Nguyễn phương thảo tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất 2 methoxybenzamid có chứa vòng thơm

Nghiên cứu tổng hợp và đánh giá tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất 2-methoxybenzamid chứa vòng thơm. Tìm hiểu tiềm năng ứng dụng trong y học.

• Tác giả: Nguyễn Phương Thảo
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Công Trường
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất 2-methoxybenzamid có chứa vòng thơm.
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất có chứa khung 2-methoxybenzamid
• 1.2. Tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất có chứa khung 2-aminobenzamid
• 1.3. Các phương pháp tổng hợp amid
• 1.3.1. Phương pháp amid hóa trực tiếp không sử dụng xúc tác
• 1.3.2. Phương pháp tổng hợp amid sử dụng xúc tác kim loại
• 1.3.3. Phương pháp sử dụng dẫn chất boron làm chất xúc tác
• 1.3.4. Phương pháp tổng hợp amid thông qua Carbodiimid/ N-Hydroxybenzotriazol
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi
• 2.2. Thiết bị thí nghiệm
• 2.3. Nội dung nghiên cứu
• 2.3.1. Tổng hợp hóa học các dẫn chất 2-methoxybenzamid
• 2.3.2. Thử độc tính tế bào của các dẫn chất tổng hợp được
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp tổng hợp các dẫn chất 2-methoxybenzamid thơm
• 2.4.2. Phương pháp tinh chế và xác định cấu trúc
• 2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính gây độc tế bào
• 3. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ
• 3.1. Tổng hợp hóa học
• 3.1.1. Tổng hợp các dẫn chất acid 4-((3-halogenobenzyl)oxy) 2-methoxybenzoic
• 3.1.2. Tổng hợp chất trung gian 2-amino-5-(dimethylamino)benzamid (8)
• 3.1.3. Tổng hợp các dẫn chất 2-methoxybenzamid thơm
• 3.2. Kiểm tra độ tinh khiết, khẳng định cấu trúc
• 3.2.1. Kiểm tra độ tinh khiết
• 3.2.2. Khẳng định cấu trúc
• 3.3. Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Tổng hợp hóa học
• 4.1.1. Tổng hợp các dẫn chất trung gian acid 4-((3-halogenobenzyl)oxy)-2-methoxybenzoic (4a-c)
• 4.1.2. Tổng hợp chất trung gian 2-amino-5-(dimethylamino)benzamid (8)
• 4.1.3. Phản ứng tổng hợp các dẫn chất 2-methoxybenzamid thơm (9a-c)
• 4.2. Khẳng định cấu trúc
• 4.2.1. Phổ khối lượng (MS)
• 4.2.2. Phổ hồng ngoại IR
• 4.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)
• 4.2.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13C-NMR)
• 4.3. Về hoạt tính kháng tế bào ung thư
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu 2 Methoxybenzamid Kháng Ung Thư

Ung thư là một thách thức y tế toàn cầu, nguyên nhân gây tử vong đứng thứ hai sau bệnh tim mạch. Theo Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC), số ca ung thư mới và tử vong do ung thư tiếp tục tăng. Hóa trị liệu ung thư, mặc dù hiệu quả, thường đi kèm với độc tính và khả năng kháng thuốc. Do đó, việc phát triển các thuốc chống ung thư mới là vô cùng quan trọng. Các hợp chất mang khung 2-methoxybenzamid đã được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học, bao gồm cả tiềm năng kháng ung thư. Nghiên cứu này tập trung vào việc tổng hợp và đánh giá tác dụng của các dẫn chất 2-methoxybenzamid nhằm tìm ra các tác nhân chống ung thư mới hiệu quả hơn. Mục tiêu chính là phát triển các tác nhân chống ung thư mới. Khóa luận tập trung vào tổng hợp các chất có vòng thơm. Mục tiêu bao gồm tổng hợp các dẫn chất có vòng thơm và đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư.

1.1. Khung 2 Methoxybenzamid và Hoạt Tính Sinh Học Đa Dạng

Các dẫn chất 2-methoxybenzamid (ortho-anisamid) là các hợp chất chứa nhóm amid. Chúng đã được báo cáo có các tác dụng sinh học đa dạng. Các tác dụng đó bao gồm chống nôn, an thần, chống loạn thần, chống khó tiêu, chống trầm cảm và đặc biệt là chống tăng sinh tế bào ung thư. Mặc dù cơ chế kháng ung thư cụ thể vẫn cần được nghiên cứu sâu hơn, nhưng các nghiên cứu hiện tại đã chỉ ra tiềm năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Theo nghiên cứu của Chinyu Sun, 2-methoxybenzamid là khung kết nối có lợi cho việc ức chế các tế bào ung thư. Khung này có lợi vì ức chế được đường dẫn truyền Hedgehog (Hh).

1.2. Vai Trò Của Dẫn Chất 2 Methoxybenzamid trong Điều Trị Ung Thư

2-methoxybenzamid có thể đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển các phương pháp điều trị ung thư hiệu quả hơn. Việc nghiên cứu và phát triển các dẫn chất mới có tiềm năng kháng ung thư mạnh mẽ là hướng đi đầy hứa hẹn. Các nghiên cứu cho thấy các dẫn chất này có thể ức chế các đường dẫn truyền tín hiệu quan trọng trong tế bào ung thư, gây ra chết tế bào theo chương trình và ngăn chặn sự phát triển của khối u. Cần có nhiều nghiên cứu hơn nữa để xác định rõ cơ chế tác dụng và hiệu quả của các dẫn chất 2-methoxybenzamid trong điều trị ung thư.

II. Tổng Hợp Hóa Học Dẫn Chất 2 Methoxybenzamid Quy Trình

Quá trình tổng hợp dẫn chất 2-methoxybenzamid bao gồm nhiều bước, từ việc chuẩn bị các chất trung gian đến phản ứng cuối cùng tạo thành hợp chất mong muốn. Các phương pháp tổng hợp amid khác nhau có thể được sử dụng, bao gồm amid hóa trực tiếp, sử dụng xúc tác kim loại, hoặc thông qua carbodiimide. Việc lựa chọn phương pháp tổng hợp phù hợp phụ thuộc vào cấu trúc của dẫn chất cần tổng hợp và các yêu cầu về hiệu suất và độ tinh khiết. Các nhà nghiên cứu đã sử dụng một quy trình tổng hợp cụ thể để tạo ra các dẫn chất có chứa vòng thơm. Các phương pháp tinh chế và xác định cấu trúc như sắc ký lớp mỏng, phổ khối lượng và cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng để đảm bảo độ tinh khiết và xác định cấu trúc của các hợp chất tổng hợp.

2.1. Các Phương Pháp Tổng Hợp Amid Phổ Biến Tổng Quan

Tổng hợp amid là một quá trình quan trọng trong hóa học hữu cơ và dược phẩm. Một số phương pháp tổng hợp amid phổ biến bao gồm amid hóa trực tiếp từ acid carboxylic và amin, sử dụng xúc tác kim loại để tăng tốc độ phản ứng, và sử dụng carbodiimide như DCC hoặc EDC/EDCI để kích hoạt acid carboxylic. Phương pháp amid hóa trực tiếp không sử dụng xúc tác, phương pháp tổng hợp amid sử dụng xúc tác kim loại, và phương pháp sử dụng dẫn chất boron làm chất xúc tác. Phương pháp tổng hợp amid thông qua Carbodiimid/ N-Hydroxybenzotriazol cũng rất phổ biến. Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp phù hợp phụ thuộc vào tính chất của các chất phản ứng và sản phẩm mong muốn.

2.2. Tinh Chế và Xác Định Cấu Trúc Dẫn Chất 2 Methoxybenzamid

Sau khi tổng hợp, việc tinh chế và xác định cấu trúc của dẫn chất 2-methoxybenzamid là rất quan trọng. Các kỹ thuật tinh chế phổ biến bao gồm sắc ký cột và kết tinh lại. Các kỹ thuật xác định cấu trúc thường được sử dụng bao gồm phổ khối lượng (MS), phổ hồng ngoại (IR), và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). Phổ NMR cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc phân tử, bao gồm cả số lượng và loại nguyên tử hydro và carbon, cũng như các mối liên kết giữa chúng. Việc xác định cấu trúc chính xác là rất quan trọng để đảm bảo tính chính xác và tin cậy của các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các dẫn chất.

III. Thử Nghiệm Tác Dụng Gây Độc Tế Bào Ung Thư Phương Pháp

Việc thử nghiệm tác dụng gây độc tế bào ung thư của các dẫn chất 2-methoxybenzamid là bước quan trọng để đánh giá tiềm năng kháng ung thư của chúng. Các thử nghiệm in vitro thường được thực hiện trên các dòng tế bào ung thư khác nhau để đánh giá khả năng ức chế sự phát triển và gây chết tế bào. Các phương pháp phổ biến bao gồm thử nghiệm MTT, SRB, và LDH. Kết quả thử nghiệm in vitro cung cấp thông tin quan trọng về hoạt tính kháng ung thư của các dẫn chất và giúp lựa chọn các ứng cử viên tiềm năng cho các nghiên cứu in vivo và thử nghiệm lâm sàng. Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư đã được tiến hành. Các kết quả cho thấy rằng các hợp chất này có thể ức chế sự tăng sinh và gây chết tế bào ung thư.

3.1. Các Dòng Tế Bào Ung Thư Thường Được Sử Dụng Trong Nghiên Cứu

Nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau được sử dụng trong các nghiên cứu về tác dụng gây độc tế bào của các dẫn chất 2-methoxybenzamid. Các dòng tế bào phổ biến bao gồm A549 (ung thư phổi), MCF-7 (ung thư vú), HCT-116 (ung thư ruột kết), và HepG2 (ung thư gan). Việc sử dụng nhiều dòng tế bào khác nhau giúp đánh giá hoạt tính kháng ung thư của các dẫn chất trên các loại ung thư khác nhau. Kết quả từ các dòng tế bào khác nhau có thể cung cấp thông tin về tính chọn lọc của các dẫn chất đối với các loại ung thư cụ thể.

3.2. Phương Pháp Đánh Giá Hoạt Tính Gây Độc Tế Bào MTT Assay

MTT assay là một phương pháp phổ biến để đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn chất. Phương pháp này dựa trên khả năng của các tế bào sống để khử MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) thành formazan màu tím. Lượng formazan tạo ra tỉ lệ thuận với số lượng tế bào sống, do đó có thể sử dụng để định lượng hoạt tính gây độc tế bào. MTT assay là một phương pháp đơn giản, nhanh chóng và nhạy cảm, và thường được sử dụng để sàng lọc các hợp chất có tiềm năng kháng ung thư.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Hoạt Tính Kháng Ung Thư Của Dẫn Chất

Nghiên cứu đã tổng hợp thành công một số dẫn chất 2-methoxybenzamid có chứa vòng thơm. Các kết quả thử nghiệm in vitro cho thấy rằng một số dẫn chất có hoạt tính kháng ung thư đáng kể trên các dòng tế bào ung thư khác nhau. Cấu trúc và tính chất hóa học của các dẫn chất có ảnh hưởng đến hoạt tính kháng ung thư của chúng. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác dụng và mối liên hệ cấu trúc-hoạt tính (SAR) của các dẫn chất này có thể giúp phát triển các thuốc chống ung thư mới hiệu quả hơn.

4.1. Tổng Hợp Thành Công Các Dẫn Chất 2 Methoxybenzamid Mới

Nghiên cứu đã thành công trong việc tổng hợp một số dẫn chất 2-methoxybenzamid mới. Các chất này được kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc bằng các phương pháp phân tích hóa học hiện đại. Việc tổng hợp thành công các dẫn chất mới là bước quan trọng để nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học và tiềm năng kháng ung thư của chúng.

4.2. Đánh Giá Hoạt Tính Gây Độc Tế Bào Trên Các Dòng Ung Thư

Các dẫn chất 2-methoxybenzamid đã được đánh giá về hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư khác nhau. Kết quả cho thấy rằng một số dẫn chất có khả năng ức chế sự phát triển và gây chết tế bào ung thư. Hoạt tính kháng ung thư của các dẫn chất khác nhau tùy thuộc vào cấu trúc và tính chất hóa học của chúng. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác dụng của các dẫn chất này có thể giúp phát triển các thuốc chống ung thư mới hiệu quả hơn.

V. Thách Thức Bàn Luận Về Tác Dụng Kháng Tế Bào Ung Thư

Mặc dù các dẫn chất 2-methoxybenzamid cho thấy tiềm năng kháng ung thư, nhưng vẫn còn nhiều thách thức cần giải quyết. Cơ chế tác dụng của các dẫn chất này cần được nghiên cứu sâu hơn để hiểu rõ cách chúng tác động lên tế bào ung thư. Độc tính của các dẫn chất cần được đánh giá cẩn thận để đảm bảo an toàn khi sử dụng. Các nghiên cứu in vivo và thử nghiệm lâm sàng là cần thiết để đánh giá hiệu quả của các dẫn chất trong điều trị ung thư trên người. Cần có nhiều nghiên cứu hơn nữa để tối ưu hóa cấu trúc của các dẫn chất và phát triển các phương pháp điều trị ung thư mới hiệu quả hơn.

5.1. Cơ Chế Tác Dụng Phân Tử Của Dẫn Chất 2 Methoxybenzamid

Việc tìm hiểu cơ chế tác dụng phân tử của dẫn chất 2-methoxybenzamid là rất quan trọng để phát triển các thuốc chống ung thư hiệu quả hơn. Các dẫn chất này có thể tác động lên nhiều mục tiêu phân tử khác nhau trong tế bào ung thư, bao gồm các enzyme, protein tín hiệu, và DNA. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác dụng của các dẫn chất có thể giúp xác định các mục tiêu phân tử quan trọng và phát triển các thuốc điều trị ung thư nhắm trúng đích.

5.2. Độc Tính và An Toàn Của Các Dẫn Chất Benzamid

Độc tính và an toàn là các yếu tố quan trọng cần được xem xét khi phát triển các thuốc chống ung thư mới. Các dẫn chất 2-methoxybenzamid có thể gây ra các tác dụng phụ không mong muốn, do đó cần được đánh giá cẩn thận về độc tính trên các mô hình in vitro và in vivo. Việc tối ưu hóa cấu trúc của các dẫn chất có thể giúp giảm độc tính và tăng tính chọn lọc đối với tế bào ung thư.

VI. Kết Luận Triển Vọng Ứng Dụng 2 Methoxybenzamid Điều Trị

Nghiên cứu về dẫn chất 2-methoxybenzamid có tiềm năng lớn trong việc phát triển các thuốc chống ung thư mới. Các kết quả nghiên cứu đã cung cấp thông tin quan trọng về hoạt tính kháng ung thư và cơ chế tác dụng của các dẫn chất này. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác dụng, độc tính, và hiệu quả của các dẫn chất trong các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng là cần thiết để phát triển các phương pháp điều trị ung thư mới hiệu quả hơn và an toàn hơn. Cần tiến hành thêm nhiều nghiên cứu hơn nữa về các dẫn chất 2-methoxybenzamid trong tương lai.

6.1. Ứng Dụng Tiềm Năng Trong Điều Trị Các Loại Ung Thư Khác

Các dẫn chất 2-methoxybenzamid có tiềm năng ứng dụng trong điều trị nhiều loại ung thư khác nhau. Nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính kháng ung thư của các dẫn chất trên các dòng tế bào ung thư khác nhau có thể giúp xác định các loại ung thư phù hợp để điều trị bằng các dẫn chất này.

6.2. Phát Triển Công Thức Bào Chế và Phương Pháp Phân Phối Thuốc

Việc phát triển công thức bào chế và phương pháp phân phối thuốc phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả điều trị của các dẫn chất 2-methoxybenzamid. Các công thức bào chế có thể giúp cải thiện độ tan, sinh khả dụng, và ổn định của các dẫn chất. Các phương pháp phân phối thuốc nhắm trúng đích có thể giúp tăng cường hiệu quả điều trị và giảm tác dụng phụ.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Bệnh lý ung thư hiện là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ hai trên phạm vi toàn cầu, chỉ sau các bệnh lý tim mạch. Theo báo cáo GLOBOCAN 2020 của Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC), gánh nặng ung thư thế giới ghi nhận khoảng 19,3 triệu ca mắc mới và gần 10 triệu ca tử vong. Ước tính trung bình cứ 5 người thì có 1 người mắc ung thư trong đời; tỷ lệ tử vong do ung thư là 1/9 ở nam giới và 1/12 ở phụ nữ. Dự báo đến năm 2030, số ca mắc mới hàng năm trên thế giới sẽ tăng lên 26 triệu người và số ca tử vong đạt 17 triệu người. Ung thư đặc trưng bởi sự tăng sinh mất kiểm soát, khả năng xâm lấn các mô lân cận và di căn xa thông qua hệ thống tuần hoàn máu hoặc bạch huyết. Dù hóa trị liệu đã được ứng dụng trong điều trị lâm sàng hơn năm thập kỷ qua, phương pháp này vẫn tồn tại những hạn chế nghiêm trọng do độc tính cao đối với tế bào lành và hiện tượng kháng hóa chất của các khối u ác tính. Do đó, việc nghiên cứu phát triển các phân tử thuốc mới có hoạt tính ức chế chọn lọc tế bào ung thư là yêu cầu cấp thiết của ngành dược phẩm.

Các công trình công bố quốc tế đã ghi nhận khung cấu trúc 2-methoxybenzamid (ortho-anisamid) sở hữu phổ hoạt tính sinh học phong phú như an thần, chống nôn, chống trầm cảm và đặc biệt là khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư thông qua vai trò là một khung kết nối (linker) thuận lợi. Song song đó, khung cấu trúc 2-aminobenzamid (anthranilamid) cũng được xem là khung đặc quyền (privileged scaffold) xuất hiện trong nhiều hợp chất ức chế sinh mạch và ức chế protein đích. Xuất phát từ cơ sở thực tiễn và lý thuyết này, đề tài "Tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất 2-methoxybenzamid có chứa vòng thơm" được triển khai nhằm thực hiện hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Tổng hợp được một số dẫn chất 2-methoxybenzamid có chứa vòng thơm.
2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn chất tổng hợp được trên một số dòng tế bào ung thư.

Đối tượng nghiên cứu của khóa luận là dãy ba dẫn chất 2-methoxybenzamid thế halogen trên vòng benzyl (ký hiệu 9a, 9b, 9c) cùng các hợp chất trung gian trong quy trình tổng hợp. Phạm vi thực nghiệm tổng hợp hóa học, kiểm tra lý hóa sơ bộ được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa Hữu cơ, Khoa Công nghệ Hóa dược, Trường Đại học Dược Hà Nội. Việc phân tích phổ khẳng định cấu trúc được thực hiện tại Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (Đại học Quốc gia Hà Nội). Phạm vi đánh giá hoạt tính sinh học in vitro được tiến hành trên hai dòng tế bào ung thư người gồm tế bào ung thư phổi A549 và tế bào ung thư vú MCF-7 tại Phòng Hóa sinh ứng dụng thuộc Viện Hóa học. Toàn bộ nghiên cứu được hoàn thành vào năm 2024.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng thiết kế phân tử dựa trên sự tích hợp cấu trúc giữa khung 2-methoxybenzamid và nhân 2-aminobenzamid:

• Khung 2-methoxybenzamid: Đã được chứng minh có khả năng ức chế con đường truyền tín hiệu Hedgehog (Hh) thông qua liên kết với protein Smoothened (Smo), tiêu biểu là dẫn chất Ic đạt IC50 = 0,03 µM tương đương thuốc đối chứng vismodegib; kích hoạt căng thẳng lưới nội chất (ERS) và phản ứng mở xoắn protein (UPR) trên tế bào ung thư đại trực tràng (dẫn chất mesalamin II); ức chế kép con đường PI3K/AKT/mTOR (dẫn chất IIIa); ức chế enzym Nicotinamid Phosphoribosyltransferase (NAMPT) trên tế bào ung thư tụy (các dẫn chất IVa, IVb); ức chế yếu tố nhân NF-κB (dẫn chất OMe-DHMEQ, MBNQ); hoặc gắn kết vào vị trí colchicin của tubulin gây ngừng chu kỳ tế bào ở pha G2/M (dãy chất VII).
• Khung 2-aminobenzamid: Sở hữu liên kết hydro nội phân tử bền vững giữa nhóm amin và carbonyl amid tạo thành giả vòng 6 cạnh tương tự phthalazin. Khung này thể hiện ái lực ức chế chọn lọc thụ thể yếu tố tăng trưởng nội mạch (VEGFR như phân tử AAL993) hoặc ức chế protein sốc nhiệt HSP 90 (các phân tử IXa, BJ-B11, AT-533) can thiệp vào trục truyền tín hiệu HIF-1α/VEGF/VEGFR-2.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

• Phương pháp tổng hợp hóa dược: Quy trình tổng hợp đa giai đoạn kết hợp các phản ứng kinh điển và hiện đại:
  1. Phản ứng alkyl hóa nhóm thế phenol của 4-hydroxy-2-methoxybenzaldehyd bằng các tác nhân benzyl clorid thế halogen meta (-F, -Cl, -Br) với xúc tác base K2CO3 trong dung môi N,N-dimethylformamid (DMF).
  2. Phản ứng oxy hóa Pinnick chuyển nhóm chức aldehyd thành acid carboxylic tương ứng sử dụng hệ tác nhân natri clorit (NaClO2), dung dịch đệm dinatri hydrophosphat (NaH2PO4) và hydro peroxid (H2O2).
  3. Phản ứng chuyển acid 5-cloro-2-nitrobenzoic thành clorid acid bằng thionyl clorid (SOCl2), tiếp theo là phản ứng amid hóa với dung dịch amoni hydroxyd 30% để tạo dẫn chất benzamid trung gian.
  4. Phản ứng thế ái nhân thơm (SNAr) của dimethylamin vào vị trí para của 5-cloro-2-nitrobenzamid.
  5. Phản ứng khử hóa chọn lọc nhóm nitro thành amin thơm sử dụng thiếc(II) clorid dihydrat (SnCl2.2H2O) có mặt acid hydrocloric đặc trong ethanol.
  6. Phản ứng ghép nối tạo liên kết amid giữa acid carboxylic và amin thơm sử dụng hệ tác nhân carbodiimid: 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid hydroclorid (EDC.HCl) kết hợp chất cộng gộp N-hydroxybenzotriazol (HOBt) và base triethylamin (TEA) trong DMF ở 50°C.
• Phương pháp tinh chế và kiểm tra lý hóa: Theo dõi tiến trình phản ứng và kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) trên bản mỏng silicagel 60 F254 của Merck, soi dưới đèn tử ngoại bước sóng 254 nm; tinh chế sản phẩm thô bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển sử dụng pha tĩnh silicagel và phương pháp kết tinh lại; xác định khoảng nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo tự động EZ-Melt.
• Phương pháp xác định cấu trúc: Sử dụng phổ khối lượng (MS) trên thiết bị 1100 Series LC-MSD-Trap-SL (Agilent); phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) trên máy Affinity-IS (Shimadzu) đo theo kỹ thuật ép viên nén KBr trong khoảng số sóng 4000–500 cm⁻¹; phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (¹H-NMR ở tần số 600 MHz) và carbon (¹³C-NMR ở tần số 126 MHz) trên thiết bị Bruker Avance III HD sử dụng dung môi DMSO-d6 và chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS).
• Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học: Thử nghiệm độc tính tế bào in vitro bằng phương pháp MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid). Nguyên tắc dựa trên hoạt tính của enzym dehydrogenase trong ty thể của tế bào sống khử muối tetrazolium màu vàng thành tinh thể formazan màu tím không tan. Tinh thể formazan được hòa tan bằng dimethylsulfoxid (DMSO) và đo mật độ quang (OD) tại bước sóng 540 nm trên máy quang phổ BioTek. Thử nghiệm tiến hành lặp lại 3 lần trên đĩa 96 giếng với 5 nồng độ pha loãng (0,5; 2; 8; 32 và 128 µg/mL). Chất đối chứng dương là Ellipticin. Dữ liệu được tính toán xác định giá trị nồng độ ức chế 50% sự phát triển tế bào (IC50) thông qua phần mềm Rawdata.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở dữ liệu khoa học về cấu trúc hóa học và tiềm năng kháng ung thư của hai khung phân tử 2-methoxybenzamid và 2-aminobenzamid. Tác giả phân tích sâu các con đường truyền tín hiệu sinh học phân tử mà hai khung này tác động, bao gồm con đường Hedgehog/Smoothened, con đường stress lưới nội chất ERS/UPR, trục PI3K/AKT/mTOR, enzym chuyển hóa năng lượng NAMPT, yếu tố phiên mã NF-κB, phức hợp tubulin và protein sốc nhiệt HSP 90. Phần thứ hai của chương trình bày tổng quan các phương pháp kinh điển và hiện đại để tạo liên kết amid từ acid carboxylic và amin:

• Phương pháp amid hóa trực tiếp không xúc tác (đòi hỏi nhiệt độ cao 110–150°C trong toluen/xylen, dễ tạo muối amoni carboxylat bền, hạn chế với aryl amin).
• Phương pháp sử dụng xúc tác kim loại chuyển tiếp nhóm IV (cho hiệu suất 56–94% nhưng vẫn cần điều kiện nhiệt độ cao).
• Phương pháp xúc tác hợp chất boron như triphenyl borat (hiệu suất 16–92%, tránh được thiết bị bẫy nước Dean-Stark nhưng nhiệt độ cao làm tăng nguy cơ racemic hóa).
• Phương pháp sử dụng tác nhân ghép cặp carbodiimid (DCC, DIC, EDC) phối hợp chất phụ gia HOBt. Tác giả phân tích ưu điểm vượt trội của EDC.HCl khi tạo ra sản phẩm phụ dimethylaminopropyl-3-ethylure tan tốt trong nước, cho phép loại bỏ triệt để khỏi sản phẩm amid mục tiêu chỉ bằng thao tác rửa chiết với nước, đồng thời HOBt đóng vai trò trung gian este hoạt hóa giúp ngăn chặn phản ứng phụ tạo N-acylure và tránh hiện tượng racemic hóa. Đây là luận điểm quyết định để lựa chọn quy trình hóa học cho khóa luận.

Chương 2: Nguyên liệu, thiết bị, dụng cụ, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết danh mục 28 loại hóa chất, dung môi hữu cơ đạt tiêu chuẩn phân tích từ các nhà sản xuất Merck, Acros, cùng hệ thống trang thiết bị thí nghiệm của Bộ môn Hóa Hữu cơ. Chương 2 chuẩn hóa toàn bộ các bước quy trình thực nghiệm: quy trình tổng hợp 3 giai đoạn để thu nhận 3 dẫn chất mục tiêu (9a, 9b, 9c); quy trình kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM (với các hệ dung môi giải ly ethyl acetat:n-hexan và methanol:dicloromethan) kết hợp đo nhiệt độ nóng chảy; quy trình ghi và giải đoán phổ cấu trúc (IR, MS, ¹H-NMR, ¹³C-NMR). Đồng thời, chương trình bày chi tiết quy trình nuôi cấy hai dòng tế bào ung thư người A549 và MCF-7 từ ngân hàng chuẩn ATCC trong môi trường DMEM/MEME bổ sung 7–10% huyết thanh thai bò (FBS), ủ ở 37°C, 5% CO2 và độ ẩm 98%, cùng các công thức tính toán độ ức chế và giá trị IC50 trong thử nghiệm MTT.

Chương 3: Thực nghiệm, kết quả

Chương 3 ghi nhận toàn bộ thông số thực nghiệm định lượng của quy trình tổng hợp và kết quả kiểm tra hóa lý:

• Giai đoạn 1: Phản ứng alkyl hóa giữa 4-hydroxy-2-methoxybenzaldehyd (1) với các tác nhân benzyl clorid (2a, 2b, 2c) thu được các dẫn chất aldehyd (3a-c) ở dạng chất rắn màu trắng với hiệu suất lần lượt là 3a (-F): 81% (1,11 g, Rf = 0,56); 3b (-Cl): 78% (1,14 g, Rf = 0,54); 3c (-Br): 85% (1,44 g, Rf = 0,54) trong hệ dung môi EA:n-hexan = 2:8. Phản ứng oxy hóa Pinnick tiếp theo tạo ra các dẫn chất acid trung gian (4a-c) đạt hiệu suất 85–92% (riêng dẫn chất 4b thu được 1,03 g, hiệu suất 85%, Rf = 0,36 trong hệ EA:n-hexan = 1:9).
• Giai đoạn 2: Tổng hợp chất trung gian nhánh amin (8) qua 3 phản ứng: Phản ứng chuyển acid 5-cloro-2-nitrobenzoic (5) thành 5-cloro-2-nitrobenzamid (6) đạt hiệu suất cao khoảng 90%; phản ứng thế dimethylamin tạo dẫn chất 5-(dimethylamino)-2-nitrobenzamid (7) là chất rắn màu vàng đạt hiệu suất 62% (650 mg, Rf = 0,63 trong hệ MeOH:DCM = 5:95); phản ứng khử nhóm nitro bằng SnCl2.2H2O tạo 2-amino-5-(dimethylamino)benzamid (8) là chất rắn màu xanh lá với hiệu suất 63% (350 mg, Rf = 0,31 trong hệ MeOH:DCM = 5:95 sau khi tinh chế qua cột sắc ký).
• Giai đoạn 3: Phản ứng ghép cặp giữa amin (8) và các acid (4a-c) với sự hiện diện của EDC.HCl, HOBt, TEA trong DMF tạo thành ba dẫn chất 2-methoxybenzamid thơm mục tiêu:
  • Dẫn chất 9a (-F): 95 mg, hiệu suất 76% (bảng tổng hợp ghi 75%), chất rắn màu cam nhạt, tonc = 229,1–230,3°C, Rf = 0,44.
  • Dẫn chất 9b (-Cl): 99 mg, hiệu suất 77%, chất rắn màu trắng, tonc = 232,5–234,0°C, Rf = 0,45.
  • Dẫn chất 9c (-Br): 102 mg, hiệu suất 72%, chất rắn màu xanh lơ, tonc = 235,1–236,1°C, Rf = 0,45.
• Kiểm tra tinh khiết và phổ cấu trúc: Cả ba chất đều cho một vết tròn gọn duy nhất trên bản mỏng silicagel và khoảng nóng chảy hẹp (chênh lệch 1–2°C). Dữ liệu phổ khối lượng MS hiển thị pic ion giả phân tử [M+H]⁺ tương ứng chính xác: m/z 438,4 đối với 9a (C24H24FN3O4); m/z 454,4 đối với 9b (C24H24ClN3O4); m/z 499,4 đối với 9c (C24H24BrN3O4). Phổ IR ghi nhận đầy đủ dao động đặc trưng của liên kết amid (νN-H ở 3473–3301 cm⁻¹; νC=O ở 1671–1634 cm⁻¹), liên kết C=C thơm (1607–1506 cm⁻¹), liên kết ether C-O (1261–1038 cm⁻¹) và các liên kết C-halogen. Phổ ¹H-NMR và ¹³C-NMR xác nhận số lượng proton, carbon, độ bội và hằng số tương tác J hoàn toàn trùng khớp với công thức cấu tạo dự kiến.
• Thử hoạt tính độc tế bào: Kết quả phương pháp MTT cho thấy hai dẫn chất 9a và 9b không thể hiện hoạt tính gây độc ở nồng độ tối đa thử nghiệm (IC50 > 128 µg/mL tương ứng > 292,6 µM với 9a và > 282,0 µM với 9b trên cả hai dòng tế bào A549 và MCF-7). Riêng dẫn chất 9c thể hiện hoạt tính ức chế với giá trị IC50 đạt 114,2 ± 4,43 µg/mL (229,14 ± 8,89 µM) trên dòng ung thư phổi A549 và 117,86 ± 0,75 µg/mL (236,50 ± 1,50 µM) trên dòng ung thư vú MCF-7. Chất chuẩn Ellipticin đạt IC50 lần lượt là 0,44 ± 0,02 µg/mL (1,78 ± 0,08 µM) trên A549 và 0,43 ± 0,02 µg/mL (1,75 ± 0,08 µM) trên MCF-7.

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 tập trung phân tích bản chất cơ chế phản ứng hóa học và tương quan cấu trúc - hoạt tính:

• Trong phản ứng alkyl hóa phenol, tác giả làm rõ việc sử dụng base yếu K2CO3 là phù hợp để tách chọn lọc proton của OH phenol (có tính acid yếu) tạo phenoxid có tính ái nhân cao tấn công SN2 vào dẫn chất benzyl clorid; tác nhân clorid được chọn thay vì iodid (kém bền, quá hoạt động) hay florid (liên kết C-F quá bền).
• Trong phản ứng oxy hóa Pinnick, acid hypoclorơ (HOCl) sinh ra như một sản phẩm phụ có thể làm phân hủy tác nhân NaClO2 và gây các phản ứng phụ clo hóa không mong muốn; do đó việc bổ sung H2O2 đóng vai trò là chất dập tắt HOCl theo phương trình: $HOCl + H_2O_2 \rightarrow HCl + O_2 + H_2O$, giúp phản ứng oxy hóa aldehyd đạt hiệu suất cao từ 85–92%.
• Đối với trung gian nhánh amin (8), tác giả phân tích cơ chế phản ứng thế ái nhân thơm của dimethylamin diễn ra thuận lợi ở nhiệt độ 110°C nhờ nhóm nitro ở vị trí ortho/para hút điện tử mạnh làm giảm mật độ điện tử tại vị trí liên kết C-Cl. Phản ứng khử nhóm nitro bằng SnCl2 trong môi trường HCl diễn ra êm dịu, tuy nhiên tạo ra nhiều phức thiếc trung gian nên việc kiềm hóa dung dịch sau phản ứng bằng Na2CO3 bão hòa đến pH = 9–10 là bước kỹ thuật bắt buộc để kết tủa hoàn toàn ion thiếc, tạo điều kiện thuận lợi cho việc chiết tách sản phẩm vào pha dicloromethan.
• Đối với phản ứng ghép nối amid, tác giả bàn luận chi tiết về cơ chế tạo O-acylisoure giữa EDC và acid carboxylic, vai trò của HOBt trong việc chuyển hóa chất này thành este hoạt hóa OBt nhằm tránh sự chuyển vị tạo N-acylure thụ động cũng như ức chế hiện tượng racemic hóa. Ưu điểm độ tan của dẫn xuất ure từ EDC trong nước tiếp tục được khẳng định như một yếu tố then chốt giúp tinh chế sản phẩm đạt độ sạch cao.
• Về kết quả sinh học, tác giả phân tích bước đầu mối liên quan cấu trúc - tác dụng (SAR): khi thay đổi nhóm thế halogen ở vị trí meta của vòng benzyl từ -F (9a), -Cl (9b) sang -Br (9c), hoạt tính gây độc tế bào tăng lên rõ rệt (chỉ có dẫn chất 9c mang nhóm thế brom thể hiện hoạt tính ức chế tế bào A549 và MCF-7). Halogen brom có bán kính nguyên tử lớn hơn và độ âm điện nhỏ hơn so với flo và clo, điều này gợi ý rằng kích thước nhóm thế và tính kỵ nước tại vị trí này đóng vai trò quan trọng trong việc tương tác với đích sinh học.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã tổng hợp thành công và xác định đầy đủ cấu trúc hóa học của ba dẫn chất 2-methoxybenzamid thơm mang khung kết nối benzamid thế halogen (9a, 9b, 9c) cùng các hợp chất trung gian qua quy trình tổng hợp đa bước. Dữ liệu thực nghiệm hóa lý và hoạt tính sinh học được tổng hợp chi tiết trong bảng dưới đây:

Ký hiệu	Nhóm thế R	Công thức phân tử	Khối lượng phân tử (g/mol)	Khối phổ m/z [M+H]⁺	Hiệu suất tổng hợp (%)	Nhiệt độ nóng chảy (°C)	Giá trị Rf (MeOH:DCM = 5:95)	IC50 trên dòng A549 (µg/mL)	IC50 trên dòng MCF-7 (µg/mL)
9a	-F	C24H24FN3O4	437,47	438,4	75%	229,1 – 230,3	0,44	> 128	> 128
9b	-Cl	C24H24ClN3O4	453,92	454,4	77%	232,5 – 234,0	0,45	> 128	> 128
9c	-Br	C24H24BrN3O4	498,38	499,4	72%	235,1 – 236,1	0,45	114,2 ± 4,43	117,86 ± 0,75
Ellipticin	(Đối chứng)	-	-	-	-	-	-	0,44 ± 0,02	0,43 ± 0,02

Đóng góp của khóa luận thể hiện ở các điểm sau:

1. Đã thiết kế và thực hiện thành công quy trình tổng hợp các dẫn chất mới kết hợp khung 2-methoxybenzamid và nhân 2-amino-5-(dimethylamino)benzamid qua 6 bước phản ứng với hiệu suất từng giai đoạn đạt từ khá đến cao (62% đến 92%).
2. Khẳng định cấu trúc phân tử của ba hợp chất mới một cách toàn diện và chính xác thông qua hệ thống phân tích phổ hiện đại gồm MS, FT-IR, ¹H-NMR (600 MHz) và ¹³C-NMR (126 MHz).
3. Cung cấp dữ liệu sàng lọc hoạt tính sinh học in vitro đầu tiên của dãy chất trên hai dòng tế bào ung thư người A549 và MCF-7; qua đó phát hiện dẫn chất 9c mang nhóm thế meta-brom có hoạt tính gây độc tế bào, mở ra định hướng tối ưu hóa cấu trúc cho các thế hệ dẫn chất tiếp theo.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận còn một số hạn chế gắn liền với phạm vi nghiên cứu thực nghiệm:

• Số lượng dẫn chất tổng hợp còn hạn chế (mới dừng lại ở 3 dẫn chất mang nhóm thế halogen -F, -Cl, -Br trên vị trí meta của vòng benzyl), chưa khảo sát các vị trí thế khác (ortho, para) hoặc các nhóm thế có tính chất điện tử và không gian khác nhau (nhóm đẩy điện tử, nhóm dị vòng).
• Hoạt tính ức chế tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được nhìn chung còn ở mức thấp đến trung bình; hai chất 9a và 9b chưa thể hiện tác dụng ở nồng độ 128 µg/mL; chất 9c có hoạt tính nhưng giá trị IC50 (114,2 µg/mL và 117,86 µg/mL) vẫn cao hơn rất nhiều so với chất đối chứng dương Ellipticin (khoảng 0,43–0,44 µg/mL).
• Nghiên cứu mới dừng lại ở thử nghiệm độc tính tế bào in vitro sơ bộ trên 2 dòng tế bào ung thư, chưa tiến hành đánh giá độ an toàn trên các dòng tế bào bình thường để xác định chỉ số chọn lọc, đồng thời chưa có điều kiện thực nghiệm để xác định đích tác dụng phân tử cụ thể (như ức chế HSP 90, VEGFR hay cảm ứng căng thẳng lưới nội chất ERS).

Hướng nghiên cứu tiếp theo được mở rộng từ văn bản:

• Mở rộng thư viện hóa học bằng cách tổng hợp thêm các dẫn chất 2-methoxybenzamid mới mang các nhóm thế đa dạng trên vòng thơm nhằm xây dựng mối liên quan cấu trúc - tác dụng (SAR) toàn diện.
• Sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư khác nhau (như đại trực tràng HCT-116, gan HepG2, tuyến tụy PANC-1) và đánh giá độc tính tế bào trên dòng tế bào người bình thường.
• Triển khai các thử nghiệm sinh học phân tử chuyên sâu (như Western blot, đo hoạt tính enzym, thử nghiệm nhuộm huỳnh quang tế bào chết) để làm sáng tỏ cơ chế tác động kháng ung thư của dẫn chất 9c.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Công nghệ Hóa dược, Hóa hữu cơ và Dược học thực nghiệm đang thực hiện các đề tài về tổng hợp hóa dược và sàng lọc hoạt tính sinh học in vitro.
• Các nhà nghiên cứu quan tâm đến quy trình tổng hợp tạo liên kết amid khó bằng hệ tác nhân carbodiimid (EDC/HOBt), kỹ thuật oxy hóa Pinnick có mặt H2O2 để loại bỏ HOCl, hoặc quy trình khử chọn lọc nhóm nitro bằng muối thiếc(II) và phương pháp xử lý tủa ion thiếc ở pH kiềm.
• Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình sàng lọc độc tính tế bào bằng phương pháp MTT chuẩn hóa trên đĩa 96 giếng và bộ dữ liệu phổ thực nghiệm (MS, IR, ¹H-NMR, ¹³C-NMR) của các khung cấu trúc benzamid đa chức.

Câu hỏi thường gặp

1. Khóa luận đã tổng hợp thành công bao nhiêu dẫn chất mục tiêu và cấu trúc của chúng khác nhau ở điểm nào?
Khóa luận đã tổng hợp thành công 3 dẫn chất 2-methoxybenzamid thơm mục tiêu, ký hiệu là 9a, 9b và 9c. Cả ba hợp chất đều có chung khung cấu trúc N-(2-carbamoyl-4-(dimethylamino)phenyl)-2-methoxybenzamid liên kết với nhóm benzyl oxy ở vị trí số 4, chỉ khác biệt duy nhất ở nguyên tử halogen thế tại vị trí meta (vị trí số 3) của vòng benzyl: dẫn chất 9a mang nhóm thế flo (-F), 9b mang nhóm thế clo (-Cl) và 9c mang nhóm thế brom (-Br).

2. Tại sao tác giả lựa chọn tác nhân ghép nối EDC.HCl kết hợp với HOBt cho phản ứng tạo liên kết amid thay vì các carbodiimid khác như DCC hay DIC?
Phản ứng ghép nối amid sử dụng carbodiimid tạo ra sản phẩm phụ là dẫn chất ure tương ứng. Diisopropyl ure (tạo ra từ DIC) tan nhiều trong dicloromethan, dicyclohexyl ure (tạo ra từ DCC) rất khó tan trong nước và dung môi hữu cơ gây khó khăn cho việc tinh chế. Trong khi đó, dimethylaminopropyl-3-ethylure sinh ra từ EDC.HCl tan rất tốt trong nước, cho phép loại bỏ hoàn toàn khỏi khối phản ứng chỉ bằng thao tác rửa chiết với nước và dung dịch muối bão hòa. Việc bổ sung HOBt giúp chuyển hóa chất trung gian O-acylisoure thành este hoạt hóa OBt, vừa ngăn chặn phản ứng phụ tạo N-acylure không hoạt động, vừa hạn chế hiện tượng racemic hóa và nâng cao hiệu suất phản ứng lên 72–77%.

3. Vai trò của H2O2 trong phản ứng oxy hóa Pinnick tổng hợp các dẫn chất acid trung gian (4a-c) là gì?
Trong phản ứng oxy hóa Pinnick sử dụng tác nhân NaClO2 trong môi trường đệm NaH2PO4, quá trình oxy hóa aldehyd thành acid carboxylic sẽ đồng thời sinh ra sản phẩm phụ là acid hypoclorơ (HOCl). Phân tử HOCl này có thể phản ứng gây phân hủy tác nhân chính NaClO2 và gây ra các phản ứng phụ clo hóa vào vòng thơm. Việc bổ sung H2O2 vào môi trường phản ứng đóng vai trò chất dập tắt, phản ứng với HOCl sinh ra HCl, O2 và H2O, loại bỏ hoàn toàn tác nhân phụ gây hại mà không cản trở quá trình oxy hóa chính, giúp phản ứng đạt hiệu suất cao 85–92%.

4. Dẫn chất nào thể hiện hoạt tính kháng ung thư trong thử nghiệm sinh học in vitro và số liệu cụ thể là bao nhiêu?
Trong ba dẫn chất đem thử nghiệm bằng phương pháp MTT, chỉ có dẫn chất 9c (mang nhóm thế -Br) thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, với giá trị IC50 đạt 114,2 ± 4,43 µg/mL (tương ứng 229,14 ± 8,89 µM) trên dòng tế bào ung thư phổi A549 và 117,86 ± 0,75 µg/mL (tương ứng 236,50 ± 1,50 µM) trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7. Hai dẫn chất 9a (-F) và 9b (-Cl) không thể hiện hoạt tính ở dải nồng độ thử nghiệm (IC50 > 128 µg/mL trên cả hai dòng tế bào).

5. Hoạt tính kháng ung thư của các dẫn chất tổng hợp được so sánh như thế nào với chất chuẩn đối chứng?
Hoạt tính của dẫn chất có hoạt tính tốt nhất trong nghiên cứu là 9c (IC50 = 114,2 µg/mL trên A549 và 117,86 µg/mL trên MCF-7) thấp hơn đáng kể so với chất đối chứng dương Ellipticin. Cụ thể, Ellipticin thể hiện hoạt tính gây độc tế bào rất mạnh với IC50 đạt 0,44 ± 0,02 µg/mL (1,78 ± 0,08 µM) trên dòng tế bào A549 và 0,43 ± 0,02 µg/mL (1,75 ± 0,08 µM) trên dòng tế bào MCF-7.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Phương Thảo đã hoàn thành đầy đủ hai mục tiêu đề ra thông qua việc thiết lập quy trình tổng hợp 6 bước để tạo thành ba dẫn chất mới 2-methoxybenzamid thơm (9a-c) với hiệu suất phản ứng đạt từ 72% đến 77%. Cấu trúc của toàn bộ các sản phẩm tổng hợp đã được xác minh rõ ràng thông qua tập hợp dữ liệu phổ chuẩn mực bao gồm MS, FT-IR, ¹H-NMR và ¹³C-NMR. Kết quả đánh giá độc tính tế bào in vitro bằng phương pháp MTT trên hai dòng tế bào ung thư người A549 và MCF-7 đã ghi nhận dẫn chất 9c mang nhóm thế meta-brom có tác dụng ức chế tế bào với IC50 lần lượt là 114,2 µg/mL và 117,86 µg/mL, đóng vai trò là dữ liệu thực nghiệm nền tảng cho việc tiếp tục thiết kế và tối ưu hóa cấu trúc phân tử thuốc chống ung thư trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 1. Tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất có chứa khung 2- methoxybenzamid Các dẫn chất 2-methoxybenzamid hay ortho-anisamid là hợp chất chứa nhóm amid đã được báo cáo là có các tác dụng sinh học đa dạng: chống nôn, an thần và chống loạn thần, chống khó tiêu, chống trầm cảm [5] và chống tăng sinh tế bào ung thư [15]. Mặc dù cơ chế chính xác về hoạt động chống ung thư của nó có thể chưa được tìm hiểu đầy đủ, nhưng đã có các nghiên cứu cho thấy rằng 2-methoxybenzamid có thể chống tăng sinh tế bào ung thư. Năm 2021, Chinyu Sun và các cộng sự đã xây dựng và tổng hợp một nhóm các dẫn chất có chứa khung 2-methoxybenzamid (dãy chất Ia, Ib) làm chất ức chế đường dẫn truyền Hedgehog (Hh) - con đường liên quan đến sự phát triển của nhiều loại ung thư.

Sự kích hoạt bất thường của đường dẫn Hh có thể tăng cường sự hình thành và lan rộng của các khối u ác tính như ung thư biểu mô tế bào đáy (BCC), u tủy sọ (MB), ung thư tụy, ung thư đại trực tràng và ung thư bạch cầu. Trong xét nghiệm báo cáo Gli-luc, nhóm chất ức chế này thể hiện phạm vi giá trị IC50 dưới micromol, biểu thị rằng bộ khung 2- methoxybenzamid làm chất kết nối có lợi cho việc ức chế con đường Hh. Trong đó, đáng chú ý nhất là hợp chất (Ic) có khả năng ức chế con đường Hh mạnh mẽ nhất với giá trị IC50 = 0,03 μM và khả năng ức chế con đường Hh của hợp chất (Ic) tương đương với khả năng ức chế của hợp chất vismodegib được sử dụng làm chất đối chứng dương. Cơ sở của sự ức chế này được cho là do sự ức chế Smo (Protein Smoothened) - thành phần chính của đường truyền tín hiệu Hh.

Đặc biệt, hợp chất Ic vẫn giữ được hiệu lực ức chế đối với Smo đột biến, hơn nữa, nó còn thể hiện hoạt tính chống tăng sinh tốt hơn đối với các tế bào Daoy kháng vismodegib [37]. (Ia) (Ib) 2 (Ic) IC50 = 0,03 μM Carmine Stolfi và các cộng sự đã phát triển một số dẫn chất của mesalamin - một chất đã được nghiên cứu thực nghiệm cho thấy có thể ức chế con đường duy trì sự phát triển của tế bào CRC (ung thư đại trực tràng) và bước đầu đánh giá tác dụng của các dẫn chất này. Trong đó, hợp chất 2-methoxy-5-amino-N-hydroxybenzamid (II) cho thấy tác dụng ức chế sự tăng sinh và sống sót của tế bào CRC mạnh hơn gấp 10 lần so với mesalamin và cản trở sự phát triển của CRC in vivo mà không làm thay đổi sự tăng sinh của tế bào ruột bình thường nên có thể giúp thiết kế các chương trình phòng ngừa ung thư đại trực tràng mới. Cơ chế chống tăng sinh được đưa ra là hợp chất (II) kích thích ERS (căng thẳng lưới nội chất) và điều chỉnh các protein liên quan đến ERS.

Cảm ứng ERS là một trong những cơ chế chính mà qua đó các tác nhân khác nhau phát huy hoạt động chống ung thư. ERS xảy ra khi chức năng của lưới nội chất bị rối loạn, dẫn đến sự tích tụ các protein không gấp nếp hoặc gấp nếp sai trong lưới nội chất. Để khôi phục lại sự cân bằng, các tế bào kích hoạt phản ứng mở xoắn protein (UPR) tác động theo vai trò kép: vừa có tính thích nghi vừa có tính gây chết các tế bào khối u [44], [43]. Do đó, sơ bộ thấy rằng khả năng (II) có tác dụng ở liều thấp hơn mesalamin có thể liên quan đến việc kích hoạt con đường ERS trong tế bào CRC [35], [36].

Năm 2014, Teng Shao và các cộng sự đã tổng hợp các dẫn chất 3-sulfonamino-5- (quinazolin-6-yl hoặc quinolin-6-yl)benzamid mang các nhóm thế khác nhau ở vị trí số 2 (dãy chất III). Kết quả cho thấy các hợp chất có amino ở R1 và methoxy ở R3 thể hiện hoạt tính chống lại bốn dòng tế bào ung thư A549, HCT-116, U-87 MG và KB, đặc biệt là chống lại HCT-116. Phân tích SAR của các hợp chất cho thấy methoxy ở vị trí thứ 2 của vòng benzamid có thể cải thiện hoạt tính chống tăng sinh tế bào ung thư với IC50 ở khoảng μM. 3 Trong đó hợp chất (IIIa) có tác dụng chống tăng sinh với IC50 = 0,54±0,28 μM trên HCT- 116 có thể so sánh với hợp chất của chất ức chế kép PI3K và mTOR là BEZ235.

Kết quả xét nghiệm hoạt tính enzyme PI3K và mTOR và kết quả xét nghiệm Western blot của hợp chất (IIIa) cho thấy rằng (IIIa) có thể ức chế con đường PI3K/AKT/mTOR. Hơn nữa, hợp chất (IIIa) cũng thể hiện tác dụng ức chế sự phát triển của khối u ở mô hình xenograft U- 87 MG trên chuột đã được thiết lập khi theo dõi về sự thay đổi thể tích khối u. Trên nhóm chuột được thử nghiệm bằng hợp chất (IIIa) ở mức liều 20 mg/kg và 50 mg/kg cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của khối u lần lượt là 30,05% và 57,20% so với nhóm chứng [32]. (III) (IIIa) R2= 4-FPh R1 = NH2; NHMe; N2Me; OMe IC50= 4,32 ± 1,52 μM (A549) R2 = 4-FPh; 4-ClPh; 4-MePh; 2,4-diFPh 0,54 ± 0,28 μM (HCT-116) R3 = OMe; H; Cl 1,37 ± 0,40 μM (U87 MG) 4,45 ± 2,82 μM (KB) Năm 2022, Jian-Fei Bai và các cộng sự đã tổng hợp hơn 50 dẫn chất tương tự FK866 - một chất ức chế NAMPT nổi tiếng với hoạt tính chống ung thư, tuy nhiên đã thất bại trong thử nghiệm lâm sàng giai đoạn II.

Hoạt tính in vitro được thử nghiệm đầu tiên ở tế bào Jurkat (bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính tế bào T) và đối với các hợp chất có hoạt tính cao nhất (IC50 < 10 nM) được thử trên các dòng tế bào ung thư tuyến tụy: MIA PaCa-2, BxPC-3 và PANC-1. Trong đó, dẫn chất ortho-methoxybenzamid (IVa) cho thấy khả năng ức chế được cải thiện đối với cả tế bào MIA PaCa-2 và PANC-1 so với FK866 - chất đối chứng dương. Hợp chất (IVa) đặc biệt vì các dẫn chất para- và meta-methoxy tương tự cho kết quả hoạt tính kém hơn nhiều. Dẫn chất 4 2,6-dimethoxybenzamid (IVb) có tác dụng ức chế tăng trưởng tốt hơn nhiều đối với các dòng tế bào ung thư tuyến tụy MIA PaCa-2 (IC50 = 0,5 nM) và BxPC-3 (IC50 = 0,004 nM) so với FK866.

Kết quả cho thấy sự methyl hóa nhóm hydroxyl ở vị trí số 2 (OMe-DHMEQ) (Vb) không làm giảm hoạt động ức chế trong khi sự có mặt của nhóm hexyl hay phenyl ở vị trí này làm giảm hoạt tính khi so sánh với chất đối chứng dương là DHMEQ (Va) - một chất ức chế NF-κB đã được chứng minh trước đó. NF-κB là một yếu tố phiên mã cảm ứng, kích thích sự biểu hiện của các cytokin gây viêm như IL-1, IL-6, IL- 8, TNF-α và các protein ức chế hiện tượng chết tế bào theo chương trình. Do đó ức chế NF- κB có thể ngăn chặn sự sống sót và tăng trưởng của các tế bào ung thư [10]. (V) (Va) R= OH (DHMEQ) (Vb) R= OMe (OMe-DHMEQ) 5 Dựa trên nghiên cứu của Umezawaa, Riko Nakagawa và các cộng sự đã tổng hợp hợp chất N-(7,8-dioxo-7,8-dihydronaphthalen-1-yl)-2-methoxybenzamid (MBNQ) (VI) trong đó 1,2-naphthoquinon (2-NQ) thay thế cho phần epoxy-quinon của OMe-DHMEQ.

Kết quả đánh giá sinh học cho thấy (VI) có hoạt động ức chế yếu NF-κB và không được tăng cường so với 2-NQ. Tuy nhiên việc đưa thêm nhóm 2-methoxybenzamid vào 2-NQ giúp gây độc tính tế bào mạnh hơn ở tế bào A549 bằng cách gây ra hiện tượng chết tế bào theo chương trình chống lại các tế bào ung thư phổi. Bằng chứng là 10 µM (VI) làm giảm đáng kể khả năng tồn tại của các tế bào A549 trong khi 2-NQ không biểu hiện độc tính gây độc tế bào ở nồng độ này. Nhóm methoxy salicylat cũng được chứng minh đã làm giảm độc tính thành công đối với các tế bào bình thường và tăng cường hoạt động chống ung thư phổi.

Ngoài ra, hoạt động chống ung thư của (VI) chống lại nhóm 60 dòng tế bào ung thư ở người đã được Chương trình Trị liệu Phát triển tại Viện Ung thư Quốc gia (NCI, Hoa Kỳ) kiểm tra. Những phát hiện thu được cho thấy (VI) có hoạt tính cao chống lại một số tế bào bạch cầu cũng như tế bào ung thư buồng trứng/thận [28]. (VI) Năm 2021, nhóm nghiên cứu của Alaaeldin M. Galal và Khaled Mahmoud đã công bố nghiên cứu tổng hợp 20 dẫn chất mang khung 2-methoxybenzamid kết hợp với các dẫn chất sulfonyl-α-L-amino acid (dãy chất VII).

Các dẫn chất này được thử nghiệm in vitro về hoạt tính chống tăng sinh trên 4 dòng tế bào: ung thư vú (MCF-7), ung thư biểu mô tế bào gan (HepG2), ung thư ruột kết (HCT-116), dòng tế bào tuyến tụy (PaCa2) và so sánh với dòng tế bào thường, trong đó doxorubicin được sử dụng làm chất đối chứng dương. Kết quả cho thấy các hợp chất (VIIa), (VIIb), (VIIc) lần lượt là các dẫn chất có hoạt tính mạnh nhất chống lại các dòng tế bào HepG2, MCF-7 và PaCa2 với IC50 = 51,9; 54,2 và 59,7 µg/mL tương ứng. Cơ chế gây độc tế bào được đề xuất là thông qua liên kết với vị trí gắn colchicin của tubulin bằng cách ngăn chặn sự phân chia tế bào ở pha G2/M [15]. Tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất có chứa khung 2- aminobenzamid Khung 2-aminobenzamid hay anthranilamid được lý luận rằng có liên kết nội phân tử mạnh giữa nhóm chức amin và nhóm chức carbonyl của amid để tạo thành một vòng giả sáu cạnh có thể bắt chước vòng phthalazin [14].

2-aminobenzamid đã được sử dụng rộng rãi như một khung đặc quyền để tạo ra các phân tử thuốc khác nhau [18], [9], [6]. Hơn nữa, nhiều dẫn chất có chứa 2-aminobenzamid trước đây đã được báo cáo là chất chống ung thư [18], [17], [9]. Hợp chất AAL993 (2-((4-pyridyl)methyl)amino-N-(3-(trifluoromethyl)phenyl) benzamid) là một chất ức chế chọn lọc và mạnh mẽ các VEGFR, có đặc tính chống khối u mạnh, đặc tính dược lý tốt và sinh khả dụng qua đường uống tốt [24], [25]. Các gốc 2-aminobenzamid có trong các cấu trúc này được coi là nguyên nhân tạo nên đặc tính chống ung thư mạnh.

7 Năm 2013, Jianzhen Liu và các cộng sự đã tổng hợp 17 dẫn chất 2-aminobenzamid được thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư ruột kết ở người (HCT-116) và dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú ở người (MDA-MB-231). Trong đó, hợp chất (VIII) có hoạt tính gây độc tế bào tốt nhất trên cả hai dòng tế bào HCT-116 và MDA-MB-231 với giá trị IC50 lần lượt là 14,60±3,54 và 13,86±1,44 μmol/L và cho thấy hoạt động chống tăng sinh được cải thiện trên các tế bào MDA-MB-231 và HCT-116 so với chất đối chiếu AAL993 (19,11±0,86 μmol/L trên HCT-116 và >80 μmol/L trên MDA-MB-231).