MỞ ĐẦU Tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne là nhóm tuyến trùng nội ký sinh cố định gây sần rễ [1]. Sau khi xâm nhập vào rễ, ấu trùng tuổi 2 sẽ di chuyển và cư trú tại mô phân sinh, tấn công vào đỉnh sinh trưởng của chóp rễ, làm phân hóa tế bào đỉnh sinh trưởng, đồng thời tiết ra enzyme làm thay đổi mô rễ và hình thành các điểm dinh dưỡng cho tuyến trùng. Rễ cây bị nhiễm tuyến trùng sần rễ sẽ bị tổn thương, trên bề mặt có dạng sần sùi hoặc tạo thành các u cục, cây bị còi cọc, vàng lá và gây chết. Các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne có khả năng ký sinh trên nhiều loại cây chủ khác nhau và phân bố rộng trên toàn cầu, làm suy giảm năng suất và sản lượng của các loại cây trồng, đặc biệt là các vùng Nam, Trung Mỹ, Châu Phi và Châu Á trong đó có Việt Nam [1], [2], [3], [4].
Vì vậy, tuyến trùng sần rễ Meloidogyne trở thành mối quan tâm trong sản xuất nông nghiệp. Tính đến năm 2006, có 111 loài Meloidogyne được mô tả, trong số đó có 18 loài ký sinh trên cây cà phê, chứng tỏ rằng các loài Meloidogyne có tính đa dạng cao [5]. Ở Việt Nam, cho đến năm 2000 mới chỉ ghi nhận được 5 loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne, trong đó Tây Nguyên được biết đến có mặt cả 5 loài này [6]. Các nghiên cứu sau này cho thấy hiện nay tại khu vực Tây Nguyên, sự hiện diện và gây hại của nhóm tuyến trùng này rất lớn đặc biệt trên cà phê và hồ tiêu.
Sự gây hại của các loài Meloidogyne spp. làm hàng trăm hecta cà phê, hồ tiêu đã phải loại bỏ để thay thế trồng những cây trồng khác [6], [7], [8], [9]. Biến đổi hình thái của mỗi loài tuyến trùng sần rễ chịu sự ảnh hưởng của cây chủ cũng như phân bố của các quần thể ở sinh thái khác nhau. Những tiêu chuẩn chủ yếu trong phân loại bằng hình thái của tuyến trùng sần rễ thường sử dụng tấm cắt cutin vùng chậu (hậu môn-sinh dục) của con cái, ngoài ra các đặc điểm hình thái vùng đầu con đực, vùng đuôi của ấu trùng; các đặc điểm hình thái lượng của con cái, con đực, ấu trùng cũng được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng hình thái giữa các loài [10], [11], [12], [2].
Tuy nhiên, sự chồng lấn các đặc điểm hình thái của các quần thể trong cùng một loài, giữa các loài gần gũi, hay trên các cây chủ khác nhau hoặc giữa các vùng địa lý khác nhau thường có sự dao động lớn nên gặp nhiều khó khăn trong chẩn loại bằng các đặc điểm hình thái [13], [14]. Vì vậy, để hỗ trợ cho phương pháp phân loại dựa trên hình thái, kỹ thuật phân tử đã được sử dụng hiệu 2 quả trong phân loại các loài Meloidogyne spp. Nghiên cứu về di truyền trong phân tích trình tự các vùng gen trong hệ gen nhân (18S, ITS, và 28S) [15], [16], [17], [18], [19], [20] và các vùng gen trong hệ gen ty thể COI và COII và đoạn không mã hóa giữa 2 vùng gen COII-16S-rRNA [21], [22], [23], [24] đã hỗ trợ rất nhiều cho các nghiên cứu phân loại và phát sinh chủng loại của các loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne được nhanh chóng và chính xác, góp phần phục vụ cho biện pháp đánh giá tác hại và phòng trừ tuyến trùng sần rễ. Với tác hại và phân bố rộng của tuyến trùng sần rễ trên cây trồng, việc ngăn chặn và phòng trừ nhóm tuyến trùng này luôn được quan tâm và định hướng tới nền nông nghiệp an toàn.
Biện pháp phòng trừ tuyến trùng hiện nay chủ yếu sử dụng thuốc hóa học với hàm lượng cao đã gây nên hiện tượng kháng thuốc cũng như ảnh hưởng đến môi trường đất, làm suy giảm sự đa dạng của các sinh vật có ích, suy thoái đất, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe của con người và vật nuôi [25]. Do đó, các biện pháp phòng trừ sinh học hiện được chú trọng hơn khi sử dụng các vi sinh vật để chống lại các loài tuyến trùng ký sinh thực vật, được xem là một trong những biện pháp rất tiềm năng [26], [27]. Nhiều loại vi sinh vật có khả năng làm tăng sinh trưởng của cây, tạo ra các chất kháng sinh và độc tố làm ngăn cản sự sinh sản, nở trứng và khả năng sống sót của ấu trùng tuổi 2 tuyến trùng sần rễ do vậy có thể được đưa vào ứng dụng trong phòng trừ tuyến trùng [28], [29]. Xuất phát từ thực tiễn về đa dạng cây trồng và địa hình ở Tây Nguyên, cũng như đa dạng của loài tuyến trùng sần rễ và khả năng gây hại, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự đa dạng tuyến trùng ký sinh gây sần rễ Meloidogyne spp.
ở Tây Nguyên’’ Mục tiêu nghiên cứu Xác định được các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne gây hại trên các cây trồng chính ở khu vực Tây Nguyên. Đánh giá mức độ đa dạng hình thái và phân tử của các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở khu vực Tây Nguyên. Đánh giá khả năng sử dụng một số vi sinh vật trong việc hạn chế sự phát triển của tuyến trùng sần rễ M. incognita trong điều kiện phòng thí nghiệm.
3 Phạm vi nghiên cứu Đặc điểm hình thái và phân tử của các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ghi nhận trên một số cây trồng ở khu vực Tây Nguyên. Đánh giá ảnh hưởng của một số vi sinh vật đối kháng lên khả năng nở trứng và sống sót của ấu trùng Meloidogyne incognita. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Ý nghĩa khoa học Bổ sung mới thành phần loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở Tây Nguyên, trong đó ghi nhận thêm nhiều cây ký chủ bị nhiễm tuyến trùng Meloidogyne cũng như sự phân bố của chúng. Mô tả và ghi nhận loài mới loài Meloidogyne daklakensis ký sinh trên cà phê tại tỉnh Đắk Lắk.
Các chỉ tiêu hình thái của các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở các cây chủ và địa điểm khác nhau được đánh giá, so sánh đưa ra sự biến đổi hình thái trong loài và các loài khác nhau đã xác định được những chỉ tiêu quan trọng ít thay đổi trong phân loại loài như các đặc điểm hình thái, hình thái lượng của vân cutin vùng chậu con cái, vùng đầu con đực và phần đuôi ấu trùng. Đánh giá đa dạng di truyền giữa các quần thể trong một loài và giữa các loài Meloidogyne ở Tây Nguyên được phân tích đưa ra các đoạn gen bảo thủ và tiến hóa cũng như phát sinh loài. Từ đó góp phần đưa ra chọn lựa tốt nhất trong phân loại từng nhóm loài Meloidogyne bằng sinh học phân tử. Bên cạnh đó, lần đầu tiên đóng góp cơ sở dữ liệu các vùng gen nhân (ITS, D2D3) và gen ty thể (COI, COII-16S, NAD5) của các loài Meloidogyne có mặt ở Việt Nam trên Genbank.
Luận án khẳng định vai trò ký sinh và gây chết của vi sinh vật có lợi trong điều kiện phòng thí nghiệm của nấm Paecilomyces javanicus, vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 trong phòng trừ loài Meloidogyne incognita phổ biến trên nhiều cây trồng. Ý nghĩa thực tiễn 4 Xác định thành phần loài, mật độ tuyến trùng sần rễ hại cây trồng là tiêu chuẩn trong phòng trừ hiệu quả. Cung cấp số liệu về khả năng ký sinh, ký chủ, gây hại và phân bố của các loài tuyến trùng ký sinh gây sần rễ góp phần ngăn chặn chúng phát tán trong điều kiện tự nhiên bảo vệ cây trồng tránh bị lây nhiễm. Từ đó lựa chọn phương thức canh tác phù hợp đối với từng cây trồng nhất là đối với cà phê và hồ tiêu cũng như những cây trồng xen và luân canh.
Luận án cung cấp cơ sở dữ liệu về hình thái và phân tử của các loài Meloidogyne phục vụ cho tra cứu, tham khảo. Đánh giá khả năng phòng trừ tuyến trùng sần rễ Meloidogyne bởi nấm Pacylomyces javanicus, vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124, kháng sinh 4-HPAA làm cơ sở cho việc lựa chọn các tác nhân trong phòng trừ, qua đó góp phần giảm lượng thuốc hóa học trong phòng trừ, giữ được cân bằng sinh thái để phát triển bền vững các cây trồng chủ lực ở Tây Nguyên. Những đóng góp mới của luận án Luận án lần đầu tiên đưa ra dữ liệu đầy đủ về phân bố, cây chủ và đặc trưng hình thái, phân tử của các loài tuyến trùng sần rễ trên cà phê, hồ tiêu và các cây trồng xen ở Tây Nguyên. Đã xác định thêm nhiều cây chủ mới nhiễm tuyến trùng Meloidogyne ở Tây Nguyên cũng như cho Việt Nam.
Bổ sung 145 trình tự các vùng gen ITS, D2D3, COI, COII-16S, NAD5 của các loài tuyến trùng sần rễ ở Tây Nguyên trên Genbank. Đã ghi nhận 01 loài tuyến trùng sần rễ mới cho khoa học ký sinh trên cà phê đã được mô tả, công bố và đặt tên Meloidogyne daklakensis n. và 01 loài còn lại đã được gửi công bố. Lần đâu tiên tại Việt Nam đã đánh giá khả năng ký sinh và gây chết của nấm Pacylomyces javanicus, vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 và chất kháng sinh 4-HPAA đối với tuyến trùng sần rễ M.
incognita trong điều kiện phòng thí nghiệm. 5 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne trên thế giới 1. Lịch sử nghiên cứu Berkeley (1855) là nhà khoa học đầu tiên công bố sự xuất hiện của tuyến trùng sần rễ trên rễ cây dưa chuột trồng tại khu vườn Nuneham, Vương Quốc Anh với các mô tả triệu chứng như: các nốt sần có màu kem đục, gần như hình cầu, có vảy mờ, có hiện tượng phình to ở rễ (hình 1. Jobert (1878) đã ghi nhận sự hiện diện trong rễ cà phê các cá thể hình giun được nở ra từ trứng có trong rễ cây,và ông đã đưa ra các mô tả cơ bản về tuyến trùng này.
Sau đó, nhóm tuyến trùng này lần lượt được đặt tên là Anguillula marioni (Cornu, 1879); Heterodera radicicola (Carl Muller, 1884), Heterodera javanica Treub (Melchior, 1885) [30]. Năm 1887 tên tuyến trùng sần rễ Meloidogyne (Meloidogyne theo tiếng latin có nghĩa là „con cái có hình quả táo‟) đã được đề xuất bởi Göldi khi mô tả chi tiết loài M. exigua trên rễ cà phê ở Braxil [1] (hình 1. Đến năm 1949, Chitwood thống nhất tách giống tuyến trùng Meloidogyne Göldi, 1887 dựa trên loài chuẩn M.
exigua (Goldi, 1887) tách khỏi tuyến trùng bào nang Heterodera. Vị trí phân loại của giống Meloidogyne hiện tại được theo hệ thống Karsen et al. Ngành: Nematoda Potts, 1932 Lớp: Chromadorea Inglis, 1983 Phân lớp: Chromadoria Pearse, 1942 Bộ: Rhabditida Chitwood, 1933 Phân bộ: Tylenchina Thorne, 1949 Họ: Meloidogynidae Skarbilovich, 1959 Phân họ: Meloidogyninae Skarbilovich, 1959 Giống: Meloidogyne Göldi, 1887 6 Hình 1.