Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Bệnh đái tháo đường đang gia tăng nhanh chóng và trở thành một trong những tình trạng y tế khẩn cấp toàn cầu trong thế kỷ 21. Theo số liệu của Hiệp hội Đái tháo đường Thế giới (IDF - International Diabetes Federation), năm 2021 toàn cầu có khoảng 537 triệu người trong độ tuổi 20–79 mắc bệnh đái tháo đường; con số này dự báo tăng lên 643 triệu người vào năm 2030 và 783 triệu người vào năm 2045. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc đái tháo đường chiếm khoảng 6,1% dân số và dự kiến đạt 7,7% vào năm 2045, với chi phí y tế trực tiếp toàn cầu xấp xỉ 1.000 tỷ USD. Đái tháo đường là bệnh lý mạn tính đòi hỏi người bệnh phải sử dụng thuốc thường xuyên để duy trì chỉ số đường huyết ổn định. Việc dùng thuốc lặp lại nhiều lần bằng đường tiêm truyền thống dẫn đến sự bất tiện, nguy cơ độc tính do nồng độ thuốc dao động và giảm mức độ tuân thủ điều trị của bệnh nhân.

Trong lĩnh vực phát triển hệ thống dẫn truyền thuốc, các vật liệu polymer y sinh thông minh có khả năng đáp ứng với kích thích môi trường (nhiệt độ, pH) đang nhận được sự quan tâm lớn nhờ khả năng kiểm soát tốc độ và vị trí giải phóng dược chất. Tuy nhiên, các hệ vật liệu hiện hành bộc lộ một số khoảng trống kỹ thuật:

  • Hệ hydrogel nhạy nhiệt copolymer lưỡng tính dạng micelle (như PLA-PEG-PLA) có cấu trúc lõi kỵ nước và vỏ ưa nước, thích hợp mang thuốc kỵ nước nhưng giữ thuốc ưa nước kém; thuốc ưa nước phân bố ở lớp vỏ PEG dễ bị rò rỉ và giải phóng ồ ạt ban đầu. Ngoài ra, sự chuyển pha sol-gel nhanh khi thay đổi nhiệt độ đột ngột từ môi trường sang thân nhiệt (37°C) dễ gây tắc nghẽn kim tiêm, đồng thời quá trình phân hủy PLA sinh ra acid lactic làm giảm pH cục bộ.
  • Hệ hạt micro-nano chitosan chế tạo bằng phương pháp electrospraying có độ bền cơ học và khả năng phân tán tốt, nhưng hiệu quả bao gói (EE) và dung lượng tải thuốc (LC) đối với các loại thuốc không có tương tác tĩnh điện đặc hiệu thường thấp, dẫn đến việc khó kiểm soát tốc độ giải phóng thuốc ban đầu.
  • Các nghiên cứu kết hợp giữa cấu trúc hạt micro-nano và hydrogel nhạy nhiệt, nhạy pH nhằm hình thành cơ chế kiểm soát nhả thuốc đa rào cản đối với các phân tử thuốc ưa nước, đặc biệt là peptide điều trị đái tháo đường như exendin-4, vẫn còn rất hạn chế.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu

Mục đích nghiên cứu: Đánh giá đặc tính hệ vật liệu bao gồm hạt micro-nano chitosan và hydrogel nhạy nhiệt độ, nhạy pH nhằm ứng dụng làm hệ dẫn truyền thuốc dạng tiêm; định hướng gia tăng khả năng tải thuốc và kéo dài thời gian giải phóng thuốc, đặc biệt là thuốc ưa nước exendin-4 dùng trong điều trị đái tháo đường tuýp 2.

Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể được tác giả xác định gồm 6 nội dung:

  1. Tổng hợp polymer hydrogel y sinh nhạy nhiệt độ PLA-PEG-PLA, hydrogel y sinh nhạy nhiệt độ và pH từ PEG và D,L-Lactide đạt trạng thái tạo gel ở điều kiện 37°C và pH 7,4.
  2. Chế tạo hạt micro-nano chitosan và hạt micro-nano chitosan chứa thuốc bằng phương pháp electrospraying có đường kính trong khoảng 200–500 nm, đạt độ đồng đều hình thái.
  3. Đánh giá quá trình phân hủy và độ tương thích sinh học của hydrogel, hạt micro-nano chitosan trong điều kiện in vitro và in vivo.
  4. Nghiên cứu quá trình giải phóng thuốc ưa nước (paracetamol) và thuốc kỵ nước (ibuprofen, ceftiofur hydrochloride) từ các hệ hydrogel và hạt micro-nano chitosan.
  5. Biến tính hạt micro-nano chitosan với copolymer PLA-PEG-PLA nhằm cải thiện khả năng bao gói thuốc ưa nước paracetamol.
  6. Thiết lập mô hình chuột thực nghiệm mắc đái tháo đường tuýp 2 để thử nghiệm hệ vật liệu kết hợp gồm hạt micro-nano chitosan chứa thuốc exendin-4 phân tán trong hydrogel nhạy nhiệt và pH; từ đó đánh giá khả năng giải phóng exendin-4, độ phân hủy và tính tương thích sinh học in vivo.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu:
    • Hạt micro-nano chitosan được chế tạo bằng kỹ thuật electrospraying.
    • Các hệ hydrogel nhạy nhiệt độ PLA-PEG-PLA và pentablock copolymer nhạy nhiệt độ, nhạy pH gồm OS-PLA-PEG-PLA-OS (ghép oligomer serine) và OSA-PLA-PEG-PLA-OSA (ghép oligomer từ acid suberic và ethylenediamine) được tổng hợp từ PEG (Mn = 1750 g/mol) và D,L-Lactide qua phản ứng trùng hợp mở vòng và phản ứng ngưng tụ.
  • Phạm vi nghiên cứu:
    • Không gian: Thực hiện tại các phòng thí nghiệm thuộc Trường Đại học Bách khoa – ĐHQG TP.HCM và Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM.
    • Thời gian: Thời gian thực hiện đề tài là 36 tháng.
    • Giới hạn nội dung: Khảo sát tổng hợp vật liệu; phân tích hóa lý (NMR, FTIR, GPC, XRD, SEM, TEM, góc tiếp xúc, độ nhớt, thế Zeta); khảo sát chuyển pha sol-gel; thử nghiệm phân hủy và tương thích in vitro/in vivo; đánh giá nhả thuốc (ibuprofen, paracetamol, ceftiofur hydrochloride, exendin-4) trên mô hình in vitro và trên chuột nhắt trắng (Mus musculus) 1 tháng tuổi gây tiểu đường bằng Streptozotocin (STZ).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước đây

Luận án đã tổng quan các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến ba nhóm chủ đề chính:

  1. Hydrogel copolymer nhạy nhiệt độ và nhạy pH:

    • Phương pháp tổng hợp và chuyển pha sol-gel: Breche và cộng sự nghiên cứu tổng hợp triblock copolymer PLA-PEG-PLA thông qua phản ứng mở vòng D,L-Lactide có xúc tác tin(II) 2-ethylhexanoate [Sn(Oct)2]. Shi và cộng sự khảo sát giản đồ chuyển pha sol-gel của hệ PDLLA-PEG-PDLLA với các phân tử lượng khác nhau (S1, S2, S3), chứng minh LCGT giảm và UCGT tăng khi nồng độ copolymer tăng. Ho và cộng sự nghiên cứu hệ pentablock PA-PCL-PEG-PCL-PA, chỉ ra rằng giá trị pH gel tới hạn (CGpH) phụ thuộc vào phân tử lượng của khối oligomer polyamide (PA).
    • Phân hủy và tương thích sinh học: Shi và cộng sự công bố dữ liệu phân hủy in vitro và in vivo của PDLLA-PEG-PDLLA, đồng thời thử nghiệm độc tính tế bào trên dòng L929 và HUVEC (tỷ lệ sống đạt trên 85% ở nồng độ 2,5 mg/mL) và nhuộm mô học HE vùng tiêm.
    • Hệ dẫn truyền thuốc: Mao và cộng sự phân tích ảnh hưởng của pH và đồng phân quang học (L, D, D,L) của PLA lên tốc độ nhả paclitaxel và doxorubicin. Shim và cộng sự nghiên cứu hệ hydrogel PAE-PCL-PEG-PCL-PAE nhạy nhiệt/pH kéo dài khả năng nhả insulin in vivo đến 30 ngày.

  2. Hạt micro-nano chitosan chế tạo bằng phương pháp electrospraying và các hướng biến tính:

    • Thien và cộng sự tối ưu hóa thông số electrospraying thu được hạt chitosan kích thước ~340 nm mang indomethacin. Nguyen và cộng sự khảo sát hạt chitosan mang insulin giải phóng qua tương tác tĩnh điện trong môi trường PBS 7,4.
    • Các hướng biến tính hóa học của chitosan được điểm lại gồm: ghép poly(L-lysine) và PEG để phân phối gen plasmid (Yu và cộng sự); gắn tripolyphosphat mang insulin; thiol hóa bằng acid thioglycolic (Martien và cộng sự); carboxymethyl hóa kết hợp acid linoleic hoặc natri acrylat để dẫn truyền adriamycin, doxorubicin (Chen và cộng sự, Tan và cộng sự, Jeong và cộng sự).

  3. Hệ kết hợp giữa hydrogel và hạt micro-nano:

    • Nguyen và cộng sự kết hợp hydrogel OS-PCL-PEG-PCL-OS (30%) với hạt micro-nano chitosan mang 20% insulin, cho thấy tốc độ giải phóng insulin in vitro chậm hơn đáng kể so với từng hệ riêng lẻ (hệ kết hợp giải phóng 80% sau 30 ngày, trong khi hạt chitosan nhả gần 100% sau 5 ngày).
    • Thoniyot và cộng sự tổng quan các hệ hydrogel kết hợp hạt nano kim loại (Au) hoặc polymer gia cường cơ tính và kiểm soát giải phóng.

  4. Tình hình nghiên cứu trong nước:

    • Nhóm Huỳnh Đại Phú và cộng sự (Trường ĐH Bách khoa TP.HCM): Tổng hợp sợi PCL/chitosan mang curcumin qua electrospinning (Hoan và cs); chế tạo hạt micro-nano PLA, PCL (kích thước thay đổi theo Mw 80 kDa và 180 kDa); công nghệ coaxial electrospraying tạo hạt nano chitosan cấu trúc lõi-vỏ mang curcumin; tổng hợp pentablock OS-PCL-PEG-PCL-OS.
    • Nhóm Nguyễn Cửu Khoa và cộng sự (Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng): Nghiên cứu dendrimer PAMAM G3.5 ghép mPEG (PAMAM-mPEG) mang thuốc ung thư carboplatin (CPT); kết hợp dendrimer thế hệ 4 với Pluronics (P123, F68, F127, F108) mang thuốc kỵ nước.
    • Nhóm Hà Phương Thư và cộng sự (Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam): Nghiên cứu hệ micelle copolymer PLA-TPGS mang paclitaxel, curcumin gắn folat hướng đích và hệ mang doxorubicin gắn hạt nano từ tính.
    • Các nghiên cứu của Đ.H. Thiên (electrospraying chitosan) và Đ. Trang (nano chitosan tải insulin).

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Từ tổng quan tài liệu, tác giả nhận thấy hầu hết các nghiên cứu tập trung vào việc bao gói thuốc kỵ nước (>80% các công bố). Các phương pháp biến tính hạt chitosan thường sử dụng phản ứng hóa học phức tạp có thể gây ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của dược chất dạng protein/peptide. Luận án lựa chọn giải quyết các khoảng trống:

  1. Thiết lập mối quan hệ định lượng giữa tính chất dung dịch chitosan (độ nhớt, nồng độ, tỷ lệ dung môi acid acetic) với thông số vận hành máy electrospraying (hiệu điện thế, khoảng cách phun) nhằm thu được hạt đồng đều, đường kính 200–500 nm mà không làm biến tính nguyên liệu.
  2. Tổng hợp các hệ hydrogel nhạy nhiệt và nhạy pH trên cơ sở PEG1750 và D,L-Lactide, ghép các oligomer nhạy pH chứa liên kết amide/sulfonamide (OS, OSA) để mở rộng vùng chuyển pha tại 37°C và pH 7,4, đồng thời khắc phục hiện tượng giảm pH do phân hủy PLA.
  3. Đề xuất giải pháp kết hợp vật lý giữa hạt micro-nano chitosan và hydrogel thông minh tạo hệ rào cản kép nhằm nâng cao hiệu quả bao gói, dung lượng tải và kiểm soát giải phóng kéo dài thuốc ưa nước (paracetamol và exendin-4).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

  • Cơ chế chuyển pha của copolymer lưỡng tính nhạy nhiệt: Triblock copolymer dạng B-A-B (với A là khối PEG ưa nước, B là khối PLA kỵ nước) tồn tại ở dạng micelle phân tán trong nước tại nhiệt độ thấp (trạng thái sol). Khi nhiệt độ tăng vượt qua điểm nhiệt độ tạo gel tới hạn dưới (LCGT), các micelle tự sắp xếp và liên kết kỵ nước giữa các khối PLA ngoài đầu mạch tạo thành mạng lưới không gian 3 chiều (trạng thái gel). Ở nhiệt độ cao hơn điểm UCGT, hiện tượng khử hydrat hóa hoàn toàn dẫn đến sự co rút gel và tách pha (precipitation).
  • Cơ chế nhạy pH của oligomer polyacid: Các nhóm chức sulfonamide (-SO2NH-) và carboxamide (-CONH-) có tính acid yếu (polyacid). Tại môi trường pH cao hơn pKa, các nhóm này nhận electron tạo ion tích điện âm, sinh ra lực đẩy tĩnh điện làm mạch polymer trương nở và tan (trạng thái sol). Tại môi trường pH sinh lý máu (7,15–7,40) thấp hơn hoặc xấp xỉ pKa, các nhóm chức bị đề ion hóa, giảm tính phân cực, mạng polymer co lại hình thành liên kết gel.
Môi trường pH > pKa:  Polymer-H + OH-  -->  Polymer- + H2O  (Ion hóa -> Đẩy tĩnh điện -> Tan/Sol)
Môi trường pH <= pKa: Polymer- + H+    -->  Polymer-H        (Đề ion hóa -> Tương tác kỵ nước -> Gel)
  • Khung phân tích hệ giải phóng thuốc hai rào cản: Dược chất ưa nước được bao bọc bên trong hạt micro-nano chitosan (rào cản thứ nhất), sau đó các hạt này được phân tán đều trong mạng lưới hydrogel nhạy nhiệt/pH (rào cản thứ hai). Quá trình giải phóng thuốc diễn ra qua hai giai đoạn khuếch tán nối tiếp, làm giảm hiện tượng giải phóng ồ ạt ban đầu và duy trì nồng độ thuốc ổn định.

Phương pháp thực nghiệm và kỹ thuật phân tích

Nhóm nội dung Phương pháp thực nghiệm & Thiết bị phân tích Mục đích & Thông số kiểm tra
Tổng hợp vật liệu - Trùng hợp mở vòng (ROP) D,L-Lactide có PEG1750, xúc tác Sn(Oct)2 ở 135°C (20 h) trong môi trường N2.
- Phản ứng ngưng tụ tạo OS (D,L-serine + Benzenesulfonyl chloride) và OSA (Suberic acid + Ethylenediamine).
- Phản ứng ghép tạo pentablock qua xúc tác DCC/DMAP trong dung môi 1,4-dioxane/DMF.		 Tổng hợp triblock PLA-PEG-PLA (T-2.6) và các pentablock copolymer OS-PLA-PEG-PLA-OS (P-2.6), OSA-PLA-PEG-PLA-OSA (P-2.6A).
Chế tạo hạt Kỹ thuật electrospraying; khảo sát hiệu điện thế $U$ (9–18 kV), khoảng cách kim thu $L$ (10–12 cm), nồng độ chitosan (0,2–1,0%), acid acetic (70–90%). Tạo hạt micro-nano chitosan trơn và hạt chứa thuốc (ceftiofur hydrochloride, paracetamol, exendin-4).
Phân tích cấu trúc - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, Bruker 500 MHz, dung môi $\text{CDCl}_3, \text{D}_2\text{O}, \text{DMSO}$).
- Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR, Nicolet iS50).
- Nhiễu xạ tia X (XRD, D8 Advance).
- Sắc ký thẩm thấu gel (GPC, THF/nước).		 Xác định cấu trúc hóa học, phân tử lượng ($M_n, M_w$), độ đa phân tán (PDI), cấu trúc micelle lõi-vỏ và độ kết tinh của vật liệu.
Đặc tính hóa lý - Phương pháp đảo ống nghiệm (test tube inverting method).
- Chuẩn độ acid-base xác định pKa.
- Đo độ nhớt mao quản, đo góc tiếp xúc, đo thế Zeta.		 Xác định giản đồ chuyển pha sol-gel (LCGT, UCGT, CGpH), bước nhạy pH, điện tích bề mặt hạt và khả năng phân tán.
Hình thái hạt & gel - Kính hiển vi điện tử quét (SEM, JSM-IT200).
- Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM, JEM-1400).		 Đánh giá kích thước hạt, độ phân bố cỡ hạt, hình thái bề mặt và cấu trúc micelle nano.
Phân hủy & Tương thích - Phân hủy in vitro: ngâm mẫu trong dung dịch đệm PBS pH 7,4 ở 37°C.
- Phân hủy in vivo & tương thích: tiêm dưới da chuột nhắt trắng Mus musculus (1 tháng tuổi, 20–25 g).
- Kỹ thuật nhuộm Hematoxylin & Eosin (HE).		 Theo dõi độ giảm khối lượng gel, sự thay đổi pH môi trường, biến đổi khối lượng chuột và phản ứng viêm mô học xung quanh vết tiêm.
Đánh giá nhả thuốc - Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC, Agilent 1260).
- Quang phổ hấp thụ phân tử tử ngoại - khả kiến (UV-Vis).		 Định lượng dung lượng tải (LC), hiệu quả bao gói (EE) và động học nhả thuốc in vitro/in vivo.
Mô hình in vivo Chuột nhắt trắng gây đái tháo đường tuýp 2 bằng tiêm Streptozotocin (STZ); đo nồng độ glucose huyết bằng máy đo đường huyết cá nhân. Đánh giá hiệu quả hạ và ổn định đường huyết của hệ hạt chitosan mang exendin-4 phân tán trong hydrogel P-2.6.

Nguồn tư liệu và hóa chất

Danh mục nguyên liệu, hóa chất chính được sử dụng gồm:

  • Chitosan (CS): $M_w > 10^5\text{ Da}$, dạng vảy trắng (Sigma Aldrich).
  • Poly(Ethylene glycol) (PEG): $M_n = 1750\text{ g/mol}$, dạng sáp trắng (Sigma Aldrich).
  • D,L-Lactide: $M = 90,08\text{ g/mol}$, dạng rắn trắng (Tokyo Chemical Industry).
  • Các tiền chất tổng hợp oligomer: D,L-Serine (Aladdin), Benzenesulfonyl chloride (Aladdin), Suberic acid (Aladdin), Ethylenediamine (Sigma Aldrich).
  • Xúc tác và dung môi: Tin(II) 2-ethylhexanoate [$\text{Sn(Oct)}_2$], DCC, DMAP, 1,4-Dioxane, DMF, Chloroform, Diethyl ether, Ethyl acetate, THF, Acetic acid.
  • Dược chất thử nghiệm: Paracetamol (Độ tinh khiết 99,5%, Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP.HCM), Ceftiofur hydrochloride (Độ tinh khiết 99%, Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc Thú y TW2), Ibuprofen, Exendin-4 ($M = 4186,57\text{ g/mol}$, Độ tinh khiết 99,98%, MedChemExpress).
  • Chất gây bệnh & Động vật: Streptozotocin (STZ, Aladdin, độ tinh khiết 98%); Chuột nhắt trắng (Mus musculus) 1 tháng tuổi (20–25 g) do Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP.HCM cung cấp.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 trình bày cơ sở lý luận về các hệ thống phân phối thuốc dạng hạt micro-nano và hydrogel y sinh thông minh. Tác giả phân tích chi tiết cấu trúc hóa học của chitosan, cơ chế nhạy nhiệt của copolymer lưỡng tính B-A-B và cơ chế nhạy pH của các oligomer nhóm sulfonamide/carboxamide. Chương này tổng thuật toàn diện các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về các polymer thông minh (PDLLA-PEG-PDLLA, OS-PCL-PEG-PCL-OS, PAE-PCL-PEG-PCL-PAE, PAMAM dendrimer), chỉ rõ những hạn chế trong việc bao gói thuốc ưa nước và kiểm soát tốc độ giải phóng ban đầu. Trên cơ sở đó, tác giả luận giải tính cấp thiết, xác định mục tiêu, đối tượng, phạm vi và xây dựng các nội dung nghiên cứu cụ thể của luận án.

Chương 2: Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và các phương pháp nghiên cứu:

  • Quy trình tổng hợp polymer:
    • Tổng hợp triblock PLA1750-PEG1750-PLA1750 (ký hiệu T-2.6) qua phản ứng mở vòng D,L-Lactide có xúc tác $\text{Sn(Oct)}_2$ (1,3% khối lượng so với PEG) ở 135°C trong 20 giờ dưới khí $\text{N}_2$; tinh chế bằng cách hòa tan trong chloroform và kết tủa trong diethyl ether khan, sấy chân không 48 giờ ở 45°C.
    • Tổng hợp oligomer nhạy pH: Oligomer serine (OS) từ D,L-serine và benzenesulfonyl chloride; oligomer OSA từ suberic acid và ethylenediamine.
    • Tổng hợp pentablock OS-PLA-PEG-PLA-OS (P-2.6) và OSA-PLA-PEG-PLA-OSA (P-2.6A) bằng phản ứng ghép nối nhóm carboxyl của oligomer vào nhóm hydroxyl đầu mạch của triblock nhờ xúc tác DCC/DMAP.
  • Quy trình tạo hạt electrospraying: Thiết lập thông số phun dung dịch chitosan trong acid acetic, tối ưu hóa điện áp ($U$), khoảng cách ($L$) và nồng độ dung dịch để thu được hạt kích thước nano.
  • Quy trình đánh giá in vitro và in vivo: Đo sol-gel bằng phương pháp đảo ống nghiệm; đo tốc độ phân hủy và biến thiên pH trong môi trường đệm PBS 7,4 ở 37°C; đánh giá tương thích mô học bằng nhuộm HE; thiết lập mô hình chuột tiểu đường bằng STZ và theo dõi nồng độ đường huyết sau khi tiêm hệ dẫn mang exendin-4.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

1. Tổng hợp và đặc tính của hydrogel nhạy nhiệt độ PLA-PEG-PLA

  • Tổng hợp và cấu trúc: Triblock copolymer PLA-PEG-PLA được tổng hợp với các tỷ lệ khối lượng D,L-Lactide/PEG khác nhau (2,3; 2,6; 2,7; 2,8). Phổ $^1\text{H-NMR}$ xác nhận sự xuất hiện của các mũi cộng hưởng đặc trưng: nhóm $-\text{CH}_3$ (1,5 ppm) và $-\text{CH}-$ (5,2 ppm) của khối PLA; nhóm $-\text{CH}_2-$ (3,6 ppm) của khối PEG. Mẫu T-2.6 (tỷ lệ đưa vào 2,6) cho tỷ lệ khối lượng phân tử thực tế PLA1750-PEG1750-PLA1750 với phân tử lượng xấp xỉ 5250 g/mol và chỉ số đa phân tán PDI hẹp.
  • Đặc tính micelle và chuyển pha sol-gel: Đo phổ $^1\text{H-NMR}$ trong dung môi $\text{D}_2\text{O}$ cho thấy mũi của PLA bị suy giảm mạnh do bị bao bọc trong lõi kỵ nước, trong khi mũi của PEG vẫn hiển thị rõ ràng, xác nhận cấu trúc micelle dạng lõi-vỏ. Ảnh TEM cho thấy các micelle có dạng hình cầu đồng đều. Khảo sát sol-gel cho thấy mẫu T-2.6 ở nồng độ 25% (kl/tt) tồn tại ở dạng sol tại nhiệt độ phòng (khoảng 20–25°C) và chuyển hoàn toàn sang trạng thái gel bền vững tại 37°C.

2. Tổng hợp oligomer nhạy pH và hydrogel nhạy nhiệt/pH

  • Tổng hợp OS và OSA: Oligomer serine (OS) và oligomer OSA từ suberic acid và ethylenediamine được xác định cấu trúc qua phổ $^1\text{H-NMR}$ và FTIR. Phép chuẩn độ acid-base xác định khoảng nhạy pH của các oligomer OSA nằm trong vùng pH 6,8–8,0, phù hợp với khoảng pH sinh lý.
  • Pentablock copolymer nhạy nhiệt/pH:
    • Ghép OS tạo pentablock OS-PLA1750-PEG1750-PLA1750-OS (mẫu P-2.6 25%).
    • Ghép OSA tạo pentablock OSA-PLA1750-PEG1750-PLA1750-OSA (mẫu P-2.6A 35%).
    • Cả hai hệ pentablock đều biểu hiện tính nhạy kép: ở nhiệt độ phòng và pH > 7,4, dung dịch ở trạng thái sol linh động; khi đưa vào điều kiện sinh lý (37°C, pH 7,4), hệ chuyển nhanh sang trạng thái gel đặc, ngăn ngừa hiện tượng tắc kim tiêm trong quá trình thao tác tiêm truyền.

3. Khả năng phân hủy và tương thích sinh học

  • Phân hủy in vitro và in vivo:
    • Thử nghiệm in vitro trong đệm PBS 7,4 ở 37°C cho thấy mẫu hydrogel T-2.6 phân hủy từ từ qua cơ chế thủy phân liên kết ester của PLA. Tỷ lệ LA/EO giảm dần theo thời gian. Sự phân hủy làm giảm nhẹ pH môi trường từ 7,4 xuống khoảng 6,2 sau 4 tuần do giải phóng acid lactic.
    • Đối với hệ P-2.6 và P-2.6A, sự hiện diện của các nhóm chức amide/sulfonamide giúp đệm bớt sự giảm pH môi trường. Kết quả GPC xác nhận sự suy giảm phân tử lượng theo thời gian.
    • Thử nghiệm in vivo trên chuột nhắt cho thấy khối gel dưới da giảm dần thể tích: sau 1 tuần khối gel duy trì hình dạng, sau 3 tuần tiêu biến trên 70% và biến mất hoàn toàn sau 6–8 tuần.
  • Tương thích sinh học: Chuột sau tiêm duy trì cân nặng ổn định, không ghi nhận trường hợp sốc phản vệ hay tử vong. Ảnh nhuộm mô học HE vùng mô quanh vết tiêm cho thấy phản ứng viêm cấp tính nhẹ ở tuần thứ 1 (thâm nhiễm bạch cầu và đại thực bào), giảm mạnh ở tuần thứ 2–3 và cấu trúc mô trở lại bình thường sau 4 tuần.
Tiêm in vivo (Chuột Mus musculus) -> Tuần 1: Viêm cấp tính nhẹ (HE) -> Tuần 2-3: Đại thực bào giảm -> Tuần 4: Mô phục hồi bình thường -> Tuần 6-8: Gel tiêu biến hoàn toàn

4. Chế tạo hạt micro-nano chitosan bằng phương pháp electrospraying

  • Ảnh hưởng của thông số dung dịch và thiết bị:
    • Độ nhớt dung dịch tăng mạnh theo nồng độ chitosan. Ở nồng độ cao (>1,0%), dung dịch khó tạo giọt dạng côn ở đầu kim dẫn đến tắc nghẽn hoặc tạo sợi.
    • Ở nồng độ chitosan 0,2% hòa tan trong acid acetic 90%, thiết lập hiệu điện thế $U = 9\text{ kV}$, khoảng cách phun $L = 10\text{ cm}$, thu được hạt micro-nano chitosan hình cầu đồng đều, bề mặt nhẵn, không bị kết tụ, kích thước hạt trung bình đạt 367 nm.
  • Tương thích và phân hủy của hạt chitosan: Hạt chitosan phân hủy chậm trong môi trường in vitro và in vivo; kết quả nhuộm HE xác nhận hạt có tính tương thích mô học cao, không gây hoại tử mô.

5. Đánh giá khả năng tải thuốc và giải phóng thuốc in vitro

+-------------------------------------------------------------------------------------------------------+
| Dung dịch Chitosan + Paracetamol + Copolymer T-2.6  --Electrospraying-->  Hạt Nano (LC: 3,94%, EE: 60,25%)  |
+-------------------------------------------------------------------------------------------------------+
                                                     |
                                            (Tương tác liên kết Hydro)
                                                     |
+-------------------------------------------------------------------------------------------------------+
| Hạt Chitosan/Exendin-4  --Phân tán trong-->  Hydrogel Pentablock P-2.6  -->  Hệ Rào Cản Kép (Nhả Chậm)  |
+-------------------------------------------------------------------------------------------------------+
  • Thuốc kỵ nước (Ibuprofen, Ceftiofur hydrochloride):
    • Hydrogel T-2.6 bao gói ibuprofen trong lõi kỵ nước PLA. Quá trình giải phóng ibuprofen tuân theo quy luật phân hủy của khối gel: nhả chậm trong 3 tuần đầu và tăng tốc sau tuần thứ 3 khi khung PLA bị thủy phân rã mạch.
    • Hạt chitosan nạp ceftiofur hydrochloride (CEF) cho giá trị LC và EE ở mức trung bình, tốc độ giải phóng phụ thuộc vào sự khuếch tán bề mặt.
  • Thuốc ưa nước (Paracetamol):
    • Hệ hydrogel đơn thuần nhả paracetamol rất nhanh (hơn 80% trong vài giờ đầu) do thuốc phân bố ở vỏ PEG ưa nước dễ khuếch tán ra ngoài.
    • Hạt micro-nano chitosan trơn nạp paracetamol có LC và EE thấp do không có lực liên kết đặc hiệu giữa chitosan và paracetamol.
  • Giải pháp kết hợp nâng cao khả năng bao gói và kiểm soát nhả thuốc ưa nước:
    • Giải pháp 1: Tạo hạt micro-nano từ dung dịch hỗn hợp chitosan và copolymer T-2.6 chứa paracetamol bằng electrospraying. Tương tác liên kết hydro giữa nhóm $-\text{NH}_2, -\text{OH}$ của chitosan và nhóm carbonyl/ester của PLA giúp tăng dung lượng tải LC lên 3,94% và hiệu quả bao gói EE đạt 60,25% (cao hơn rõ rệt so với hạt chitosan đơn thuần). Tuy nhiên, việc kiểm soát tốc độ nhả thuốc kéo dài vẫn gặp khó khăn.
    • Giải pháp 2: Chế tạo hạt micro-nano chitosan chứa thuốc exendin-4, sau đó phân tán hạt vào hệ hydrogel nhạy nhiệt/pH P-2.6 (tạo hệ rào cản kép).

6. Thử nghiệm in vivo trên chuột đái tháo đường tuýp 2

  • Thiết lập mô hình chuột đái tháo đường bằng cách tiêm STZ liều thấp kết hợp chế độ ăn giàu năng lượng, xác nhận đường huyết chuột tăng và duy trì ổn định ở ngưỡng bệnh lý (>200 mg/dL).
  • Đánh giá khả năng hạ đường huyết sau khi tiêm dưới da:
    • Nhóm tiêm thuốc exendin-4 tự do hoặc hạt chitosan đơn thuần giải phóng nhanh, đường huyết giảm sâu trong 24–48 giờ đầu nhưng tăng nhanh trở lại sau đó.
    • Nhóm tiêm hệ kết hợp (hạt chitosan chứa exendin-4 phân tán trong hydrogel P-2.6) duy trì tốc độ giải phóng exendin-4 chậm và ổn định, kiểm soát chỉ số đường huyết chuột ở mức an toàn kéo dài nhiều ngày mà không gây sốc hạ đường huyết đột ngột.
    • Khối gel kết hợp phân hủy hoàn toàn sau 6 tuần dưới da mà không để lại di chứng mô học.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học lý luận

  1. Đã tổng hợp thành công các pentablock copolymer lưỡng tính nhạy nhiệt và nhạy pH mới gồm OS-PLA1750-PEG1750-PLA1750-OS và OSA-PLA1750-PEG1750-PLA1750-OSA; làm sáng tỏ quy luật chuyển pha sol-gel phụ thuộc đồng thời vào nhiệt độ (37°C) và pH (7,4), đồng thời chứng minh vai trò đệm pH của các nhóm oligomer amide/sulfonamide giúp hạn chế sự acid hóa môi trường trong quá trình phân hủy PLA.
  2. Xác lập được mối tương quan giữa các thông số hóa lý của dung dịch chitosan (độ nhớt, nồng độ, tỷ lệ acid acetic) với các thông số công nghệ electrospraying (hiệu điện thế, khoảng cách điện cực) để kiểm soát hình thái hạt micro-nano dạng cầu đồng nhất với đường kính trung bình 367 nm.
  3. Chứng minh cơ chế tương tác liên kết hydro giữa chitosan và copolymer PLA-PEG-PLA giúp gia tăng đáng kể dung lượng tải thuốc (LC = 3,94%) và hiệu quả bao gói (EE = 60,25%) đối với dược chất ưa nước paracetamol trong kỹ thuật electrospraying.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn và giải pháp đề xuất

  1. Chế tạo thành công hệ dẫn truyền thuốc dạng tiêm kết hợp hai cấu trúc vật liệu: hạt micro-nano chitosan bao gói thuốc peptide ưa nước exendin-4 phân tán trong nền hydrogel nhạy nhiệt độ/pH (P-2.6).
  2. Thử nghiệm tiền lâm sàng trên mô hình chuột nhắt trắng Mus musculus mắc đái tháo đường tuýp 2 cho thấy hệ kết hợp kéo dài thời gian giải phóng exendin-4, duy trì ổn định đường huyết vượt trội so với từng hệ vật liệu riêng lẻ, đồng thời đảm bảo tính tương thích mô học và khả năng phân hủy sinh học hoàn toàn sau 6 tuần.
  3. Đề xuất quy trình công nghệ tổng hợp pentablock copolymer và quy trình electrospraying tạo hạt nano có thể mở rộng ứng dụng cho việc dẫn truyền các hoạt chất sinh học, protein và peptide khác.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án

  • Khảo sát thực nghiệm in vivo mới được tiến hành trên mô hình động vật nhỏ là chuột nhắt trắng (Mus musculus) ở giai đoạn 1 tháng tuổi; chưa được kiểm chứng trên các loài động vật linh trưởng hoặc động vật lớn có hệ tuần hoàn và sinh lý gần hơn với người.
  • Độ ổn định hoạt tính sinh học lâu dài của phân tử peptide exendin-4 trong quá trình phối trộn và bảo quản trong hệ hydrogel chưa được đánh giá chi tiết theo các tiêu chuẩn dược điển về độ ổn định thời gian thực.
  • Quy mô tổng hợp pentablock copolymer và chế tạo hạt bằng electrospraying mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (từng mẻ nhỏ), chưa đánh giá các thông số truyền khối và tối ưu hóa năng suất cho quy mô công nghiệp.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Mở rộng thử nghiệm tiền lâm sàng trên các mô hình động vật lớn hơn để đánh giá dược động học (PK) và dược lực học (PD) chi tiết của exendin-4 giải phóng từ hệ kết hợp.
  • Nghiên cứu cơ chế bảo tồn cấu trúc bậc cao của peptide/protein khi kết hợp trong hệ mang nano-hydrogel trong thời gian lưu trữ dài hạn ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau.
  • Tối ưu hóa và nâng cấp quy mô hệ thống electrospraying đa kim (multi-nozzle electrospraying) nhằm nâng cao năng suất thu hồi hạt micro-nano phục vụ thử nghiệm lâm sàng.

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên thuộc các chuyên ngành Kỹ thuật Hóa học, Kỹ thuật Y sinh, Hóa Polyme, Khoa học Vật liệu và Công nghệ Dược phẩm.
  • Giảng viên và nhà nghiên cứu tại các trường đại học, viện nghiên cứu đang phát triển các vật liệu polymer thông minh đáp ứng kích thích kép (nhiệt độ/pH) và các hệ thống phân phối thuốc hướng đích.
  • Các chuyên gia phát triển công thức thuốc và nhà hoạch định công nghệ y dược quan tâm đến các giải pháp kỹ thuật kéo dài thời gian tác dụng của thuốc tiêm điều trị bệnh mạn tính (đặc biệt là bệnh đái tháo đường).

Các nội dung đáng tham khảo

  • Quy trình chi tiết tổng hợp và tinh chế pentablock copolymer nhạy nhiệt độ và nhạy pH (OS-PLA-PEG-PLA-OS và OSA-PLA-PEG-PLA-OSA) từ nguyên liệu PEG1750 và D,L-Lactide.
  • Bảng thông số thực nghiệm tối ưu hóa quá trình electrospraying hạt micro-nano chitosan dựa trên đặc tính độ nhớt và sức căng bề mặt dung dịch.
  • Phương pháp luận và thiết kế thực nghiệm đánh giá phân hủy in vitro/in vivo, kỹ thuật nhuộm mô học HE và quy trình thiết lập mô hình chuột đái tháo đường tuýp 2 bằng STZ để đánh giá hiệu quả giải phóng thuốc in vivo.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao tác giả lựa chọn khối PEG có phân tử lượng $M_n = 1750\text{ g/mol}$ để tổng hợp triblock copolymer PLA-PEG-PLA?

Việc lựa chọn PEG1750 dựa trên sự cân bằng giữa nồng độ micelle tới hạn (CMC) và khả năng tạo gel sinh học:

  • Nếu chọn PEG có phân tử lượng quá nhỏ ($M_n \le 1000\text{ g/mol}$), giá trị CMC thấp nhưng độ bền cơ học của khối gel ở 37°C rất kém, vùng tạo gel hẹp khó đáp ứng yêu cầu tiêm.
  • Nếu chọn PEG có phân tử lượng quá lớn, giá trị CMC cao đòi hỏi nồng độ polymer lớn mới tạo được gel, đồng thời khối lượng phân tử chung của copolymer tăng cao làm chậm đáng kể tốc độ phân hủy sinh học trong cơ thể.
  • Khối PEG1750 kết hợp với tỷ lệ PLA thích hợp (mẫu T-2.6) tạo ra copolymer có phân tử lượng xấp xỉ 5250 g/mol, tạo vùng gel bền vững ở 37°C tại nồng độ 25% và phân hủy hoàn toàn sau 6–8 tuần.

2. Nhóm chức nhạy pH trong pentablock copolymer đóng vai trò gì trong việc khắc phục nhược điểm của hydrogel nhạy nhiệt PLA-PEG-PLA?

Hydrogel nhạy nhiệt đơn thuần PLA-PEG-PLA dễ chuyển gel nhanh khi gặp nhiệt độ cao gây nghẽn kim tiêm, đồng thời khi PLA phân hủy sinh ra acid lactic làm giảm pH cục bộ. Việc gắn thêm các oligomer chứa nhóm sulfonamide (OS) hoặc carboxamide (OSA) tạo ra tính nhạy pH:

  • Ở môi trường bảo quản trước khi tiêm (pH > 7,4), các nhóm chức bị ion hóa mang điện tích âm, tạo lực đẩy tĩnh điện giữ hệ ở trạng thái sol lỏng linh động, giúp thao tác tiêm dễ dàng.
  • Khi vào cơ thể (pH sinh lý máu 7,15–7,40), các nhóm chức bị đề ion hóa, làm mất điện tích và kích hoạt chuyển sang trạng thái gel bao gói thuốc.
  • Bản chất các nhóm amide/sulfonamide đóng vai trò chất đệm hóa học, giảm thiểu hiện tượng tụt pH đột ngột khi khối PLA bị thủy phân.

3. Thông số tối ưu của quá trình electrospraying để chế tạo hạt micro-nano chitosan đạt kích thước 367 nm là gì?

Qua khảo sát thực nghiệm trên máy electrospraying, các thông số tối ưu được xác định:

  • Nồng độ chitosan: 0,2% (kl/tt).
  • Dung môi: Acid acetic nồng độ 90%.
  • Hiệu điện thế phun ($U$): 9 kV.
  • Khoảng cách từ đầu kim đến bản thu ($L$): 10 cm. Ở chế độ này, giọt dung dịch tại đầu kim tạo thành hình nón Taylor ổn định, thu được hạt micro-nano chitosan hình cầu đồng đều, bề mặt nhẵn, không dính kết với kích thước trung bình 367 nm.

4. Tại sao hệ kết hợp hạt chitosan và hydrogel P-2.6 lại kiểm soát nhả thuốc exendin-4 in vivo tốt hơn từng hệ riêng lẻ?

Hệ kết hợp tạo ra cơ chế rào cản khuếch tán kép:

  • Exendin-4 là một peptide ưa nước; nếu chỉ nạp trong hydrogel micelle, thuốc sẽ nằm ở lớp vỏ PEG và nhanh chóng khuếch tán ra ngoài; nếu chỉ nạp trong hạt chitosan, do thiếu tương tác liên kết ion đặc hiệu, thuốc cũng thoát nhanh ra ngoài bề mặt.
  • Khi bao exendin-4 trong hạt nano chitosan rồi phân tán hạt vào khối hydrogel P-2.6, phân tử thuốc muốn ra môi trường sinh học phải vượt qua hai bước cản: (1) khuếch tán từ cấu trúc hạt chitosan vào mạng lưới gel, và (2) khuếch tán qua mạng lưới gel pentablock đang phân hủy từ từ. Kết quả thực nghiệm in vivo trên chuột đái tháo đường cho thấy nồng độ đường huyết được kiểm soát hạ từ từ và duy trì ổn định kéo dài nhiều ngày.

Kết luận

Luận án của tác giả Nguyễn Thị Thanh Hiền đã hoàn thành việc tổng hợp và đánh giá hệ vật liệu y sinh dạng tiêm kết hợp giữa hạt micro-nano chitosan (kích thước trung bình 367 nm chế tạo bằng phương pháp electrospraying) và các hydrogel copolymer nhạy nhiệt độ, nhạy pH (T-2.6, P-2.6 và P-2.6A). Các hệ vật liệu đều đạt tiêu chuẩn về tính tương thích sinh học, không gây độc tế bào và phân hủy hoàn toàn in vivo sau 6–8 tuần. Giải pháp tích hợp hạt micro-nano chitosan mang thuốc exendin-4 phân tán trong nền hydrogel pentablock P-2.6 đã thiết lập cơ chế giải phóng hai rào cản, giúp kiểm soát tốc độ nhả thuốc ưa nước và duy trì ổn định đường huyết trên mô hình chuột đái tháo đường tuýp 2, cung cấp cơ sở khoa học và dữ liệu thực nghiệm giá trị cho hướng phát triển các hệ dẫn truyền thuốc điều trị bệnh mạn tính.