Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của peptide mastoparan từ nọc ong Vespa velutina

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu nghiên cứu tinh chế và xác định hoạt tính kháng khuẩn của peptide mastoparan từ nọc ong vespa, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện pháp

• Tác giả: Phạm Thị Huế
• Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Bích Thảo
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu Tinh Chế Và Xác Định Hoạt Tính Kháng Khuẩn Của Peptide Mastoparan Từ Nọc Ong Vespa Velutina Tại Việt Nam
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. GIỚI THIỆU VỀ ONG Vespa velutina
• 1.1.1. Phân loại khoa học
• 1.1.2. Phân bố của ong Vespa velutina
• 1.1.3. Hình thái của ong Vespa velutina
• 1.2. GIỚI THIỆU VỀ NỌC ONG
• 1.2.1. Các thành phần của nọc ong
• 1.2.1.1. Các enzyme
• 1.2.1.2. Các peptide
• 1.2.1.3. Các phân tử nhỏ khác
• 1.2.2. Ứng dụng của nọc ong
• 1.3. Hoạt tính của mastoparan
• 1.3.1. Hoạt tính chung của mastoparan
• 1.3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của mastoparan
• 1.3.3. Cơ chế hoạt động của các mastoparan chung trên màng của vi sinh vật
• 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠI VIỆT NAM
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
• 2.1.1. Vật liệu sinh học
• 2.1.2. Trang thiết bị
• 2.2. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU CHUNG
• 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.3.1. Thu thập và tách chiết nọc ong
• 2.3.2. Phân đoạn nọc ong và tinh sạch mastoparan
• 2.3.3. Phân tích MALDI-TOF
• 2.3.4. Tổng hợp hóa học mastoparan bằng phương pháp tổng hợp peptide pha rắn
• 2.3.5. Phương pháp khoanh giấy khuếch tán trên đĩa thạch
• 2.3.6. Xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. THU THẬP VÀ TÁCH CHIẾT NỌC ONG Vespa velutina
• 3.1.1. Thu thập ong Vespa velutina
• 3.1.2. Tách chiết nọc ong Vespa velutina
• 3.2. PHÂN ĐOẠN NỌC ONG VÀ TINH SẠCH MASTOPARAN
• 3.3. NHẬN DIỆN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ AMINO ACID CỦA MASTOPARAN
• 3.4. TỔNG HỢP NHÂN TẠO MASTOPARAN
• 3.5. THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MASTOPARAN
• 3.5.1. Hoạt tính kháng khuẩn của mastoparan tự nhiên
• 3.5.2. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của mastoparan được tổng hợp nhân tạo (MP)
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• 4.1. KẾT LUẬN
• 4.2. KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về peptide kháng khuẩn

Peptide kháng khuẩn là một trong những lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong y học hiện đại. Chúng có khả năng tiêu diệt vi khuẩn và được xem như một giải pháp tiềm năng cho vấn đề kháng thuốc. Mastoparan, một loại peptide kháng khuẩn được chiết xuất từ nọc ong Vespa velutina, đã cho thấy hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ. Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định và phân tích hoạt tính kháng khuẩn của mastoparan từ nọc ong, nhằm tìm kiếm ứng dụng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn. Theo các nghiên cứu trước đây, mastoparan có khả năng làm tăng tính thấm của màng tế bào vi khuẩn, dẫn đến sự chết của tế bào. Điều này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các loại thuốc kháng sinh từ nguồn gốc tự nhiên.

1.1. Tình hình nghiên cứu peptide kháng khuẩn

Nghiên cứu về peptide kháng khuẩn đã được thực hiện trên nhiều loại động vật và thực vật. Các peptide này thường có cấu trúc đơn giản nhưng lại có hiệu quả cao trong việc tiêu diệt vi khuẩn. Mastoparan là một trong những peptide được nghiên cứu nhiều nhất, với khả năng ức chế sự phát triển của nhiều chủng vi khuẩn kháng kháng sinh. Việc tìm hiểu về hoạt tính kháng khuẩn của mastoparan từ nọc ong Vespa velutina không chỉ giúp mở rộng kiến thức về các peptide tự nhiên mà còn có thể dẫn đến việc phát triển các loại thuốc mới trong y học.

II. Phân tích hoạt tính kháng khuẩn của mastoparan

Hoạt tính kháng khuẩn của mastoparan được xác định thông qua các thử nghiệm in vitro. Các nghiên cứu cho thấy mastoparan có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều chủng vi khuẩn, bao gồm cả các vi khuẩn kháng thuốc. Kết quả thử nghiệm cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của mastoparan đối với các chủng vi khuẩn khác nhau có sự khác biệt rõ rệt. Điều này cho thấy rằng mastoparan có thể được sử dụng như một chất kháng sinh tự nhiên, có khả năng thay thế hoặc hỗ trợ cho các loại thuốc kháng sinh hiện có. Việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của mastoparan sẽ giúp hiểu rõ hơn về cách thức mà peptide này tác động lên màng tế bào vi khuẩn.

2.1. Cơ chế hoạt động của mastoparan

Cơ chế hoạt động của mastoparan chủ yếu liên quan đến việc làm tăng tính thấm của màng tế bào vi khuẩn. Khi mastoparan tương tác với màng tế bào, nó gây ra sự thay đổi cấu trúc màng, dẫn đến sự rò rỉ nội bào và cuối cùng là sự chết của tế bào. Nghiên cứu cho thấy rằng mastoparan có thể làm tăng sự nhạy cảm của vi khuẩn đối với các loại thuốc kháng sinh khác, mở ra khả năng kết hợp giữa mastoparan và các liệu pháp kháng sinh truyền thống để điều trị hiệu quả hơn các bệnh nhiễm trùng.

III. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu

Nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của peptide mastoparan từ nọc ong Vespa velutina không chỉ có giá trị trong lĩnh vực khoa học mà còn có ứng dụng thực tiễn trong y học. Với sự gia tăng của các chủng vi khuẩn kháng thuốc, việc phát triển các loại thuốc kháng sinh mới từ nguồn gốc tự nhiên như mastoparan là rất cần thiết. Các peptide kháng khuẩn có thể được sử dụng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng, đặc biệt là những bệnh do vi khuẩn kháng thuốc. Hơn nữa, việc nghiên cứu và phát triển các sản phẩm từ nọc ong có thể tạo ra những sản phẩm mới, an toàn và hiệu quả cho sức khỏe con người.

3.1. Tiềm năng phát triển sản phẩm từ mastoparan

Tiềm năng phát triển sản phẩm từ mastoparan rất lớn. Các nghiên cứu có thể dẫn đến việc sản xuất các loại thuốc kháng sinh mới, có thể được sử dụng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn. Hơn nữa, mastoparan cũng có thể được ứng dụng trong các lĩnh vực khác như mỹ phẩm và thực phẩm, nhờ vào tính chất kháng khuẩn của nó. Việc phát triển các sản phẩm từ nọc ong không chỉ mang lại lợi ích cho sức khỏe mà còn góp phần bảo vệ môi trường và phát triển bền vững.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong bối cảnh gia tăng nhanh chóng các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc trên toàn cầu, việc tìm kiếm các chất kháng khuẩn mới có hiệu quả cao và an toàn trở thành một nhu cầu cấp thiết. Thuốc kháng sinh truyền thống đang dần mất hiệu lực do sự xuất hiện của các vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt là nhóm vi khuẩn ESKAPE gồm Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa và Enterobacter spp. Trong đó, peptide kháng khuẩn từ nọc ong được xem là nguồn tài nguyên quý giá với tiềm năng phát triển thuốc kháng sinh mới. Mastoparan, một peptide lưỡng phần có trong nọc ong Vespa velutina, được đánh giá cao về hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng chống lại cả vi khuẩn gram dương và gram âm.

Nghiên cứu này tập trung vào việc tinh chế và xác định hoạt tính kháng khuẩn của peptide mastoparan từ nọc ong Vespa velutina thu thập tại Việt Nam. Mục tiêu chính là phát hiện một loại mastoparan mới, đánh giá hiệu quả kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn chuẩn và đa kháng thuốc, từ đó mở ra hướng ứng dụng trong y dược như một chất kháng sinh tiềm năng. Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn 2020-2021, với phạm vi thu thập mẫu tại nhiều tỉnh miền Bắc và miền Trung Việt Nam, đồng thời thử nghiệm trên các chủng vi khuẩn gram dương và gram âm, bao gồm cả các chủng kháng thuốc phân lập từ bệnh viện.

Ý nghĩa của nghiên cứu được thể hiện qua việc cung cấp dữ liệu khoa học về thành phần peptide trong nọc ong Vespa velutina tại Việt Nam, đồng thời góp phần phát triển các giải pháp điều trị mới nhằm đối phó với tình trạng kháng thuốc hiện nay. Kết quả nghiên cứu có thể hỗ trợ phát triển các thuốc kháng khuẩn peptide an toàn, hiệu quả, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng và giảm thiểu tác động của vi khuẩn đa kháng thuốc.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Lý thuyết cấu trúc và hoạt tính peptide lưỡng phần: Mastoparan là peptide cation, gồm 14 amino acid, có cấu trúc xoắn α lưỡng phần, trong đó các gốc kỵ nước tập trung một phía và các gốc tích điện dương tập trung phía đối diện. Cấu trúc này giúp peptide tương tác mạnh với màng tế bào vi khuẩn, làm tăng tính thấm màng và gây ly giải tế bào.

• Mô hình cơ chế tác động trên màng vi sinh vật: Mastoparan gây phá vỡ màng tế bào vi khuẩn theo các mô hình như “carpet model” (mô hình thảm), “toroidal pore” (mô hình lỗ hình xuyến) và “barrel-stave” (mô hình thùng). Trong đó, mô hình thảm được ủng hộ mạnh mẽ, mô tả peptide tương tác song song với màng, tạo ra sự mất ổn định và phá vỡ lớp lipid kép.

• Khái niệm peptide kháng khuẩn (AMPs): Peptide kháng khuẩn là thành phần quan trọng trong hệ miễn dịch bẩm sinh, có khả năng tiêu diệt vi khuẩn, nấm và một số virus. Mastoparan thuộc nhóm AMPs với hoạt tính phổ rộng và tiềm năng ứng dụng trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn đa kháng thuốc.

• Khái niệm đa kháng thuốc và nhóm vi khuẩn ESKAPE: Nhóm vi khuẩn này có khả năng đề kháng cao với nhiều loại kháng sinh hiện có, gây khó khăn trong điều trị lâm sàng và đe dọa sức khỏe cộng đồng.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu và mẫu nghiên cứu: Mẫu ong Vespa velutina cái được thu thập tại nhiều tỉnh miền Bắc và miền Trung Việt Nam, bảo quản ở -20°C. Các chủng vi khuẩn chuẩn và đa kháng thuốc được cung cấp từ Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương, Trung tâm Bệnh nhiệt đới Bệnh viện Bạch Mai và Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

• Phương pháp tách chiết và tinh sạch peptide: Cơ quan nọc độc (ngòi và túi chứa nọc) được giải phẫu, chiết xuất protein/peptide bằng dung dịch acetonitrile 50% trong 3 giờ ở 4°C, ly tâm và làm khô bằng SpeedVac. Hỗn hợp peptide được tinh sạch bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao đảo pha (RP-HPLC) với cột Luna C18, sử dụng gradient acetonitrile 5-60% chứa 0,1% TFA.

• Phân tích và xác định trình tự peptide: Các phân đoạn thu được được phân tích bằng khối phổ MALDI-TOF/MS, phổ được xử lý bằng phần mềm FlexAnalysis và PEAK để nhận diện và xác định trình tự amino acid của mastoparan.

• Tổng hợp peptide mastoparan nhân tạo: Sử dụng phương pháp tổng hợp peptide pha rắn tự động với nguyên liệu N-α F-moc amino acid, tinh sạch bằng RP-HPLC và xác nhận bằng khối phổ.

• Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn: Phương pháp khoanh giấy khuếch tán trên đĩa thạch Muller-Hinton agar được áp dụng để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của mastoparan tự nhiên và tổng hợp trên các chủng vi khuẩn gram dương, gram âm chuẩn và đa kháng thuốc. Mật độ vi khuẩn chuẩn hóa khoảng 10^6 CFU/mL, ủ ở 36±1°C trong 24 giờ. Đường kính vùng ức chế được đo để đánh giá hiệu quả.

• Xử lý số liệu: Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm Excel, trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn, các thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần để đảm bảo độ tin cậy.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tinh sạch và nhận diện mastoparan: Qua sắc ký RP-HPLC, 11 phân đoạn peptide được thu nhận, trong đó phân đoạn số 7 và số 9 có cường độ hấp thụ UV cao nhất (khoảng 1700 và 2000 mAu) và diện tích đỉnh lớn nhất, cho thấy số lượng peptide dồi dào. Phân tích MALDI-TOF/MS xác định hai phân đoạn này tương ứng với mastoparan-X và mastoparan-like peptide 12a, với khối lượng phân tử xấp xỉ 1444.4 Da.

2. Hoạt tính kháng khuẩn của mastoparan tự nhiên: Mastoparan tinh sạch thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn gram âm (E. coli, S. flexneri, S. typhimurium) và gram dương (S. aureus) chuẩn với đường kính vùng ức chế dao động từ 12 đến 22 mm, cho thấy hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng.

3. Hoạt tính kháng khuẩn của mastoparan tổng hợp trên vi khuẩn đa kháng thuốc: Mastoparan tổng hợp nhân tạo (MP) cho thấy hiệu quả ức chế đáng kể trên các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc như Salmonella spp kháng ampicillin, Klebsiella pneumoniae đa kháng thuốc, Acinetobacter baumannii đa kháng thuốc và MRSE (Methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis). Đường kính vùng ức chế đạt từ 10 đến 18 mm, tương đương hoặc vượt trội so với một số kháng sinh đối chứng.

4. Mức độ nhạy cảm và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Mastoparan có MIC thấp đối với các chủng vi khuẩn thử nghiệm, thể hiện hiệu quả kháng khuẩn cao ngay ở nồng độ peptide thấp. So sánh với các kháng sinh truyền thống, mastoparan duy trì hoạt tính trên các chủng kháng thuốc, cho thấy tiềm năng vượt trội trong điều trị các nhiễm khuẩn khó chữa.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu khẳng định mastoparan từ nọc ong Vespa velutina thu tại Việt Nam có cấu trúc và hoạt tính tương tự các mastoparan đã được báo cáo ở các loài ong khác trong chi Vespa. Việc tinh sạch thành công hai phân đoạn mastoparan với khối lượng phân tử phù hợp và xác định trình tự amino acid cho thấy quy trình chiết tách và phân tích đạt hiệu quả cao.

Hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng của mastoparan, đặc biệt trên các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc, phù hợp với cơ chế tác động qua màng tế bào theo mô hình thảm, làm tăng tính thấm và gây ly giải tế bào vi khuẩn. So với các nghiên cứu trước đây, mastoparan trong nghiên cứu này thể hiện hiệu quả tương đương hoặc cao hơn, đặc biệt khi thử nghiệm trên các chủng vi khuẩn phân lập lâm sàng đa kháng thuốc tại Việt Nam.

Dữ liệu cũng cho thấy mastoparan tổng hợp nhân tạo giữ được hoạt tính sinh học, mở ra khả năng sản xuất peptide với số lượng lớn phục vụ nghiên cứu và ứng dụng. Các biểu đồ sắc ký và phổ khối phổ MALDI-TOF minh họa rõ ràng sự phân tách và nhận diện peptide, trong khi bảng so sánh đường kính vùng ức chế và MIC cung cấp bằng chứng định lượng về hiệu quả kháng khuẩn.

Những phát hiện này góp phần làm rõ tiềm năng của mastoparan như một ứng viên thuốc kháng sinh mới, đặc biệt trong bối cảnh kháng thuốc gia tăng. Đồng thời, nghiên cứu cũng bổ sung dữ liệu khoa học về thành phần nọc ong Vespa velutina tại Việt Nam, hỗ trợ phát triển các sản phẩm dược phẩm peptide trong tương lai.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển quy trình tổng hợp và tinh sạch mastoparan quy mô lớn

   • Mục tiêu: Tăng sản lượng peptide chất lượng cao để phục vụ nghiên cứu và ứng dụng.
   • Thời gian: 1-2 năm.
   • Chủ thể thực hiện: Các viện nghiên cứu công nghệ sinh học và dược phẩm.

2. Nghiên cứu sâu về cơ chế tác động và độc tính peptide mastoparan

   • Mục tiêu: Đánh giá an toàn, độc tính trên tế bào người và mô hình động vật, xác định cơ chế phân tử chi tiết.
   • Thời gian: 2-3 năm.
   • Chủ thể thực hiện: Các trung tâm nghiên cứu sinh học phân tử và dược lý.

3. Thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng peptide mastoparan kết hợp với kháng sinh hiện có

   • Mục tiêu: Tăng hiệu quả điều trị, giảm liều kháng sinh, hạn chế kháng thuốc.
   • Thời gian: 3-5 năm.
   • Chủ thể thực hiện: Các bệnh viện, trung tâm nghiên cứu lâm sàng, công ty dược phẩm.

4. Xây dựng cơ sở dữ liệu peptide kháng khuẩn từ nọc ong các loài tại Việt Nam

   • Mục tiêu: Khai thác đa dạng peptide có hoạt tính sinh học, mở rộng nguồn nguyên liệu thuốc mới.
   • Thời gian: 3 năm.
   • Chủ thể thực hiện: Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, các trường đại học.

5. Tăng cường hợp tác quốc tế trong nghiên cứu peptide kháng khuẩn

   • Mục tiêu: Trao đổi kỹ thuật, nâng cao chất lượng nghiên cứu, đẩy nhanh ứng dụng thực tiễn.
   • Thời gian: Liên tục.
   • Chủ thể thực hiện: Các viện nghiên cứu, tổ chức khoa học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành sinh học phân tử, công nghệ sinh học

   • Lợi ích: Hiểu rõ quy trình tinh sạch peptide, kỹ thuật phân tích MALDI-TOF, tổng hợp peptide pha rắn và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn.
   • Use case: Áp dụng trong nghiên cứu peptide kháng khuẩn và phát triển thuốc mới.

2. Chuyên gia và kỹ thuật viên trong lĩnh vực dược phẩm và y sinh

   • Lợi ích: Nắm bắt tiềm năng ứng dụng mastoparan trong phát triển thuốc kháng sinh peptide, phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn.
   • Use case: Thiết kế sản phẩm thuốc mới, thử nghiệm tiền lâm sàng.

3. Bác sĩ và nhà quản lý y tế quan tâm đến vấn đề kháng thuốc

   • Lợi ích: Hiểu về các giải pháp thay thế kháng sinh truyền thống, cập nhật xu hướng nghiên cứu peptide kháng khuẩn.
   • Use case: Đề xuất hướng điều trị mới, chính sách kiểm soát kháng thuốc.

4. Doanh nghiệp công nghệ sinh học và dược phẩm

   • Lợi ích: Khai thác nguồn nguyên liệu peptide từ thiên nhiên, phát triển sản phẩm thuốc peptide kháng khuẩn.
   • Use case: Đầu tư nghiên cứu, thương mại hóa sản phẩm mới.

Câu hỏi thường gặp

1. Mastoparan là gì và tại sao nó được quan tâm trong nghiên cứu kháng khuẩn?
   Mastoparan là peptide lưỡng phần gồm 14 amino acid, có cấu trúc xoắn α đặc trưng giúp tương tác mạnh với màng tế bào vi khuẩn, gây phá vỡ màng và tiêu diệt vi khuẩn. Nó có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng, hiệu quả trên cả vi khuẩn gram dương và gram âm, kể cả các chủng đa kháng thuốc, nên được xem là ứng viên tiềm năng cho thuốc kháng sinh mới.

2. Phương pháp tinh sạch mastoparan trong nghiên cứu này như thế nào?
   Nọc ong Vespa velutina được chiết xuất bằng dung dịch acetonitrile 50%, sau đó tinh sạch peptide bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao đảo pha (RP-HPLC) với cột Luna C18, sử dụng gradient acetonitrile 5-60% chứa 0,1% TFA. Các phân đoạn thu được được phân tích bằng khối phổ MALDI-TOF để nhận diện và xác định trình tự.

3. Mastoparan có hiệu quả trên các vi khuẩn đa kháng thuốc không?
   Có. Mastoparan tổng hợp nhân tạo trong nghiên cứu đã thể hiện hoạt tính ức chế đáng kể trên các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc như Salmonella spp kháng ampicillin, Klebsiella pneumoniae đa kháng thuốc, Acinetobacter baumannii đa kháng thuốc và MRSE, với đường kính vùng ức chế từ 10 đến 18 mm.

4. Cơ chế tác động của mastoparan lên màng vi khuẩn là gì?
   Mastoparan tương tác với màng tế bào vi khuẩn theo mô hình “carpet model”, trong đó peptide bám song song lên bề mặt màng, tạo ra sự mất ổn định lớp lipid kép, dẫn đến hình thành các lỗ tạm thời và phá vỡ màng, gây ly giải tế bào vi khuẩn.

5. Nghiên cứu này có thể ứng dụng thực tiễn như thế nào?
   Kết quả nghiên cứu mở ra khả năng phát triển mastoparan như một loại thuốc kháng sinh peptide mới, đặc biệt trong điều trị các nhiễm khuẩn do vi khuẩn đa kháng thuốc. Ngoài ra, peptide này có thể được tổng hợp nhân tạo quy mô lớn để phục vụ nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng, góp phần giảm thiểu kháng thuốc và nâng cao hiệu quả điều trị.

Kết luận

• Đã tinh sạch thành công peptide mastoparan từ nọc ong Vespa velutina thu thập tại Việt Nam, xác định trình tự amino acid và khối lượng phân tử phù hợp với các mastoparan đã biết.
• Mastoparan thể hiện hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng trên các chủng vi khuẩn gram dương, gram âm chuẩn và đa kháng thuốc, với hiệu quả ức chế rõ rệt.
• Peptide mastoparan tổng hợp nhân tạo giữ được hoạt tính sinh học, mở ra tiềm năng sản xuất quy mô lớn phục vụ nghiên cứu và ứng dụng.
• Cơ chế tác động chủ yếu là phá vỡ màng tế bào vi khuẩn theo mô hình thảm, làm tăng tính thấm và gây ly giải tế bào.
• Nghiên cứu góp phần bổ sung dữ liệu khoa học về peptide kháng khuẩn từ nọc ong Vespa velutina tại Việt Nam, đồng thời đề xuất các hướng phát triển thuốc kháng sinh peptide mới trong tương lai.

Next steps: Tiếp tục nghiên cứu độc tính, cơ chế phân tử chi tiết, thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng, đồng thời phát triển quy trình tổng hợp và tinh sạch peptide quy mô lớn.

Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp trong lĩnh vực công nghệ sinh học, dược phẩm được khuyến khích hợp tác để phát triển mastoparan thành sản phẩm thuốc kháng sinh peptide hiệu quả, góp phần giải quyết vấn đề kháng thuốc hiện nay.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ ONG Vespa velutina Ong bắt mồi chân vàng, Vespa velutina (Hình 1.1) là một loài ong có nguồn gốc từ các nước khu vực Châu Á [1] và đã xâm nhập vào một số khu vực của Châu Âu, lần đầu tiên xuất hiện ở Pháp vào năm 2004 [1]. Như một kẻ săn mồi nói chung, chúng là một loài gây hại cho ong mật và là mối quan tâm chính của nhiều người nuôi ong.1 Ong Vespa velutina (Lepeletier) [1] Luan van 6 1.1 Phân loại khoa học Giới (regnum) : Animalia Ngành (phylum) : Arthropoda Lớp (class) : Insecta Bộ (ordo) : Hymenoptera Họ (familia) : Vespidae Phân họ (subfamilia) : Vespinae Chi (genus) : Vespa Loài (species) : V.2 Phân bố của ong Vespa velutina Vespa velutina có nguồn gốc từ Châu Á, là loài bản địa ở Đông Nam Á, xuất hiện ở Hàn Quốc [1], Trung Quốc [2] và Nhật Bản [3] và mốt số quốc gia Châu Á khác. Nó được du nhập vào Pháp vào năm 2004, rất có thể thông qua việc nhập khẩu các chậu cây cảnh [2].

Loài này có khả năng xâm lấn rất cao và dễ dàng lây lan sang các khu vực châu Âu khác như Ý [4], Anh [5], Quần đảo Balearic [6] và miền bắc nước Đức [7] Phân bố của loài ong Vespa velutina ở Việt Nam Loài ong Vespa velutina có thể được tìm thấy ở các tỉnh của Việt Nam như: Hà Giang, Cao Bằng, Thái Nguyên, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hà Tây, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Lâm Đồng, v.3 Hình thái của ong Vespa velutina V. velutina rất đa dạng về màu sắc và 10 phân loài đã được xác định [8], [9], [10]. Villemant (Bảo tàng Lịch sử Tự nhiên Quốc gia, Paris, thông tin cá nhân của Pháp, 2013) mô tả Vespa velutina nigrithorax (Hình 1.3) như sau: Luan van 7 Ong cái: Đầu và ngực nhọn, có lông tơ mịn mọc rải rác, bụng có rãnh. Cơ thể màu nâu sẫm, mặt và miệng có màu cam (trừ răng sẫm màu); râu màu nâu ở mặt lưng, màu cam ở bụng.

Mặt lưng của các đoạn bụng màu nâu với các rìa đỉnh rõ ràng hơn: một dải mỏng màu vàng ở đoạn thứ nhất và dải mỏng màu cam ở đoạn thứ hai và thứ ba; đoạn bụng thứ tư gần như hoàn toàn màu cam với một vạch đen hình tam giác ở giữa, thường không nhìn thấy khi ong bắp cày còn sống; đoạn bụng thứ năm và thứ sáu có màu nâu cam nhiều hơn hoặc ít hơn. Phần bụng màu nâu, đỉnh hình tam giác thường nhạt hơn; phân đoạn thứ hai và thứ ba màu vàng toàn thân với một vạch đen ở giữa. Chân màu nâu trừ tarsi vàng; cánh màu nâu xám. Không có sự khác biệt rõ rệt về hình thái giữa con cái (ong thợ) hữu tính và bất dục.

Một số ong thợ nhỏ hơn (đặc biệt là vào mùa xuân) nhưng vào mùa thu, nhiều ong thợ lớn như những ong chúa tương lai. Bên trong đàn, có thể nhận ra ong chúa đẻ trứng bằng phần bụng căng phồng và vào cuối mùa, đôi cánh bị hư hại.2 Ong Vespa velutina nigrithorax cái mặt lưng (phía trên) và bụng (phía dưới) [11] Luan van 8 Con đực: rất giống con cái về kích thước và màu sắc, râu dài hơn. Mặt bụng của bụng màu nâu, đỉnh cụt có một đôi đốm vàng. Ong đực và ong cái có thể phân biệt với nhau bằng các râu của chúng, với các râu ong cái có vẻ mỏng hơn và chiều dài ngắn hơn so với râu của ong đực.

Như với tất cả các Bộ cánh màng, con cái có ngòi độc còn con đực thì không.3 Ong Vespa velutina nigrithorax cái (bên trái) và đực (bên phải) [12] 1.2 GIỚI THIỆU VỀ NỌC ONG Các sinh vật sử dụng nọc độc như một thứ vũ khí hoá học hiệu quả để tự vệ và săn bắt con mồi, vì vậy nọc của chúng được tiến hoá theo hướng đặc trưng cho loài và độc tính cao. Bên cạnh đó, nọc độc cũng là nguồn dự trữ các hợp chất có hoạt tính sinh học quý, mang lại nhiều hứa hẹn trong việc tìm tòi và phát triển các loại thuốc chữa bệnh (Hình 1. Luan van 9 Hình 1.4 Nọc ong săn mồi như một nguồn của các hợp chất có hoạt tính sinh học và các ứng dụng của chúng [13].1 Các thành phần của nọc ong Nọc ong là một hỗn hợp phức tạp chứa 3 nhóm chất chính: gồm các enzyme có bản chất là protein (hyaluronidase, phospholipase A và B, phosphatase acid, các protease, esterase và glucidase); các peptide nhỏ (apamin là chất độc thần kinh, melittin là chất độc gây tan máu, MCD peptide - Mast cell degranulating peptide, kinin, bradykinin, kháng nguyên 5, mastoparan); và cuối cùng gồm các phân tử nhỏ khác như các amin gây viêm (histamin, noradrenalin, dopamin, serotonin, acetylcholine) (Bảng 1. Luan van 10 Hyaluronidase Phospholipase A2 Melittin Mastoparan Hình 1.5 Một số hợp chất trong thành phần trong nọc ong Luan van 11 1.1 Các enzyme Hyaluronidase và Phospholipase là hai enzyme chính có trong nọc độc của các loài ong.

Hai enzyme này có thể kích hoạt phản ứng miễn dịch, bằng cách cảm ứng IgE gây ra các phản ứng quá mẫn dẫn đến phá huỷ lớp lipid kép trong màng tế bào, gây độc tế bào hoặc kích thích miễn dịch đối với các loại tế bào khác [15], [16]. Hyaluronidase thuỷ phân và cắt đặc hiệu acid hyaluronic, có thể được sử dụng như các tác nhân gây mê, giảm đau, chống ung thư và cũng hỗ trợ sự phân tán thuốc trong mô [17]. Phospholipase A-2 (PLA2) là thành phần chủ yếu thứ 2 của nọc ong, chiếm 10-12% trọng lượng khô của nọc. PLA2 là một enzyme phụ thuộc vào canxi mà thủy phân sn-2 este của glycerophospholipids để tạo ra một acid béo và một lysophospholipid.

Nó có thể phá hủy phospholipids, phá vỡ tính toàn vẹn của lớp lipid kép, do đó làm cho các tế bào dễ bị suy thoái hơn. Trên thực tế, các sản phẩm phản ứng PLA2, chẳng hạn như lysophosphatidylcholine, acid lysophosphatidic và sphingosine 1- phosphate, có thể có tác dụng gây độc tế bào hoặc kích thích miễn dịch trên các loại tế bào khác nhau, gây viêm và phản ứng miễn dịch [16] 1.2 Các peptide MCD peptide (Mast cell degranulating peptide) là một peptide tích điện dương gồm 22 amino acid chứa 2 cầu disulfide giữa Cys3 và Cys15, Cys5 và Cys19, có cấu trúc giống như apamin, [18]. Peptide này có tiềm năng kháng viêm, tuy nhiên khi ở nồng độ thấp MCD peptide lại là chất trung gian mạnh của quá trình phân rã tế bào mast và giải phóng chủ động histamine từ các tế bào mast, mà được hiện diện trong việc truyền máu và trong tất cả các cô được truyền dịch bằng máu [19]. Bradykinin là peptide thuộc nhóm protein kinin, tác động vào hai thụ thể được ký hiệu là B1 và B2 gây đau và làm giảm huyết áp [19].

Đối với thụ thể B1 chỉ được biểu hiện do tổn thương mô và nó được cho là có vai trò gây đau mãn tính. Ngược lại, thụ thể B2 được biểu hiện chủ yếu, tham gia vào quá trình Luan van 12 giãn mạch thông qua việc giải phóng prostacyclin, oxit nitric, và yếu tố tăng phân cực có nguồn gốc nội mô, do đó góp phần làm giảm huyết áp [19], [20]. Adolapin là peptide đầu tiên được tinh sạch từ nọc ong trong thập kỷ 80, ức chế hoạt động của protstaglandin gây ra hiệu quả giảm đau và kháng viêm mạnh khi thử nghiệm trên chuột [21], [22]. Melittin là peptide độc hoà tan trong nước chiếm 50% trọng lượng khô của nọc.

Đây là peptide xoắn lưỡng phần ( một phân tử có cả tính chất ưa nước và kỵ nước ) bao gồm 26 gốc amino acid và trong đó cùng đầu N chủ yếu kỵ nước và vùng đầu C là ưa nước. Melittin là thành phần hoạt động chính của nọc ong (apitoxin) và chịu trách nhiệm phá vỡ và giết các tế vào. Khi một số peptide melittin tích tụ trong màng tế bào, quá trình đóng gói phospholipid bị phá vỡ nghiêm trọng, do đó dẫn đến ly giải tế bào [23]. Melittin và phospholipase A-2 ức chế sự tăng sinh tế bào khối u và do đó có giá trị tiềm năng cho chữa trị ung thư và giảm khả năng nhiễm HIV-1 [24].

Apamin là độc tố thần kinh trong nọc ong gồm có 18 gốc amino acid với hai cầu nối disulfide mà liên kết vị trí 1 với 11 và vị trí 3 với 15 [25]. Apamin được biết từ rất lâu như là chất ức chế chọn lọc cao của các kênh K+ đã kích hoạt Ca2+ (kênh SK) được biểu hiện trong hệ thống thần kinh trung ương. Loại kênh này đóng một vai trò quan trọng trong các hoạt động lặp đi lặp lại trong các tế bào thần kinh, ngăn chặn nhiều hiệu ứng ức chế siêu phân cực [26]. Mastoparan là một peptide lưỡng phần hoạt động trên màng với 14 amino acid, cảm ứng sự vận chuyển tính thấm của màng nên ảnh hưởng đến khả năng sống sót của tế bào [27].3 Các phân tử nhỏ khác Ngoài 2 thành phần cơ bản ở trên, trong nọc ong còn chứa một số phân tử nhỏ khác như các chất khoáng, các amino acid và các chất có hoạt tính giống như amin.

Trong nhóm này kể đến histamine là một chất chính điển hình, tham gia vào quá trình gây viêm thông qua việc làm tăng tính thấm của thành mao mạch [22]. Luan van 13 Tương tự như vậy noradrenalin và dopamine làm tăng nhịp đập của tim và gây ra tăng tuần hoàn máu. Tuy nhiên giống như histamin, tác dụng của hai catecholamine này phần lớn bị lu mờ bởi những thành phần khác của nọc độc [22]. Serotonin hoạt động như một chất kích thích và góp phần gây ra những cơn đau.

Cuối cùng, acetylcholine có thể làm tăng cảm giác đau của một vết chích bằng cách kích thích thụ thể đau đồng thời với tác dụng của histamine [22].1 Một số protein và peptide chính được tìm thấy trong nọc ong [22]. Nọc ong mật Nọc ong vò vẽ % Tỉ lệ trong Kiểu và MW (Da) (bee) (wasp) nọc khô Phospholipase A2 Phospholipase A2 Enzyme (~18 kDa) 10-12 Phospholipase B Phospholipase B Enzyme (~26 kDa) 1 Hyaluronidase Hyaluronidase Enzyme (~54 kDa) 1.5-2 Phosphatase Phosphatase Enzyme (~60 kDa) 1 - Gluosidase - Gluosidase Enzyme (~170 kDa) 0.6 Melittin - Peptide (2847 Da) 40-50 Apamin - Peptide (2027 Da) 2-3 MCD peptide - Peptide (2593 Da) 2-3 - Mastoparan Peptide (1422 Da) - - Bradykinin Peptide (1060 Da) - Luan van 14 1.2 Ứng dụng của nọc ong Nọc ong là một chất độc với con người, vì vậy hiểu biết cặn kẽ đặc tính về thành phần phân tử, tác dụng phụ và độc học của chúng đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong việc bảo vệ con người cũng như tìm kiếm các thuốc mới một cách an toàn, hiệu quả. Nọc ong mật đã được nghiên cứu rất nhiều trong thế kỷ trước [18], [28].