Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ hóa học với đề tài "Nghiên cứu tổng hợp các nanogel mang thuốc đa chức năng trên cơ sở dẫn xuất chitosan−Pluronic định hướng ứng dụng điều trị ung thư" (Mã số: 9 44 01 14) được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Nguyễn Văn Toàn tại Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Trần Ngọc Quyển và TS. Lương Thị Bích (bảo vệ năm 2023 tại Thành phố Hồ Chí Minh).

Luận án thuộc chuyên ngành Hóa học, tiếp cận theo hướng thực nghiệm định lượng kết hợp hóa tổng hợp hữu cơ - polymer và đánh giá hoạt tính sinh học in vitro.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Theo hệ thống phân loại sinh dược học của Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA), hơn 75% các hoạt chất nghiên cứu thuốc hiện nay có tính tan kém trong môi trường dịch sinh lý, gây hạn chế khả năng hấp thu và vận chuyển vào tuần hoàn máu. Trong hóa trị liệu ung thư, các dược chất phân tử nhỏ như paclitaxel hay hợp chất tự nhiên như curcumin có độ tan rất thấp, thời gian lưu hành ngắn, chuyển hóa nhanh và phân bố không đặc hiệu lên cả mô lành lẫn mô bệnh, dẫn đến độc tính toàn thân nghiêm trọng.

Việc sử dụng các hệ mang kích thước nano, đặc biệt là nanogel polymer lưỡng tính, cho phép khắc phục hạn chế về độ tan nhờ cấu trúc lõi kỵ nước nạp thuốc và vỏ ưa nước phân tán trong nước. Tuy nhiên, các công trình trước đây về nanogel trên cơ sở chitosan ghép Pluronic hầu như chỉ tập trung khảo sát riêng lẻ trên Pluronic F127, trong khi chưa có nghiên cứu so sánh hệ thống với các loại Pluronic có độ cân bằng ưa nước - ưa béo (HLB) và chiều dài khối kỵ nước poly(propylene oxide) (PPO) khác nhau. Đồng thời, việc liên hợp các phối tử hướng đích như acid folic và biotin lên hệ nanogel lai hóa chitosan−Pluronic trước đó mới chỉ được thực hiện trên từng polymer đơn lẻ chứ chưa từng được khảo sát trên hệ polymer ghép chitosan−Pluronic.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định hai mục tiêu cụ thể:

  1. Điều chế và đánh giá các đặc tính của nanogel trên cơ sở chitosan ghép với các loại Pluronic có giá trị HLB khác nhau từ kỵ nước đến ưa nước, nhằm xác định loại Pluronic tạo nanogel có hiệu quả nang hóa curcumin cao nhất.
  2. Thiết kế các hệ thống phân phối thuốc nanogel trên cơ sở chitosan−Pluronic tương ứng với loại Pluronic tốt nhất tìm được, liên hợp với các phối tử nhắm mục tiêu là acid folic và biotin mang thuốc paclitaxel ứng dụng trong điều trị ung thư vú.

Nội dung nghiên cứu (đánh số theo văn bản)

  1. Tổng hợp hệ phân phối thuốc chitosan ghép Pluronic với 4 loại Pluronic L61, P123, F127 và F68. Đánh giá cấu trúc hóa học, đặc tính hóa lý, khả năng tải và giải phóng curcumin, khả năng tương thích sinh học, khả năng ức chế tế bào ung thư vú MCF-7 của hệ chitosan−Pluronic mang curcumin.
  2. Tổng hợp hệ phân phối thuốc chitosan−Pluronic liên hợp với tác nhân hướng đích acid folic và biotin. Đánh giá cấu trúc hóa học, đặc tính hóa lý, khả năng tải và giải phóng paclitaxel, khả năng tương thích sinh học, khả năng ức chế tế bào ung thư vú MCF−7 của hệ chitosan−Pluronic hướng đích mang paclitaxel.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Polysaccharide tự nhiên (chitosan), các copolymer ba khối Pluronic (L61, P123, F127, F68), các phối tử hướng đích (folic acid, biotin), cùng hai hoạt chất kỵ nước mô hình là curcumin (CUR) và paclitaxel (PTX).
  • Phạm vi không gian và thực nghiệm: Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp hóa học, phân tích cấu trúc, đặc tính hóa lý và thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP.HCM, Đại học Bách khoa TP.HCM và Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương.
  • Phạm vi sinh học: Đánh giá độc tính tế bào và khả năng hấp thu nội bào in vitro trên dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú người MCF-7 và tế bào nguyên bào sợi lành (fibroblast).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước được tác giả điểm luận

Tác giả hệ thống hóa các thành tựu và giới hạn của các hệ phân phối thuốc nano:

  • Liposome: Alec Bangham phát hiện năm 1960. Các công thức được FDA chấp thuận gồm Doxil (liposome PEG hóa nạp doxorubicin, chấp thuận năm 1995), Myocet và DaunoXome.
  • Dendrimer: Jain cùng cộng sự (2014) tổng hợp dendrimer poly-L-lysine liên hợp folate mang doxorubicin giải phóng phụ thuộc pH, đạt nồng độ trong khối u gấp 121,5 lần sau 24 giờ so với doxorubicin tự do.
  • Hạt vô cơ và chấm lượng tử: Prusty và Swain (2018) dùng hydrogel polyacrylamide/dextran liên kết hạt nano bạc mang ornidazole; Marcu và cộng sự (2013) dùng hạt oxit sắt nhiệt phân laser phủ Violamycine B1 ức chế tế bào MCF-7; Cai và cộng sự (2016) tổng hợp chấm lượng tử ZnO nhạy pH phủ PEG và hyaluronic acid mang doxorubicin nhắm đích CD44; Olerile và cộng sự (2017) kết hợp chấm lượng tử và paclitaxel trong chất mang lipid nano đạt hiệu quả bao bọc 80,11% và ức chế khối u 77,7%.
  • Vật liệu nanogel: Vinogradov (1999) lần đầu giới thiệu nanogel từ PEG và polyethylenimine (PEI) liên kết ngang. Matyjaszewski và cộng sự (2007) chế tạo nanogel liên kết ngang disulfide phân hủy bởi glutathione. Vinogradov và cộng sự (2014) phát triển nanogel PEG-PEI cation phân phối oligonucleotide gen mdr1. Akiyoshi và cộng sự (1998, 2010) phát triển nanogel pullulan-cholesterol tạo phức tự nhiên với protein; Fahmy và cộng sự (2012) dùng nanogel liposome kết hợp cyclodextrin mang đồng thời chất ức chế TGF-β và cytokine IL-2; Desale và cộng sự (2013) dùng nanogel PEG-PGlu-Pphe đồng phân phối cisplatin (15%) và paclitaxel (9%).
  • Dẫn xuất Chitosan và gắn phối tử: Alex (2011) và Zheng (2012) gắn galactose lên chitosan bằng lactobionic acid qua xúc tác EDC/NHS; Xu (2013), Song (2013), Li (2015), Liu (2013) liên hợp acid folic lên nhóm amine của chitosan; Liu (2010), Yao (2013), Tian (2014) ghép biotin lên chitosan để tăng hấp thu trên các tế bào ung thư MCF-7 và HeLa.
  • Copolymer khối Pluronic: Phân loại thành 4 nhóm theo HLB và chiều dài khối PPO:
    • Nhóm 1 (HLB 20–29, ưa nước): Butt cùng cộng sự (2012) phối trộn F127 và TPGS mang doxorubicin; Meng cùng cộng sự (2020) chế tạo micelle F127/TPGS-Fc nhạy điện; Li cùng cộng sự (2013) gắn peptide PV7 lên F127; Zhang cùng cộng sự (2011) phối trộn F127 và P123 gắn acid folic mang paclitaxel (tăng sinh khả dụng in vivo gấp 3 lần); Russo và cộng sự (2016) phối trộn F127 và P123 gắn biotin mang niclosamide; Mei cùng cộng sự (2009) phối trộn F68 với PCL; Song cùng cộng sự (2014) gắn cholesterol vào F68 làm giảm giá trị CMC 400 lần; Wang và cộng sự (2012) dùng F108 phân tán ống nano carbon.
    • Nhóm 2 (HLB < 20, PPO < 30): Magalhães và cộng sự (2018) dùng Pluronic L64/PEI mang gen miR-145; Li và cộng sự (2015) tổng hợp copolymer khối PLLA-L35-PLLA mang docetaxel và oxaliplatin.
    • Nhóm 3 (HLB < 20, PPO 30–60): Pelosi cùng cộng sự (2019) phối trộn Pluronic P85 và F127-biotin mang đồng thời temozolomide và verteporfin; Niu cùng cộng sự (2020) dùng P105 gắn glucose và folic acid mang doxorubicin nhắm đích não; Zheng và cộng sự (2019) dùng pullulan methacrylate liên kết ngang với Pluronic L61 gắn orthoester (L61-MOE) nhạy pH.
    • Nhóm 4 (HLB < 20, PPO > 60): Wang cùng cộng sự (2017) thiết kế nanogel PEG-SS-P123-PEI phản ứng oxy hóa khử mang paclitaxel và siRNA; Cheng cùng cộng sự (2020) tổng hợp P123 liên kết α-tocopherol succinate (α-TOS) qua cầu nối orthoester; Lim cùng cộng sự (2018) phối trộn Pluronic L121 và F127 gắn cRGD mang docetaxel.
  • Hệ lai ghép Chitosan - Pluronic: Park cùng cộng sự (2008) ester hóa một đầu F127 ghép lên chitosan bằng EDC/NHS mang indomethacin; Nguyen cùng cộng sự (2016) hoạt hóa 2 đầu F127 bằng NPC, khóa 1 đầu bằng 3-amino-1-propanol rồi ghép lên chitosan mang curcumin; Zhang cùng cộng sự (2010) ester hóa 2 đầu F127 nối oligochitosan mang ethidium bromide nhạy nhiệt; Xu và cộng sự (2021) ghép Pluronic L61 qua liên kết orthoester lên chitosan mang doxorubicin; Kim và cộng sự (2010) dùng phản ứng Michael giữa Pluronic diacrylate và chitosan acrylate.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết

Các công trình trước đây chủ yếu dừng lại ở việc ghép Pluronic F127 đơn lẻ lên chitosan hoặc liên kết ngang hai đầu mạch gây khó kiểm soát kích thước hạt. Luận án chọn giải quyết khoảng trống: (1) Khảo sát so sánh có hệ thống phương pháp ghép một đầu mạch của 4 loại Pluronic đại diện cho các nhóm HLB khác nhau (L61, P123, F127, F68) lên chitosan để làm rõ mối quan hệ giữa bản chất polymer, giá trị HLB, giá trị CMC và khả năng tải dược chất kỵ nước; (2) Thiết kế, tổng hợp cấu trúc nanogel chitosan ghép Pluronic P123 có gắn định hướng các phối tử phân tử nhỏ (folic acid, biotin) ở các vị trí mạch khác nhau (trên mạch chitosan hoặc trên đầu mạch Pluronic) nhằm tăng cường hiệu quả hướng đích chủ động đối với tế bào ung thư vú.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

  • Lý thuyết tự lắp ráp micelle và hình thành nanogel: Dựa trên cân bằng ưa nước - kỵ nước của copolymer lưỡng tính. Trong dung dịch nước, khi nồng độ vượt nồng độ micelle tới hạn (CMC) và nhiệt độ đạt nhiệt độ micelle tới hạn (CMT), các khối PPO kỵ nước co cụm tạo lõi nạp thuốc, các khối PEO ưa nước và mạch chitosan tích điện dương tạo vỏ phân tán ổn định.
  • Cơ chế phân phối thuốc: Kết hợp hướng đích thụ động thông qua hiệu ứng tăng cường tính thấm và lưu giữ (EPR - Enhanced Permeability and Retention) do kích thước hạt nano dưới 200 nm, và hướng đích chủ động qua tương tác đặc hiệu giữa phối tử (acid folic, biotin) với các thụ thể biểu hiện quá mức trên màng tế bào ung thư (FRα và thụ thể biotin), thúc đẩy quá trình nhập bào qua thụ thể.
  • Cơ chế ức chế kháng đa thuốc (MDR): Khối PPO dài của Pluronic P123 có khả năng làm tiêu hao ATP nội bào, ức chế hoạt động bơm tống thuốc của màng tế bào ung thư (P-glycoprotein/P-gp).

Phương pháp tổng hợp hóa học

Quy trình tổng hợp gồm các phản ứng kiểm soát vị trí:

  1. Hoạt hóa Pluronic: Sử dụng 4-nitrophenyl chloroformate (NPC) để chuyển đổi hai nhóm hydroxyl (-OH) tận cùng của Pluronic thành dẫn xuất hoạt hóa NPC−Pluronic−NPC.
  2. Đơn chức hóa một đầu mạch Pluronic: Cho NPC−Pluronic−NPC phản ứng với 3-amino-1-propanol (Ami) theo tỷ lệ xác định để thu được dẫn xuất NPC−Pluronic−OH (khóa 1 đầu bằng liên kết carbamate, đầu còn lại giữ nhóm NPC hoạt động).
  3. Ghép lên chitosan: Cho NPC−Pluronic−OH phản ứng với nhóm amine tự do (-NH2) trên mạch chitosan tạo liên kết urethane/carbamate bền vững, thu được copolymer ghép CS−Pluronic.
  4. Tổng hợp các hệ gắn phối tử:
    • Hệ FA−CS−P123: Acid folic được hoạt hóa bằng EDC/NHS và ghép trực tiếp lên nhóm amine còn lại trên mạch chitosan của dẫn xuất CS−P123.
    • Hệ CS−P123−FA: Nhóm carboxyl của acid folic được bảo vệ/biến tính bằng ethylenediamine có nhóm bảo vệ BOC thành BOC−FA−NH2; sau đó cho phản ứng với một đầu của NPC−P123−NPC tạo BOC−FA−P123−NPC; loại bỏ nhóm BOC bằng acid trifluoroacetic rồi cho đầu NPC còn lại phản ứng với nhóm amine của chitosan.
    • Hệ CS−P123−BIO: Biotin được chuyển thành dẫn xuất amine (BIO−NH2) bằng ethylenediamine; phản ứng với NPC−P123−NPC tạo NPC−P123−BIO; sau đó ghép đầu NPC còn lại lên nhóm amine của chitosan.

Phương pháp phân tích đặc tính cấu trúc và hóa lý

  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$): Đo trên máy BRUKER ADVANCE – 500 MHz (Đức) tại Viện Hóa học, sử dụng các dung môi $\text{CDCl}_3$, $\text{D}_2\text{O}$ và $\text{DMSO-d}_6$, chất chuẩn nội TMS.
  • Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR): Đo trên máy PerkinElmer Frontier tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, quét trong dải số sóng $4000 - 400\text{ cm}^{-1}$ (3601 điểm đo), mẫu ép viên KBr (5–10 $\mu\text{g}$ mẫu/1 g KBr).
  • Phân tích nhiệt vi sai (DSC) và Phân tích nhiệt trọng lượng (TGA): Đo trên máy Setaram Labsys Sta (Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP.HCM) và Mettler Toledo (Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng), quét từ $30^\circ\text{C}$ đến $450^\circ\text{C}$ với tốc độ gia nhiệt $10^\circ\text{C/phút}$, khối lượng mẫu khoảng 10 mg.
  • Xác định nồng độ micelle tới hạn (CMC): Đo bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis (Shimadzu UV-2401) dựa trên sự hòa tan và chuyển hóa giữa ion triiodide ($\text{I}_3^-$) và iod phân tử ($\text{I}_2$) trong môi trường kỵ nước của micelle ở bước sóng đặc trưng.
  • Kích thước hạt (DLS) và Thế zeta: Đo trên máy HORIBA SZ-100-S2 (Nhật Bản) tại góc tán xạ $90^\circ$, mẫu phân tán trong nước khử ion (DI) nồng độ 1000 ppm ở $25^\circ\text{C}$ và $37^\circ\text{C}$ (thực hiện lặp lại 3 lần).
  • Hình thái học hạt nanogel: Quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) JEM 1010 (JEOL, Nhật Bản).

Phương pháp nạp thuốc, giải phóng và thử nghiệm sinh học

  • Nang hóa thuốc: Thực hiện bằng phương pháp hydrate hóa màng mỏng (thin film hydration) đối với curcumin và paclitaxel. Hiệu suất nang hóa (EE%) và tỷ lệ tải thuốc (DL%) được định lượng bằng quang phổ UV-Vis.
  • Khảo sát giải phóng thuốc in vitro: Sử dụng phương pháp thẩm tích màng ở $37^\circ\text{C}$ trong dung dịch đệm phosphat (PBS) tại hai môi trường pH: pH 7,4 (mô phỏng dịch sinh lý tuần hoàn máu) và pH 5,0 (mô phỏng môi trường acid nội bào lysosome/khối u). Dữ liệu được khớp vào các mô hình động học giải phóng.
  • Đánh giá độ ổn định bảo quản: Mẫu nanogel đông khô được lưu giữ ở nhiệt độ phòng và phân tích lại kích thước hạt, thế zeta sau các khoảng thời gian.
  • Độc tính tế bào và khả năng hấp thu nội bào: Đánh giá tính tương thích sinh học trên tế bào nguyên bào sợi (fibroblast) và độc tính ức chế tế bào ung thư vú MCF-7 bằng phương pháp đo màu Sulforhodamine B (SRB), xác định giá trị $\text{IC}_{50}$. Quan sát hình thái tế bào chết theo chương trình bằng kính hiển vi huỳnh quang với phương pháp nhuộm màu kép Acridine Orange / Ethidium Bromide (AO/EB).

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Trình bày bối cảnh ung thư toàn cầu (theo GLOBOCAN 2020: 19,3 triệu ca mắc mới, gần 10 triệu ca tử vong; ung thư vú nữ chiếm 11,7% ca mắc mới) và tại Việt Nam (182.563 ca mắc mới, 122.690 ca tử vong năm 2020). Phân tích hạn chế sinh dược học của các thuốc hóa trị kỵ nước; giới thiệu tính cấp thiết, mục tiêu, nội dung nghiên cứu và các điểm đóng góp mới của đề tài.

Chương 1: Tổng quan về bệnh ung thư và những tiến bộ trong hóa trị liệu

Tổng hợp toàn diện 7 chuyên đề lý thuyết và tài liệu chuyên ngành:

  1. Ung thư và những thách thức trong hóa trị liệu: Phân tích dược động học, độc tính không đặc hiệu và hiện tượng kháng đa thuốc.
  2. Các hệ thống phân phối thuốc nano: Cấu trúc và cơ chế nạp thuốc của liposome, dendrimer, hạt nano vô cơ, chấm lượng tử và polymer sinh học.
  3. Phân phối thuốc hướng đích: Cơ chế hướng đích bị động qua khe nang mạch máu khối u (400–800 nm, phân tử $> 80\text{ kDa}$) và hướng đích chủ động qua thụ thể.
  4. Hệ phân phối thuốc nanogel: Cấu trúc mạng 3D ngậm nước, tính nhạy kích thích nhiệt độ, pH, thế oxy hóa khử; các ứng dụng mang phân tử nhỏ, oligonucleotide và protein.
  5. Hệ phân phối thuốc nanogel trên cơ sở chitosan: Đặc tính hóa học của chitosan từ chitin; các phản ứng biến tính gắn phối tử galactose, folate, biotin.
  6. Hệ phân phối thuốc nanogel trên cơ sở Pluronic: Cơ chế micelle hóa lõi kỵ nước PPO và vỏ ưa nước PEO; phân loại 4 nhóm Pluronic theo HLB và ứng dụng trong ức chế P-glycoprotein.
  7. Định hướng nghiên cứu chitosan ghép Pluronic và tác nhân nang hóa: Tổng hợp các công trình ghép chitosan với F127, L61, F68; phân tích lý do lựa chọn 4 loại Pluronic (L61, P123, F127, F68), lựa chọn phối tử acid folic, biotin và hai dược chất curcumin, paclitaxel.

Chương 2: Thực nghiệm

Mô tả chi tiết danh mục hóa chất tinh khiết của Sigma Aldrich, Thermo Scientific, Fisher BioReagents; các thông số vận hành của hệ thống thiết bị phân tích ($^1\text{H-NMR}$, FT-IR, DSC, TGA, DLS, TEM, UV-Vis). Quy trình tổng hợp 4 hệ polymer CS−Pluronic và 3 hệ polymer hướng đích (FA−CS−P123, CS−P123−FA, CS−P123−BIO). Trình bày chi tiết các công thức toán học xác định CMC, hiệu suất nang hóa (EE%), hàm lượng tải thuốc (DL%), quy trình thẩm tích giải phóng thuốc, kỹ thuật thử nghiệm độc tính tế bào SRB, nhuộm huỳnh quang AO/EB và phương pháp xử lý thống kê.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu được tác giả trình bày qua hai phần chính với các số liệu thực nghiệm:

1. Hệ phân phối thuốc CS−Pluronic mang Curcumin

  • Cấu trúc hóa học: Phổ $^1\text{H-NMR}$ và FT-IR xác nhận phản ứng hoạt hóa hai đầu Pluronic bằng NPC, tiếp theo là phản ứng thế một đầu bằng 3-amino-1-propanol tạo NPC−Pluronic−OH với hiệu suất giữ lại nhóm NPC đạt yêu cầu để ghép lên chitosan. Phổ FT-IR của CS−Pluronic xuất hiện dải hấp thụ đặc trưng của liên kết carbamate và dao động C-O-C của Pluronic bên cạnh mạch chitosan. Giản đồ DSC và TGA chứng minh copolymer ghép CS−Pluronic tạo thành một pha đồng nhất, có độ bền nhiệt và tính chất vật lý khác biệt hoàn toàn so với mẫu phối trộn vật lý đơn thuần.
  • Giá trị CMC và kích thước hạt DLS: Khi ghép Pluronic lên mạch chitosan, giá trị CMC của hệ CS−Pluronic giảm đáng kể so với Pluronic ban đầu, giúp micelle bền vững hơn ở nồng độ thấp. Khi tăng nhiệt độ từ $25^\circ\text{C}$ lên $37^\circ\text{C}$, kích thước thủy động học DLS của nanogel co lại do tính kỵ nước của khối PPO tăng lên khi nhiệt độ tăng.
Hệ chất mang HLB của Pluronic tiền chất CMC của Pluronic ($\text{mg/mL}$) CMC của CS−Pluronic ($\text{mg/mL}$) DLS ở $37^\circ\text{C}$ (nm) Thế Zeta (mV) Hiệu suất nạp CUR (EE%)
CS−L61 3 Thấp 0,028 150–180 Dương (+30 đến +38) Cao
CS−P123 8 Thấp 0,019 120–160 Dương (+32 đến +40) Cao nhất
CS−F127 22 (hoặc 24) Trung bình 0,065 140–190 Dương (+28 đến +35) Trung bình
CS−F68 29 Cao 0,140 160–210 Dương (+25 đến +32) Thấp nhất

Ghi chú: Giá trị HLB và CMC trích xuất theo các đồ thị và bảng so sánh trong luận án.

  • Khả năng nang hóa và giải phóng Curcumin: Khả năng nang hóa curcumin không tuân theo quy luật giá trị HLB của Pluronic mà phụ thuộc vào giá trị CMC của dẫn xuất CS−Pluronic. CS−P123 có giá trị CMC thấp nhất và chuỗi PPO dài đã mang lại hiệu quả nạp curcumin cao nhất. Quá trình giải phóng CUR in vitro từ các nanogel CS−Pluronic diễn ra chậm, kéo dài qua 48 giờ; tốc độ giải phóng ở pH 5,0 cao hơn đáng kể so với ở pH 7,4 do sự trương nở và hòa tan một phần của vỏ chitosan khi nhóm amine bị proton hóa trong môi trường acid.
  • Độ ổn định và độc tính tế bào: Bột nanogel CS−Pluronic/CUR sau khi đông khô và bảo quản ở nhiệt độ phòng có độ ổn định cao, kích thước hạt và thế zeta không bị thay đổi đáng kể sau khi tái phân tán trong nước. Thử nghiệm trên tế bào nguyên bào sợi lành cho thấy các hạt nanogel trống CS−Pluronic ở nồng độ $100\ \mu\text{g/mL}$ có độ tương thích sinh học tốt (tỷ lệ sống sót tế bào đạt trên 80%). Trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7, các nanogel nạp CUR gây độc tế bào phụ thuộc nồng độ với giá trị $\text{IC}_{50}$ thấp hơn so với CUR tự do; quan sát huỳnh quang AO/EB ghi nhận rõ các hiện tượng tế bào chết theo chương trình (ngưng tụ chất nhiễm sắc, phân mảnh nhân).

2. Hệ phân phối thuốc hướng đích gắn Folic Acid và Biotin mang Paclitaxel

  • Tổng hợp và đặc trưng cấu trúc: Phổ $^1\text{H-NMR}$ và FT-IR chứng minh việc gắn thành công acid folic trực tiếp lên chitosan (FA−CS−P123) cũng như gắn qua đầu mạch Pluronic P123 (CS−P123−FA). Tương tự, dẫn xuất biotinyl hóa đầu mạch Pluronic P123 cũng được ghép thành công lên chitosan (CS−P123−BIO).
  • Đặc trưng hóa lý nanogel mang Paclitaxel: Các hạt nanogel mang PTX có dạng hình cầu đồng đều dưới kính hiển vi TEM, kích thước phân bố trong khoảng 100–160 nm, thế zeta mang điện tích dương bề mặt giúp ngăn chặn hiện tượng kết tụ.
Hệ nanogel hướng đích Phối tử gắn đích Vị trí liên kết phối tử Kích thước DLS ở $37^\circ\text{C}$ (nm) Thế Zeta (mV) Hiệu suất nạp PTX (EE%) Mức độ hấp thu nội bào (MCF-7)
CS−P123/PTX Không Không 120–140 Dương Cao Cơ bản (nhập bào thụ động)
FA−CS−P123/PTX Acid folic Trên mạch Chitosan 130–155 Dương Cao Tăng cường qua thụ thể FRα
CS−P123−FA/PTX Acid folic Đầu mạch Pluronic P123 125–150 Dương Cao Cao nhất (vượt trội hơn FA gắn trên CS)
CS−P123−BIO/PTX Biotin Đầu mạch Pluronic P123 130–160 Dương Cao Tăng cường qua thụ thể Biotin
  • Khả năng giải phóng PTX và độ ổn định: PTX được giải phóng có kiểm soát, kéo dài và nhạy cảm pH (giải phóng nhanh hơn ở pH 5,0 so với pH 7,4). Dạng bột đông khô bảo quản tốt ở nhiệt độ phòng, giữ nguyên độ phân tán sau khi hoàn nguyên.
  • Hoạt tính sinh học in vitro:
    • Tính tương thích sinh học: Nanogel chất mang không nạp thuốc không gây độc cho tế bào nguyên bào sợi lành ở nồng độ $100\ \mu\text{g/mL}$ sau 48 giờ.
    • Hấp thu nội bào: Hình ảnh huỳnh quang sau 1 giờ ủ trên tế bào MCF-7 cho thấy các nanogel có gắn phối tử (FA, BIO) tích tụ trong tế bào chất cao hơn rõ rệt so với nanogel không có phối tử. Trong đó, hệ CS−P123−FA (gắn FA ở đầu mạch Pluronic P123) có sự hấp thu nội bào mạnh hơn hệ FA−CS−P123 (gắn FA trên mạch chitosan), do chuỗi PEO linh động giúp bộc lộ phối tử ra bề mặt ngoài tốt hơn.
    • Độc tính trên tế bào MCF-7: Tất cả các hệ nanogel mang PTX đều có giá trị $\text{IC}_{50}$ thấp hơn paclitaxel tự do. Hệ nanogel gắn acid folic thể hiện khả năng ức chế và tiêu diệt tế bào MCF-7 mạnh hơn so với hệ gắn phối tử biotin trong cùng điều kiện thực nghiệm in vitro.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

Luận án tự công bố các đóng góp mới sau:

  1. Xác định được quy luật nang hóa hợp chất kỵ nước của các nanogel chitosan ghép Pluronic: Trong dãy 4 loại Pluronic khảo sát (L61, P123, F127, F68 với các giá trị HLB lần lượt là 3, 8, 24 và 29), khả năng nang hóa curcumin không phụ thuộc vào giá trị HLB của Pluronic tiền chất mà phụ thuộc trực tiếp vào giá trị CMC của Pluronic cũng như CMC của dẫn xuất chitosan−Pluronic.
  2. Chứng minh vai trò của chitosan trong việc gia tăng độ ổn định của micelle: Chitosan liên kết với Pluronic giúp hạ thấp giá trị CMC và tăng cường đáng kể hiệu quả nang hóa curcumin so với hệ micelle Pluronic tiền chất đứng riêng lẻ.
  3. Lần đầu tiên thiết kế và tổng hợp thành công các hệ nanogel chitosan−Pluronic P123 liên hợp phối tử nhắm mục tiêu chủ động là acid folic và biotin (FA−CS−P123, CS−P123−FA, CS−P123−BIO).
  4. Làm rõ ảnh hưởng của vị trí liên hợp phối tử lên hiệu quả nhập bào: Phối tử acid folic khi liên hợp lên đầu chuỗi Pluronic (CS−P123−FA) có khả năng được tế bào ung thư vú MCF-7 hấp thu hiệu quả hơn so với khi liên hợp trực tiếp lên mạch chitosan (FA−CS−P123).
  5. So sánh hiệu quả sinh học giữa hai phối tử: Phối tử acid folic giúp tăng cường khả năng tiêu diệt tế bào ung thư vú MCF-7 của paclitaxel mạnh hơn so với phối tử biotin trên cùng mô hình thực nghiệm in vitro.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

  • Đề xuất quy trình công nghệ 3 bước đơn giản, hiệu quả sử dụng tác nhân NPC và 3-amino-1-propanol để đơn chức hóa một đầu mạch Pluronic trước khi ghép lên chitosan, khắc phục triệt để nguy cơ tạo liên kết ngang không mong muốn giữa các mạch polymer.
  • Lựa chọn hệ chất mang CS−P123 liên hợp acid folic ở đầu mạch Pluronic mang paclitaxel làm công thức tối ưu định hướng ứng dụng trong các chế phẩm hóa trị liệu hướng đích điều trị ung thư vú.
  • Ứng dụng kỹ thuật sấy đông khô để bảo quản hệ nanogel mang thuốc ở dạng bột khô ổn định tại nhiệt độ phòng, thuận lợi cho việc vận chuyển và hoàn nguyên trước khi dùng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án

  • Các thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học, khả năng ức chế tăng sinh tế bào và mức độ hấp thu nội bào mới chỉ được thực hiện ở quy mô in vitro trên một dòng tế bào ung thư vú người (MCF-7) và một dòng tế bào lành (nguyên bào sợi fibroblast); chưa có dữ liệu đánh giá trên các dòng tế bào ung thư vú có mức độ kháng thuốc lâm sàng cao hơn hoặc các dòng ung thư biểu mô khác.
  • Nghiên cứu chưa triển khai các thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật mang khối u để đánh giá toàn diện các thông số dược động học, thời gian lưu thông máu, phân bố sinh học qua hiệu ứng EPR và hiệu quả thu nhỏ thể tích khối u thực tế.

Hạn chế theo phạm vi nghiên cứu và hướng phát triển tiếp

  • Cần tiếp tục triển khai các thử nghiệm tiền lâm sàng in vivo trên chuột mang khối u ung thư vú để xác minh độc tính toàn thân và khả năng hướng đích của hệ hạt CS−P123−FA/PTX.
  • Nghiên cứu cơ chế chi tiết về sự cạn kiệt ATP nội bào và mức độ ức chế bơm P-glycoprotein của nanogel CS−P123 trên các tế bào ung thư kháng đa thuốc (MDR).
  • Khảo sát mở rộng khả năng đồng nang hóa (co-delivery) nhiều loại thuốc hóa trị hoặc kết hợp giữa thuốc hóa trị với các hoạt chất sinh học tự nhiên (như tổ hợp Curcumin và Paclitaxel) trong cùng một hạt nanogel CS−P123 để tăng hiệu quả điều trị hiệp đồng.

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng hữu ích

  • Nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Hóa học, Hóa polymer, Vật liệu y sinh và Dược học: Cung cấp tài liệu tham khảo phương pháp luận về kỹ thuật biến tính hóa học có kiểm soát trên polymer tự nhiên và copolymer khối.
  • Giảng viên và nhà nghiên cứu công nghệ nano y sinh: Làm tài liệu giảng dạy và nghiên cứu về các hệ phân phối thuốc hướng đích, động học micelle hóa và các thử nghiệm sinh học in vitro.
  • Các nhà phát triển công thức dược phẩm và bào chế thuốc: Cung cấp giải pháp kỹ thuật nâng cao độ hòa tan của các phân tử thuốc kỵ nước nhóm II và IV theo phân loại sinh dược học của FDA.

Các phần có giá trị tham khảo chuyên sâu

  • Chương 1: Phần phân loại và tổng quan chi tiết về 4 nhóm Pluronic theo chỉ số HLB, mối liên hệ giữa chiều dài chuỗi PPO với khả năng ức chế kháng đa thuốc; hệ thống các phản ứng liên hợp phối tử acid folic, biotin, galactose lên chitosan.
  • Chương 2: Giao thức thực nghiệm chi tiết về phản ứng hoạt hóa một đầu Pluronic bằng NPC, kỹ thuật bảo vệ nhóm amine bằng $\text{BOC}_2\text{O}$, quy trình đo CMC bằng phương pháp UV-Vis với hệ chỉ thị $\text{I}_3^-/\text{I}_2$, và phương pháp tạo hạt nạp thuốc bằng hydrate màng mỏng.
  • Chương 3: Bộ dữ liệu đối sánh phổ cộng hưởng từ hạt nhân $^1\text{H-NMR}$, phổ hồng ngoại FT-IR, nhiệt DSC/TGA và phân tích giải phóng động học của các hệ nanogel chitosan−Pluronic và nanogel gắn phối tử.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao tác giả lựa chọn 4 loại Pluronic L61, P123, F127 và F68 để ghép lên chitosan?

Bốn loại Pluronic này đại diện cho 4 nhóm cấu trúc khác biệt về độ cân bằng ưa nước - ưa béo (HLB) và chiều dài chuỗi kỵ nước PPO: Pluronic L61 có $\text{HLB} = 3$ (rất kỵ nước), Pluronic P123 có $\text{HLB} = 8$ (kỵ nước, chuỗi PPO dài $> 60$), Pluronic F127 có $\text{HLB} = 22\text{--}24$ (ưa nước, độ tương thích sinh học cao), và Pluronic F68 có $\text{HLB} = 29$ (rất ưa nước, tan tốt trong nước). Việc lựa chọn 4 loại này cho phép tác giả thực hiện nghiên cứu so sánh có hệ thống để tìm ra quy luật ảnh hưởng của HLB và cấu trúc phân tử Pluronic đến khả năng tạo micelle và tải dược chất kỵ nước khi ghép lên chitosan.

2. Yếu tố nào quyết định hiệu quả nang hóa curcumin của hệ nanogel CS−Pluronic?

Khả năng nang hóa curcumin của nanogel CS−Pluronic không phụ thuộc vào giá trị HLB của Pluronic tiền chất mà phụ thuộc trực tiếp vào giá trị nồng độ micelle tới hạn (CMC) của Pluronic và của chính dẫn xuất CS−Pluronic tạo thành. Hệ CS−P123 có giá trị CMC thấp nhất và chuỗi PPO kỵ nước dài nhất đã tạo ra lõi micelle bền vững và đạt hiệu quả nang hóa curcumin cao nhất. Đồng thời, sự có mặt của khung chitosan giúp làm giảm CMC của hệ so với Pluronic đơn lẻ, từ đó gia tăng khả năng nạp thuốc.

3. Phương pháp hóa học nào được sử dụng để ghép Pluronic lên chitosan mà không gây hiện tượng khâu mạch mạng lưới?

Tác giả áp dụng phương pháp hoạt hóa và khóa một đầu: Đầu tiên hoạt hóa 2 đầu -OH của Pluronic bằng 4-nitrophenyl chloroformate (NPC) tạo NPC−Pluronic−NPC; sau đó dùng 3-amino-1-propanol để thay thế nhóm NPC ở một đầu mạch tạo thành dẫn xuất NPC−Pluronic−OH. Do chỉ còn một đầu mang nhóm chức NPC hoạt động, phân tử Pluronic này khi phản ứng với các nhóm amine của chitosan sẽ chỉ ghép nhánh đơn lẻ lên mạch chitosan mà không tạo liên kết ngang giữa các phân tử chitosan với nhau, giúp kiểm soát tốt kích thước hạt nanogel.

4. Vị trí ghép phối tử acid folic (trên mạch Chitosan hay đầu mạch Pluronic) ảnh hưởng thế nào đến khả năng hấp thu của tế bào ung thư MCF-7?

Kết quả thực nghiệm huỳnh quang chứng minh phối tử acid folic khi được liên hợp ở đầu mạch Pluronic (hệ CS−P123−FA) cho mức độ hấp thu nội bào vào tế bào MCF-7 cao hơn so với khi liên hợp trực tiếp lên mạch chitosan (hệ FA−CS−P123). Nguyên nhân là do các khối PEO ưa nước của Pluronic có độ linh động cao, giúp bộc lộ phối tử acid folic ra phía ngoài bề mặt hạt nanogel tốt hơn, tạo điều kiện thuận lợi cho sự nhận diện và liên kết đặc hiệu với các thụ thể folate (FRα) trên màng tế bào ung thư.

5. Khả năng tiêu diệt tế bào ung thư MCF-7 của hệ nanogel mang Paclitaxel gắn phối tử thể hiện ưu thế gì so với Paclitaxel tự do?

Tất cả các hạt nanogel mang paclitaxel (CS−P123/PTX, FA−CS−P123/PTX, CS−P123−FA/PTX, CS−P123−BIO/PTX) đều làm giảm giá trị $\text{IC}_{50}$ trên tế bào MCF-7 so với paclitaxel tự do và nanogel không có phối tử. Các hạt nanogel có gắn phối tử acid folic và biotin làm tăng cường quá trình nhập bào qua trung gian thụ thể, từ đó nâng cao nồng độ thuốc tích tụ nội bào và kích hoạt mạnh mẽ chu trình chết theo chương trình apoptosis (thể hiện qua hình ảnh nhuộm màu kép AO/EB). Trong đó, hệ nanogel gắn phối tử acid folic mang lại hiệu quả tiêu diệt tế bào MCF-7 cao hơn hệ gắn biotin.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Văn Toàn đã thiết kế và tổng hợp thành công các hệ nanogel lưỡng tính trên cơ sở dẫn xuất chitosan ghép với 4 loại Pluronic (L61, P123, F127, F68) và các hệ nanogel hướng đích liên hợp acid folic, biotin. Nghiên cứu đã chứng minh quy luật khả năng nang hóa hoạt chất kỵ nước (curcumin, paclitaxel) phụ thuộc vào giá trị CMC và cấu trúc lõi kỵ nước PPO chứ không phụ thuộc vào giá trị HLB của Pluronic tiền chất, trong đó hệ dẫn xuất CS−P123 đạt hiệu quả tối ưu nhất. Các hạt nanogel mang thuốc có kích thước dưới 200 nm, thế zeta dương, giải phóng thuốc có kiểm soát nhạy cảm pH, tương thích sinh học tốt với tế bào lành và gia tăng khả năng hấp thu nội bào cũng như độc tính tiêu diệt tế bào ung thư vú MCF-7. Công trình cung cấp cơ sở thực nghiệm vững chắc cho việc phát triển các hệ dẫn thuốc polymer nano đa chức năng ứng dụng trong hóa trị liệu ung thư hướng đích.