với hiệu suất 8,62%; Robert Gál và cộng sự trích ly gelatin từ xương cá chép đạt hiệu suất 18,7–55,7%.
    • Tại Việt Nam, các nghiên cứu tách chiết chủ yếu tập trung trên da cá tra và cá basa: Nguyễn Đỗ Quỳnh và Nguyễn Lê Anh Đào trích ly gelatin từ da cá tra đạt hiệu suất 5,57%; Trần Thị Huyền và cộng sự xử lý da cá tra với NaOH 0,2 M, acid citric 0,003 M, acetic acid 0,5 M và kết tủa bằng NaCl 2,5 M, đạt hiệu suất 76,9% tính theo khối lượng khô; Võ Quốc Văn và Hà Thanh Toàn chiết tách gelatin da cá tra ở 50°C trong CH3COOH 0,05 M; Trương Thị Mộng Thu và cộng sự chiết collagen da cá lóc (Channa striata) bằng dung dịch butyl alcohol 10% và pepsin 0,45%.

  2. Nghiên cứu chiết xuất và chế biến carrageenan:

    • Andi Hasiah và cộng sự chiết carrageenan từ Eucheuma spinosum bằng nhiệt điện trở với hiệu suất cực đại 61,59% ở 95°C, dung dịch KOH 0,4 M trong 240 phút; Webber và cộng sự tối ưu hóa quá trình chiết đạt hiệu suất 31,17%; Anisuzzaman và cộng sự sử dụng kỹ thuật sấy phun trên rong Kappaphycus alvarezii xử lý kiềm KOH 6,70%; các phương pháp sử dụng enzyme cellulase hoặc chiếu xạ vi sóng được nghiên cứu bởi nhiều nhóm tác giả quốc tế.
    • Tại Việt Nam, Đào Trọng Hiếu nghiên cứu quy trình tách chiết carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii bằng NaOH 6% ở 30°C và nấu chiết ở 102°C với KCl 0,06%; Nguyễn Thị Thu Thùy và cộng sự xử lý rong sụn Ninh Thuận với KOH 6,5% ở 95°C cho hiệu suất 48,31%; Trần Thị Luyến chiết carrageenan bán tinh chế ở Khánh Hòa đạt hiệu suất 70%; Lê Thị Thúy Hằng và cộng sự sử dụng enzym Viscozyme L xử lý rong sụn ở 42°C, pH 5,1.

  3. Nghiên cứu hệ chất mang polyme tự nhiên và polyme tổ hợp:

    • Hệ mang trên nền carrageenan: nạp theophylline, sodium salicylate và chlorpheniramine maleate tuân theo động học bậc 0 trong 8–12 giờ; hệ kappa-Car mang curcumin giải phóng ở pH 5,0 nhanh hơn pH 7,4; hệ hydrogel CMC/kappa-Car cố định tế bào vi khuẩn L. plantarum; phức hợp iota-Car mang diltiazem HCl hoặc metoprolol tartrate; các hạt nanocomposit từ tính carrageenan mang thuốc kháng viêm và chống ung thư.
    • Hệ mang trên nền collagen: màng collagen/poly(N-isopropylacrylamide) mang peptide chống viêm; hydrogel collagen/PVA mang hormon tăng trưởng GH giải phóng phụ thuộc hàm lượng collagen.
    • Hệ tổ hợp polyme: hạt hydrogel chitosan/carrageenan của Piyakulawat và cộng sự mang diclofenac sodium duy trì giải phóng 8–24 giờ; tổ hợp carboxymethyl chitosan/kappa-Car; tổ hợp CAF (collagen/alginat/sợi) của Montalbano và cộng sự ứng dụng kỹ thuật mô; màng tổ hợp CoL/Ch/DBC của Ming-Mao Chen và cộng sự mang doxorubicin.

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án giải quyết

Mặc dù các nghiên cứu đơn lẻ về collagen da cá hoặc carrageenan rong biển đã được công bố, chưa có công trình nào nghiên cứu toàn diện từ khâu xây dựng quy trình công nghệ khử khoáng, khử tạp chất trên hỗn hợp vảy cá nước ngọt họ cá Chép Việt Nam để thu collagen tinh khiết, đến việc phối hợp hai polyme thiên nhiên này (carrageenan và collagen vảy cá) nhằm chế tạo màng và hạt nano tổ hợp mang dược chất allopurinol, đồng thời tiến hành thử nghiệm toàn diện động học giải phóng in vitro và hoạt tính hạ acid uric máu in vivo.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết, khái niệm và khung phân tích

  • Cấu trúc phân tử collagen: Đơn vị cấu trúc cơ bản là tropocollagen dạng xoắn ba (triple helix) có chiều dài khoảng 300 nm, đường kính 1,5 nm, khối lượng phân tử khoảng 300 kDa. Phân tử gồm ba chuỗi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối hydro giữa các nhóm –CO– và –NH–. Mỗi chuỗi chứa khoảng 1050 amino acid với trình tự lặp lại Gly-X-Y (X thường là proline, Y thường là hydroxyproline hoặc hydroxylysine). Nhóm hydroxyl của hydroxyproline hướng ra ngoài, liên kết với các phân tử nước tạo thành cầu nước ổn định cấu trúc xoắn.
  • Cấu trúc và tính chất của carrageenan: Là nhóm galactan sulfate gồm các gốc D-galactose liên kết xen kẽ với 3,6-anhydro-D-galactose bằng liên kết beta-(1,3) và beta-(1,4) glycosid. Phân loại thành kappa-Car (chứa 25–30% este sulfate, 28–35% 3,6-AG), iota-Car (chứa 28–30% este sulfate, 25–30% 3,6-AG) và lambda-Car (chứa 32–39% este sulfate, không có 3,6-AG). Cơ chế tạo mạng hydrogel của carrageenan dựa trên sự chuyển đổi từ cấu trúc cuộn ngẫu nhiên ở nhiệt độ cao sang cấu trúc xoắn đôi khi hạ nhiệt độ, liên kết mạng không gian 3 chiều dưới sự hỗ trợ của các ion K+ hoặc Ca2+.
  • Dược chất Allopurinol (ALP): Là hoạt chất ức chế cạnh tranh với enzym xanthine oxidase, ngăn cản quá trình chuyển hóa xanthine và hypoxanthine thành acid uric trong cơ thể, dùng trong điều trị gút nguyên phát và thứ phát.

Phương pháp thực nghiệm và kỹ thuật chế tạo

  1. Quy trình trích ly collagen từ vảy cá họ cá Chép (4 bước):

    • Bước 1 (Sơ chế thô): Rửa sạch vảy cá tươi bằng nước sạch để loại bỏ chất bẩn, bùn đất, sau đó sấy khô nhẹ hoặc để ráo.
    • Bước 2 (Xử lý kiềm): Ngâm vảy cá trong dung dịch NaOH (khảo sát các nồng độ từ 0,1 M đến 1,0 M và thời gian từ 2 đến 12 giờ) nhằm loại bỏ protein phi collagen, chất béo và sắc tố.
    • Bước 3 (Khử khoáng bằng acid): Xử lý vảy cá đã qua kiềm bằng dung dịch hỗn hợp acid để hòa tan muối khoáng canxi và hydroxyapatite.
    • Bước 4 (Thu hồi và tinh chế collagen thô): Chiết collagen bằng dung dịch acid hữu cơ loãng, kết tủa phân đoạn bằng dung dịch muối NaCl, ly tâm thu kết tủa, thẩm tích qua màng bán thấm trong 24–48 giờ để loại muối thừa và đông khô thu collagen tinh khiết.

  2. Chế tạo màng tổ hợp carrageenan/collagen/allopurinol (CCA):

    • Hòa tan carrageenan trong nước cất ở 70–80°C, bổ sung dung dịch collagen vảy cá theo các tỷ lệ khối lượng xác định, thêm chất tạo gel KCl 1%, sau đó phối trộn allopurinol dạng phân tán mịn. Rót hỗn hợp ra đĩa petri và làm bay hơi dung môi ở nhiệt độ phòng để thu màng mỏng đồng nhất.

  3. Chế tạo hạt tổ hợp nano carrageenan/collagen/allopurinol (ACC):

    • Sử dụng phương pháp tạo gel ion hóa kết hợp tương tác polyelectrolyte: hòa tan collagen và allopurinol trong dung dịch phân tán, nhỏ giọt vào dung dịch carrageenan chứa KCl dưới điều kiện khuấy từ tốc độ cao và siêu âm phân tán để tạo hạt nano, sau đó thu hồi bột hạt tổ hợp bằng ly tâm và sấy khô.

Phương pháp phân tích và đánh giá cấu trúc

Luận án sử dụng các phương pháp hóa lý:

  • Kính hiển vi điện tử quét (SEM): Khảo sát hình thái bề mặt màng, kích thước và hình thái hạt nano tổ hợp.
  • Tán xạ ánh sáng động (DLS): Xác định đường kính hạt trung bình và phân bố kích thước hạt trong dung dịch.
  • Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR): Xác định các nhóm chức đặc trưng (Amide A, B, I, II, III của collagen; liên kết este sulfate, liên kết C-O-C của carrageenan; tương tác liên kết hydro giữa polyme và dược chất).
  • Nhiễu xạ tia X (XRD): Phân tích trạng thái kết tinh hoặc vô định hình của dược chất allopurinol trong mạng polyme tổ hợp.
  • Phân tích nhiệt (DSC và TGA/DTG): Xác định nhiệt độ biến tính, nhiệt độ nóng chảy và độ bền nhiệt của collagen, carrageenan và các mẫu tổ hợp CCA, ACC.
  • Điện di gel SDS-PAGE: Xác định khối lượng phân tử và các dải chuỗi polypeptide của collagen trích ly.
  • Phổ phát xạ tia X phân tán năng lượng (EDX): Định lượng tỷ lệ phần trăm khối lượng các nguyên tố trong mẫu collagen trước và sau khi thẩm tích.
  • Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và quang phổ UV-Vis: Xây dựng đường chuẩn allopurinol, định lượng hiệu suất nạp thuốc và xác định nồng độ thuốc giải phóng theo thời gian.

Đánh giá động học giải phóng in vitro

Khảo sát sự giải phóng allopurinol từ màng CCA và hạt ACC trong dung dịch đệm pH 2,0 (mô phỏng dịch dạ dày) và pH 7,4 (mô phỏng dịch ruột/huyết tương) ở 37°C. Dữ liệu giải phóng được xử lý theo 5 mô hình toán học:

  • Phương trình động học bậc 0 (Zero Order - ZO)
  • Phương trình động học bậc 1 (First Order - FO)
  • Phương trình Higuchi (HG)
  • Phương trình Hixson-Crowell (HC)
  • Phương trình Korsmeyer-Peppas (KP)

Phương pháp thử nghiệm sinh học in vivo

  • Đối tượng: Chuột nhắt trắng dòng Swiss.
  • Thử nghiệm độc tính cấp: Cho chuột uống hạt tổ hợp nano ACC19-10 ở các mức liều tăng dần (pha dò liều và pha thử nghiệm độc tính), theo dõi triệu chứng lâm sàng và tỷ lệ sống sót sau 72 giờ; giải phẫu quan sát đại thể gan, thận, lách.
  • Thử nghiệm độc tính bán trường diễn: Cho chuột uống lặp lại liều ACC19-10 trong 14 ngày và 28 ngày. Đánh giá biến thiên khối lượng cơ thể, các chỉ số huyết học, các chỉ số sinh hóa máu (AST, ALT, creatinin, ure), trọng lượng cơ quan nội tạng và phân tích mô bệnh học vi thể gan, thận, lách.
  • Thử nghiệm hạ acid uric máu: Mô hình hóa tăng acid uric máu bằng tiêm phúc mạc dung dịch potassium oxalate (K2C2O4). Chia thành các lô thử nghiệm: lô chứng trắng (chuột bình thường), lô chứng bệnh (tiêm K2C2O4 không điều trị), lô đối chứng uống allopurinol tự do và lô điều trị uống hạt tổ hợp nano ACC19-10. Định lượng nồng độ acid uric huyết thanh và tính toán tỷ lệ hạ acid uric ở các thời điểm.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý thuyết và các nghiên cứu liên quan đến cấu trúc, tính chất của collagen, carrageenan và các hệ polyme mang dược chất:

  • Tổng quan về collagen: Trình bày chi tiết phân loại 28 loại collagen trong cơ thể sống, chia thành dạng tạo sợi (Type I, II, III, V, XI, XXIV, XXVII) và dạng không tạo sợi (dạng màng, chuỗi hạt, chuỗi ngắn, FACIT, chuyển màng). Phân tích cấu trúc phân tử của chuỗi xoắn ba [alpha1(I)]2 alpha2(I) của collagen loại I, sự tham gia của hydroxyproline tạo cầu nối liên kết hydro trung gian qua phân tử nước để duy trì độ bền nhiệt. Nêu rõ tính chất hút ẩm, độ trương nở, hiện tượng biến tính thành gelatin khi gia nhiệt trên 60°C hoặc đun sôi, cũng như phản ứng lưỡng tính của collagen trong môi trường acid và kiềm.
  • Tổng quan về carrageenan: Trình bày cấu tạo phân tử galactan sulfate gồm các gốc D-galactose và 3,6-anhydrogalactose. Mô tả đặc tính tạo gel, độ tan và độ nhớt của các phân loại kappa-, iota- và lambda-carrageenan. Phân tích cơ chế tạo gel phụ thuộc vào cation K+ (tạo gel cứng, chắc với kappa-Car) và Ca2+ (tạo gel đàn hồi với iota-Car).
  • Tổng quan về polyme mang dược chất: Điểm lại các nghiên cứu ứng dụng carrageenan, collagen và tổ hợp polyme thiên nhiên (Car/Chitosan, Car/PVA, Collagen/PVA, Collagen/Alginate) trong việc bào chế viên nén, màng giải phóng chậm và hạt nano nhạy pH.
  • Tổng quan về allopurinol: Trình bày cơ chế sinh hóa chuyển hóa purine thành acid uric qua trung gian enzym xanthine oxidase, cấu trúc hóa lý của allopurinol và hạn chế của dạng thuốc tự do (thời gian bán thải ngắn, nguy cơ kích ứng tiêu hóa, phân bố không chọn lọc), khẳng định sự cần thiết của việc tạo hệ mang polyme giải phóng kéo dài.

Chương 2: Thực nghiệm

Chương 2 trình bày toàn bộ hóa chất, trang thiết bị, quy trình chế tạo mẫu và phương pháp đo đạc thực nghiệm.

Tác giả đã tổng hợp danh mục thành phần phối trộn để chế tạo các dãy mẫu màng (CCA) và mẫu hạt (ACC) như trong hai bảng dưới đây:

Bảng 1: Thành phần và ký hiệu các mẫu màng tổ hợp carrageenan/collagen/allopurinol (CCA)

STT Ký hiệu mẫu màng Carrageenan (g) Collagen (g) Allopurinol (g) KCl (g)
1 CC955-0 0,095 0,005 0 0,001
2 CCA991-5 0,099 0,001 0,005 0,001
3 CCA973-5 0,097 0,003 0,005 0,001
4 CCA955-5 0,095 0,005 0,005 0,001
5 CCA937-5 0,093 0,007 0,005 0,001
6 CCA9010-5 0,090 0,010 0,005 0,001
7 CCA955-3 0,095 0,005 0,003 0,001
8 CCA955-10 0,095 0,005 0,010 0,001
9 CCA955-15 0,095 0,005 0,015 0,001
10 CaA5 0,100 0 0,005 0,001
11 CoA5 0 0,100 0,005 0,001

Bảng 2: Thành phần và ký hiệu các mẫu hạt tổ hợp carrageenan/collagen/allopurinol (ACC)

STT Ký hiệu mẫu hạt Carrageenan (g) Collagen (g) Allopurinol (g) KCl (g)
1 ACC19-5 0,010 0,090 0,005 0,001
2 ACC19-10 0,010 0,090 0,010 0,001
3 ACC19-15 0,010 0,090 0,015 0,001
4 ACC28-10 0,020 0,080 0,010 0,001
5 ACC55-10 0,050 0,050 0,010 0,001
6 ACC64-10 0,060 0,040 0,010 0,001

Chương này cũng thiết lập chi tiết quy trình xây dựng đường chuẩn allopurinol bằng phương pháp phổ hấp thụ UV-Vis và HPLC, xác định hàm lượng thuốc được nạp vào chất mang và đo lượng thuốc giải phóng theo các mốc thời gian trong dung dịch đệm pH 2,0 và pH 7,4. Đồng thời, mô tả thiết kế thử nghiệm in vivo trên các nhóm chuột thí nghiệm.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

  1. Kết quả trích ly và đặc trưng collagen vảy cá:

    • Khảo sát xử lý kiềm: Đánh giá trực quan và hiệu suất khử protein phi collagen, lipid trên vảy cá theo thời gian và nồng độ dung dịch NaOH. Kết quả cho thấy xử lý vảy cá bằng NaOH 0,5 M trong thời gian 8 giờ loại bỏ triệt để sắc tố và chất béo bám dính mà không làm phân hủy sâu chuỗi collagen.
    • Khảo sát khử khoáng bằng acid: Đánh giá ảnh hưởng của các nồng độ acid khác nhau đến hiệu suất thu hồi collagen. Xử lý khử khoáng triệt để giúp hòa tan muối vô cơ.
    • Độ tinh khiết và thành phần nguyên tố: Phổ EDX cho thấy sau khi thẩm tích 24 giờ và 48 giờ, tỷ lệ phần trăm khối lượng các tạp chất vô cơ giảm rõ rệt, khẳng định độ tinh khiết của collagen tinh chế.
    • Thành phần acid amin: Kết quả phân tích dịch collagen (kết tinh lần 1) xác nhận sự hiện diện đầy đủ của các acid amin đặc trưng, trong đó chiếm tỷ lệ chủ yếu là Glycine, Proline và Hydroxyproline.
    • Cấu trúc và hình thái: Phổ FTIR của collagen sau thẩm tích 48 giờ xuất hiện rõ các dải hấp thụ đặc trưng của Amide A, B, I, II và III. Ảnh SEM thể hiện cấu trúc sợi liên kết xốp. Giản đồ DSC và TGA/DTG xác nhận nhiệt độ biến tính nhiệt và các giai đoạn phân hủy khối lượng của mẫu collagen tinh khiết. Kết quả điện di SDS-PAGE khẳng định cấu trúc các chuỗi alpha1 và alpha2 đặc trưng của collagen loại I.

  2. Đặc trưng và động học giải phóng của màng tổ hợp CCA:

    • Cấu trúc và hình thái: Phổ FTIR của màng CCA cho thấy sự dịch chuyển số sóng của các nhóm chức đặc trưng, chứng minh tương tác liên kết hydro giữa allopurinol, carrageenan và collagen. Giản đồ XRD của allopurinol tinh khiết có các đỉnh nhiễu xạ sắc nhọn đặc trưng cho cấu trúc tinh thể, trong khi trên màng CCA955-5 (tỷ lệ Car/C = 95/5, 1% KCl), các đỉnh này suy giảm mạnh hoặc chuyển sang dạng vô định hình. Ảnh SEM chỉ ra màng có bề mặt phẳng, đồng nhất, allopurinol phân tán đều trong mạng polyme.
    • Đặc trưng nhiệt: Giản đồ DSC và TGA chỉ ra màng tổ hợp CCA có độ bền nhiệt cao hơn so với các polyme đơn lẻ.
    • Động học giải phóng in vitro: Khảo sát giải phóng allopurinol từ các mẫu màng trong đệm pH 2,0 và pH 7,4. Kết quả cho thấy trong môi trường pH 2,0 (mô phỏng dịch dạ dày), lượng allopurinol giải phóng ra môi trường rất thấp. Ngược lại, trong dung dịch đệm pH 7,4 (mô phỏng dịch ruột), allopurinol được giải phóng từ từ và kéo dài.
    • Mô hình hóa động học: Bảng giá trị hệ số tương quan R2 từ các phương trình động học (ZO, FO, Higuchi, Hixson-Crowell, Korsmeyer-Peppas) ở cả hai môi trường pH 2,0 và pH 7,4 cho thấy quá trình giải phóng tuân theo mô hình Korsmeyer-Peppas và Higuchi, đặc trưng bởi cơ chế khuếch tán thuốc có kiểm soát qua mạng hydrogel trương nở.

  3. Đặc trưng và động học giải phóng của hạt tổ hợp nano ACC:

    • Phổ FTIR và kích thước hạt: Phổ FTIR của các hạt tổ hợp ACC (ACC19-5, ACC19-10, ACC19-15, ACC28-10, ACC55-10, ACC64-10) khẳng định sự liên kết bền vững giữa các thành phần. Kết quả DLS và ảnh SEM cho thấy các hạt tổ hợp nano có dạng hình cầu, bề mặt tương đối đồng đều. Kích thước hạt trung bình biến thiên phụ thuộc vào tỷ lệ Car/C và nồng độ allopurinol nạp vào.
    • Đặc trưng nhiệt: Phân tích DSC của các mẫu hạt tổ hợp nano (ACC28-10, ACC55-10, ACC64-10) cho thấy allopurinol tồn tại ở trạng thái phân tán phân tử/vô định hình trong mạng polyme.
    • Hiệu suất mang và giải phóng: Hiệu suất mang allopurinol của hạt nano ACC đạt mức cao. Tốc độ giải phóng allopurinol trong đệm pH 2,0 bị ức chế mạnh, trong khi ở pH 7,4 quá trình giải phóng diễn ra liên tục, kéo dài qua nhiều giờ và tuân theo mô hình động học khuếch tán.

  4. Thử nghiệm sinh học in vivo trên động vật:

    • Độc tính cấp: Chuột sau 72 giờ uống hạt tổ hợp nano ACC19-10 ở cả pha dò liều và pha thử độc tính đều sống 100%, hoạt động bình thường, không ghi nhận dấu hiệu ngộ độc lâm sàng. Quan sát đại thể gan, lách, thận không phát hiện tổn thương xuất huyết hay hoại tử.
    • Độc tính bán trường diễn: Theo dõi chuột uống ACC19-10 sau 14 ngày và 28 ngày ghi nhận: khối lượng cơ thể chuột tăng trưởng đều đặn tương đương nhóm chứng; các chỉ số huyết học (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, huyết sắc tố) và các chỉ số sinh hóa máu (AST, ALT, ure, creatinin) duy trì trong giới hạn sinh lý bình thường; trọng lượng gan, thận, lách không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê so với lô chứng; hình ảnh vi thể nhu mô gan, thận, lách không xuất hiện tổn thương cấu trúc tế bào.
    • Hiệu quả hạ acid uric máu: Trên mô hình chuột bị gây tăng acid uric máu bằng tiêm phúc mạc potassium oxalate (K2C2O4), nồng độ acid uric ở nhóm chứng bệnh tăng cao rõ rệt so với nhóm chứng trắng. Ở nhóm chuột được uống hạt tổ hợp nano ACC19-10, nồng độ acid uric trong máu giảm mạnh theo thời gian, tỷ lệ giảm acid uric máu đạt mức vượt trội so với lô đối chứng sử dụng allopurinol tự do ở cùng mức liều.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt khoa học và lý luận

  1. Đã thiết lập được quy trình công nghệ 4 bước hoàn chỉnh để trích ly và tinh chế collagen loại I từ hỗn hợp vảy cá nước ngọt họ cá Chép (Cyprinus carpio, Labeo rohita, Ctenopharyngodon idella, Oreochromis niloticus) tại Việt Nam bằng phương pháp hóa học kết hợp xử lý kiềm NaOH 0,5 M trong 8 giờ, khử khoáng bằng acid và tinh chế qua màng thẩm tích 48 giờ. Sản phẩm collagen thu được giữ nguyên cấu trúc xoắn ba đặc trưng, độ tinh khiết cao và có đầy đủ các dải peptide alpha1, alpha2.
  2. Làm sáng tỏ cơ chế tương tác liên kết hydro và tương tác tĩnh điện giữa polyme tích điện âm carrageenan, polyme lưỡng tính collagen vảy cá và phân tử dược chất allopurinol trong mạng hydrogel tạo bởi ion K+.
  3. Xác lập bản chất động học giải phóng allopurinol từ màng CCA và hạt nano ACC: hệ vật liệu có khả năng bảo vệ dược chất trong môi trường acid dạ dày (pH 2,0) và giải phóng kéo dài có kiểm soát trong môi trường pH 7,4 theo cơ chế khuếch tán mô tả bởi mô hình Korsmeyer-Peppas và Higuchi.

Đóng góp về mặt thực tiễn và ứng dụng

  1. Đã chế tạo thành công hai dạng vật liệu tổ hợp mang allopurinol: dạng màng mỏng (CCA) và dạng hạt nano (ACC) với hiệu suất nạp thuốc cao, trạng thái dược chất phân tán vô định hình đồng nhất.
  2. Cung cấp đầy đủ bằng chứng thực nghiệm tiền lâm sàng in vivo trên chuột chứng minh hạt nano tổ hợp ACC19-10 an toàn tuyệt đối về mặt độc tính cấp (72 giờ) và độc tính bán trường diễn (28 ngày), đồng thời có tác dụng hạ nồng độ acid uric trong máu ở chuột gây tăng acid uric bằng potassium oxalate hiệu quả hơn so với dạng allopurinol thương phẩm tự do.
  3. Mở ra giải pháp kỹ thuật hữu ích trong việc tận dụng nguồn phế phẩm vảy cá nước ngọt dồi dào của ngành thủy sản Việt Nam để tạo ra sản phẩm y sinh có giá trị gia tăng cao.

Kiến nghị và đề xuất

  • Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện và nâng cấp quy trình trích ly collagen vảy cá ở quy mô pilot hoặc bán công nghiệp.
  • Mở rộng thử nghiệm dược động học (pharmacokinetics) chuyên sâu và thử nghiệm lâm sàng trên các đối tượng động vật bậc cao hơn trước khi ứng dụng vào sản xuất chế phẩm hỗ trợ điều trị bệnh gút.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

  1. Nghiên cứu thực nghiệm trích ly collagen và chế tạo màng/hạt tổ hợp mới chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (lab-scale), chưa khảo sát các yếu tố vận hành ở quy mô sản xuất công nghiệp.
  2. Thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học in vivo mới được thực hiện trên đối tượng chuột nhắt trắng với thời gian theo dõi bán trường diễn tối đa là 28 ngày; chưa đánh giá tác dụng trên các dòng động vật lớn hơn cũng như chưa theo dõi độc tính trường diễn dài ngày.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  1. Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình trích ly collagen vảy cá bằng phương pháp kết hợp enzym protease để nâng cao hơn nữa hiệu suất thu hồi và giảm thiểu sử dụng hóa chất.
  2. Khảo sát khả năng ứng dụng của hệ tổ hợp carrageenan/collagen vảy cá để mang các hoạt chất dược lý hoặc hợp chất thiên nhiên kém tan khác.
  3. Triển khai các nghiên cứu tiền lâm sàng mở rộng về dược động học, sinh khả dụng và thử nghiệm lâm sàng chế phẩm nano allopurinol trên người bệnh gút.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao đối với:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hoá Hữu cơ, Hoá lý Polyme, Công nghệ Vật liệu sinh học và Bào chế Dược phẩm: Có thể tham khảo phương pháp luận kết hợp giữa khoa học vật liệu polyme và thử nghiệm dược lý sinh học.
  • Giảng viên và nhà nghiên cứu tại các trường đại học, viện nghiên cứu: Cung cấp số liệu thực nghiệm gốc về cấu trúc phân tử, phổ FTIR, giản đồ XRD, phân tích nhiệt DSC/TGA và các mô hình toán học giải phóng dược chất.
  • Các doanh nghiệp chế biến thủy sản và sản xuất dược phẩm: Cung cấp quy trình công nghệ định hướng tận dụng vảy cá nước ngọt để sản xuất nguyên liệu collagen y sinh chất lượng cao, giảm thiểu ô nhiễm môi trường và phát triển các dạng thuốc mới giải phóng có kiểm soát.

Câu hỏi thường gặp

1. Nguồn nguyên liệu vảy cá sử dụng trong luận án gồm những loài nào?

Tác giả sử dụng nguồn phụ phẩm vảy của 4 loài cá nước ngọt phổ biến tại Việt Nam thuộc họ cá Chép (Cyprinidae), bao gồm: cá chép (Cyprinus carpio), cá trôi (Labeo rohita), cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idella) và cá rô phi (Oreochromis niloticus).

2. Quy trình trích ly collagen từ vảy cá gồm những giai đoạn chính nào?

Quy trình gồm 4 bước: (1) Sơ chế làm sạch nguyên liệu thô; (2) Xử lý bằng dung dịch kiềm NaOH 0,5 M trong 8 giờ để loại bỏ protein phi collagen và chất béo; (3) Xử lý khử khoáng bằng dung dịch hỗn hợp acid; (4) Trích ly collagen bằng acid hữu cơ loãng, kết tủa phân đoạn bằng muối NaCl và tinh chế qua màng thẩm tích trong 48 giờ trước khi sấy đông khô.

3. Tổ hợp polyme Car/C/ALP được chế tạo thành những dạng cấu trúc nào?

Luận án chế tạo thành công 2 dạng cấu trúc: (1) Dạng màng tổ hợp (ký hiệu CCA) bằng phương pháp bốc hơi dung dịch với tác nhân tạo gel KCl 1%; (2) Dạng hạt tổ hợp nano (ký hiệu ACC) bằng phương pháp tạo gel ion hóa kết hợp tương tác polyelectrolyte và phân tán siêu âm.

4. Tại sao hệ vật liệu Car/C lại có khả năng kiểm soát giải phóng allopurinol theo pH?

Trong môi trường acid mạnh ở dạ dày (pH 2,0), mạng hydrogel carrageenan/collagen duy trì trạng thái co cuộn chặt chẽ, hạn chế sự trương nở nên lượng allopurinol khuếch tán ra ngoài rất nhỏ. Khi chuyển sang môi trường trung tính ở ruột (pH 7,4), mạng polyme trương nở mạnh hơn, cho phép allopurinol giải phóng từ từ và kéo dài theo cơ chế khuếch tán tuân theo phương trình động học Korsmeyer-Peppas và Higuchi.

5. Kết quả thử nghiệm in vivo của hạt nano ACC19-10 trên chuột thể hiện điều gì?

Thử nghiệm in vivo chứng minh: hạt nano ACC19-10 an toàn tuyệt đối, không gây độc tính cấp sau 72 giờ và không làm biến đổi các chỉ số huyết học, sinh hóa máu hay mô học gan/thận/lách sau 28 ngày thử nghiệm bán trường diễn. Đồng thời, trên mô hình chuột gây tăng acid uric máu bằng potassium oxalate, hạt ACC19-10 giúp hạ nồng độ acid uric huyết thanh mạnh hơn so với dạng allopurinol tự do.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Vi Quốc Mạnh đã hoàn thành xuất sắc việc xây dựng quy trình trích ly collagen loại I tinh khiết từ phụ phẩm vảy cá nước ngọt họ cá Chép tại Việt Nam và kết hợp thành công với carrageenan để tạo thành hệ vật liệu tổ hợp dạng màng và hạt nano mang dược chất allopurinol. Hệ vật liệu tạo ra có cấu trúc phân tán vô định hình đồng nhất, độ bền nhiệt tốt và thể hiện đặc tính giải phóng thuốc nhạy pH, giúp bảo vệ dược chất ở dạ dày và giải phóng kéo dài ở môi trường ruột. Kết quả thử nghiệm tiền lâm sàng in vivo trên chuột xác nhận chế phẩm hạt nano ACC19-10 an toàn sinh học và có hiệu quả hạ acid uric máu vượt trội, mở ra hướng ứng dụng thực tiễn giá trị trong công nghệ dược phẩm và chế biến phụ phẩm thủy sản.