HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM CHUNG MỸ LOAN NGHIÊN CỨU BỆNH VÀNG LỤI LÚA (RICE YELLOW STUNT VIRUS) Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 60.12 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Hà Viết Cường NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày… tháng… năm 2017 Tác giả luận văn Chung Mỹ Loan ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Hà Viết Cường đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Trung tâm nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới- Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn.
Hà Nội, ngày… tháng… năm 2017 Tác giả luận văn Chung Mỹ Loan iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Lời cảm ơn. iii Mục lục. iv Danh mục chữ viết tắt.
vii Danh mục bảng. viii Danh mục hình. ix Trích yếu luận văn. Tính cấp thiết của đề tài.
Mục tiêu nghiên cứu. Mục tiêu tổng quát. Mục tiêu cụ thể. Phạm vi nghiên cứu.
Tổng quan tài liệu. Lịch sử phát hiện bệnh. Triệu chứng bệnh. Lan truyền virus vàng lụi.
Tình hình nghiên cứu bệnh. Phân loại, hình thái và đặc điểm bộ gen virus RYSV. Hình thái phân tử virus (virion) và tổ chức bộ gen. Biến nạp dna plasmit vào tế bào E.coli bằng phương pháp xung điện.
Kỹ thuật biểu hiện gen bằng vi khuẩn. Hệ biểu hiện gen trong E. Hệ vector biểu hiện pET28a. Cơ chế cảm ứng biểu hiện bằng IPTG.
Phương pháp chẩn đoán virus bằng ELISA. Nguyên lý của phương pháp huyết thanh học và ứng dụng. Chẩn đoán virus RYSV. 20 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.
Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu. Dòng vi khuẩn E. Chất kháng sinh. Hóa chất, dung dịch đệm.
Kit thương mại. Môi trường. Các loại đệm thực hiện kiểm tra ELISA. Dụng cụ nghiên cứu.
Nội dung nghiên cứu. Các phương pháp nghiên cứu. Phương pháp điều tra bệnh đồng ruộng. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu.
Phương pháp bảo quản mẫu. Phương pháp nuôi rầy. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli dòng Rossetta bằng xung điện. Kỹ thuật điện di trên gel agarose.
Kiểm tra sản phẩm miniprep. Phương pháp SDS-PAGE. Phương pháp tinh chiết protein tái tổ hợp. Phương pháp PTA-ELISA.
Phản ứng PCR kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc. Kết quả và thảo luận. Điều tra bệnh vàng lụi vụ mùa 2016. Điều tra bệnh vàng lụi vụ mùa 2016 tại tỉnh Bắc Ninh.
Điều tra bệnh vàng lụi lúa vụ mùa 2016 tại Hiệp Hòa (Bắc Giang). Biến nạp cấu trúc PET28-G6 vào vi khuẩn E.coli chủng Rosetta (De3) và đặc trưng phân tử gen G. Biến nạp cấu trúc pET28-G6 vào vi khuẩn E.coli chủng Rosetta (DE3) .31 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Giải trình tự gen G.
Đặc trưng phân tử của gen G. So sánh trình tự và phân tích phả hệ gen G. Biểu hiện protein g tái tổ hợp trong vi khuẩn E.coli chủng rosetta (DE3). Kiểm tra ELISA phát hiện virus RYSV trên các mẫu lúa thu thập từ các vùng khác nhau trong năm 2013- 2014.
Kiểm tra ELISA đánh giá mức độ nhiễm virus trên các bộ phận cây lúa từ các mẫu thu thập. Kiểm tra ELISA phát hiện virus RYSV trong các mẫu lúa thu thập từ các vùng khác nhau. Đánh giá điều kiện phản ứng ELISA. Đánh giá độ hòa loãng kháng nguyên.
Đánh giá độ hòa loãng kháng huyết thanh. Đánh giá độ hòa loãng kháng thể thứ cấp. Kết luận và đề nghị. 53 Tài liệu tham khảo.
54 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt BVTV Bảo vệ thực vật ICTV Ủy ban phân loại và danh pháp virus quốc tế IgG Immunoglobulin G IgM Immunoglobulin M NNVN Nông nghiệp Việt Nam NST Nhiễm sắc thể OD Giá trị mật độ quang RTYV Rice transitory yellowing virus RXĐĐ Rầy xanh đuôi đen RYSV Rice yellow stunt virus Sở NN-PTNT Sở nông nghiệp và phát triển nông thôn RLT Rầy lưng trắng RN Rầy nâu VLDĐ Vàng lá di động ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay PTA-ELISA Plate-trapped antigen ELISA PCR Polymerase chain reaction RT-PCR Reverse transcription-PCR vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 3. Thành phần bản điện di 2 lớp cho 2 bản gel (8 x 8,5 cm). Điều tra bệnh vàng lụi lúa vụ mùa năm 2016 tại tỉnh Bắc Ninh. Diễn biến bệnh vàng lụi lúa do virus RYSV tại Hiệp Hòa- Bắc Giang trong vụ mùa năm 2016.
Điều tra bệnh vàng lụi lúa mùa năm 2016 tại một số xã thuộc huyện Hiệp Hòa- Bắc Giang. Biến nạp cấu trúc biểu hiện pET28-G6 vào vi khuẩn Rosetta (DE3) bằng phương pháp xung điện. Kiểm tra vi khuẩn Rosetta (DE3) biến nạp bằng PCR và cắt bằng enzyme cắt giới hạn. Kết quả giải trình tự gen G của virus RYSV từ dòng pET28-G6.
Các dấu hiệu và motif chức năng trên protein G của các nucleorhabdovirus. Danh sách các loài virus thuộc họ Rhabdoviridae trên GenBank được sử dụng trong phân tích. So sánh trình tự gen của mẫu virus RYSV Việt Nam với các rhabdovirus khác. Phân tích SDS-PAGE kiểm tra sự biểu hiện protein G của vi khuẩn Rosetta (DE3) mang cấu trúc pET28-G6.
Kiểm tra ELISA đánh giá mức độ nhiễm virus trên các bộ phận cây lúa từ các mẫu thu thập.12 Kiểm tra ELISA phát hiện virus RYSV trên các mẫu bệnh khô thu thập từ các vùng bị bệnh khác nhau .13 Kiểm tra ELISA phát hiện sự có mặt của virus RYSV qua các năm 2013, 2014 .14 Kiểm tra PTA- ELISA độ hòa loãng kháng nguyên. Kiểm tra PTA- ELISA độ hòa loãng kháng huyết thanh. Kiểm tra PTA-ELISA ở độ hòa loãng kháng thể thứ cấp khác nhau .17 Kiểm tra ELISA phát hiện virus RYSV trên các mẫu cỏ thu thập tại Hiệp Hòa- Bắc Giang 2017. 51 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 2.
Phân bô dịch bệnh “vàng lụi” tại Viet Nam, bệnh “vàng lùn” tại phía Nam Trung Quốc và “vàng tạm thời” tại Đài Loan (các hình tam giác đỏ) trong những năm 60, 70. Bệnh vàng lụi với triệu chứng cây lùn và lá bệnh có gân xanh. Hình thái 3 loài rầy xanh truyền RYSV. Cấu trúc phân tử của các rhabdovirus (Viralzone, 2009).
Phân tử virus RYSV (hình trái, Shikata and Chen, 1969) và vị trí hình thành của các phân tử virus RYSV trong phần ngoại vi của nhân tế bào lúa (hình phải, Ou, 1985). Sơ đồ tổ chức bộ gen của RYSV. Sơ đồ của vector pET28a và các vùng chức năng quan trọng (pET system Manual, phiên bản 11, 2006). Sơ đồ cơ chế điều hòa của T7 promotor.
Các kỹ thuật ELISA khác nhau (Hull, 2002). Nuôi rầy xanh đuôi đen tại TTNC BC nhiệt đới phục vụ thí nghiệm. Điều tra bệnh vàng lụi lúa tại Hiệp Hòa- Bắc Giang. Kết quả biến nạp cấu trúc biểu biện pET28-G6 trên môi trường LB hai kháng sinh Kanamycin và Chloramphenicol (trái) và cấy chuyển 9 khuẩn lạc được chọn (phải).
Kiểm tra kết quả biến nạp cấu trúc pET28-G6 vào vi khuẩn Rosetta. Các dấu hiệu và motif chức năng trên protein G của mẫu RYSV Việt Nam. Vị trí sai khác (2 amino acid) ở vùng đầu C của protein G dẫn tới sự có mặt của dấu hiệu nhập nhân (KKKKK) của mẫu Việt Nam. Phân tích phả hệ dựa trên trình tự toàn bộ gen G của các rhabdovirus.
trình tự nu. trình tự aa. Thanh bar chỉ khoảng cách di truyền: (I) Các nucleorhabdovirus; (II) là các cytorhabdovirus; (III) các rhabdovirus hại động vật. Phân tích SDS-PAGE kiểm tra sự biểu hiện protein G của vi khuẩn Rosetta (DE3) mang cấu trúc pET28-G6.
44 ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Chung Mỹ Loan Tên Luận văn: Nghiên cứu bệnh vàng lụi lúa (Rice yellow stunt virus) Ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 60.12 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Điều tra tình hình bệnh vàng lụi lúa vụ mùa năm 2016, nghiên cứu biến nạp tạo chủng Rossetta mang cấu trúc pET28-G6, đồng thời kiểm tra, đánh giá sự xuất hiện của virus RYSV trong các mẫu lúa và cỏ. Phương pháp nghiên cứu Sử dụng các phương pháp điều tra, thu thập và bảo quản mẫu để nắm được tình hình bệnh và cung cấp mẫu cho các nghiên cứu tiếp theo. Biến nạp, kiểm tra sản phẩm và tinh chiết gen để tạo ra chủng Rossetta mang cấu trúc pET28-G6. Kiểm tra ELISA để phát hiện, đánh giá sự tồn tại của virus trong lúa và cỏ.
Kết quả chính và kết luận Qua điều tra bênh vàng lụi lúa vụ mùa năm 2016 có thể thấy tỉ lệ bệnh từ 32- 95% tùy từng giống lúa. Trong đó có vùng Thái Sơn nhiễm nặng và phổ biến nhất là giống lúa BC15.