Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm và đồ uống lên men, xu hướng phát triển các dòng sản phẩm nước giải khát có nguồn gốc tự nhiên, giàu hoạt tính sinh học và có nồng độ cồn thấp đang nhận được sự quan tâm lớn. Hoa đậu biếc (Clitoria ternatea) là nguồn nguyên liệu giàu các hợp chất chống oxy hóa tự nhiên như polyphenol, flavonoid và anthocyanin, mang lại màu sắc đặc trưng và giá trị dược tính cao. Kết hợp dịch chiết hoa đậu biếc với hệ vi sinh vật hạt kefir nước (water kefir grains) mở ra hướng nghiên cứu chế biến nước giải khát lên men kefir soda có gas tự nhiên, vị chua dịu và hương thơm đặc trưng, đáp ứng yêu cầu an toàn vệ sinh thực phẩm.

Mục tiêu và các nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể trong đề tài bao gồm:

  1. Khảo sát các thành phần hóa lý cơ bản của nguyên liệu hoa đậu biếc khô nhằm xác định giá trị dinh dưỡng và tiềm năng ứng dụng công nghệ.
  2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa quá trình thu nhận dịch chiết giàu polyphenol từ hoa đậu biếc bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM).
  3. Khảo sát các thông số công nghệ của quá trình lên men kefir soda hoa đậu biếc, bao gồm hàm lượng đường sucrose bổ sung, tỷ lệ hạt kefir nước và thời gian lên men.
  4. Đánh giá chất lượng sản phẩm hoàn thiện thông qua các chỉ tiêu hóa lý, vi sinh vật (đối chiếu các Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 5042:1994 và TCVN 12828:2019) và đánh giá cảm quan.
  5. Đề xuất quy trình sản xuất kefir soda từ dịch chiết hoa đậu biếc ở quy mô thử nghiệm.

Đối tượng nghiên cứu là bột hoa đậu biếc khô, hạt kefir nước, dung môi trích ly (nước khoáng) và sản phẩm nước giải khát lên men kefir soda hoa đậu biếc. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào các công đoạn thực nghiệm tại phòng thí nghiệm công nghệ thực phẩm và phân tích kiểm nghiệm chỉ tiêu vi sinh tại Công ty TNHH Phân tích Kiểm nghiệm Việt Tín.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Đề tài vận dụng cơ sở lý thuyết về trích ly hợp chất tự nhiên và động học lên men đồng hóa/dị hóa của hệ vi sinh vật cộng sinh trong hạt kefir nước. Hệ vi sinh vật này bao gồm vi khuẩn lactic (Lactobacillus hilgardii chứa enzyme glucansucrase tổng hợp exopolysaccharide - EPS), vi khuẩn acetic và nấm men. Quá trình lên men chuyển hóa đường sucrose thành ethanol, acid lactic, acid acetic, glycerol, mannitol và khí $CO_2$.

Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và công cụ phân tích đã được áp dụng:

  • Phương pháp phân tích hóa lý: Định tính các nhóm hợp chất tự nhiên (phenolic, flavonoid, terpenoid, saponin, alkaloid, tanin); định lượng độ ẩm, độ tro toàn phần, hàm lượng đường tổng; định lượng polyphenol tổng số bằng phương pháp Folin-Ciocalteu biểu diễn qua đương lượng gallic acid (mg GAE/g nguyên liệu hoặc mg/mL sản phẩm); xác định hàm lượng acid tổng số (tính theo acid lactic) bằng phương pháp chuẩn độ; xác định độ cồn (% v/v) và đo pH.
  • Phương pháp tối ưu hóa: Sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) theo mô hình cấu trúc xoay tâm cầu (Central Composite Design - CCD) trên phần mềm Minitab 18 với 3 biến độc lập: nhiệt độ trích ly ($X_1$), thời gian trích ly ($X_2$), và tỷ lệ nguyên liệu:dung môi ($X_3$) ở 5 cấp độ mã hóa (-1,68; -1; 0; +1; +1,68), gồm 20 thí nghiệm (14 nghiệm thức giai thừa và 6 nghiệm thức tâm).
  • Phương pháp đánh giá cảm quan: Phép thử so hàng đánh giá mức độ ưa thích về độ ngọt, độ chua và chất lượng tổng thể của sản phẩm; xử lý số liệu phi tham số bằng kiểm định Friedman.
  • Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh: Kiểm tra các vi sinh vật gây bệnh và chỉ thị vệ sinh (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens) theo TCVN 5042:1994.
  • Nguồn dữ liệu và xử lý thống kê: Dữ liệu thực nghiệm thu thập từ các thí nghiệm lặp lại 3 lần ($n = 3$), biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (Mean ± SD), phân tích phương sai ANOVA ở mức ý nghĩa $P < 0,05$.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3 trình bày toàn bộ quy trình công nghệ, hóa chất, thiết bị và phương pháp phân tích phục vụ nghiên cứu. Sơ đồ quy trình sản xuất thử nghiệm bao gồm các công đoạn: Chuẩn bị nguyên liệu hoa đậu biếc khô $\rightarrow$ Trích ly bằng nước khoáng ở điều kiện tối ưu $\rightarrow$ Lọc dịch chiết $\rightarrow$ Phối chế đường sucrose $\rightarrow$ Bổ sung hạt kefir nước (giống lên men) $\rightarrow$ Lên men ở nhiệt độ phòng $\rightarrow$ Tách hạt kefir $\rightarrow$ Ổn định và đóng chai sản phẩm.

Hệ thống phương pháp kiểm tra chất lượng sản phẩm được xây dựng dựa trên:

  • Bảng các chỉ tiêu khảo sát nguyên liệu và quy trình trích ly.
  • Bảng chỉ tiêu hóa lý thành phẩm (pH, acid tổng, độ cồn, polyphenol, đường tổng).
  • Bảng chỉ tiêu vi sinh vật theo TCVN 5042:1994 về nước giải khát có nồng độ cồn thấp.
  • Phương pháp xử lý dữ liệu thực nghiệm trên phần mềm thống kê chuyên dụng.

Chương 4: Kết quả và biện luận

1. Thành phần hóa lý của nguyên liệu bột hoa đậu biếc khô

Kết quả định tính cho thấy trong dịch chiết hoa đậu biếc có chứa phenolic, flavonoid, terpenoid, saponin và alkaloid, hoàn toàn không phát hiện tanin. Khi đối chiếu với các công bố trước đây, tác giả ghi nhận sự đồng thuận về sự có mặt của flavonoid, alkaloid, terpenoid nhưng có sự khác biệt về tanin và saponin so với các nghiên cứu của Manjula và cộng sự (2013) hay Mai Huỳnh Cang và cộng sự (2020) do điều kiện thổ nhưỡng và vùng trồng khác nhau.

Chỉ tiêu phân tích nguyên liệu Kết quả thực nghiệm ($n = 3$) Giá trị tham chiếu từ tài liệu
Định tính hợp chất tự nhiên Có phenolic, flavonoid, terpenoid, saponin, alkaloid; không có tanin Tương đồng về flavonoid, terpenoid, alkaloid
Độ ẩm (%) $13,40 \pm 0,03$ $< 15%$ (thuận lợi cho bảo quản)
Độ tro toàn phần (%) $4,67 \pm 0,03$ $\le 5%$ (Ali Esmail Al-Snafi, 2016)
Hàm lượng đường tổng (%) $42,71 \pm 0,42$ $64,1%$ (Piya Kosai và cộng sự, 2015)

2. Khảo sát và tối ưu hóa quá trình trích ly dịch chiết hoa đậu biếc

Khảo sát đơn yếu tố cho thấy hàm lượng polyphenol tổng đạt đỉnh ở nhiệt độ 60 °C ($25,99 \pm 0,08$ mg/g), thời gian trích ly 60 phút ($25,74 \pm 0,10$ mg/g) và tỷ lệ nguyên liệu:dung môi 3 g/L ($25,79 \pm 0,12$ mg/g). Nhiệt độ trên 60 °C hoặc thời gian vượt quá 60 phút làm suy giảm polyphenol do nhiệt phân và oxy hóa.

Mô hình hóa RSM-CCD thiết kế 20 thí nghiệm trên Minitab 18 cho phương trình hồi quy tương quan: $$Y = 25,952 - 0,0474X_1 + 0,2017X_2 + 0,5356X_3 - 1,6715X_1^2 - 2,8365X_2^2 - 1,4842X_3^2 + 0,294X_1X_2 + 0,154X_1X_3 - 0,111X_2X_3$$

Trong đó: $Y$ là hàm lượng polyphenol tổng (mg GAE/g); $X_1, X_2, X_3$ lần lượt là biến mã hóa của nhiệt độ (°C), thời gian (phút) và tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (g/L).

Phân tích phương sai ANOVA khẳng định mô hình có ý nghĩa thống kê cao ($P = 0,000 < 0,005$) với hệ số xác định $R^2 = 99,33%$ và $R^2$ hiệu chỉnh $= 98,72%$. Yếu tố tỷ lệ nguyên liệu:dung môi ($X_3$) và tương tác giữa nhiệt độ - thời gian ($X_1X_2$) có ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê ($P < 0,05$) đến hàm lượng polyphenol thu nhận. Điều kiện tối ưu hóa dự đoán là 60 °C, thời gian 60,34 phút (khoảng 60 phút 20 giây) và tỷ lệ 3,18 g/L. Thực nghiệm kiểm chứng cho kết quả $26,16 \pm 0,14$ mg GAE/g, sai số dưới 5% so với giá trị lý thuyết.

3. Khảo sát các thông số của quá trình lên men kefir soda

  • Tỷ lệ đường sucrose: Khảo sát ở các mức 5%, 10%, 15% và 20% (w/v). Khi tăng nồng độ đường, hàm lượng acid tổng giảm dần do áp suất thẩm thấu cao ức chế vi khuẩn lactic, trong khi nồng độ cồn tăng từ $0,18 \pm 0,02%$ lên $0,76 \pm 0,04%$ v/v. Nghiệm thức 15% sucrose cho nồng độ cồn đạt $0,53 \pm 0,02%$ v/v và được đánh giá cảm quan ưa thích nhất thông qua phép thử Friedman.
  • Tỷ lệ hạt kefir nước: Khảo sát ở các mức 4%, 6%, 8% và 10% (w/v). Tỷ lệ men giống tỷ lệ thuận với lượng acid tổng sinh ra (tăng từ $0,19 \pm 0,01$ đến $0,35 \pm 0,01$ g/100 mL), nhưng tỷ lệ nghịch với độ cồn. Điều này do vi khuẩn lactic chiếm ưu thế mật độ cạnh tranh cơ chất với nấm men và vi khuẩn acetic oxy hóa cồn thành acid acetic. Tỷ lệ 6% hạt kefir cho độ cồn phù hợp ($0,52 \pm 0,01%$) và điểm cảm quan hài hòa nhất.
  • Thời gian lên men: Khảo sát tại 24, 48, 72 và 96 giờ. Trong 72 giờ đầu, acid tổng tăng đều đặn (khoảng 0,1 g/100 mL sau mỗi 24 giờ). Nồng độ cồn giảm mạnh sau 48 giờ (từ $0,65 \pm 0,01%$ xuống $0,53 \pm 0,02%$). Thời gian lên men 48 giờ ở nhiệt độ phòng tạo ra sản phẩm có sự cân bằng tối ưu giữa vị chua, độ ngọt, gas nhẹ và hương thơm đặc trưng.
Thông số công nghệ lên men Mức khảo sát Mức tối ưu lựa chọn Cơ sở khoa học và chỉ số đạt được
Nồng độ sucrose bổ sung 5%, 10%, 15%, 20% (w/v) 15% (w/v) Cồn đạt $0,53 \pm 0,02%$; cảm quan ưa thích nhất theo phép thử Friedman
Tỷ lệ hạt kefir nước 4%, 6%, 8%, 10% (w/v) 6% (w/v) Acid tổng $0,23$ g/100 mL; cồn đạt $0,52 \pm 0,01%$; vị chua thanh dịu
Thời gian lên men 24, 48, 72, 96 giờ 48 giờ Hệ vi sinh vật chuyển hóa cân bằng; cồn $0,53 \pm 0,02%$; cảm quan tối ưu

4. Kiểm tra chất lượng sản phẩm hoàn thiện

Sản phẩm sau 1 ngày sản xuất có các chỉ số hóa lý đặc trưng: pH đạt $3,53 \pm 0,03$ (giảm mạnh từ 7,56 của dịch chiết ban đầu); độ cồn đạt $0,52 \pm 0,03%$; acid tổng số là $0,23 \pm 0,01%$; đường tổng đạt $0,08 \pm 0,01$ g/mL; hàm lượng polyphenol tổng số đạt $0,17 \pm 0,01$ mg/mL (tương đương 170 mg/L, vượt tiêu chuẩn tối thiểu 100 mg/L của TCVN 12828:2019). Về mặt vi sinh, kết quả kiểm nghiệm độc lập tại Công ty TNHH Phân tích Kiểm nghiệm Việt Tín xác nhận sản phẩm đạt chuẩn TCVN 5042:1994 đối với các vi sinh vật gây bệnh (E. coli, S. aureus, C. perfringens).

Chương 5: Kết luận - Kiến nghị

Tác giả tổng kết toàn bộ các thông số kỹ thuật đã tối ưu từ khâu trích ly nguyên liệu đến chế độ lên men và khẳng định khả năng tạo ra sản phẩm nước giải khát lên men kefir soda hoa đậu biếc đạt chuẩn chất lượng và an toàn thực phẩm.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã xây dựng thành công bộ thông số công nghệ hoàn chỉnh cho quy trình sản xuất kefir soda từ dịch chiết hoa đậu biếc:

  • Xác định bộ chỉ tiêu hóa lý của nguyên liệu hoa đậu biếc khô: độ ẩm $13,40%$, độ tro $4,67%$, đường tổng $42,71%$, giàu hợp chất phenolic, flavonoid, terpenoid, saponin và alkaloid.
  • Xác lập điều kiện trích ly tối ưu bằng mô hình toán RSM-CCD: nhiệt độ 60 °C, thời gian 60,34 phút, tỷ lệ nguyên liệu:dung môi 3,18 g/L; hàm lượng polyphenol thực nghiệm thu nhận đạt $26,16 \pm 0,14$ mg GAE/g hoa đậu biếc khô ($R^2 = 99,33%$).
  • Xác lập chế độ lên men kefir soda tối ưu: bổ sung 15% (w/v) đường sucrose, 6% (w/v) hạt kefir nước giống, thời gian lên men 48 giờ ở nhiệt độ phòng.
  • Sản phẩm hoàn thiện đạt hàm lượng polyphenol 170 mg/L (đáp ứng TCVN 12828:2019), nồng độ cồn kiểm soát ở mức $0,52 \pm 0,03%$ (phù hợp với đồ uống lên men nồng độ cồn thấp), pH 3,53 và an toàn vi sinh vật theo TCVN 5042:1994 đối với E. coli, S. aureus và C. perfringens.

Về mặt đóng góp khoa học, đề tài đã làm rõ động học cạnh tranh giữa vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic và nấm men trong hạt kefir nước khi lên men trên cơ chất dịch chiết hoa đậu biếc. Kết quả chứng minh sự suy giảm nồng độ cồn khi tăng tỷ lệ giống hoặc kéo dài thời gian lên men, đồng thời cung cấp thêm dữ liệu thực nghiệm về thành phần hóa thực vật của hoa đậu biếc canh tác tại Việt Nam so với các công bố quốc tế.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận được thực hiện trong phạm vi quy mô phòng thí nghiệm và còn một số điểm giới hạn:

  • Các thí nghiệm trích ly và lên men mới dừng lại ở quy mô mẻ nhỏ trong điều kiện nhiệt độ phòng không kiểm soát tuyệt đối.
  • Chỉ tiêu vi sinh vật không tiến hành kiểm nghiệm tổng số vi khuẩn hiếu khí và tổng số nấm men/mốc do đặc thù sản phẩm lên men sống chứa hệ vi sinh vật có lợi.
  • Chưa khảo sát biến đổi chất lượng sản phẩm trong quá trình bảo quản dài hạn và thử nghiệm các loại bao bì đóng gói khác nhau.

Hướng phát triển tiếp theo của đề tài bao gồm việc nghiên cứu theo dõi hạn sử dụng, động thái biến đổi của các nhóm lợi khuẩn và hoạt tính chống oxy hóa của sản phẩm trong điều kiện bảo quản lạnh.

Giá trị tham khảo

Công trình là tài liệu tham khảo giá trị đối với:

  • Sinh viên, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm, Công nghệ Sinh học, Kỹ thuật Hóa học trong việc ứng dụng mô hình bề mặt đáp ứng (RSM-CCD trên phần mềm Minitab) để tối ưu hóa quy trình trích ly hoạt chất sinh học từ thực vật.
  • Các nhà nghiên cứu và kỹ sư phát triển sản phẩm (R&D) đồ uống lên men truyền thống, nước giải khát chức năng có nguồn gốc từ thảo mộc, quan tâm đến quy trình công nghệ và phương pháp kiểm soát nồng độ cồn dưới 0,5% trong sản phẩm lên men từ hạt kefir nước.

Câu hỏi thường gặp

1. Thành phần hóa thực vật định tính trong hoa đậu biếc của nghiên cứu này có điểm gì khác biệt so với các công bố trước?

Dịch chiết hoa đậu biếc trong nghiên cứu được định tính có chứa phenolic, flavonoid, terpenoid, saponin và alkaloid, nhưng hoàn toàn không có tanin. Kết quả này đồng thuận với nghiên cứu của Manjula và cộng sự (2013) cũng như Mai Huỳnh Cang và cộng sự (2020) về sự hiện diện của flavonoid, terpenoid và alkaloid; tuy nhiên khác biệt ở chỗ hai công bố trước đều tìm thấy tanin, trong khi nghiên cứu này phát hiện thêm saponin và phenolic. Nguyên nhân xuất phát từ sự khác biệt về điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu và vùng trồng nguyên liệu.

2. Mô hình toán học RSM-CCD tối ưu hóa quá trình trích ly cho kết quả cụ thể như thế nào?

Mô hình toán học xây dựng trên Minitab 18 có hệ số tương quan $R^2 = 99,33%$ ($R^2$ hiệu chỉnh $= 98,72%$, $P = 0,000 < 0,005$). Phương trình hồi quy chỉ ra rằng tỷ lệ nguyên liệu:dung môi ($X_3$) và cặp tương tác nhiệt độ - thời gian ($X_1X_2$) có ảnh hưởng mang ý nghĩa thống kê ($P < 0,05$) đến hàm lượng polyphenol. Điểm tối ưu lý thuyết được xác định tại nhiệt độ 60 °C, thời gian 60,34 phút và tỷ lệ nguyên liệu:dung môi 3,18 g/L, cho giá trị kiểm chứng thực nghiệm đạt $26,16 \pm 0,14$ mg GAE/g hoa đậu biếc khô.

3. Tại sao khi tăng tỷ lệ hạt kefir nước từ 4% lên 10% thì nồng độ cồn sinh ra lại giảm?

Khi tăng tỷ lệ giống hạt kefir, mật độ vi khuẩn sinh acid (đặc biệt là vi khuẩn lactic) tăng vượt trội (theo tài liệu tham khảo, vi khuẩn lactic chiếm ưu thế gấp 10 - 100 lần so với nấm men trên mỗi gram hạt kefir). Sự áp đảo này tạo ra sự cạnh tranh dinh dưỡng gay gắt, ức chế khả năng lên men sinh cồn của nấm men. Đồng thời, sự hiện diện của vi khuẩn acetic ở mật độ cao sẽ thúc đẩy quá trình oxy hóa lượng ethanol sinh ra thành acid acetic, khiến nồng độ cồn cuối cùng bị suy giảm.

4. Các thông số công nghệ lên men tối ưu được lựa chọn là gì và dựa trên tiêu chí nào?

Các thông số tối ưu gồm: bổ sung 15% (w/v) đường sucrose, 6% (w/v) hạt kefir nước và thời gian lên men 48 giờ ở nhiệt độ phòng. Các thông số này được lựa chọn dựa trên sự kết hợp đồng thời giữa các phân tích hóa lý (độ cồn $0,52 - 0,53%$, acid tổng $0,23%$) và đánh giá cảm quan thông qua phép thử so hàng (xử lý bằng kiểm định Friedman) nhằm đạt được sự cân bằng hài hòa về vị chua thanh, độ ngọt dịu và mùi hương đặc trưng.

5. Sản phẩm kefir soda hoa đậu biếc hoàn thiện có đáp ứng các tiêu chuẩn chất lượng quốc gia không?

Có. Sản phẩm có hàm lượng polyphenol đạt $0,17 \pm 0,01$ mg/mL (tương đương 170 mg/L), vượt mức quy định tối thiểu 100 mg/L của TCVN 12828:2019 về nước giải khát; độ cồn đạt $0,52 \pm 0,03%$, phù hợp với quy chuẩn nước giải khát lên men nồng độ cồn thấp; các chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh (E. coli, S. aureus, C. perfringens) đều đạt chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm theo TCVN 5042:1994.

Kết luận

Đề tài đã hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất nước giải khát lên men kefir soda từ dịch chiết hoa đậu biếc khô thông qua việc tối ưu hóa thực nghiệm quá trình trích ly và lên men. Mô hình RSM-CCD đã giải quyết bài toán trích ly tối đa hàm lượng polyphenol ($26,16$ mg GAE/g) tại điều kiện 60 °C, thời gian 60,34 phút và tỷ lệ nguyên liệu:dung môi 3,18 g/L. Quá trình lên men với 15% sucrose, 6% hạt kefir trong 48 giờ tạo ra sản phẩm có giá trị cảm quan tốt, nồng độ cồn thấp ($0,52%$), giàu hoạt tính sinh học (polyphenol đạt 170 mg/L) và đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn TCVN 12828:2019 cũng như TCVN 5042:1994.