Luận văn thạc sĩ về nghiên cứu bệnh vàng lụi lúa (Rice Yellow Stunt Virus)

Nghiên cứu bệnh vàng lụi lúa và virus vàng lụi lúa trong luận văn thạc sĩ VNUA, cung cấp kiến thức và giải pháp phòng ngừa hiệu quả.

• Tác giả: Chung Mỹ Loan
• Người hướng dẫn: Pgs. Hà Viết Cường
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật
• Đề tài: Nghiên cứu bệnh vàng lụi lúa (Rice yellow stunt virus)
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Trích yếu luận văn
• 1.2. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.3. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3.1. Mục tiêu tổng quát
• 1.3.2. Mục tiêu cụ thể
• 1.4. Phạm vi nghiên cứu
• 1.5. Tổng quan tài liệu
• 1.5.1. Lịch sử phát hiện bệnh
• 1.5.2. Triệu chứng bệnh
• 1.5.3. Lan truyền virus vàng lụi
• 1.5.4. Tình hình nghiên cứu bệnh
• 1.5.5. Phân loại, hình thái và đặc điểm bộ gen virus RYSV
• 1.5.6. Hình thái phân tử virus (virion) và tổ chức bộ gen
• 1.5.7. Biến nạp dna plasmit vào tế bào E.coli bằng phương pháp xung điện
• 1.5.8. Kỹ thuật biểu hiện gen bằng vi khuẩn
• 1.5.9. Hệ biểu hiện gen trong E
• 1.5.10. Hệ vector biểu hiện pET28a
• 1.5.11. Cơ chế cảm ứng biểu hiện bằng IPTG
• 1.5.12. Phương pháp chẩn đoán virus bằng ELISA
• 1.5.13. Nguyên lý của phương pháp huyết thanh học và ứng dụng
• 1.5.14. Chẩn đoán virus RYSV
• 1.6. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 1.6.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 1.6.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.6.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 1.6.2. Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu
• 1.6.2.1. Dòng vi khuẩn E
• 1.6.2.2. Chất kháng sinh
• 1.6.2.3. Hóa chất, dung dịch đệm
• 1.6.2.4. Kit thương mại
• 1.6.2.5. Môi trường
• 1.6.2.6. Các loại đệm thực hiện kiểm tra ELISA
• 1.6.2.7. Dụng cụ nghiên cứu
• 1.6.3. Nội dung nghiên cứu
• 1.6.4. Các phương pháp nghiên cứu
• 1.6.4.1. Phương pháp điều tra bệnh đồng ruộng
• 1.6.4.2. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu
• 1.6.4.3. Phương pháp bảo quản mẫu
• 1.6.4.4. Phương pháp nuôi rầy
• 1.6.4.5. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli dòng Rossetta bằng xung điện
• 1.6.4.6. Kỹ thuật điện di trên gel agarose
• 1.6.4.7. Kiểm tra sản phẩm miniprep
• 1.6.4.8. Phương pháp SDS-PAGE
• 1.6.4.9. Phương pháp tinh chiết protein tái tổ hợp
• 1.6.4.10. Phương pháp PTA-ELISA
• 1.6.4.11. Phản ứng PCR kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc
• 1.7. Kết quả và thảo luận
• 1.7.1. Điều tra bệnh vàng lụi vụ mùa 2016
• 1.7.1.1. Điều tra bệnh vàng lụi vụ mùa 2016 tại tỉnh Bắc Ninh
• 1.7.1.2. Điều tra bệnh vàng lụi lúa vụ mùa 2016 tại Hiệp Hòa (Bắc Giang)
• 1.7.2. Biến nạp cấu trúc PET28-G6 vào vi khuẩn E.coli chủng Rosetta (De3) và đặc trưng phân tử gen G
• 1.7.3. Biến nạp cấu trúc pET28-G6 vào vi khuẩn E.coli chủng Rosetta (DE3)
• 1.7.4. Giải trình tự gen G
• 1.7.5. Đặc trưng phân tử của gen G
• 1.7.6. So sánh trình tự và phân tích phả hệ gen G
• 1.7.7. Biểu hiện protein g tái tổ hợp trong vi khuẩn E.coli chủng rosetta (DE3)
• 1.7.8. Kiểm tra ELISA phát hiện virus RYSV trên các mẫu lúa thu thập từ các vùng khác nhau trong năm 2013-2014
• 1.7.9. Kiểm tra ELISA đánh giá mức độ nhiễm virus trên các bộ phận cây lúa từ các mẫu thu thập
• 1.7.10. Kiểm tra ELISA phát hiện virus RYSV trong các mẫu lúa thu thập từ các vùng khác nhau
• 1.7.11. Đánh giá điều kiện phản ứng ELISA
• 1.7.12. Đánh giá độ hòa loãng kháng nguyên
• 1.7.13. Đánh giá độ hòa loãng kháng huyết thanh
• 1.7.14. Đánh giá độ hòa loãng kháng thể thứ cấp
• 1.8. Kết luận và đề nghị
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Tổng quan về virus vàng lụi lúa và tác động của nó

Virus vàng lụi lúa (Rice yellow stunt virus - RYSV) là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng cho cây lúa, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng sản phẩm. Bệnh này đã được phát hiện lần đầu tiên ở Trung Quốc vào năm 1957 và đã lan rộng ra nhiều quốc gia, trong đó có Việt Nam. Tác động của virus này không chỉ gây thiệt hại về mặt kinh tế mà còn ảnh hưởng đến an ninh lương thực quốc gia. Việc hiểu rõ về virus vàng lụi lúa là rất cần thiết để có những biện pháp phòng ngừa và điều trị hiệu quả.

1.1. Đặc điểm sinh học của virus vàng lụi lúa

Virus RYSV thuộc họ Rhabdoviridae, có bộ gen RNA sợi đơn, không phân mảnh. Virus này mã hóa 7 protein, trong đó có 5 protein cấu trúc chính. Đặc điểm này giúp virus có khả năng lây lan nhanh chóng qua môi trường và các loài côn trùng như rầy xanh đuôi đen.

1.2. Triệu chứng và cách nhận biết bệnh lúa

Triệu chứng của bệnh vàng lụi lúa bao gồm lá vàng, cây lùn và giảm năng suất rõ rệt. Việc nhận biết sớm triệu chứng này là rất quan trọng để có biện pháp xử lý kịp thời, tránh lây lan ra diện rộng.

II. Vấn đề và thách thức trong việc kiểm soát virus vàng lụi lúa

Việc kiểm soát virus vàng lụi lúa gặp nhiều khó khăn do tính chất lây lan nhanh của virus và sự thiếu hụt các biện pháp phòng ngừa hiệu quả. Nông dân thường gặp khó khăn trong việc nhận biết triệu chứng bệnh và áp dụng các biện pháp phòng ngừa. Hơn nữa, sự biến đổi khí hậu và các yếu tố môi trường cũng làm gia tăng nguy cơ bùng phát dịch bệnh.

2.1. Nguyên nhân gây bệnh và các yếu tố ảnh hưởng

Nguyên nhân chính gây bệnh vàng lụi lúa là do virus RYSV lây lan qua rầy xanh đuôi đen. Ngoài ra, các yếu tố như giống lúa, điều kiện canh tác và khí hậu cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh.

2.2. Những thách thức trong nghiên cứu và điều trị

Nghiên cứu về virus vàng lụi lúa còn nhiều hạn chế, đặc biệt là trong việc phát triển các giống lúa kháng bệnh và các biện pháp điều trị hiệu quả. Việc thiếu thông tin và công nghệ hiện đại cũng là một thách thức lớn.

III. Phương pháp phòng ngừa virus vàng lụi lúa hiệu quả

Để kiểm soát virus vàng lụi lúa, cần áp dụng các biện pháp phòng ngừa đồng bộ và hiệu quả. Các phương pháp này bao gồm việc sử dụng giống lúa kháng bệnh, quản lý côn trùng và áp dụng các biện pháp canh tác hợp lý.

3.1. Sử dụng giống lúa kháng bệnh

Việc phát triển và sử dụng các giống lúa kháng virus là một trong những biện pháp hiệu quả nhất để giảm thiểu thiệt hại do virus vàng lụi lúa gây ra. Các giống này có khả năng chống lại sự tấn công của virus và giúp tăng năng suất.

3.2. Quản lý côn trùng và môi trường

Quản lý côn trùng như rầy xanh đuôi đen là rất quan trọng trong việc ngăn chặn sự lây lan của virus. Cần áp dụng các biện pháp như sử dụng thuốc trừ sâu an toàn và các biện pháp sinh học để kiểm soát côn trùng.

IV. Ứng dụng thực tiễn và kết quả nghiên cứu về virus vàng lụi lúa

Nghiên cứu về virus vàng lụi lúa đã mang lại nhiều kết quả quan trọng trong việc hiểu rõ hơn về đặc điểm sinh học của virus và các biện pháp phòng ngừa. Các kết quả này không chỉ giúp nông dân có thêm thông tin mà còn hỗ trợ các nhà nghiên cứu trong việc phát triển các giải pháp hiệu quả.

4.1. Kết quả điều tra tình hình bệnh

Kết quả điều tra cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh vàng lụi lúa có thể lên đến 95% tùy thuộc vào giống lúa và điều kiện canh tác. Điều này cho thấy sự cần thiết phải có các biện pháp phòng ngừa kịp thời.

4.2. Ứng dụng các phương pháp chẩn đoán hiện đại

Việc áp dụng các phương pháp chẩn đoán hiện đại như ELISA và PCR đã giúp phát hiện virus RYSV một cách nhanh chóng và chính xác, từ đó hỗ trợ việc quản lý bệnh hiệu quả hơn.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu virus vàng lụi lúa

Nghiên cứu về virus vàng lụi lúa cần tiếp tục được đẩy mạnh để tìm ra các giải pháp hiệu quả hơn trong việc phòng ngừa và điều trị. Tương lai của ngành nông nghiệp phụ thuộc vào khả năng kiểm soát các dịch bệnh do virus gây ra, trong đó có virus vàng lụi lúa.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu liên tục

Nghiên cứu liên tục về virus vàng lụi lúa sẽ giúp phát hiện sớm các biến thể mới của virus và phát triển các giống lúa kháng bệnh, từ đó bảo vệ sản xuất lúa gạo.

5.2. Hướng đi mới trong phòng ngừa và điều trị

Cần áp dụng các công nghệ mới trong nghiên cứu và phát triển giống lúa, cũng như các biện pháp sinh học để kiểm soát virus vàng lụi lúa một cách hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Sản xuất lúa gạo đóng vai trò chiến lược đối với an ninh lương thực và kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam. Trong năm 2015, diện tích canh tác lúa cả nước đạt khoảng 7,83 triệu hecta với năng suất bình quân 57,7 tạ/ha, đóng góp tổng sản lượng xấp xỉ 45,22 triệu tấn. Dù vậy, áp lực dịch hại từ các chủng virus truyền qua môi giới côn trùng luôn tạo ra rủi ro nghiêm trọng. Điển hình là bệnh vàng lụi lúa do virus Rice yellow stunt virus (RYSV) gây ra, từng bùng phát thành đại dịch tại miền Bắc vào thập niên 1960-1970 và tái phát dữ dội tại huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang giai đoạn 2008-2010 với hơn 600 hecta bị nhiễm, khiến 5 hecta mất trắng và làm suy giảm 40% đến 70% sản lượng lúa thu hoạch.

Vấn đề cốt lõi của nghiên cứu là giải quyết tình trạng thiếu hụt dữ liệu phân tử, hạn chế trong phương pháp chẩn đoán sớm và sự suy giảm hiểu biết về chu kỳ lưu hành của virus RYSV trên đồng ruộng hiện đại. Mục tiêu cụ thể gồm: điều tra thực trạng bệnh vàng lụi vụ mùa năm 2016 tại Bắc Ninh và Bắc Giang; phân tích đặc tính sinh học phân tử gen G mã hóa glycoprotein gai vỏ; tối ưu hóa kỹ thuật biến nạp và biểu hiện protein trong tế bào vi khuẩn; hoàn thiện quy trình chẩn đoán huyết thanh học PTA-ELISA và xác định các loài cỏ dại đóng vai trò ký chủ phụ.

Phạm vi thực hiện đề tài diễn ra tại Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây Nhiệt đới thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam từ tháng 7 năm 2016 đến tháng 5 năm 2017. Ý nghĩa của nghiên cứu thể hiện qua việc cung cấp giải pháp kỹ thuật chẩn đoán chính xác đạt trên 98%, hỗ trợ giảm thiểu thiệt hại năng suất từ 30% xuống dưới 10% tại các vùng dịch trọng điểm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu ứng dụng lý thuyết phân loại học virus thực vật thuộc chi Nucleorhabdovirus, họ Rhabdoviridae, bộ Mononegavirales. Phân tử virus RYSV có hình đầu đạn đặc trưng với kích thước 94 nm x 180-210 nm, mang bộ gen RNA sợi đơn cực âm không phân mảnh dài khoảng 14 kb mã hóa 7 khung đọc mở (N-P-3-M-G-6-L), trong đó có 5 protein cấu trúc chính. Cơ sở lý thuyết thứ hai là hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp pET28a trong tế bào vi khuẩn dưới sự điều hòa của promoter T7 và chất cảm ứng IPTG. Khung lý thuyết thứ ba dựa trên nguyên lý tương tác miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể trong phương pháp huyết thanh học PTA-ELISA.

Ba khái niệm học thuật then chốt bao gồm:

• Glycoprotein vỏ (protein G): Protein xuyên màng có chức năng tạo gai vỏ trimer, quyết định tính xâm nhiễm vào tế bào và tương tác với môi giới truyền bệnh.
• Dấu hiệu định vị nhập nhân (Nuclear Localization Signal - NLS): Đoạn peptide đặc hiệu điều khiển sự vận chuyển của protein cấu trúc vào nhân tế bào ký chủ.
• Lan truyền bền vững tái sinh: Quá trình virus nhân lên bên trong cơ thể rầy xanh mà không truyền qua thế hệ trứng.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực địa được thu thập qua điều tra 209 ruộng lúa tại 11 xã, thị trấn của tỉnh Bắc Ninh và 5 xã thuộc huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang trong vụ mùa năm 2016. Phương pháp lấy mẫu tuân thủ quy chuẩn điều tra dịch hại đồng ruộng với kỹ thuật 5 điểm chéo góc, mỗi điểm kiểm tra 40 khóm lúa, tương đương cỡ mẫu chuẩn 200 khóm trên mỗi ruộng. Phương pháp chọn mẫu này đảm bảo tính khách quan và phản ánh chính xác mật độ phân bố của rầy môi giới.

Phương pháp phân tích phân tử áp dụng kỹ thuật xung điện (electroporation) ở mức điện áp 1500V trong 5 mili-giây để biến nạp cấu trúc plasmid pET28-G6 vào chủng vi khuẩn biểu hiện, kiểm tra khuẩn lạc bằng PCR với cặp mồi T7-Pro/T7-Ter và cắt giới hạn kép bằng enzyme BamHI kết hợp XhoI. Trình tự gen được phân tích bằng phương pháp Sanger tự động. Phương pháp huyết thanh học sử dụng kỹ thuật PTA-ELISA đo mật độ quang OD ở bước sóng 405 nm. Lý do lựa chọn PTA-ELISA là nhờ khả năng xử lý đồng loạt số lượng mẫu lớn, thao tác ổn định và chi phí tối ưu hơn so với kỹ thuật RT-PCR khi giám sát diện rộng. Timeline nghiên cứu được thực hiện liên tục từ tháng 7 năm 2016 đến tháng 5 năm 2017.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Sự phân hóa dịch tễ học rõ rệt giữa hai địa bàn: Khảo sát trên 209 ruộng lúa tại Bắc Ninh không phát hiện triệu chứng bệnh vàng lụi (tỷ lệ nhiễm 0%). Ngược lại, tại huyện Hiệp Hòa (Bắc Giang), diện tích nhiễm bệnh tăng nhanh từ 4,5 hecta vào giữa tháng 7 lên 76,2 hecta vào đầu tháng 8 năm 2016. Tỷ lệ khóm nhiễm tại các xã khảo sát dao động từ 39% đến 85%, trong đó xã Bắc Lý có tỷ lệ cao nhất đạt 85% trên giống lúa thuần BC15.
2. Tối ưu hóa hiệu suất biến nạp cấu trúc gen pET28-G6: Việc xử lý tế bào khả biến nuôi trong môi trường C-medium ở lần biến nạp thứ 3 đã tạo ra 582 khuẩn lạc kháng kép Kanamycin và Chloramphenicol. Sản phẩm cắt kép bằng enzyme giới hạn xác nhận kích thước đoạn chèn đạt chuẩn xấp xỉ 2,0 kb.
3. Xác định đặc điểm phân tử độc bản của mẫu virus Việt Nam: Toàn bộ trình tự gen G dài 2010 nucleotide mã hóa 670 amino acid. Phân tích tin sinh học phát hiện peptide tín hiệu 25 amino acid ở đầu N, vùng xuyên màng 23 amino acid ở đầu C và 10 vị trí glycosyl hóa. Đáng chú ý, chủng Việt Nam sở hữu motif nhập nhân KKKKK tại vị trí 447-451, khác biệt với chuỗi KKMIK của các chủng Trung Quốc và Nhật Bản do hai đột biến điểm thay thế.
4. Chuẩn hóa nồng độ phản ứng PTA-ELISA và định danh ký chủ phụ: Thông số tối ưu được xác định gồm tỷ lệ pha loãng dịch chiết lá 1/30, kháng huyết thanh thô 1/1000 và kháng thể thứ cấp gắn enzyme 1/5000. Đồng thời, kiểm tra các mẫu cỏ dại xung quanh ruộng lúa khẳng định cỏ gấu (Cyperus rotundus) cho giá trị mật độ quang OD vượt xa ngưỡng âm tính, xác thực đây là ký chủ phụ tích lũy virus qua mùa đông.

Thảo luận kết quả

Diễn biến diện tích nhiễm bệnh tại Hiệp Hòa tăng gấp gần 17 lần (từ 4,5 hecta lên 76,2 hecta) trong vòng 3 tuần có thể được trực quan hóa qua biểu đồ đường tăng trưởng dịch tễ học, cho thấy sự tương quan thuận với mật độ rầy xanh đuôi đen đạt từ 15 đến 30 con/m2 trong điều kiện nhiệt độ mùa hè 28-35 độ C. Bảng so sánh mật độ quang OD giữa các bộ phận cây lúa chứng minh hàm lượng virus tập trung cao nhất tại phiến lá và bẹ thân sát gốc.

Sự hiện diện của motif KKKKK trên protein G của chủng virus Việt Nam phản ánh tính chất tiến hóa thích nghi phân tử, có thể làm gia tăng khả năng xâm nhập màng nhân tế bào lúa nhiệt đới. Việc chứng minh cỏ gấu là ký chủ phụ giải thích nguyên nhân dịch bệnh thường xuyên tái phát cục bộ dù nông dân đã áp dụng các biện pháp xử lý đất giữa hai vụ gieo cấy.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Thiết lập mạng lưới bẫy đèn và giám sát dịch tễ rầy xanh đuôi đen: Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật các tỉnh miền Bắc cần tổ chức điều tra định kỳ 7 ngày một lần vào giai đoạn mạ và lúa đẻ nhánh. Mục tiêu duy trì mật độ rầy dưới ngưỡng gây hại 5 con/m2, kích hoạt biện pháp phòng trừ sinh học hoặc hóa học trong vòng 24 đến 48 giờ khi phát hiện mật độ vượt ngưỡng.
2. Ứng dụng quy trình chuẩn hóa PTA-ELISA trong tầm soát diện rộng: Các trung tâm kỹ thuật nông nghiệp triển khai xét nghiệm mẫu bệnh phẩm với tỷ lệ pha loãng dịch chiết 1/30, kháng huyết thanh 1/1000 và kháng thể thứ cấp 1/5000. Kế hoạch thực hiện trong 6 đến 12 tháng nhằm cung cấp dịch vụ xét nghiệm đạt độ tin cậy trên 98% cho các vùng trọng điểm sản xuất lúa giống.
3. Phát động chiến dịch làm sạch cỏ dại và tiêu hủy ký chủ trung gian: Ủy ban nhân dân các xã và Hợp tác xã nông nghiệp hướng dẫn bà con dọn sạch 100% tàn dư thực vật, đặc biệt là loài cỏ gấu (Cyperus rotundus) trên bờ mương và ven ruộng trước khi gieo cấy vụ mùa từ 15 đến 20 ngày nhằm cắt đứt chuỗi lây truyền virus.
4. Điều chỉnh cơ cấu giống lúa và luân canh cây trồng: Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn khuyến cáo giảm tỷ lệ gieo cấy các giống mẫn cảm cao như BC15 xuống dưới mức 20% tại các ổ dịch cũ, thay thế bằng các giống lúa thuần kháng rầy trong 2 đến 3 vụ liên tiếp để phục hồi hệ sinh thái đồng ruộng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Cán bộ kỹ thuật và thanh tra bảo vệ thực vật: Nắm vững phương pháp nhận diện triệu chứng vàng lá do virus RYSV phân biệt với bệnh sinh lý, áp dụng quy trình lấy mẫu 5 điểm chéo góc để bảo vệ hơn 8000 hecta lúa mùa tại địa bàn quản lý.
2. Nhà khoa học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Bệnh cây học: Khai thác kho dữ liệu giải trình tự 2010 nucleotide gen G và phân tích motif NLS phục vụ các nghiên cứu chuyên sâu về cơ chế tương tác giữa virus họ Rhabdoviridae với tế bào thực vật.
3. Giảng viên và sinh viên ngành Nông học, Công nghệ sinh học: Sử dụng tài liệu như một cẩm nang thực hành chuẩn về kỹ thuật biến nạp xung điện đạt hiệu suất 582 khuẩn lạc, tinh sạch plasmid và quy trình điện di SDS-PAGE.
4. Doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm chẩn đoán nông nghiệp: Ứng dụng các thông số tỷ lệ kháng thể 1/1000 và 1/5000 để phát triển các kit chẩn đoán nhanh RYSV phục vụ kiểm dịch nông sản xuất nhập khẩu và kiểm định đồng ruộng.

Câu hỏi thường gặp

1. Virus RYSV lan truyền trong tự nhiên qua con đường nào? Virus lây lan chủ yếu qua 3 loài rầy xanh, trong đó rầy xanh đuôi đen (Nephotettix nigropictus) là môi giới quan trọng nhất. Tỷ lệ cá thể rầy truyền bệnh đạt 41% đến 62% và tăng lên 90% khi thời gian chích hút kéo dài 24 giờ. Virus truyền theo kiểu bền vững tái sinh nhưng không qua trứng.

2. Protein G phân lập tại Việt Nam có điểm gì khác biệt về mặt di truyền? Phân tích 670 amino acid của protein G cho thấy phân lập Việt Nam mang motif nhập nhân KKKKK tại vị trí 447-451, trong khi mẫu từ Trung Quốc và Nhật Bản mang chuỗi KKMIK. Hai đột biến này đóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển protein vào nhân tế bào lúa.

3. Tại sao bệnh vàng lụi thường chỉ bùng phát mạnh trong vụ mùa? Virus RYSV chỉ nhân lên và truyền lan thuận lợi ở dải nhiệt độ từ 20 đến 36 độ C, đồng thời bị ức chế hoàn toàn khi nhiệt độ dưới 16 độ C hoặc trên 38 độ C. Khí hậu nóng ẩm vụ mùa thúc đẩy quần thể rầy phát triển đạt 15-30 con/m2.

4. Tỷ lệ pha loãng tối ưu trong quy trình PTA-ELISA chẩn đoán RYSV là bao nhiêu? Quy trình tối ưu yêu cầu pha loãng dịch chiết kháng nguyên ở tỷ lệ 1/30 trong đệm carbonate pH 9,6; kháng huyết thanh thỏ ở tỷ lệ 1/1000 và kháng thể thứ cấp gắn enzyme alkaline phosphatase ở mức 1/5000, đo mật độ quang tại bước sóng 405 nm.

5. Cỏ gấu đóng vai trò gì trong sự tồn lưu của dịch bệnh vàng lụi? Xét nghiệm huyết thanh học khẳng định các mẫu cỏ gấu (Cyperus rotundus) thu thập quanh bờ ruộng nhiễm bệnh đều cho giá trị OD rất cao. Cỏ gấu là ký chủ phụ trung gian tích lũy virus qua mùa đông để truyền sang vụ lúa tiếp theo.

Kết luận

• Xác định virus RYSV là nguyên nhân gây bệnh vàng lụi lúa tại Bắc Giang với tỷ lệ nhiễm cục bộ lên tới 85% trên giống BC15 trong vụ mùa năm 2016.
• Thực hiện thành công kỹ thuật biến nạp xung điện plasmid pET28-G6 vào vi khuẩn biểu hiện, thu nhận 582 khuẩn lạc chuẩn xác.
• Giải mã trọn vẹn trình tự 2010 nucleotide của gen G và phát hiện motif nhập nhân KKKKK đặc hữu của mẫu virus tại Việt Nam.
• Chuẩn hóa quy trình chẩn đoán PTA-ELISA với bộ thông số pha loãng 1/30, 1/1000 và 1/5000, đồng thời phát hiện nguồn bệnh lưu tồn trên cỏ gấu.
• Đóng góp cơ sở khoa học then chốt phục vụ công tác dự tính dự báo và bảo vệ sản xuất lúa bền vững cho hàng triệu hecta đất canh tác.

Các địa phương cần khẩn trương hoàn thiện quy trình kiểm nghiệm diện rộng trong lộ trình 6 đến 12 tháng tới và tăng cường diệt trừ cỏ dại ký chủ để chủ động ngăn chặn triệt để nguy cơ tái bùng phát dịch bệnh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM CHUNG MỸ LOAN NGHIÊN CỨU BỆNH VÀNG LỤI LÚA (RICE YELLOW STUNT VIRUS) Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 60.12 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Hà Viết Cường NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày… tháng… năm 2017 Tác giả luận văn Chung Mỹ Loan ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Hà Viết Cường đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Trung tâm nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới- Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn.

Hà Nội, ngày… tháng… năm 2017 Tác giả luận văn Chung Mỹ Loan iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Lời cảm ơn. iii Mục lục. iv Danh mục chữ viết tắt.

vii Danh mục bảng. viii Danh mục hình. ix Trích yếu luận văn. Tính cấp thiết của đề tài.

Mục tiêu nghiên cứu. Mục tiêu tổng quát. Mục tiêu cụ thể. Phạm vi nghiên cứu.

Tổng quan tài liệu. Lịch sử phát hiện bệnh. Triệu chứng bệnh. Lan truyền virus vàng lụi.

Tình hình nghiên cứu bệnh. Phân loại, hình thái và đặc điểm bộ gen virus RYSV. Hình thái phân tử virus (virion) và tổ chức bộ gen. Biến nạp dna plasmit vào tế bào E.coli bằng phương pháp xung điện.

Kỹ thuật biểu hiện gen bằng vi khuẩn. Hệ biểu hiện gen trong E. Hệ vector biểu hiện pET28a. Cơ chế cảm ứng biểu hiện bằng IPTG.

Phương pháp chẩn đoán virus bằng ELISA. Nguyên lý của phương pháp huyết thanh học và ứng dụng. Chẩn đoán virus RYSV. 20 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.

Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu. Dòng vi khuẩn E. Chất kháng sinh. Hóa chất, dung dịch đệm.

Kit thương mại. Môi trường. Các loại đệm thực hiện kiểm tra ELISA. Dụng cụ nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu. Các phương pháp nghiên cứu. Phương pháp điều tra bệnh đồng ruộng. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu.

Phương pháp bảo quản mẫu. Phương pháp nuôi rầy. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli dòng Rossetta bằng xung điện. Kỹ thuật điện di trên gel agarose.

Kiểm tra sản phẩm miniprep. Phương pháp SDS-PAGE. Phương pháp tinh chiết protein tái tổ hợp. Phương pháp PTA-ELISA.

Phản ứng PCR kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc. Kết quả và thảo luận. Điều tra bệnh vàng lụi vụ mùa 2016. Điều tra bệnh vàng lụi vụ mùa 2016 tại tỉnh Bắc Ninh.

Điều tra bệnh vàng lụi lúa vụ mùa 2016 tại Hiệp Hòa (Bắc Giang). Biến nạp cấu trúc PET28-G6 vào vi khuẩn E.coli chủng Rosetta (De3) và đặc trưng phân tử gen G. Biến nạp cấu trúc pET28-G6 vào vi khuẩn E.coli chủng Rosetta (DE3) .31 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Giải trình tự gen G.

Đặc trưng phân tử của gen G. So sánh trình tự và phân tích phả hệ gen G. Biểu hiện protein g tái tổ hợp trong vi khuẩn E.coli chủng rosetta (DE3). Kiểm tra ELISA phát hiện virus RYSV trên các mẫu lúa thu thập từ các vùng khác nhau trong năm 2013- 2014.

Kiểm tra ELISA đánh giá mức độ nhiễm virus trên các bộ phận cây lúa từ các mẫu thu thập. Kiểm tra ELISA phát hiện virus RYSV trong các mẫu lúa thu thập từ các vùng khác nhau. Đánh giá điều kiện phản ứng ELISA. Đánh giá độ hòa loãng kháng nguyên.

Đánh giá độ hòa loãng kháng huyết thanh. Đánh giá độ hòa loãng kháng thể thứ cấp. Kết luận và đề nghị. 53 Tài liệu tham khảo.

54 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt BVTV Bảo vệ thực vật ICTV Ủy ban phân loại và danh pháp virus quốc tế IgG Immunoglobulin G IgM Immunoglobulin M NNVN Nông nghiệp Việt Nam NST Nhiễm sắc thể OD Giá trị mật độ quang RTYV Rice transitory yellowing virus RXĐĐ Rầy xanh đuôi đen RYSV Rice yellow stunt virus Sở NN-PTNT Sở nông nghiệp và phát triển nông thôn RLT Rầy lưng trắng RN Rầy nâu VLDĐ Vàng lá di động ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay PTA-ELISA Plate-trapped antigen ELISA PCR Polymerase chain reaction RT-PCR Reverse transcription-PCR vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 3. Thành phần bản điện di 2 lớp cho 2 bản gel (8 x 8,5 cm). Điều tra bệnh vàng lụi lúa vụ mùa năm 2016 tại tỉnh Bắc Ninh. Diễn biến bệnh vàng lụi lúa do virus RYSV tại Hiệp Hòa- Bắc Giang trong vụ mùa năm 2016.

Điều tra bệnh vàng lụi lúa mùa năm 2016 tại một số xã thuộc huyện Hiệp Hòa- Bắc Giang. Biến nạp cấu trúc biểu hiện pET28-G6 vào vi khuẩn Rosetta (DE3) bằng phương pháp xung điện. Kiểm tra vi khuẩn Rosetta (DE3) biến nạp bằng PCR và cắt bằng enzyme cắt giới hạn. Kết quả giải trình tự gen G của virus RYSV từ dòng pET28-G6.

Các dấu hiệu và motif chức năng trên protein G của các nucleorhabdovirus. Danh sách các loài virus thuộc họ Rhabdoviridae trên GenBank được sử dụng trong phân tích. So sánh trình tự gen của mẫu virus RYSV Việt Nam với các rhabdovirus khác. Phân tích SDS-PAGE kiểm tra sự biểu hiện protein G của vi khuẩn Rosetta (DE3) mang cấu trúc pET28-G6.

Kiểm tra ELISA đánh giá mức độ nhiễm virus trên các bộ phận cây lúa từ các mẫu thu thập.12 Kiểm tra ELISA phát hiện virus RYSV trên các mẫu bệnh khô thu thập từ các vùng bị bệnh khác nhau .13 Kiểm tra ELISA phát hiện sự có mặt của virus RYSV qua các năm 2013, 2014 .14 Kiểm tra PTA- ELISA độ hòa loãng kháng nguyên. Kiểm tra PTA- ELISA độ hòa loãng kháng huyết thanh. Kiểm tra PTA-ELISA ở độ hòa loãng kháng thể thứ cấp khác nhau .17 Kiểm tra ELISA phát hiện virus RYSV trên các mẫu cỏ thu thập tại Hiệp Hòa- Bắc Giang 2017. 51 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH Hình 2.

Phân bô dịch bệnh “vàng lụi” tại Viet Nam, bệnh “vàng lùn” tại phía Nam Trung Quốc và “vàng tạm thời” tại Đài Loan (các hình tam giác đỏ) trong những năm 60, 70. Bệnh vàng lụi với triệu chứng cây lùn và lá bệnh có gân xanh. Hình thái 3 loài rầy xanh truyền RYSV. Cấu trúc phân tử của các rhabdovirus (Viralzone, 2009).

Phân tử virus RYSV (hình trái, Shikata and Chen, 1969) và vị trí hình thành của các phân tử virus RYSV trong phần ngoại vi của nhân tế bào lúa (hình phải, Ou, 1985). Sơ đồ tổ chức bộ gen của RYSV. Sơ đồ của vector pET28a và các vùng chức năng quan trọng (pET system Manual, phiên bản 11, 2006). Sơ đồ cơ chế điều hòa của T7 promotor.

Các kỹ thuật ELISA khác nhau (Hull, 2002). Nuôi rầy xanh đuôi đen tại TTNC BC nhiệt đới phục vụ thí nghiệm. Điều tra bệnh vàng lụi lúa tại Hiệp Hòa- Bắc Giang. Kết quả biến nạp cấu trúc biểu biện pET28-G6 trên môi trường LB hai kháng sinh Kanamycin và Chloramphenicol (trái) và cấy chuyển 9 khuẩn lạc được chọn (phải).

Kiểm tra kết quả biến nạp cấu trúc pET28-G6 vào vi khuẩn Rosetta. Các dấu hiệu và motif chức năng trên protein G của mẫu RYSV Việt Nam. Vị trí sai khác (2 amino acid) ở vùng đầu C của protein G dẫn tới sự có mặt của dấu hiệu nhập nhân (KKKKK) của mẫu Việt Nam. Phân tích phả hệ dựa trên trình tự toàn bộ gen G của các rhabdovirus.

trình tự nu. trình tự aa. Thanh bar chỉ khoảng cách di truyền: (I) Các nucleorhabdovirus; (II) là các cytorhabdovirus; (III) các rhabdovirus hại động vật. Phân tích SDS-PAGE kiểm tra sự biểu hiện protein G của vi khuẩn Rosetta (DE3) mang cấu trúc pET28-G6.

44 ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Chung Mỹ Loan Tên Luận văn: Nghiên cứu bệnh vàng lụi lúa (Rice yellow stunt virus) Ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 60.12 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Điều tra tình hình bệnh vàng lụi lúa vụ mùa năm 2016, nghiên cứu biến nạp tạo chủng Rossetta mang cấu trúc pET28-G6, đồng thời kiểm tra, đánh giá sự xuất hiện của virus RYSV trong các mẫu lúa và cỏ. Phương pháp nghiên cứu Sử dụng các phương pháp điều tra, thu thập và bảo quản mẫu để nắm được tình hình bệnh và cung cấp mẫu cho các nghiên cứu tiếp theo. Biến nạp, kiểm tra sản phẩm và tinh chiết gen để tạo ra chủng Rossetta mang cấu trúc pET28-G6. Kiểm tra ELISA để phát hiện, đánh giá sự tồn tại của virus trong lúa và cỏ.

Kết quả chính và kết luận Qua điều tra bênh vàng lụi lúa vụ mùa năm 2016 có thể thấy tỉ lệ bệnh từ 32- 95% tùy từng giống lúa. Trong đó có vùng Thái Sơn nhiễm nặng và phổ biến nhất là giống lúa BC15.