Tổng quan luận án

Đề tài luận án tiến sĩ dược học mang tên "Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin ứng dụng vào viên nang cứng", thuộc chuyên ngành Công nghệ Dược phẩm và Bào chế thuốc (mã số: 62720402), do nghiên cứu sinh Nguyễn Hồng Trang thực hiện tại Trường Đại học Dược Hà Nội dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. Phạm Thị Minh Huệ và PGS. Vũ Thị Thu Giang, bảo vệ năm 2020.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Quercetin (C15H10O7) là một hợp chất flavonoid tự nhiên thuộc nhóm flavonol, có nhiều trong thực vật và thường được thu nhận từ rutin trong nụ hoa hòe (Sophora japonica L.). Hoạt chất này có nhiều tác dụng sinh học như chống oxy hóa, chống viêm, chống dị ứng, ngăn ngừa hình thành khối u và bảo vệ tế bào gan. Tuy nhiên, theo Hệ thống phân loại sinh dược học bào chế (BCS), quercetin thuộc nhóm II với đặc tính thấm tốt qua màng nhưng độ tan trong nước rất thấp (khoảng 1 µg/ml ở 25°C), đồng thời bị chuyển hóa mạnh qua gan và thải trừ nhanh (thời gian bán thải t1/2 khoảng 3,5 giờ). Do đó, sinh khả dụng đường uống của quercetin chỉ đạt khoảng 16% đến 17%, đòi hỏi liều dùng lâm sàng cao (500 – 1000 mg) để đạt hiệu quả điều trị.

Công nghệ phytosome—phức hợp giữa hoạt chất có nguồn gốc thực vật với phospholipid ở cấp độ phân tử—tạo ra cấu trúc tiểu phân lưỡng tính giúp tăng độ tan, tăng khả năng vận chuyển qua màng lipid kép và hấp thu qua hệ lympho đường ruột, từ đó hạn chế chuyển hóa bước 1 qua gan. Tại Việt Nam, nghiên cứu về phytosome chủ yếu dừng lại ở dịch chiết hoặc một số hoạt chất đơn lẻ như curcumin, rutin; nguồn nguyên liệu phytosome thương mại chủ yếu nhập khẩu với chi phí cao. Chưa có công trình trong nước nào nghiên cứu hệ thống về phytosome quercetin cũng như ứng dụng phức hợp này vào dạng thuốc rắn dùng đường uống (viên nang cứng).

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định hai mục tiêu chính được đánh số như sau:

  1. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế phytosome quercetin. Bước đầu đánh giá tác dụng chống oxy hoá in vitro và tác dụng bảo vệ gan in vivo của phytosome quercetin.
  2. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Quercetin dihydrat (nguyên liệu và chuẩn đối chiếu), phospholipid (lecithin đậu nành, phosphatidylcholin đậu nành đã hydrogen hóa - HSPC), cholesterol, tá dược viên nang cứng (lactose khan, SSG, Aerosil 200, Magnesi stearat, Talc, Tween 80), phức hợp phytosome quercetin và viên nang cứng chứa phytosome quercetin (hàm lượng quy đổi 50 mg quercetin/viên).
  • Đối tượng thử nghiệm sinh học: Chuột thuần chủng dòng BALB/c (5 – 6 tuần tuổi, khối lượng 20 – 35 g, không phân biệt giới tính).
  • Phạm vi không gian thực hiện: Bộ môn Bào chế – Trường Đại học Dược Hà Nội; Khoa Dược – Trường Đại học Y Dược, Đại học Huế; Viện Công nghệ Sinh học và Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQG Hà Nội); Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
  • Phạm vi thời gian: Luận án hoàn thành và bảo vệ năm 2020.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước được tác giả điểm luận

Tác giả tổng hợp các công trình trong và ngoài nước liên quan đến cải thiện sinh khả dụng đường uống của quercetin và ứng dụng công nghệ phytosome:

  • Các hệ phân tán nano cải thiện sinh khả dụng quercetin:
    • Hỗn dịch nano: Sun M. và cộng sự (2012) bào chế hỗn dịch nano quercetin kích thước 393,5 nm, nâng độ tan lên 78,26 µg/ml (gấp 71 lần dạng tự do), tăng diện tích dưới đường cong AUC0→∞ trên chuột lên 14,56 lần.
    • Hệ tiểu phân nano polyme: Nghiên cứu của các nhóm tác giả sử dụng PLGA giúp giải phóng > 50% quercetin sau 30 phút; hệ nano Eudragit® E kết hợp polyvinyl alcohol tăng tốc độ hòa tan gấp 74 lần.
    • Hệ tiểu phân nano lipid rắn (SLN): Li H. và cộng sự bào chế SLN chứa 13,2% quercetin, kéo dài giải phóng trên 48 giờ và tăng sinh khả dụng tương đối trên chuột lên 5,71 lần so với quercetin tự do.
    • Phytosome quercetin: Vankudri R. và cộng sự chứng minh phytosome quercetin tăng nồng độ đỉnh Cmax và nâng AUC0→∞ trên chuột gấp 2,44 lần. Riva A. và cộng sự đánh giá trên người tình nguyện khỏe mạnh cho thấy liều 500 mg phytosome quercetin làm tăng AUC0→∞ gấp 18 lần so với uống quercetin dạng tự do.
  • Nghiên cứu phytosome đối với các hoạt chất khác:
    • Bhattacharyya S. (2013) nghiên cứu phức hợp phospholipid - acid gallic làm tăng hấp thu 4,31 lần và kéo dài t1/2 từ 0,98 giờ lên 2,12 giờ.
    • Tan Q. và cộng sự nghiên cứu phytosome evodiamin kéo dài thời gian bán thải lên 2,07 giờ (so với 1,33 giờ của hoạt chất tự do).
    • Rudra Pratap Singh và cộng sự nghiên cứu phytosome lawsone, so sánh phương pháp bốc hơi dung môi và kết tủa dung môi, thu được hiệu suất phytosome hóa 97,7%.
  • Tình hình nghiên cứu phytosome tại Việt Nam:
    • Phạm Thị Minh Huệ và cộng sự (2015) bào chế phytosome curcumin bằng phương pháp bốc hơi dung môi sử dụng HSPC, kích thước tiểu phân 283,6 nm, hiệu suất quy trình 82,48%.
    • Nguyễn Thị Thúy và cộng sự (2016) bào chế phytosome saponin tam thất (Panax notoginseng) bằng phương pháp kết tủa trong dung môi.
    • Vũ Thị Quỳnh (2018) bào chế phytosome cao bạch quả (Ginkgo biloba) với tỷ lệ flavonoid : lecithin là 1:4.
    • Nhóm nghiên cứu tại ĐH Dược Hà Nội (2018) nghiên cứu phytosome rutin bằng phương pháp phun sấy và bốc hơi dung môi với tỷ lệ rutin:PC:cholesterol là 1:1:0,2.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù phytosome đã chứng minh được hiệu quả tăng cường hấp thu, hầu hết các nghiên cứu trong nước trước đó mới tập trung vào giai đoạn tạo phức hợp ở quy mô phòng thí nghiệm nhỏ, chưa hoàn thiện quy trình nâng quy mô, chưa phân tích toàn diện cấu trúc liên kết bằng chuỗi phổ hóa lý hiện đại (FTIR, DSC, XRD, 1H-NMR, 13C-NMR, MS), và chưa phát triển dạng thuốc hoàn chỉnh (viên nang cứng) có đánh giá đầy đủ độ ổn định cùng tác dụng dược lý thực nghiệm in vivo. Luận án giải quyết khoảng trống này bằng cách thiết lập quy trình bào chế phytosome quercetin đồng bộ từ quy mô phòng thí nghiệm đến 500 g/mẻ, kiểm chứng cấu trúc phân tử, và phát triển thành công dạng viên nang cứng 50 mg.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

  • Lý thuyết tạo phức hợp phytosome: Phytosome hình thành dựa trên liên kết hydro và tương tác tĩnh điện giữa các nhóm hydroxyl phân cực (-OH) của phân tử polyphenol (quercetin có 5 nhóm -OH tại các vị trí C3, C3', C4', C5, C7) với phần đầu phân cực (nhóm phosphat mang điện tích âm và nhóm cholin/amonium mang điện tích dương) của phospholipid (phosphatidylcholin). Hai chuỗi acid béo thân dầu không tham gia liên kết, quay ra ngoài tạo màng bao bọc.
  • Phân biệt phytosome và liposome: Luận án sử dụng khung phân tích so sánh bản chất liên kết giữa hai hệ mang:
Tiêu chí Phytosome Liposome
Bản chất liên kết Hoạt chất liên kết hóa học (liên kết hydro, tĩnh điện) với phospholipid tạo thành phức hợp phân tử Hoạt chất nằm trong khoang nước hoặc xen kẽ lớp lipid kép, không có liên kết hóa học với phospholipid
Tỷ lệ thành phần Tỷ lệ mol hoạt chất : phospholipid xác định (thường 1:1 đến 1:3) Hàng trăm đến hàng nghìn phân tử lipid bao bọc một lượng nhỏ dược chất
Môi trường hình thành Hình thành trong dung môi không phân cực hoặc phân cực yếu/trung bình (ethanol, ethyl acetat) Hình thành trong môi trường nước hoặc dung dịch đệm
Tính chất tiểu phân Cấu trúc phân tử lưỡng thân, tạo micell bền vững khi hydrat hóa Cấu trúc túi lipid đa lớp hoặc đơn lớp bao bọc pha nước
  • Cơ chế gây độc gan của CCl4: Carbon tetraclorid được chuyển hóa qua hệ enzym cytochrom P450 (chủ yếu là CYP2E1) thành gốc tự do tricloromethyl ($CCl_3^\bullet$) và tricloromethyl peroxyl ($CCl_3OO^\bullet$), gây peroxy hóa lipid màng tế bào gan, giải phóng men gan (AST, ALT) vào máu, làm giảm nồng độ glutathion (GSH) và tăng hàm lượng malondialdehyd (MDA) trong mô gan.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Kỹ thuật bào chế:
    • Phương pháp bốc hơi dung môi: Hòa tan quercetin và HSPC/cholesterol trong ethanol tuyệt đối, cất quay tạo màng phim ở 60 – 80°C, hút chân không loại dung môi trong 16 giờ, hydrat hóa bằng nước cất ở 60°C, siêu âm giảm kích thước tiểu phân và sấy chân không ở 40°C trong 24 giờ.
    • Phương pháp kết tủa trong dung môi: Hòa tan thành phần trong ethanol, khuấy phản ứng ở 60 – 80°C, kết tủa phân lập bằng n-hexan.
    • Nâng quy mô: Thiết lập quy trình trên hệ thống cất quay Buchi bình cầu 20 lít ở mẻ 500 g.
    • Bào chế viên nang cứng: Tạo cốm phytosome quercetin bằng phương pháp xát hạt ướt với cồn, phối hợp tá dược rã trong/rã ngoài, đóng vào vỏ nang gelatin số 0 bằng thiết bị đóng nang bán tự động.
  • Kỹ thuật phân tích và kiểm nghiệm hóa lý:
    • Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Hệ thống Agilent 1260, cột C18 (4,6 × 250 mm; 5 µm), detector UV bước sóng 370 nm; pha động methanol : nước : acid phosphoric (100:100:1, tt/tt), tốc độ dòng 1,0 ml/phút.
    • Quang phổ hấp thụ UV-Vis: Đo độ hấp thụ tại bước sóng 255 nm và 370 nm/374 nm để định lượng trong thử nghiệm hòa tan.
    • Hiệu suất phytosome hóa (EE%): Tách quercetin tự do và phytosome bằng dung môi hòa tan chọn lọc (ethyl acetat) kết hợp siêu âm và ly tâm màng siêu lọc Amicon® Ultra (10 – 50 kDa).
    • Hình thái và kích thước tiểu phân: Kính hiển vi điện tử quét FESEM Hitachi S-4800; tán xạ ánh sáng động (DLS) và đo thế Zeta trên thiết bị Zetasizer NanoZS90.
    • Xác định cấu trúc và trạng thái vật lý: Nhiễu xạ tia X (XRD - Brucker D8 Advance), phân tích nhiệt quét vi sai (DSC - Mettler Toledo), phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR - Jasco FT/IR 6700), cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR - Bruker Ascend 500 MHz), phổ khối lượng (ESI-MS - LTQ OrbitrapXL).
  • Phương pháp đánh giá dược lý:
    • Khả năng chống oxy hóa in vitro: Đánh giá khả năng trung hòa gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) qua độ giảm hấp thụ quang ở bước sóng 517 nm, tính giá trị IC50 so sánh với acid ascorbic và quercetin tự do.
    • Tác dụng bảo vệ gan in vivo: Gây tổn thương gan cấp tính trên chuột BALB/c bằng CCl4 pha trong dầu ô liu. Đánh giá hoạt độ enzym AST, ALT trong huyết thanh; hàm lượng MDA và GSH trong mô đồng thể gan; tính khối lượng gan tương đối.
  • Đánh giá độ ổn định: Bảo quản mẫu bột phytosome và viên nang trong tủ vi khí hậu DEAYANG TH-180S ở điều kiện dài hạn (25°C ± 2°C, RH 60% ± 5%) và điều kiện lão hóa cấp tốc (40°C ± 2°C, RH 75% ± 5%) trong thời gian 6 tháng.
  • Xử lý số liệu thống kê: Tính toán giá trị trung bình, độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD%). Phân tích ý nghĩa thống kê bằng kiểm định t-test hoặc ANOVA qua phần mềm chuyên dụng (mức ý nghĩa p < 0,05).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 cung cấp luận cứ khoa học tổng hợp về hoạt chất quercetin, cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa, các phương pháp định lượng và các rào cản dược động học chính:

  • Tổng hợp các đặc tính của quercetin: khối lượng phân tử 302,23 g/mol, nhiệt độ nóng chảy 316,5°C, hệ số phân bố dầu - nước log P = 1,82 ± 0,32, các hằng số phân ly pKa (từ 7,17 đến 13,11).
  • Trình bày chi tiết dược động học: hấp thu kém qua đường tiêu hóa (SKD 16 – 17%), liên kết protein huyết tương cao (98%), chuyển hóa liên hợp glucuronid/sulfat hóa mạnh tại ruột và gan, thời gian bán thải ngắn (3,5 giờ).
  • Đánh giá toàn diện các hệ mang thuốc cải thiện sinh khả dụng quercetin, phân tích ưu nhược điểm của từng hệ và khẳng định tính khả thi của hệ phytosome.
  • Khái quát lý thuyết cấu tạo phytosome, phân loại phospholipid (tự nhiên, tổng hợp, hydrogen hóa), vai trò của cholesterol trong việc làm bền cấu trúc màng micell và hạn chế rò rỉ dược chất.
  • Tổng kết các phương pháp phân tích hóa lý hiện đại áp dụng trong đánh giá phytosome và mô hình gây độc gan bằng CCl4 trên động vật thực nghiệm.

Chương 2: Nguyên liệu, trang thiết bị và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết về thông số kỹ thuật, nguồn gốc xuất xứ của nguyên vật liệu, hệ thống máy móc phân tích và các quy trình thực nghiệm:

  • Bảng danh mục hóa chất chuẩn và nguyên liệu chính: Quercetin dihydrat (Shaanxi Kingsci, > 95%), Quercetin chuẩn (Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP.HCM, 95,7%), Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (HSPC - Lipoid, Đức), Lecithin đậu nành (chứa 50,9% PC), Cholesterol (Lipoid, Đức), DPPH, CCl4, TBA, TCA.
  • Mô tả chi tiết quy trình bào chế theo hai phương pháp (bốc hơi dung môi và kết tủa dung môi), trong đó phương pháp bốc hơi dung môi sử dụng ethanol tuyệt đối được lựa chọn làm quy trình chính.
  • Quy trình phân tích định lượng HPLC thẩm định đầy đủ về tính thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng.
  • Mô tả quy trình xây dựng công thức viên nang cứng, quy trình tạo hạt cốm phytosome, khảo sát ảnh hưởng của các tá dược (tá dược độn lactose khan, tá dược rã SSG, tỷ lệ rã trong : rã ngoài, tá dược tăng độ tan Tween 80).
  • Mô tả thiết kế thí nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro (DPPH) và quy trình gây độc gan bằng CCl4 trên chuột BALB/c (phân chia các lô đối chứng âm, đối chứng bệnh lý CCl4, lô chứng dương, lô uống quercetin tự do và lô uống phytosome quercetin).

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được qua các giai đoạn nghiên cứu:

  • Thẩm định phương pháp định lượng:
    • Phương pháp HPLC: Đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát ($R^2 > 0,999$), độ lặp lại có RSD < 2,0%, độ đúng thu hồi đạt từ 98,0% đến 102,0%.
    • Phương pháp UV-Vis: Xác định bước sóng hấp thụ cực đại tại 370 nm (trong ethanol/nước), độ tuyến tính cao, phù hợp cho thử nghiệm hòa tan.
  • Xây dựng công thức và quy trình bào chế phytosome quercetin:
    • Khảo sát loại phospholipid: HSPC cho hiệu suất phytosome hóa cao hơn và tiểu phân bền vững hơn so với lecithin thô.
    • Tỷ lệ mol tối ưu: Quercetin : HSPC : Cholesterol đạt tỷ lệ 1 : 1 : 0,2 cho hiệu suất phytosome hóa cao nhất (> 95%), kích thước tiểu phân nhỏ và phân bố hẹp.
    • Thông số quy trình tối ưu: Nhiệt độ phản ứng 60°C, tốc độ quay 100 vòng/phút, thời gian tạo phức 2 giờ, thời gian bốc hơi dung môi 16 giờ.
    • Nâng quy mô thành công lên 500 g/mẻ: Các chỉ tiêu chất lượng (hàm lượng hoạt chất, EE%, độ ẩm < 5%) của lô 500 g tương đương với mẻ quy mô phòng thí nghiệm.
Quercetin + HSPC + Cholesterol (1 : 1 : 0,2 mol)
          Khuấy phản ứng (60°C, 2 giờ)
          Màng phim phytosome khô
          Hỗn dịch phytosome thô
          Hỗn dịch phytosome phân tán đều
          Bột phytosome quercetin (Độ ẩm < 5%)
  • Đặc tính hóa lý và tương tác phân tử của phytosome:
    • Hình thái và kích thước: Ảnh SEM cho thấy phytosome có dạng hình cầu đồng nhất; phương pháp DLS xác định kích thước tiểu phân nằm trong khoảng nano/submicron với chỉ số PDI < 0,3; thế Zeta âm đảm bảo độ bền tĩnh điện.
    • Độ tan và tốc độ hòa tan: Độ tan trong nước của quercetin trong phytosome tăng đáng kể so với quercetin nguyên liệu ở tất cả các môi trường pH (pH 1,2; 4,5; 6,8 và nước cất). Khả năng giải phóng qua màng bán thấm tăng vượt trội so với dạng tự do.
    • Phổ DSC và XRD: Giản đồ XRD của phytosome cho thấy sự biến mất hoàn toàn của các pic nhiễu xạ tinh thể sắc nhọn của quercetin, thay bằng pic vô định hình rộng. Phổ DSC cho thấy pic nóng chảy đặc trưng của quercetin ở 316,5°C biến mất, xác nhận hoạt chất đã chuyển sang trạng thái vô định hình và phân tán phân tử trong chất mang.
    • Phổ FTIR, NMR và MS: Phổ FTIR ghi nhận sự dịch chuyển số sóng dao động của nhóm -OH và nhóm phosphat $(RO)_2PO_2^-$. Phổ 1H-NMR và 13C-NMR chứng minh liên kết hydro hình thành giữa nhóm -OH phenol của quercetin với đầu phân cực của HSPC mà không làm biến đổi chuỗi béo. Phổ khối ESI-MS ghi nhận các pic ion phân tử của phức hợp tương ứng với tỷ lệ phản ứng 1:1.
  • Tác dụng sinh học:
    • Tác dụng chống oxy hóa in vitro: Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của phytosome quercetin tương đương hoặc nhỉnh hơn quercetin tự do và có giá trị IC50 gần với acid ascorbic.
    • Tác dụng bảo vệ gan in vivo trên chuột: Trên mô hình gây độc bằng CCl4, lô chuột điều trị bằng phytosome quercetin ghi nhận sự suy giảm có ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$) của hoạt độ men gan AST và ALT trong huyết thanh so với lô mô hình CCl4 không điều trị. Hàm lượng MDA (chỉ số peroxy hóa lipid) trong mô gan giảm rõ rệt, trong khi hàm lượng chất chống oxy hóa nội sinh GSH được phục hồi đáng kể. Hiệu quả bảo vệ gan của phytosome quercetin cao hơn rõ rệt so với cùng mức liều quercetin tự do.
  • Nghiên cứu bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin:
    • Xây dựng thành công công thức cốm đóng nang chứa 50 mg quercetin hoạt dụng: Phytosome quercetin phối hợp với lactose khan (tá dược độn), SSG (tá dược rã với tỷ lệ rã trong : rã ngoài tối ưu), Aerosil 200 và Magnesi stearat (tá dược trơn), Tween 80 (chất diện hoạt cải thiện độ thấm ướt).
    • Đánh giá chất lượng viên: Viên nang đạt các tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam IV về độ đồng đều khối lượng, độ rã (< 15 phút), hàm lượng hoạt chất (90 – 110%) và độ hòa tan (giải phóng > 75% hoạt chất sau 45 phút).
  • Độ ổn định: Bột phytosome quercetin và viên nang cứng duy trì độ ổn định hóa học (hàm lượng quercetin không đổi) và độ ổn định vật lý (độ ẩm, độ hòa tan, trạng thái vô định hình) sau 6 tháng theo dõi ở cả điều kiện thực và điều kiện lão hóa cấp tốc.

Chương 4: Bàn luận

Tác giả phân tích, so sánh các phát hiện thực nghiệm với y văn quốc tế:

  • Biện giải cơ chế hình thành liên kết hydro giữa đầu phân cực phosphatidylcholin và nhóm -OH của quercetin thông qua dịch chuyển tín hiệu trên phổ NMR và FTIR.
  • Phân tích vai trò của cholesterol trong việc làm tăng độ bền màng micell, ngăn ngừa sự phân tách pha trong quá trình bảo quản.
  • Lý giải sự gia tăng độ tan và tốc độ giải phóng dược chất là hệ quả của việc chuyển đổi cấu trúc mạng tinh thể quercetin sang dạng vô định hình (được chứng thực bởi XRD và DSC) kết hợp với tính lưỡng thân của phospholipid.
  • Phân tích cơ chế bảo vệ tế bào gan in vivo: Sự gia tăng sinh khả dụng và kéo dài thời gian lưu thông trong tuần hoàn của phytosome giúp tăng cường ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào gan, thu dọn gốc tự do $CCl_3^\bullet$, từ đó bảo tồn cấu trúc tế bào gan và ngăn chặn rò rỉ enzym ALT, AST.
  • Bàn luận về tính khả thi trong sản xuất công nghiệp: Quy trình bốc hơi dung môi sử dụng cồn tuyệt đối thân thiện với môi trường hơn cloroform/dicloromethan, thuận lợi kiểm soát dung môi tồn dư và dễ dàng ứng dụng quy mô lớn 500 g/mẻ. Việc lựa chọn dạng viên nang cứng đóng cốm giải quyết triệt để nhược điểm trơn chảy kém và tính dẻo dính của bột phytosome.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

  1. Về mặt khoa học và lý luận:
    • Đã nghiên cứu một cách hệ thống và chứng minh bản chất liên kết phân tử của phức hợp phytosome quercetin thông qua chuỗi phương pháp phân tích cấu trúc hiện đại (FTIR, DSC, XRD, 1H-NMR, 13C-NMR và MS).
    • Chứng minh rõ ràng hoạt chất quercetin sau khi phytosome hóa tồn tại ở trạng thái vô định hình, giúp cải thiện đáng kể độ tan trong các môi trường đệm sinh lý và tăng tốc độ giải phóng qua màng.
    • Cung cấp bằng chứng thực nghiệm in vivo trên mô hình chuột BALB/c chứng minh phytosome quercetin có tác dụng bảo vệ gan vượt trội so với quercetin tự do thông qua cơ chế giảm men gan AST, ALT, giảm nồng độ MDA và duy trì nồng độ GSH nội sinh.
  2. Về mặt thực tiễn và ứng dụng:
    • Xây dựng thành công quy trình bào chế phytosome quercetin bằng phương pháp bốc hơi dung môi sử dụng ethanol tuyệt đối, nâng thành công quy mô lên 500 g/mẻ với chất lượng ổn định và hiệu suất cao (> 95%).
    • Xây dựng công thức và quy trình bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin quy mô 50 mg/viên đạt đầy đủ các tiêu chuẩn chất lượng theo DĐVN IV và dự thảo tiêu chuẩn cơ sở.
    • Thiết lập được phương pháp định lượng HPLC và phương pháp đánh giá tỷ lệ phytosome hóa (EE%) có độ tin cậy và độ lặp lại cao.
    • Đánh giá độ ổn định của bột phytosome và viên nang cứng trong thời gian 6 tháng ở điều kiện bảo quản dài hạn và lão hóa cấp tốc.

Kiến nghị và đề xuất

  • Tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm dược động học (pharmacokinetics) đầy đủ trên động vật lớn hoặc người tình nguyện để xác định chính xác các thông số sinh khả dụng tuyệt đối và tương đối của viên nang phytosome quercetin.
  • Tiếp tục nâng quy mô sản xuất viên nang cứng trên dây chuyền công nghiệp tự động và theo dõi độ ổn định dài hạn của sản phẩm ở các điều kiện vùng khí hậu IV (nhiệt đới ẩm).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

  • Nghiên cứu mới dừng lại ở đánh giá tác dụng dược lực học bảo vệ gan in vivo trên mô hình chuột bị gây độc cấp tính bởi CCl4, chưa tiến hành thử nghiệm dược động học so sánh trực tiếp nồng độ quercetin trong huyết tương động vật theo thời gian.
  • Quy mô nâng cấp mới đạt mức 500 g/mẻ trong điều kiện phòng thí nghiệm mở rộng, chưa triển khai sản xuất trên quy mô pilot công nghiệp hoàn toàn tự động.
  • Thời gian theo dõi độ ổn định dừng lại ở mốc 6 tháng (theo quy định của nghiên cứu độ ổn định cấp tốc và dài hạn bước đầu).

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Thiết kế nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng và dược động học in vivo của viên nang cứng phytosome quercetin trên người tình nguyện.
  • Mở rộng khảo sát tác dụng dược lý của chế phẩm trên các mô hình bệnh lý mạn tính khác như xơ vữa động mạch, đái tháo đường, hoặc chống viêm dị ứng.
  • Nghiên cứu ứng dụng phytosome quercetin vào các dạng bào chế khác như viên nang mềm hoặc hệ phân tán dùng qua da.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị cao trong lĩnh vực Công nghệ Dược phẩm và Bào chế:

  • Đối với nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Dược: Cung cấp quy trình bài bản từ thiết kế công thức, tối ưu hóa thông số kỹ thuật, phương pháp phân tích liên kết phân tử (phối hợp NMR, MS, DSC, XRD) đến thẩm định quy trình định lượng HPLC và kỹ thuật đánh giá hiệu suất phytosome hóa.
  • Đối với giảng viên và cán bộ nghiên cứu: Là tài liệu tham khảo chi tiết về công nghệ phytosome ứng dụng cho các hoạt chất flavonoid/polyphenol kém tan nguồn gốc thực vật.
  • Đối với các nhà sản xuất dược phẩm: Cung cấp giải pháp kỹ thuật cụ thể (công thức, quy trình nâng quy mô 500 g/mẻ, tá dược dập cốm đóng nang) có tính khả thi cao để phát triển các sản phẩm bảo vệ sức khỏe hoặc thuốc từ dược liệu chứa quercetin quy mô công nghiệp.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao luận án lựa chọn công nghệ phytosome thay vì các hệ mang nano khác (như liposome, nano polyme) để cải thiện sinh khả dụng của quercetin?

Quercetin thuộc nhóm BCS II (kém tan, thấm tốt) và bị chuyển hóa mạnh qua gan. So với hỗn dịch nano (dễ sa lắng, kém bền vật lý), hệ nano polyme (nguy cơ tồn dư tá dược tổng hợp, tính tương hợp sinh học hạn chế) hay liposome (dược chất không liên kết hóa học với lipid, tỷ lệ mang thuốc thấp và dễ rò rỉ), phytosome tạo phức hợp phân tử trực tiếp giữa quercetin và phospholipid theo tỷ lệ xác định. Hệ này có tính tương hợp sinh học cao, quy trình bốc hơi dung môi đơn giản, dễ nâng quy mô và thu được sản phẩm dạng bột rắn rất thuận lợi để đóng viên nang cứng.

2. Tỷ lệ mol tối ưu giữa Quercetin, HSPC và Cholesterol trong công thức phytosome là bao nhiêu?

Tỷ lệ mol tối ưu được xác định qua thực nghiệm là Quercetin : HSPC : Cholesterol = 1 : 1 : 0,2. Tỷ lệ này cho hiệu suất phytosome hóa cao nhất (> 95%), kích thước tiểu phân đồng nhất, chỉ số đa phân tán PDI hẹp và độ ổn định cao. Cholesterol đóng vai trò lấp vào các khoảng trống trong lớp màng phospholipid kép, giúp tăng độ đặc khít và bền vững của cấu trúc tiểu phân.

3. Phương pháp nào được sử dụng để chứng minh quercetin đã tạo phức hợp phân tử với phospholipid và chuyển sang trạng thái vô định hình?

Tác giả đã phối hợp chuỗi phương pháp vật lý hiện đại:

  • XRD và DSC: Giản đồ XRD cho thấy sự biến mất hoàn toàn của các pic tinh thể sắc nhọn của quercetin tự do; giản đồ DSC ghi nhận sự biến mất của pic thu nhiệt nóng chảy ở 316,5°C, xác nhận hoạt chất đã chuyển hoàn toàn sang dạng vô định hình.
  • FTIR, 1H-NMR, 13C-NMR và ESI-MS: Ghi nhận sự dịch chuyển tín hiệu số sóng của nhóm -OH và nhóm phosphat, chứng minh có sự tạo thành liên kết hydro giữa các nhóm hydroxyl phân cực của quercetin với đầu phân cực của HSPC mà không làm biến đổi cấu trúc mạch béo.

4. Tác dụng bảo vệ gan của phytosome quercetin trên chuột BALB/c được thể hiện qua các chỉ số sinh hóa nào?

Trên mô hình chuột bị gây tổn thương gan cấp bằng CCl4, phytosome quercetin thể hiện hiệu quả bảo vệ gan thông qua:

  • Giảm có ý nghĩa thống kê hoạt độ men gan AST và ALT trong huyết thanh so với lô chuột mô hình tổn thương không điều trị.
  • Giảm hàm lượng MDA (sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào gan).
  • Phục hồi và duy trì hàm lượng chất chống oxy hóa nội sinh glutathion (GSH) trong mô gan.
  • Các chỉ số cải thiện vượt trội so với khi dùng quercetin tự do ở cùng mức liều.

5. Viên nang cứng chứa phytosome quercetin được xây dựng với hàm lượng và tiêu chuẩn chất lượng ra sao?

Viên nang cứng được bào chế chứa hàm lượng tương đương 50 mg quercetin/viên. Công thức bao gồm cốm phytosome phối hợp tá dược độn (lactose khan), tá dược rã (SSG với tỷ lệ rã trong : rã ngoài phù hợp), tá dược trơn chảy (Aerosil 200, Magnesi stearat, Talc) và chất diện hoạt Tween 80. Chế phẩm đạt đầy đủ các tiêu chuẩn kiểm nghiệm theo Dược điển Việt Nam IV: độ rã dưới 15 phút, giải phóng trên 75% hoạt chất sau 45 phút, độ ổn định đạt yêu cầu sau 6 tháng bảo quản cấp tốc và dài hạn.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của NCS. Nguyễn Hồng Trang đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu nghiên cứu thông qua việc thiết lập công thức và quy trình công nghệ bào chế phytosome quercetin ổn định, có khả năng nâng quy mô lên 500 g/mẻ. Bằng các kỹ thuật phân tích hóa lý chuyên sâu, công trình đã chứng minh rõ bản chất liên kết phân tử và sự chuyển đổi trạng thái vô định hình giúp tăng cường độ tan của hoạt chất. Kết quả thử nghiệm sinh học khẳng định phytosome quercetin có tác dụng chống oxy hóa in vitro và bảo vệ gan in vivo trên chuột vượt trội so với quercetin nguyên liệu. Đồng thời, luận án đã phát triển thành công dạng thuốc viên nang cứng 50 mg đạt tiêu chuẩn chất lượng, mở ra triển vọng ứng dụng công nghệ phytosome vào sản xuất các chế phẩm dược phẩm hiện đại từ nguồn dược liệu trong nước.